Site de Maisons-Alfort

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1 Site de Maisons-Alfort Laboratoire d'etudes et de Recherches en Pathologie animales et Zoonoses Directeur : Eric Plateau Les activités du laboratoire portent sur les zoonoses et les maladies constituant des risques sanitaires majeurs (maladies de la liste A de l'office international des épizooties et maladies de la liste B réglementées). Les travaux effectués visent d'une part à améliorer les outils de détection et de caractérisation des agents des maladies transmissibles et d'autre part à harmoniser et évaluer les méthodes d'analyse utilisées dans les laboratoires de terrain. Ils permettent enfin de surveiller la situation sanitaire, détecter toute menace, conseiller les tutelles sur les mesures préventives ou curatives à mettre en œuvre. Le laboratoire est aussi laboratoire national de référence pour de nombreuses maladies et zoonoses. Ses unités sont par ailleurs impliquées dans plusieurs projets de recherche nationaux ou internationaux. Le laboratoire a établi de nombreuses collaborations avec d'autres laboratoires internationaux de référence, avec d'autres organismes de recherche nationaux, européens ou de pays tiers (Belgique, Espagne, Italie, Royaume-Uni, Mexique, Chine, Corée, Iran, Tunisie particulièrement). Les grands axes de recherches : o La virologie : barrière d espèces ; virus équins et virus émergents et réémergents o Les zoonoses bactériennes o La parasitologie o L épidémiologie L appui technique et l expertise o L identification d agents infectieux o L organisation d essais inter-laboratoires d aptitude o Le contrôle de réactifs biologiques et de vaccins o Les expertises immunosérologiques La recherche et l'appui scientifique et technique Afssa 2003/

2 Laboratoire national et OIE de référence et Centre collaborateur de la FAO pour la brucellose, la tuberculose et la paratuberculose. Centre national de référence (CNR) pour la brucellose et la tularémie humaine Laboratoire associé au CNR du Charbon (Institut Pasteur, Paris) Laboratoire national de référence pour le charbon bactéridien, la chlamydophilose aviaire, la métrite contagieuse équine, la tularémie, la fièvre aphteuse, la maladie vésiculeuse du porc, la peste équine, la morve, la dourine et la trichinellose. Laboratoire national de référence pour l anémie infectieuse des équidés avec L Enva. 68 personnes 5 unités de recherches dont deux unités de virologie intégrées dans l UMR virologie (Afssa-Enva- Inra) et une unité de parasitologie intégrée dans l UMR BIPAR (Afssa-Enva- Inra). Recherche Virologie Les activités de l UMR Virologie 1161 Afssa/Enva/Inra sont centrées sur les viroses animales à risque zoonotique et/ou d émergence, l étude de leur physiopathologie, le développement de nouvelles approches de diagnostic ou de prévention, ainsi que la participation à des réseaux de surveillance épidémiologique. Pour de nombreuses familles virales, les risques de transmissibilité animal vers homme ne sont que faiblement connus émergentes. L UMR contribue à une recherche spécifique dédiée aux risques potentiels liés aux virus animaux chez l homme, par l étude des interactions virus/hôte favorisant ou limitant les transmissions interspécifiques, en particulier dans le sens animal /homme. Les recherches sont actuellement ciblées aux interactions avec des tissus humains essentiellement i) à la porte d entrée muqueuse ou ii) après localisation dans un des tissus cibles retenu : le tissu nerveux. L objectif est de compléter les compétences, outils et réseaux collaboratifs afin de devenir un pôle de référence dans ce domaine. La recherche et l'appui scientifique et technique Afssa 2003/

3 Les méthodes de prévention sont orientées vers des approches vaccinales, en privilégiant la voie d administration orale compte tenu des cibles prévisibles dans la faune sauvage. Les efforts sont poursuivis afin de mieux comprendre les interactions d adénovirus avec les épithéliums muqueux, par ailleurs complémentaires au plan méthodologique du programme décrit ci-dessus. Des approches originales reposant sur l utilisation d adénovirus modifiés dans leur cycle de réplication et/ou leur protéines de structure sont poursuivies de manière à cibler les muqueuses et développer des outils génériques susceptibles d être utilisés chez les mammifères par voie locale. LNR pour plusieurs maladies virales de la liste A de l OIE, l unité assume également des missions de recherche appliquée et d appui technique qui entretiennent des fortes relations avec le terrain, ainsi que des compétences particulières en méthodes analytiques appliquées au diagnostic et à l épidémiologie. L UMR participe ainsi également aux activités de surveillance épidémiologique et de typage de souches de certaines maladies émergentes ou zoonotiques, virales ou à agent non conventionnel, sur lesquelles nous nous appuyons pour isoler les souches engagées dans les recherches ci-dessus. L UMR virologie comprend : Génétique virale Le développement de vaccins adénoviraux Les mécanismes d induction des réponses immunes systémique et muqueuse après administration vaccinale ont été étudiés. Différentes modifications de la particule virale ont permis d étudier et de modifier les interactions avec les cellules et tissus impliqués dans l établissement d une réponse immune systémique et muqueuse. Des adénovirus animaux porcin et canin ont été générés sous forme de vecteurs défectifs, réplicatifs ou pseudoréplicatifs pour application à la vaccination faune sauvage : sanglier et Peste porcine classique ; carnivores sur le modèle rage. Des premiers essais ont été conduits en matière de développement de vaccins contre les prions dans un modèle murin. Les Prions : rôle de la PrP dans la mort neuronale et dans l entrée par voie digestive Le rôle anti-apoptotique possible demontré pour la première fois pour la PrP-c in vivo, en faveur de l hypothèse selon laquelle une altération du rôle physiologique de la protéine pourrait être responsable de la mort des neurones observée dans le cas des maladies à prion. L unité a par ailleurs développé l étude de l expression intestinale de la PrPc sur un modèle de culture d entérocytes et des modèles in vivo et in vitro de franchissement de la barrière digestive par les ATNC Virologie Barrière d espèces Les objectifs de cette unité sont l étude des risques de contamination inter espèces en prenant pour modèles les virus de l encéphalomyocardite (EMCV) et de l hépatite E (HEV). La recherche et l'appui scientifique et technique Afssa 2003/

4 Ce choix est dicté par les dangers potentiels de contamination virale du porc à l homme par l intermédiaire des réactifs médicamenteux et des xénogreffes. L étude est effectuée à trois niveaux : épidémiologique, développement d outils de diagnostic, étude moléculaire. Epidémiologie : Pour le virus de l EMC, une première enquête épidémiologique effectuée en collaboration le laboratoire de l Afssa- Ploufragan est terminée. Une autre enquête sur la prévalence sérologique de l EMC et de l HE au sein de la population humaine, en accord avec l Etablissement Français du Sang se met en place. Il serait intéressant de constituer une banque de sérums au laboratoire notamment pour des enquêtes rétrospectives notamment en cas d émergence de nouveaux virus animaux. Des techniques de diagnostic sont mises au point dans les domaines suivants : Virus de l EMC : le test ELISA mis au point est en cours de validation avec l utilisation des sérums de l enquête. Virus de l HE : une protéine structurale a été exprimée à partir d une partie de l ORF2. Cette protéine est en cours d étude pour son introduction dans un test ELISA. Biologie moléculaire Des recherches sont réalisées vis à vis du virus de l EMC avec, notamment, son interaction avec différents types de cellules afin de déterminer les facteurs impliqués dans la transmissibilité inter-espèce et la pathogénicité. Des essais d adaptation aux cellules BRL ont donnés des résultats en cours d exploitation. Concernant l étude de la sensibilité de cellules primaires humaines, les premiers résultats montrent que celle-ci varie en fonction de la souche virale et du type cellulaire. Par ailleurs, le rôle de certaines mutations, identifiées au niveau du génome viral, en relation avec la spécificité cellulaire de l EMCV sont en cours de vérification. Les facteurs impliqués dans son pouvoir neurotrope et les interactions avec le tissu nerveux sont en cours d étude. Virologie des équidés et des virus émergents et ré-émergents La fièvre catarrhale du mouton («bluetongue») : les études relatives à la phylogénie des orbivirus se sont poursuivies dans le cadre notamment du contrat européen QLK2 CT Ces données ont permis de préciser les relations phylogénétiques qu entretiennent les différents sérotypes présents dans le bassin méditerranéen (1, 2, 4, 9 et 16) et d identifier 3 segments (2, 9 et 10) dont la variabilité génétique indique que ceux-ci seraient impliqués dans les mécanismes de déterminisme de la virulence. Une base de données accessible sur le web sur la phylogénie des orbivirus a été initiée en collaboration avec l «Institute for Animal Health» de Pirbright, GB Par ailleurs ans le cadre du projet de développement de vaccins recombinants léporipoxbluetongue avec l Envt et l Inra de Toulouse, les gènes qui codent les protéines VP7, NS1, La recherche et l'appui scientifique et technique Afssa 2003/

5 NS2 et NS3 ont été clonés dans des vecteurs de transfert et d expression. Les protéines VP7, NS1, NS2 et NS3 ont été, ou sont en cours, d expression Pour la protéine VP 7 qui s avère particulièrement intéressante pour le sérodiagnostic de groupe «bluetongue un dépôt de brevet est en cours. Des tests ELISA utilisant ces antigènes sont en cours de mise au point. La maladie de Borna : la technique sérologique permettant la détection, chez les chevaux, d'anticorps dirigés contre le virus Borna (techniques ELISA et Western blot) a été validée. Dans le cadre du projet «trans-zoonose», financé par l Inra, des enquêtes épidémiologiques ont été initiées concernant l infection de la faune sauvage. Une collaboration avec le CHU de Bordeaux a été développée pour ce qui concerne le volet humain. - La fièvre aphteuse : dans le cadre d une thèse de l Université Paris 7 et d une coopération avec l Institut des maladies exotiques d Anyang (République de Corée) le criblage d une banque de peptides aléatoires a permis d identifier deux épitopes correspondants aux anticorps opsonisants mais non-neutralisants. Une étude sur l activité d inhibiteurs de la mirystilation du virus aphteux a été entreprise et donne des résultats prometteurs. Enfin, dans le cadre du programme «ACI microbiologie INSERM/INRA», les protéines recombinantes VP4 d IBDV (virus de la maladie de Gumboro» - VP1 (protéine de structure du virus de la fièvre aphteuse» ont été exprimées et purifiées. Leur antigénicité est en cours d évaluation (collaboration avec l Inra de Jouy-en Josas). Zoonoses Bactériennes L unité a fourni depuis plusieurs années un très important effort de recentrage et de concentration des moyens vers les affections zoologiques bactériennes ayant un impact majeur en santé publique. Son implication dans des programmes européens d envergure est le fruit des efforts consentis. Ainsi, elle participe au programme COST 845 «Brucellosis in man and animals» et à l action concertée «Veterinary Network of laboratories Researching Improved Diagnosis and Epidemiology of Mycobacterial Diseases (VENoMYC» L unité a débuté ses études sur la PCR en temps réel pour les principales infections dont elle a la charge. Brucellose La mise en place d outils moléculaires de différenciation des souches de Brucella a commencé et les premiers essais ont été conduits pour la différenciation entre souches sauvages et vaccinales. La surveillance de la brucellose chez le sanglier sauvage en France (collaboration Dgal/Oncfs/Afssa) s est poursuivie dans 22 départements sur plus de 1500 sérums et a confirmé la très large endémie de brucellose dans cette espèce. La recherche et l'appui scientifique et technique Afssa 2003/

6 La 3 e phase de l étude comparative des tests sérologiques réalisés sur extraits pulmonaires et musculaires a confirmé la possibilité d utiliser les extraits musculaires à la place du sérum pour les enquêtes de prévalence. L existence d un nouveau biovar de Brucella abortus (biovar 7) identifié une première fois en 1999 en Mongolie a été confirmée en Turquie. Les collaborations développées au plan international ont également permis la mise en évidence du biovar 3 de B. suis chez le cheval et le sanglier en Croatie et celle du biovar 1 de B. abortus chez le buffle d eau au Brésil. Chlamydophilose aviaire L unité a été associée sur cette thématique à l enquête épidémiologique sur les pigeons de Paris dans le cadre de l installation expérimentale d un pigeonnier (collaboration ENVA). Des investigations ont été menées sur plusieurs oiseaux d une animalerie et certains de ses fournisseurs suite au décès d un patient lié semble-t-il à l ornithose-psittacose. La collection de souches a été développée et le typage moléculaire de ces souches a pu débuter. L unité a poursuivi ses travaux de développement de tests de diagnostic immunologique ou par PCR. Mycobactérioses La mise au point d un test PCR à partir de souches puis de prélèvements pathologiques pour la mise en évidence de Mycobacterium bovis (agent de la tuberculose animale) et la caractérisation des isolats de la faune sauvage dans plusieurs régions françaises avec différents marqueurs moléculaires pour déterminer des liens épidémiologiques avec des foyers de ruminants domestiques ont été poursuivies. De nouvelles méthodes de genotypage, «Variable Number Tandem Repeat (VNTR)» sur des isolats de la faune sauvage et de foyers bovins ont été mises en place. Une étude, en collaboration avec l Inra, sur la biodiversité de M. avium subsp paratuberculosis sur des souches d origines géographique et animale diverses a été initiée de même qu un suivi sérologique de troupeaux mixtes suspects de paratuberculose (bovin, ovin, caprin) de l Inra. Charbon bactéridien L étude de génotypage réalisée précédemment par l Institut Pasteur et l université d Arizona sur les souches françaises a été complétée par une étude des profils biochimiques des différents génotypes identifiés de Bacillus anthracis et de bactéries proches au plan phylogénétique appartenant à la famille des Bacillus. L étude de la distribution des terres charbonneuses en France et de la relation avec la nature des sols se sont poursuivies. Tularémie L évaluation de la PCR initiée en 2001 s est poursuivie sur les prélèvements reçus. La recherche et l'appui scientifique et technique Afssa 2003/

7 Immunologie parasitaire et fongique L'Unité mixte de recherche Afssa/Inra/Enva intitulée Biologie moléculaire et immunologie parasitaires et fongiques, «BIPAR» a pour objectifs l étude des relations hôtes-pathogènes (biologie des agents, épidémiologie moléculaire, réactions immunitaires) et leurs conséquences sur la pathogénie, le diagnostic et les moyens de lutte vis-à-vis des maladies parasitaires, fongiques ainsi que des maladies bactériennes transmises par les ectoparasites. Depuis sa création en 2000, elle a pu rapprocher les efforts de recherche présents sur le site autour notamment des outils de la biologie moléculaire dans un souci de complémentarité et de synergie. Deux thèmes fédérateurs ont été retenus : - l'étude des zoonoses parasitaires, et au premier rang d entre elles les Trichinelloses - les mycoses opportunistes et les infections émergentes qui ont aussi des implications en pathologie comparée : Aspergillus, Pneumocystis (barrière d espèce), Bartonella comme modèle de bactéries transmises par des ectoparasites. Trichinellose La cartographie des antigènes de Trichinella est en cours. Des épitopes critiques de Trichinella ont été mis en évidence avec des anticorps monoclonaux (AcM) dirigés contre les stades Adulte et L1NN du parasite. Les épitopes reconnus par ces anticorps sont en cours d analyse en partenariat avec 4 laboratoires nationaux et européens : Les gènes spécifiques de stade ont été étudiés, notamment l antigénicité des produits d expression des gènes spécifiques de stade. Un premier antigène majeur a été caractérisé (projet de brevet en cours). Deux antigènes codant pour des proteines fixant l ADN ont également été analysés après séquençage complet. Par ailleurs l analyse de la réponse immunitaire mucosale anti-trichine a porté sur l invasion de Trichinella in vivo et la réponse humorale locale. Mycoses opportunistes transmise par voie aérienne : aspergillose et pneumocystose L équipe travaille sur le thème «Etude de la physio-pathologie et de l épidémiologie des mycoses opportunistes. Relations entre mycoses animales et humaines.». Ces recherches ont pour objectifs généraux une meilleure compréhension de l épidémiologie des mycoses, l optimisation des méthodes de diagnostic et la mise en place de méthodes de lutte adaptées. Deux projets ont été développés : - interactions entre conidies d Aspergillus fumigatus et cellules épithéliales des voies aériennes supérieures chez l homme et chez l animal, - épidémiologie des mycoses se transmettant par voie aérienne (pneumocystoses et aspergilloses). La recherche et l'appui scientifique et technique Afssa 2003/

8 Bactéries pathogènes vectorisées par les tiques Les travaux ont porté sur la définition des réservoirs de Bartonella dans les animaux de rente, les mécanismes moléculaires de sa persistance et sa transmission ainsi que la confection de tiques par des bactéries pathogènes. L amplification d un fragment d ADN, codant pour les ARNr 16S et 23S, a permis un typage rapide des souches. En collaboration avec le département de microbiologie de l université de Bale, une étude de mutants de B. birlesi ayant perdu le pouvoir de bactériémie chez la souris a été entamée. L ADN de Bartonella a été retrouvé dans différentes mouches hématophages des mammifères et la présence conjointe de bactéries pathogènes a été recherchée. Epidémiologie Au cours de l année 2003, l unité d épidémiologie a poursuivi ses recherches dans le domaine de la modélisation de diverses maladies transmissibles comme la fièvre aphteuse et l encéphalite a virus West Nile. L épidémie de SRAS a fortement implique l unité qui participe aux études internationales sur l origine et la diffusion de cette maladie. Deux missions en Chine ont notamment été effectuées avec l Union européenne, l OIE, la FAO et l OMS. Un programme européen impliquant au niveau français l Afssa et le muséum d histoire naturelle a été élaboré et devrait prochainement démarrer. L appui scientifique et technique et l expertise Virologie des équidés et des virus émergents et ré émergents ; Bluetongue : environ 380 prélèvements biologiques (Corse et île de la Réunion) ont été reçus en En Corse, un virus de sérotype 4 a été isolé ; dans l île de la Réunion, un virus de sérotype 3 a été isolé. Fièvre aphteuse : Outre sa participation aux essais inter-laboratoire européen pour le diagnostic sérologique et virologique de la maladie vésiculeuse du porc l unité a étendu l étude des réactions non spécifiques en seronoutralisation a diverses souches exotiques de virus de la FA : SAT 1, A Iran, Asia).Par ailleurs, dans la perspective de sérologies en urgence et sur large échelle et corrélativement a la politique de décentralisation sélective des analyses vers des laboratoires d e terrain, il a été procédé à des études de spécificité des 2 kits actuellement disponibles (Chekit test pour la détection des anticorps anti protéines non structurales et Ceditest pour la détection des anticorps spécifiques du type O) West Nile : L unité a diagnostiqué plusieurs cas d infection à virus West Nile chez le cheval dans le Var. Enfin, 906 sérums ont été traités dans le cadre d une enquête sérologique mise en place par la DGAl et la DDSV du Var suite a la mise en évidence de cas cliniques chez l homme et le cheval. La recherche et l'appui scientifique et technique Afssa 2003/

9 LNR pour les maladies virales réglementées du cheval ainsi que pour la morve et la dourine le Laboratoire d études et de recherches en pathologie animale et zoonoses est sollicité en permanence pour des suspicions cliniques ou des contrôles aux échanges internationaux,10 % environ des demandes émanant d organismes étrangers (Services vétérinaires, organismes professionnels) car le nombre de laboratoires dans le monde capable de traiter l ensemble de ces maladies et ayant une expérience suffisante en ces domaines est très peu élevé. Plus de 6000 échantillons biologiques (soit près de analyses) constitués en majorité des sérums ont ainsi été traités dans le cadre de la surveillance et du contrôle des maladies suivantes : anémie infectieuse, artérite virale, grippe, peste équine, morve, dourine, Zoonoses bactériennes Dans le cadre des activités de référence, l unité a effectué plus de prestations d analyses, dont 2500 analyses de bactériologie, de PCR ou d épidémiologie moléculaire. Plus de 40 lots de vaccins ou de réactifs de diagnostic ont été contrôlés pour la brucellose et la tuberculose. Le laboratoire a également organisé des essais inter laboratoires et des formations aux techniques de diagnostic à destination des laboratoires d application (brucellose, charbon, métrite contagieuse équine, tuberculose, tularémie). Parasitologie L Unité parasitologie a conformément a ses missions auprès des tutelles, assuré la formation des laboratoires de terrain, le contrôle des résultats et l analyse des données epidemiologiques nationales. Par ailleurs une enquête sérologie trichine (convention ONC) chez le sanglier visant à déterminer la séroprévalence apparente de Trichinella chez le sanglier a été menée en utilisant l ELISA antigène excrétion/sécrétion (E/S), seul test de référence actuellement disponible. Des échantillons de références et des préparations antigéniques standards ont été réalisées pour mieux calibrer le test ELISA actuellement utilisé. Dans le cadre des exportations de chevaux ou les suspicions de Babésiose clinique ont plus de 2500 prélèvements ont été traités au cours de l année. Enfin l unité assure un service en microscopie électronique. qui a pu traiter 23 dossiers, correspondant à 248 colorations négatives, 137 blocs et autant de coupes ultra fines analysées. Epidémiologie L unité d épidémiologie a assuré la permanence pour l aide aux suspicions des maladies vesiculo-aphteuse et a la formation des vétérinaires sanitaires en ce domaine. Elle a participé à la surveillance au diagnostic et au contrôle des foyers de Bluetongue en Corse et à la Réunion. La recherche et l'appui scientifique et technique Afssa 2003/