VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON THESE

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1 VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON Année Thèse n Etude bibliographique des anomalies génétiques impliquées dans les lymphomes non hodgkiniens canins THESE Présentée à l UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 24 septembre 2012 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par GUYONNET Alexandre Né le 01 février 1988 à Saint Priest en Jarez (42)

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5 Remerciements A Monsieur le Professeur Jean-Yves Scoazec Professeur à l Université Claude Bernard de Lyon Vous qui nous avez fait l honneur d accepter la présidence de notre jury de thèse Veuillez trouver ici l expression la plus distinguée de notre reconnaissance A Madame le Docteur Frédérique Ponce Maître de conférences à VetagroSup campus Vétérinaire de Lyon Pour nous avoir transmis votre passion pour ces maladies, Pour nous avoir encadré tout au long de ce travail Puissiez-vous trouver dans ce dernier l expression de notre gratitude et le témoignage de notre sincère respect A Madame le Docteur Véronique Lambert Maître de conférences à VetagroSup campus Vétérinaire de Lyon Pour nous avoir aidé à corriger notre travail et avoir accepté de faire partie de notre jury Veuillez accepter nos remerciements les plus sincères 5

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7 A ma maman, Pour m avoir toujours soutenu dans toutes les petites épreuves que la vie a élevées devant moi et pour avoir toujours offert le meilleur à tes enfants souvent même à ton détriment. Pour être le plus bel exemple de courage et de générosité que je connaisse. A Maxime, Pour être à la fois le meilleur exemple à suivre et le pire, pour m avoir toujours protégé lors de ma traversée de l enfance et surtout pour ces jeux avec les règles les plus tordues possibles. A Camille et Elodie Pour avoir toujours été là malgré l éloignement, pour la solidarité quasi mystique qui vous unie, pour l amour que vous montrez difficilement mais que je sais puissant. PS : Ménager Maman serait sympa. A Nany et Grand-Père Pour tout l amour dont vous nous couvrez, Pour le chapon farci et la cuisine Façon Marcon, Pour le rire de Grand-Père et Pour m avoir appris qu il n y pas de petites occasions. A la famille Laroche Pour tous les moments passés ensemble, et pour le plaisir pris à les partager. Pour avoir fait de Walt Disney notre résidence secondaire. A Franck Pour ta bonne humeur et ta cargaison de blagues, Pour avoir prêté à Max la chevelure Verpoort. 7

8 A Anaïs Pour avoir été le tournant de ma vie, pour en être le point central et pour en être le futur. Pour ta patience (certes très limitée), pour tous les changements que tu m as apportés, Pour le bonheur que tu m offres. Le «Je ne sais pas ce que je ferai sans toi» n a jamais pris autant de sens, à la fois pour ce travail de thèse mais surtout pour tout le reste. Je t aime plus que tout. 8

9 Tables des matières Remerciements... 5 Table des illustrations Liste des abréviations Introduction I. Définitions et généralités sur les lymphomes non hodgkiniens canins (LNHs) A. Définitions des LNHs B. Classifications actuelles des LNHs Classification des LNHs humains a) Evolution de la classification humaine b) Caractéristiques des LNHs humains Classification des LNHs canins a) Evolution de la classification canine b) Particularités des lymphomes canins c) Prévalence des lymphomes canins en fonction de la race d) Prévalence des types de lymphomes selon la race II. Exploration des anomalies cytogénétiques A. Etude des anomalies cytogénétiques en médecine humaine B. Techniques utilisées Le Caryotype a) Définitions b/ Colorations en bandes ) Cytogénétique moléculaire a) Hybridation in situ fluorescente (FISH) (1) Description de la technique (Delobel 2010) (2) Indications de la technique FISH b) Hybridation génomique comparative (CGH) c) Spectral Karyotyping (SKY) C. Evolution de la cytogénétique dans l espèce canine Développement du caryotype du chien domestique Décryptage du génome canin a) Stratégies d analyses du génome canin

10 (1) Relation entre carte génétique et carte physique (2) Etablissement d une carte génétique (i) Réalisation et intérêt d une carte génétique (ii) Description de la technique d hybrides d irradiation (α) Hybridation in situ fluorescente (FISH) (β) Carte d hybrides d irradiation (3) Etablissement d une carte physique (i) Réalisation d une carte physique (ii) Développement d une carte physique chez le chien b) Séquençage du génome canin (1) Demande de financement par la communauté scientifique (2) Premier séquençage complet du génome d un chien (3) Caractéristique du génome canin (4) Cartes de synténie III. Anomalies cytogénétiques associées aux LNHs humains A. Translocations chromosomiques : Les réarrangements normaux durant la maturation a) Mécanismes de réarrangement des gènes des immunoglobulines (Ig) et de leur produit (1) Structure des Immunoglobulines : (2) Synthèse des chaînes légères et lourdes (Bach et Chatenoud 2002) (i) Réarrangement de la chaîne légère κ (ii) Réarrangement de la chaîne légère λ (iii) Réarrangement du locus de la chaîne lourde (iv) Les séquences signal de recombinaison (SSR) (v) Système de régulation de la recombinaison somatique (3) Réarrangement intervenant dans les centres germinatifs (i) L hypermutation somatique (ii) Commutation isotypique b) Mécanismes de réarrangement des récepteurs pour l antigène des lymphocytes T (TCR).. 51 (1) Structure des TCR : (2) Organisation et réarrangement des gènes du récepteur T Les translocations chromosomiques dans les cas de LNHs a) Translocations chromosomiques durant les recombinaisons des régions V, D et J b) Translocations chromosomiques durant l hypermutation somatique et la commutation isotypique c) Conséquences génétiques des translocations (Nambiar et al. 2011)

11 B. Anomalies chromosomiques retrouvées dans les différents sous-types de LNHs humains Anomalies cytogénétiques rencontrées dans les LNHs de type B a) Lymphomes lymphocytiques : b) Lymphomes à cellules du manteau (LCM) (1) Translocation t(11 ;14)(q13 ;q32) (2) Del 11q (3) Aberrations chromosomiques secondaires associées au lymphome du manteau c) Lymphomes folliculaires (LF) (1) Translocation t(14 ; 18)(q21 ;q32) (2) Anomalies structurales secondaires (i) Del 6q (ii) Gène p d) Lymphome de Burkitt (LB) e) Lymphomes B diffus à grandes cellules (LDGC) (1) Classification des LDGC (2) Anomalies cytogénétiques récurrentes f) Lymphomes des tissus lymphoïdes associés aux muqueuses (MALT) Anomalies cytogénétiques rencontrées dans les LNHs de type T a) Lymphome anaplasique à grandes cellules (1) Les ALCL ALK (i) Translocation ALK/NPM (ii) Autres fusions oncogéniques impliquant Alk (2) Lymphomes ALK- ALCL b) Lymphadénopathies angio-immunoblastiques c) Lymphome T périphérique sans autre spécification (PTCL, NOS) IV. Anomalies cytogénétiques associées aux Lymphomes non-hodgkiniens canins A. Intérêt du modèle canin dans l étude des LNHs humains Besoin de nouveaux modèles pour étudier les maladies complexes Intérêt du modèle canin Intérêt du modèle canin dans l étude des cancers a) Homologies des maladies humaines et canines b) Homologies entre les LNHs dans les deux espèces B. Etudes des anomalies cytogénétiques associées aux LNHs canins Observations d anomalies cytogénétiques à l aide des techniques conventionnelles Observations d anomalies cytogénétiques à l aide des techniques de cytogénétique moléculaire

12 a) Etudes des anomalies de nombre (1) Développement de technologies de cytogénétique moléculaire (i) Hybridation génomique comparative (ii) Cartes cytogénétiques comparatives (2) Analyses des anomalies de nombre récurrentes dans les LNHs canins (i) Caractérisation des anomalies de nombre selon le phénotype (ii) Caractérisation des anomalies de nombre selon la race (α) Relation Race-Phénotype (β) Cas de la Race Golden Retriever (iii) Etude des anomalies récurrentes (α) Trisomie du CFA (β) Gain du CFA (γ) Perte du CFA (δ) Délétion partielle du chromosome CFA (ε) Gain du CFA b) Anomalies structurales (1) Caractérisation d un réarrangement similaire à la translocation humaine t(8 ;14) (2) Délétion du locus RB-1 dans les cas de lymphomes lymphocytiques (CLL) (ii) Anomalies de nombre corrélées à un sous-type de lymphome (α) Lymphome B diffus à grandes cellules canins (cldgc) (β) Lymphomes T périphériques sans autre spécifications canins (cptcl) Conservations des anomalies cytogénétiques dans l espèce canine Conclusion Bibliographie

13 Table des illustrations Liste des figures Figure 1 : Répartition des sous-types histologiques des LNHs de l homme Figure 2 : Répartition des sous-types histologiques des LNHs canins Figure 3 : Principe de l hybridation in situ sur chromosomes (FISH) Figure 4 : Application de la technique SKY à une préparation chromosomique canine Figure 5 : Préparation de chromosomes en métaphase Figure 6 : Relations entre séquence d ADN, Carte physique et Carte génétique Figure 7 : Schéma des mécanismes d élaboration d hybrides d irradiation Figure 8 : Tasha, la femelle Boxer, dont l ADN a été utilisé pour séquencer le génome canin complet Figure 9 : La méthode Shotgun L ADN est fragmenté au hasard. Chaque fragment est amplifié puis séquencé. La séquence totale est reconstituée grâce aux chevauchements recherchés par bioinformatique Figure 10 : Structure générale d une immunoglobuline : Organisation en sous unités Figure 11 : Réarrangement du locus de la chaîne κ Figure 12 : Organisation des séquences signal de recombinaison (SSR) selon le locus de la chaîne concernée. 48 Figure 13 : Les étapes enzymatiques des réarrangements des segments géniques des immunoglobulines Figure 14 : Conséquences des translocations chromosomiques Figure 15 : Structure du locus BCL Figure 16 : Lymphomogenèse des lymphomes du manteau Figure 17 : Structure du locus BCL Figure 18 : Illustration schématique de la protéine fusion NPM-ALK résultant de la translocation t(2 ;5) Figure 19 : Régulation du cycle cellulaire par la voie Rb Figure 20 : Cellule en interphase d un chien présentant un lymphome de Burkitt montrant une co-localisation hétérozygote d un clone BAC canin (contenant le gène MYC) et d un clone BAC montrant la bande cytogénétique contenant le locus du gène codant pour l IgH Figure 21 : Expression de la protéine MYC dans certains sous-types de lymphomes canins Liste des tableaux Tableau 1 : Classification de l OMS des lymphomes humains de Tableau 2 : Classification de Kiel actualisée : Corrélation possible avec la classification WHO humaine et avec la classification de Kiel actualisée des animaux domestiques Tableau 3 : Gènes dérégulés dans les cas de LNH : Fonction cellulaire normale et Fonction après translocatio 57 Tableau 4 : Résumé des altérations du gène MYC dans les hémopathies lymphoïdes humaines Tableau 5 : Aberrations chromosomiques récurrentes dans les cas de lymphomes de type T Tableau 6 : Principales translocations impliquant le gène Alk documentées dans les cas de ALCL ALK

14 Liste des abréviations ADN : Acide désoxyribonucléique AID : Activation-induced cytidine deaminase ALCL : Lymphomes anaplasiques à grandes cellules (Anaplastic large cell lymphoma) ALK : Anaplastic lymphoma kinase BAC : Bactérial Artificial Chromosome BCL : Lymphome de type B c : concerne l espèce canine CD : Cluster of differencation CFA : Autosome de l espèce Canis familiaris CGH : Hybridation génomique comparative CS : Conserved Segment CSO : Conserved Segment Ordered EBV: Virus d Epstein-Barr FISH: Hybridation in situ fluorescente Ig: Immunoglobuline LB: Lymphomes de Burkitt LDGC: Lymphomes B diffus à grandes cellules LF: Lymphomes folliculaires LLC : Leucémies lymphoïdes chroniques h : concerne l espèce humaine HSA: Autosome de l espèce Homo sapiens LNHs: Lymphomes non hodgkinien LCM: Lymphomes à cellule du manteau MALT: Lymphomes des tissus lymphoïdes associés aux muqueuses NIH: National Institute of Health (Etats-Unis) NHEJ: Non homologous End Joining System OD: Odds Ratio OMS: Organisation Mondiale de la Santé PCR : Polymerase Chain Reaction PTCL: Lymphomes T périphériques sans autre spécification RAG: Recombination Activating Gene REAL: Revised European-American lymphoma classification RH: Hybrides d irradiations SSR: Séquences Signal de Recombinaison SKY: Spectral Karyotyping TCL : Lymphome de type T TCR : Récepteur des lymphocytes T à l antigène YAC: Yeast Artificial Chromosome 14

15 Introduction Les lymphomes forment des proliférations néoplasiques des cellules lymphoïdes B, T ou NK, à localisation ganglionnaire et/ou extra-ganglionnaire, observées chez l homme et l animal. Cette entité fut décrite pour la première fois en 1871 par Thomas Hodgkin. Il donna son nom à une affection particulière de prolifération lymphomateuse, la Maladie de Hodgkin, justifiant pour l ensemble des autres lymphomes la terminologie de lymphomes non hodgkiniens (LNHs). Les LNHs forment un groupe hétérogène de tumeurs des cellules lymphoïdes primitivement extra-médullaires fréquentes et d une réelle importante. Leur incidence augmente régulièrement de 1 à 4% par an. Ces entités se rangent actuellement au sixième rang des cancers en termes de fréquence chez l homme et au cinquième rang chez la femme aux USA (Jemal et al. 2009). La façon d aborder ces maladies a beaucoup évolué au cours du XXème siècle avec le développement de classifications pour différencier chacune de ces entités. Ces dernières sont classées selon leurs caractéristiques histopathologiques, immunophénotypiques, épidémiologiques, cliniques et cytogénétiques. L incidence des LNHs canins a également augmenté lors du XXème siècle et le développement de classifications adaptées au chien, inspirées de celles disponibles en médecine humaine, a montré la grande homologie des lymphomes chez ces espèces. Le chien est rapidement apparu comme un modèle idéal pour l étude comparée de ces affections. Malgré un retard notable dans l étude des LNHs par rapport à leurs homologues humains, de solides données histopathologiques, immunophénotypiques, épidémiologiques et cliniques sont maintenant disponibles et ont permis l adoption de nouvelles classifications comme celle de Kiel actualisée (Ponce et al. 2010). Les données cytogénétiques largement étudiées en médecine humaine sont encore parcellaires chez le chien. Cependant dans les années 2000, les techniques cytogénétiques disponibles dans l espèce canine ont vu un essor remarquable motivé par le besoin d un modèle alternatif pour élucider les mécanismes génétiques de l oncogenèse des LNHs humains. Dans une première partie, nous introduisons des données actualisées sur les classifications des lymphomes du chien et de l homme. La deuxième partie aborde l exploration des anomalies cytogénétiques avec l évolution toute récente de la cytogénétique chez le chien. La troisième partie est constituée par les anomalies cytogénétiques retrouvées lors de lymphome chez l homme et enfin la quatrième partie s intéresse aux premières anomalies détectées chez le chien et souligne l intérêt de la pathologie comparée et de l utilisation du chien comme modèle animal pour la mise en évidence d anomalies cytogénétiques. 15

16 I. Définitions et généralités sur les lymphomes non hodgkiniens canins (LNHs) A. Définitions des LNHs Les lymphomes non hodgkiniens canins (LNHs) forment un groupe hétérogène de tumeurs des cellules lymphoïdes primitivement extra-médullaires. Cette appellation sousentend l exclusion de la maladie de Hodgkin, qui fut la première forme de lymphome mise en évidence sur le plan histologique (Reyes 2001). Les lymphomes ont le plus souvent une localisation ganglionnaire ou extra-ganglionnaire mais peuvent s accompagner d un envahissement sanguin ou médullaire. Les présentations cliniques sont très variables. Par analogie avec le modèle humain, leur genèse repose sur la théorie monoclonale du cancer. Cela implique que chaque cellule intervenant dans la maturation des lymphocytes T et B peut donner naissance à un lymphome, gardant, dans la plupart des cas, les attributs morphologiques et immunophénotypiques de la cellule dont il est issu (Jaffe et al. 2001). Chez le chien, les lymphomes sont définis comme une prolifération tumorale de lymphocytes T ou B au sein d un ou plusieurs organes. Les différents tissus concernés sont le système lymphatique/nœuds lymphatiques, l appareil digestif, les reins, le système nerveux, la rate, les poumons, le cœur et les yeux (Vonderharr et Morrisson 1998). Cependant, les connaissances relatives au chien sont plus parcellaires que celles issues de la médecine humaine et en sont très largement inspirées. Les LNHs présentent de grandes similitudes pathologiques mais ils forment, en réalité, un groupe hétérogène d entités anatomo-cliniques ayant une individualité morphologique, immunologique, cytogénétique et moléculaire (Lafarge et Beurlet 2010). Depuis la seconde moitié du XXème siècle, de nombreuses classifications ont été proposées dans le but d identifier des entités anatomo-cliniques avec des pronostics et des options thérapeutiques différents. B. Classifications actuelles des LNHs Le principe de base de la classification des lymphomes repose sur la ressemblance morphologique et antigénique entre les cellules cancéreuses et leurs homologues lymphoïdes 16

17 normaux dont elles dérivent. De plus, chaque étape jalonnant la différenciation lymphoïde T et B peut engendrer un lymphome (Fournel-Fleury et al. 1994) En médecine vétérinaire, la classification des lymphomes canins repose surtout sur des bases phénotypiques et morphologiques et s inspire largement de celles développées chez l homme. La mise en place des classifications présente de nombreux intérêts. La classification propose au pathologiste des critères d identification des lymphomes permettant de les différencier d autres néoplasies ou d hyperplasie réactionnelle. Des entités anatomo-cliniques sont ainsi définies, se distinguant les unes des autres par leur morphologie, leur clinique et leur évolution. La classification a alors pour but d associer à chaque type de lymphome une présentation morphologique, immunophénotypique, une évolution clinique, un pronostic et un traitement particuliers. A long terme, chez le chien, des données sur la réponse au traitement de chaque type de lymphomes est envisageable. 1. Classification des LNHs humains a) Evolution de la classification humaine En 1832, Thomas Hodgkin décrit les tumeurs ganglionnaires. La maladie de Hodgkin est distinguée des autres tumeurs malignes ganglionnaires en 1865 sur des bases cliniques (Ottensmeier 2001). Sternberg en 1898 et Reed en 1902 décrivent des cellules géantes présentent dans les cas de maladie de Hodgkin qui portent actuellement leurs noms. Les autres tumeurs lymphatiques sont alors regroupées par opposition sous le nom de lymphome non hodgkiniens (LNHs). Le terme de lymphosarcome est employé pour la première fois par Kundrat pour toutes les tumeurs primitives des ganglions lymphatiques, les distinguant ainsi des leucémies (Brousse et Solal-Celigny 1997) Le besoin de classer les lymphomes de l homme n apparaît que vers 1950 lorsque les traitements efficaces apparaissent, scindant les lymphomes selon leurs caractéristiques cliniques et leurs pronostics. La morphologie a été d abord mise en avant dans la classification de Rappaport en 1956 permettant la distinction entre le lymphome de Hodgkin et les lymphomes non-hodgkiniens d une part, et entre les tumeurs de haut grade et de bas grade d autre part (Brousse et Solal-Celigny 1997). Ensuite, la classification européenne de Kiel, publiée en 1974 sous l impulsion de Karl Lennert, introduisit une classification anatomo-pathologique à l intérieur de ces deux catégories en fonction de la taille des cellules (Lennert et al. 1975). La version révisée ultérieure de cette classification prit en compte l apport de l immunochimie et distingua les phénotypes B et T (Stansfeld et al. 1988). Une classification américaine basée uniquement sur la clinique et la morphologie (Working formulation for clinical usage) fut élaborée sous l autorité du National Cancer Institute en Les lymphomes furent divisés en trois catégories selon leurs pronostics (bas 17

18 grade, grade intermédiaire, haut grade), mais cette classification ne distingua pas les lymphomes B et T (Non-Hodgkin s lymphoma pathologic classification project 1982). La classification REAL en 1994 (Revised european-american lymphoma classification) fit une synthèse entre la classification anatomo-pathologique de Kiel et la Working formulation clinique américaine afin d unifier le diagnostic en faisant intervenir de nombreuses méthodes, y compris la biologie moléculaire (Harris et al. 2001). La classification de l OMS (Organisation mondiale de la Santé) est une modification de cette classification REAL (cf. Tableau 1). Celle-ci est la première classification internationale (Jaffe et al. 2001). Elle décrit l ensemble des tumeurs des tissus hématopoïétiques et définit dans la mesure du possible l architecture, la morphologie, l immunophénotype, la génétique et la clinique de chaque entité. Elle fut initialement proposée en 2001 puis actualisée et complétée en Cette classification a permis une meilleure compréhension des entités lymphoïdes à l échelle internationale. De réels index pronostiques ont pu être développés (Jaffe 2009) b) Caractéristiques des LNHs humains L incidence des LNHs a fortement augmenté au cours des dernières décennies à travers le monde. Aux Etats-Unis, le National Cancer Institute rapporte une incidence de 20,21 pour personnes en 2009, représentant une augmentation de 75% depuis 1975 (Howlader et al. 2009). En France, les données récentes évaluent à nouveaux cas estimés en 2005 (Belot et al. 2006) Les lymphomes de type B sont nettement majoritaires avec 90% des cas de néoplasies lymphoïdes dans les pays occidentaux La forme ganglionnaire est la présentation clinique la plus fréquente, avec environ 70% des cas (Groves et al. 2000). Les sous-types majoritaires sont les lymphomes B diffus à grandes cellules puis les lymphomes folliculaires (Jaffe et al. 2001). Ces deux entités représentent 60% de l ensemble des cas de LNHs. Ainsi, les lymphomes T sont moins fréquents avec seulement 12% des LNHs. Les sous-types les plus représentés sont les lymphomes périphériques non spécifiés et le lymphome angioimmunoblastique T. Il faut cependant noter que les incidences sont fonction de l âge de la population, de la race et de la géographie. Les lymphomes T sont ainsi très fréquents en Asie où ils peuvent représenter environ 50% des cas. 18

19 Lymphomes B Lymphomes T et NK Tableau 1 : Classification de l OMS des lymphomes humains de 2008 (Swerdlow et al.2008) Tumeurs développées à partir de précurseurs lymphoïdes Tumeurs développées à partir de cellules matures Leucémie / Lymphome lymphoblastique avec ou sans anomalie génétique Leucémie / Lymphome lymphoblastique Leucémie lymphoïde chronique / lymphome lymphocytaire Lymphome splénique de la zone marginale Lymphomes/ Leucémies spléniques inclassables Leucémie à tricholeucocytes Lymphome lymphoplasmocytaire Myélome Maladie des chaînes lourdes (α, γ, µ) Plasmocytome solitaire osseux Plasmocytome extraosseux Lymphome extraganglionnaire de la zone marginale du tissu lymphoïde associé aux muqueuses (MALT) Lymphome ganglionnaire de la zone marginale (variante : forme de l enfant) Lymphome folliculaire (et ses variantes : lymphome folliculaire pédiatrique, lymphome primitif intestinal, autres lymphomes folliculaires extraganglionnaires, lymphomes folliculaires in situ) Lymphome centrofolliculaire primitivement cutané Lymphome du manteau Lymphome B diffus à grandes cellules sans autre spécification (variantes : centroblastique, immunoblastique, anaplasique) Lymphome B riche en cellules T/histiocytes Lymphome B médiastinale (thymique) Lymphome à grandes cellules primitivement cutané (type des membres) Lymphome à grandes cellules du système nerveux central Lymphome intravasculaire Lymphome à grandes cellules associé à une inflammation chronique Granulomatose lymphomatoïde Lymphome à grandes cellules EBV+ du sujet âgé Lymphome à grandes cellules ALK+ Lymphome plasmablastique Lymphome primitif des séreuses Lymphome HHV8+ associé à la maladie de Castleman multicentrique Lymphome de Burkitt Lymphome B inclassable de morphologie intermédiaire entre B diffus à grandes cellules et lymphome de Burkitt Lymphome de morphologie intermédiaire entre B diffus à grandes cellules et lymphome de Hodgkin classique Avec présentation le plus souvent leucémique : - Leucémie prolymphocytaire - Leucémie / Lymphome agressif NK (EBV+) - Leucémie / Lymphome de l adulte HTLV+ - Leucémie à grands lymphocytes granuleux - Lymphoprolifération chronique à cellules NK Avec présentation le plus souvent ganglionnaire : - Lymphome T périphérique sans autre spécification - Lymphome T angio-immunoblastique - Lymphome anaplasique à grandes cellules ALK+ - Lymphome anaplasique à grandes cellules ALK- Avec présentation le plus souvent extraganglionnaire : - Lymphome T/NK extraganglionnaire de type nasal - Lymphome T intestinal associé à une entéropathie - Lymphome hépatosplénique - Lymphoprolifération systémique EBV+ de l enfant - Lymphome d allurehydroa vacciforme Avec présentation cutanée : - Mycosis fongoïde - Syndrome de Sézary - Lymphome T sous-cutané de type panniculite - Lymphoprolifération primitive cutanée CD30+ (lymphome anaplasique à grandes cellules lymphomatoïdes) - Lymphome primitif cutané ã/ä - Lymphome primitif cutané agressif épidermotrope CD8+ - Lymphome primitif cutané à cellules petites/moyennes CD4+ Syndrome lymphoprolifératif post-transplantation Hyperplasie plasmocytaire Prolifération de type mononucléose infectieuse/ Lymphoprolifération polymorphe EBV+ / Prolifération monomorphe EBV+ ou EBV- Prolifération monomorphe post-transplantation 19

20 2,50% 1,80% 1,70% 2,40% 2,40% 1,20% Lymphome B diffus à grandes cellules Lymphome folliculaire Lymphome du MALT à cellules B de la zone marginale Lymphome des cellules T périphérique 6,00% 30,60% CLL/SLL 6,70% Lymphome des cellules du manteau Lymphome médiastinal à grandes cellules B 8% Lymphome à grandes cellules anaplasiques/ T ou nuls Lymphome de Burkitt 7,60% 22,10% Lymphome ganglionnaire de la zone marginale Lymphome lymphoblastique Lymphome lymphoplasmocytaire Figure 1 : Répartition des sous-types histologiques des LNHs de l homme (Jaffe et al. 2001) De nombreuses classifications des LNHs humains se sont succédées dans la seconde moitié du XXème siècle pour aboutir à la classification de l OMS, véritable consensus international. Elle permet de définir des entités basées à la fois sur la clinique, l épidémiologie, la morphologie et les données génétiques, et de proposer un pronostic précis. Cette classification reste ouverte pour s adapter à la découverte de nouvelles entités. 2. Classification des LNHs canins a) Evolution de la classification canine 20

21 La classification des LNHs canins présente le même intérêt qu en médecine humaine (Ponce et al ; Ponce et al. 2010). Cependant la classification histologique reste beaucoup moins avancée. Les différentes classifications canines restent des adaptations de celles utilisées pour l espèce humaine : classification de Kiel et de Kiel actualisée, et de l OMS. La classification de l OMS adaptée à l animal, publiée en 2002, utilise à la fois des critères histologiques et immunophénotypiques (Valli et al. 2002). Cette classification est basée sur le postulat que les LNHs canins trouvent leur équivalent chez l homme en termes de comportement clinique et de réponse à la chimiothérapie. Cependant cette classification se rapporte à plusieurs espèces et reste encore incomplète. La classification de Kiel actualisée reste actuellement la plus adaptée. Cette classification est basée sur la morphologie, l immunophénotype et la cellule initiale dont dérive la cellule lymphomateuse. La validation clinique de la classification de Kiel actualisée a été permise en 2004 (Ponce et al. 2004). Cette étude a mis en évidence une différence significative de survie selon le sous-type de lymphome, justifiant une classification selon des critères clinicomorphologiques. L objectif est de faire évoluer la classification de Kiel actualisée vers la classification de l OMS en intégrant des données épidémiologiques, cliniques, pronostiques et génétiques aux sous-types morphologiques canins. (Ponce et al, 2010). Une première étape a été franchie grâce à la comparaison morphologique entre les sous-types canins et humains (cf. Tableau 2). L évolution vers la classification OMS des LNHs canins passera donc par l intégration de données cliniques puis par l enrichissement progressif de la définition des sous types de lymphome grâce à l ajout de données génétiques et moléculaires b) Particularités des lymphomes canins Les lymphomes de haut grade sont majoritaires par rapport aux lymphomes de bas grade : respectivement 75.5% contre 24.5% (Ponce et al. 2010). La forme ganglionnaire est la présentation clinique la plus représentée, avec environ 82.4% des cas (Ponce et al. 2010). Les lymphomes de type B sont les plus fréquents : 64% selon Ponce et al ; 67% selon Braud Les sous-types les plus fréquents sont les lymphomes B diffus à grande cellules avec le lymphome centroblastique polymorphe représentant 37,3% des lymphomes canins (Ponce et al. 2010) Ainsi, les lymphomes T sont moins fréquents, représentant 35% des LNHs. Les sous-types les plus fréquents sont le lymphome pléomorphe mixte, le mycosis fongoïde et le lymphome lymphoblastique T. 21

22 .Classification de Kiel actualisée Lymphomes B Bas grade -Lymphome à petites cellules B -Lymphome à petites cellules lymphocytaires -Prolymphocytaire -Lymphoplasmocytaire - Lymphome des zones marginales -Centroblasto-centrocytaire Haut grade -Centroblastique monomorphe Sous type folliculaire Sous type diffus -Centroblastique polymorphe -Immunoblastique -Anaplasique/Médiastinal -Type Burkitt -Plasmocytoïde - Lymphome à petites cellules de haut grade NOS Classification OMS humaine Lymphomes B périphériques -Leucémie lymphocytaire B chronique/ ou lymphome à petites cellules lymphocytaires / ou lymphome à petites cellules B de bas grade NOS -Lymphome lymphoplasmocytaire -Lymphome des zones marginales nodal, -Lymphome des zones marginales extranodal, -Lymphome des zones marginales splénique -Lymphome folliculaire de grade I/II -Lymphome folliculaire de grade III -Lymphome diffus B à grandes cellules -Lymphome diffus B à grandes cellules -Lymphome diffus B à grandes cellules -Lymphome médiastinal à cellules B (Lymphome diffus B à grandes cellules) -Lymphome de Burkitt Pas de corrélation avec la classification OMS -Lymphome du manteau? Lymphomes T Lymphomes à cellules T précurseurs : lymphoblastique Lymphomes à cellules T matures : Bas grade -Prolymphocytaire -Pléomorphe à petites cellules -Lymphome des zones T Haut grade -Pléomorphe mixte -Pléomorphe grandes cellules -Immunoblastique -Plasmocytoïde -Lymphome agressif à cellules à grains Non classés Lymphome T cutané Lymphome T cutané bas grade Lymphome T cutané haut grade Néoplasie ni B ni T Lymphomes/leucémies à cellules T précurseurs Lymphomes/leucémies à cellules T périphériques : -Leucémie lymphoïde chronique à cellule T -Lymphome à cellules T périphériques, non précisé -Lymphome à cellules T périphériques, non précisé -Lymphome à cellules T périphériques, non précisé -Lymphome à cellules T périphériques, non précisé -Lymphome à cellules T périphériques, non précisé -Lymphome à cellules T périphériques, non précisé Lymphome T associé à une entéropathie / ou lymphome extranodal nasal Inclassables Mycosis fongoïde/syndrome de Sérazy Lymphome T cutané Leucémie à cellules NK Tableau 2 : Classification de Kiel actualisée : Corrélation possible avec la classification OMS humaine et avec la classification de Kiel actualisée des animaux domestiques (Ponce et al. 2010) 22

23 0,66% 0,66% 0,16% 1,32% 4,13% 1,64% 2,80% 3,45% Lymphome B diffus à grandes cellules Lymphome des cellules T périphériques Lymphomes T épithéliotropes cutanéomuqueux Lymphome de la zone marginale 10,69% 45,71% Lymphome T lymphoblastique Lymphome Burkitt-like 11,84% Lymphome lymphoplasmocytaire Lymphome folliculaire 16,94% Lymphome du manteau Lymphome à grandes cellules anaplasique Autres Non classés Figure 2 : Répartition des sous-types histologiques des LNHs canins (Ponce et al. 2010) c) Prévalence des lymphomes canins en fonction de la race Un risque de développement d un lymphome race-spécifique a également été étudié à partir des archives de la Veterinary Medical Database (Villamil et al. 2009). Ainsi certaines races semblent plus atteintes, on notera les races Bullmastiff [Odds Ratio 4,83 vs control], Boxer [OR 4,05 vs control] et Bouvier Bernois [OR 3,64 vs control]. Une étude menée sur 608 cas de LNHs sur le territoire français démontre l existence d une prédisposition raciale en particulier pour les races Boxer (12,94 cas/ chiens), Setter (3,82 cas / chiens), Cocker (2,96 cas/ chiens) et Berger Allemand (2,75 cas/ chiens) (Pastor et al. 2009) Au contraire, certaines races présentent un très faible risque de présenter un lymphome, tel que les races Caniche, Teckel et Pékinois [OR < 0,2 vs control] (Villamil et al. 2009). Ces données sont en accord avec les études précédemment publiées (Withrow et Vail 2007). Les données françaises attribuent aux races Caniche (0,51 cas/ chiens) et Bichon (0,47 cas/ chiens) les incidences les plus faibles (Pastor et al. 2009). 23

24 d) Prévalence des types de lymphomes selon la race La distribution du phénotype des lymphomes a été décrite comme spécifique de race (Modiano et al. 2005). Une prévalence en excès des lymphomes T est notée dans 10 races, parmi lesquelles l Irish Wolfhound, le Siberian Husky et le Shih Tzu présentent une prévalence de ce type de lymphome supérieure à 80%. Par opposition, certaines races présentent une fréquence élevée de lymphome B. On retrouve parmi celles-ci le Cocker Spaniel et le Basset Hound. Les races du groupe des Spitz (Akita, Basenji, Husky, Alaskan Malamute, etc ) et du groupe des Petits chiens asiatiques (Shih Tzu, Lhasa Apso, etc..) présentent un risque augmenté de développer un lymphome de type T. Ceci est interprété comme la conservation d une prédilection ancestrale à développer des lymphomes de type T (Modiano et al. 2005). Pastor et al. notent une forte prédisposition de la race Boxer pour les lymphomes de types T (85% de lymphomes de type T) et une forte prédisposition des races Berger allemand et Rottweiler (respectivement 83% et 92% de lymphomes de type B) pour les lymphomes de type B (Pastor et al. 2009). Comme chez l homme, la majorité des lymphomes canins sont de haut grade (environ 80%) et de type B. Il est intéressant de noter que les lymphomes de type T canins représentent au moins un tiers des LNHs pour seulement 12% chez l homme. Selon la classification de Kiel actualisée, le sous-type morphologique centroblastique polymorphe est le plus fréquemment retrouvé. Les lymphomes B centroblastiques monomorphe et polymorphe, immunoblastiques et anaplasiques présentés dans la classification de Lyon, représentent l équivalent du sous-type diffus à grandes cellules B selon la classification de l OMS. Ces ensembles représentent respectivement environ 38.5% des LNHs canins (Ponce et al 2010) et 30,60% des LNHs humains (Jaffe et al. 2001). Le lymphome folliculaire est très rare chez le chien, avec une fréquence d environ 1% (Ponce et al. 2010) alors qu on le retrouve en deuxième place en termes de fréquence chez l homme (Jaffe et al. 2001). Les classifications de lymphomes canins se sont largement inspirées des classifications humaines qui ont permis de mettre en évidence les caractéristiques histopathologiques, immunophénotypiques, épidémiologiques et cliniques des lymphomes du chien et tentent actuellement de se rapprocher de la classification de l OMS humaine La classification de l OMS humaine comprend des données cytogénétiques des lymphomes mais ce volet est, pour l instant, complètement absent des classifications canines. 24

25 II. Exploration des anomalies cytogénétiques A. Etude des anomalies cytogénétiques en médecine humaine Une anomalie chromosomique correspond à une altération d un chromosome, qui peut être structurale, avec modification de la séquence normale, ou numérique, avec aberrations du nombre de chromosomes. Le point de départ de la cytogénétique moderne fut le dénombrement correct des chromosomes humains en 1956 (Tijo et Levan 1956) à partir de cultures de fibroblastes de poumon embryonnaire. Les premières anomalies chromosomiques constitutionnelles furent découvertes à partir de 1959 avec la description des anomalies liées au mongolisme par Lejeune, au syndrome de Turner par Ford et au syndrome de Klinefelter par Jaccobs (Berger 2007) et marque le départ de longues recherches entre anomalies génétiques, dysmorphies et malformations. Le coup d envoi de l étude des anomalies cytogénétiques associées aux processus néoplasiques fut la découverte d un chromosome «minute» (Nowell et Hungergord 1960) dans les cellules de patients atteints de leucémie myéloïde chronique. Ce chromosome rebaptisé chromosome Philadelphie correspond au chromosome 22 avec une délétion partielle du bras long. L intérêt de cette découverte est que pour la première fois une anomalie cytogénétique est corrélée à un type de leucémie, laissant supposer une relation de cette anomalie avec un événement causal (Berger 2007). Cette découverte initia de nombreuses recherches de nouvelles anomalies chromosomiques. Mais aucune avancée majeure n est faite jusqu au développement des techniques de bandes chromosomiques. Il fut établi en 1973 que le chromosome Philadelphie résulte d une translocation t(9 ;22)(q34 ;q11) et plus tard que la translocation t(8 ;14)(q24 ;q32) est une anomalie récurrente dans le lymphome de Burkitt (Zech et al. 1976). En plus de cette translocation, il fut mis en évidence des translocations variantes moins fréquentes t(2 ;8)(p12 ;q24) et t(8 ;22)(q24 ;q11). Le fait que la localisation du point de cassure sur le chromosome 8 était identique dans ces trois anomalies et que le gène codant les chaînes lourdes d immunoglobulines soit situé sur le chromosome 14 a fait supposer qu il existait en 8q24 un oncogène et que les points de cassures sur les chromosomes 2, 14 et 22 impliquaient les locus des gènes codant pour les chaînes lourdes et légères d immunoglobulines (Lenoir et al. 1981). 25

26 Ces découvertes ont relancé l intérêt des biologistes moléculaires vis à vis de l identification de nouvelles anomalies chromosomiques acquises. Les progrès ont été plus rapides dans l étude des anomalies chromosomiques des hémopathies malignes que dans celle des tumeurs solides pour des raisons techniques et parce que les anomalies de ces premières sont souvent moins complexes que celles des tumeurs solides. Bon nombre d anomalies chromosomiques étaient non aléatoires ; en effet les anomalies de structures (translocation, inversion) étaient associées à des types plus ou moins spécifiques de proliférations et les anomalies de nombre étaient plus fréquentes que ne le voudrait le hasard. Les premières sont qualifiées de «primaire» pour signaler le fait qu elles sont fréquemment associées à un événement causal et les deuxièmes «secondaires» car plus inconstamment associées aux premières ou leurs succédant. Plusieurs centaines d anomalies récurrentes des cancers et hémopathies malignes sont maintenant connues (Mitelman et al. 2012) et un grand nombre d entre elles a pu être caractérisé sur le plan moléculaire. L étude et la recherche des anomalies moléculaires fait appel à des techniques de cytogénétique que nous allons développer et en particulier les techniques de cytogénétique moléculaire. B. Techniques utilisées 1. Le Caryotype a) Définitions Le caryotype représente un inventaire ordonné de l ensemble des chromosomes d une espèce. Les chromosomes sont classés par ordre décroissant de taille en fonction de la position du centromère qui délimite les deux bras du chromosome, le bras court ou p et le bras long ou q. L obtention du caryotype fut historiquement la première technique mise en place pour l observation du matériel génétique cellulaire. Pour observer les chromosomes, il est nécessaire de disposer de cellules en division (seule phase où les chromosomes sont visibles). La majorité des cellules ne se divisent pas activement dans leur tissu d origine. Les cellules à disposition doivent donc être mises en culture en laboratoire pour subir un traitement qui les amène à se diviser. Les lymphocytes sanguins sont les plus souvent utilisés : le sang total, recueilli stérilement sur héparine, est incubé 48 à 72 heures dans un milieu de culture contenant une lectine à fort pouvoir mitogène (phytohémagglutinine ou PHA). On examine généralement une dizaine de cellules, car la qualité de préparation et d étalement sur lame peut varier d une cellule à l autre. Un caryogramme est ensuite formé en réarrangeant les chromosomes par paires. 26

27 Une simple coloration au Giemsa permet alors de compter et classer les chromosomes par taille et indice centrométrique. Elle peut être complétée par une coloration en bandes. b/ Colorations en bandes Les techniques de révélation des bandes chromosomiques ont été développées à partir des années 1970 en utilisant différents traitements enzymatiques, thermiques ou chimiques et plusieurs colorants (Caspersson et al. 1968). Ces méthodes de marquage révèlent le long des chromosomes, à la suite de traitements particuliers, une alternance de bandes transversales, faiblement ou fortement colorées. Le dessin de ces bandes constitue un motif précis, reproductible et propre à chaque chromosome d une espèce donnée. Les bandes les plus utiles pour la localisation de gènes ou marqueurs le long des chromosomes sont les bandes Q, G et R. La dénomination des bandes Q (de quinacrine), G (de Giemsa) et R (de reverse) dépend du type de traitement et du type de coloration employés pour les produire, mais dans tous les cas on obtient une succession de bandes dont les motifs sont superposables (Bickmore et Summer 1989). Les bandes chromosomiques sont désignées selon des règles précises et font l objet d une convention internationale. De nombreuses révisions du système standard de nomenclature internationale sont proposées, la plus récente en 2009 (Shaffer et al. 2009). Les chromosomes sont découpés en régions délimitées par des bandes «repères» et notées de 1 à n. Les bandes à l intérieur de chaque région sont numérotées de 1 à n sur chacun des bras chromosomiques, depuis le centromère jusqu au télomère (par exemple la partie 10q12 du chromosome canin 10 se rapporte à la deuxième bande de la première région du bras long (q)). Pour obtenir un nombre de bandes supérieur, les chromosomes doivent être récoltés plus précocement, en fin de métaphase. Les bandes se subdivisent alors en sous-bandes et soussous-bandes permettant une segmentation plus fine. Cette technique permet de reconnaître : Des anomalies numériques : - Les erreurs de ploïdies : le nombre de jeu de chromosomes est anormal alors que chaque jeu est complet, - Aneuploïdie : tous les chromosomes ne sont pas présents le même nombre de fois. On peut ainsi avoir un chromosome excédentaire (trisomie) ou manquant (monosomie). Des anomalies de structure : - Des translocations réciproques : elles surviennent quand deux chromosomes échangent des segments non-homologues, 27

28 - Des translocations roberstoniennes : elles concernent deux chromosomes acrocentriques. Les cassures surviennent dans la partie proximale des bras courts et aboutissent à une fusion centrique, - Des délétions : elles peuvent être interstitielles ou terminales, - Des duplications, - Des inversions. Toutes les anomalies génétiques trop petites pour être reconnues à une définition de 550 bandes doivent être recherchées par des méthodes de cytogénétique moléculaire. 2) Cytogénétique moléculaire La cytogénétique moléculaire est née de la rencontre de la biologie moléculaire et de la cytogénétique conventionnelle, elle se situe à une échelle de résolution intermédiaire entre ces deux disciplines. Cet outil a permis de couvrir en partie un champ d'études inexploité jusque-là, en comblant l'intervalle qui existe d'une part entre la biologie moléculaire (quelques centaines de Kb) et d'autre part entre le pouvoir de résolution de la cytogénétique (environ 2 à 5 Mb). La cytogénétique moléculaire d'apparition relativement récente, dont l outil principal est l Hybridation In Situ Fluorescente (FISH) sur préparation chromosomique, a révolutionné l approche traditionnelle de la cytogénétique. Le pouvoir de résolution de la FISH (dans certaines conditions inférieur à 1Kb) permet une analyse fine de la structure des chromosomes (Delobel 2010) a) Hybridation in situ fluorescente (FISH) (1) Description de la technique (Delobel 2010) Cette méthode permet de détecter la présence ou l absence, la position et le nombre de copies d une séquence particulière d ADN. Le principe général de la FISH est illustré par la Figure 3. Les techniques d'hybridation in situ sont fondées sur la propriété de réassociation spécifique des acides nucléiques. Une sonde dénaturée (ADN simple brin marqué) en solution peut s'hybrider spécifiquement avec sa séquence cible (préparation chromosomique dénaturée) grâce à la complémentarité des bases nucléotidiques. Les sondes sont marquées soit par des procédés enzymatiques par introduction d haptènes (biotine, digoxigénine), soit par procédés chimiques (Read et Donnai 2009). Les sondes marquées par des haptènes sont révélées par immunoréaction grâce à des anticorps spécifiques couplés à des fluorochromes. Le montage peut comporter un seul anticorps (immunodétection directe) ou plusieurs anticorps superposés pour amplifier le signal 28

29 (immunodétection indirecte). La difficulté est ici d'obtenir un rapport signal/bruit satisfaisant avec un minimum de bruit de fond. La FISH nécessite un microscope à épifluorescence équipé de filtres appropriés aux nombreux fluorochromes disponibles : isothiocyanate de fluorescéine (vert-jaune), rouge Texas, rhodamine (rouge), coumarine (bleu). Les molécules émettent une lumière lorsqu'elles sont excitées par une longueur d'onde appropriée. Des filtres sont disponibles avec plusieurs bandes passantes permettant de détecter plusieurs couleurs durant la même observation. De nombreuses améliorations (sondes clonées, amélioration des solutions d'hybridation) ont permis d'obtenir une qualité et une reproductibilité remarquables. Son utilisation pratique est relativement facile et rapide. Figure 3 : Principe de l hybridation in situ sur chromosomes (FISH) (Matze 2007). (2) Indications de la technique FISH La FISH est particulièrement indiquée dans l étude des microdélétions et la caractérisation des anomalies, en particulier en cancérologie. 29

30 En effet dans le cas de tumeurs, les aberrations chromosomiques sont souvent nombreuses et complexes et d autre part les préparations chromosomiques sont souvent de qualité insuffisante pour être analysées par des techniques conventionnelles. La FISH permet la localisation des gènes anormaux (oncogènes, gènes suppresseurs de tumeurs) en vue de leur étude détaillée à l issue d un clonage moléculaire (Delobel 2010). La complexité des remaniements chromosomiques rencontrés dans les tumeurs solides et hématopoïétiques, et l'intérêt du point de vue fondamental de ces recherches dans le processus de la cancérogenèse ont amené les cytogénéticiens, spécialisés dans ce domaine, à utiliser de façon intensive les nouveaux outils basés sur le principe de la FISH et qui permettent une étude globale du génome étudié : Multi-FISH, CGH, biopuces à ADN. b) Hybridation génomique comparative (CGH) Il s agit d une appellation générique d un ensemble de techniques qui vise à comparer le nombre de copies d une séquence d ADN dans un échantillon avec celui d un ADN témoin. Cette technique permet de détecter des variations génomiques sans que la localisation de ces dernières soit connue a priori. Les sondes utilisées sont des microgouttes déposées les unes à côté des autres (d où l appellation anglaise : array signifiant rangée) ou synthétisées in situ sur un support en verre (ou puce) (Read et Donnai 2009) La CGH array (acgh) se fonde sur le principe du dot blot, réalisé en parallèle sur un grand nombre de sondes. L ADN de la sonde est fixé sur le support ou puce et les ADN tests du témoin et du patient sont marqués à l aide de 2 fluorochromes différents. La puce est ensuite plongée dans un liquide contenant dans les mêmes quantités l ADN testé et l ADN témoin. En chaque point de la puce, les deux ADN sont en compétition pour s hybrider avec les sondes. Après la phase d hybridation, un scanner pourra déterminer la quantité relative de fluorescence en chaque point. Si schématiquement l ADN testé est marqué en vert et l ADN témoin en rouge, un point apparaîtra jaune si les deux ADN se sont hybridés en quantité équivalente. Il sera plus rouge si la région du génome correspondant à la sonde est délétée chez le patient (Read et Donnai 2009). Grace aux données d analyse du génome humain, la position précise et la taille de dizaines de milliers de sondes constituées de larges fragments d ADN est connue. Une puce peut donc être conçue pour étudier une région particulière, un chromosome ou la totalité du génome. Comme chaque sonde correspond à une région parfaitement connue sur la carte du génome, les gènes présents dans le segment intéressé sont connus. Cependant cette technique ne permet pas de détecter les translocations équilibrées ou des inversions mais seulement des variations de nombre de copies. De plus cette technique a un coût élevé lié au matériel nécessaire à sa réalisation. 30

31 c) Spectral Karyotyping (SKY) Le SKY est une technique de cytogénétique moléculaire dérivée de la technique du FISH ; qui permet de visualiser chaque paire de chromosomes homologue à la fois, en les marquant dans différentes couleurs. Le SKY nécessite la préparation d une grande diversité de courtes séquences d ADN monobrin que l on nomme sondes. Chaque sonde est complémentaire d une unique région d un chromosome et toutes les sondes réunies forment un réseau d ADN complémentaire de tous les chromosomes. Chaque sonde est marquée par un fluorochrome correspondant au chromosome dont sa séquence est complémentaire. Par exemple, toutes les sondes complémentaires du chromosome 1 sont marquées en jaune, celles complémentaires du chromosome 2 en rouge et ainsi de suite. Toutes les sondes sont mises en contact avec les chromosomes d une cellule puis s hybrident avec l ADN chromosomique. Les sondes colorent ainsi l ensemble des chromosomes avec un grand nombre de couleurs. Il est alors possible de repérer les translocations et autres anomalies chromosomiques (Read et Donnai 2009). Figure 4 : Application de la technique SKY à une préparation chromosomique canine (Breen 2008a) 31

32 C. Evolution de la cytogénétique dans l espèce canine La cytogénétique canine a fait de grandes avancées durant les dix dernières années, et ce principalement grâce à l intérêt du chien en tant que modèle dans l étude de maladies et sa compatibilité comme ressource génomique (Breen 2008a). La connaissance de l'organisation du génome d'espèces d'intérêt, comme le chien, est un préliminaire indispensable pour des analyses génétiques plus poussées comme l'identification de gènes responsables de maladies héréditaires, les études génomiques comparatives et par la suite la mise en place d essais thérapeutiques, en particulier de thérapie génique (Switonski 2004). De nombreuses études comparatives de leurs génomes présument de nombreuses similitudes entre les deux espèces. Le génome du chien domestique est partagé entre les 38 paires d autosomes acrocentriques et deux chromosomes sexuels métacentriques. Jusqu'à très récemment, aucune autre donnée n'était disponible pour cette espèce. En effet, les premières espèces à bénéficier de ces travaux ont été l'homme et la Souris pour d'évidentes raisons pratiques et médicales. Dans un deuxième temps, de larges efforts internationaux ont été réalisés pour développer et produire les cartes génomiques des animaux de rente et enfin celles des animaux de compagnie. La première étape de la mise en place d une carte du génome du chien fut définie lors d une conférence à Oslo, Norvège en 1993 (DOGMAP CONSORTIUM 1999). A cette époque, les trois principaux objectifs étaient : - Standardiser le caryotype canin, - Etablir une carte cytogénétique avec au moins deux marqueurs assignés à chaque chromosome, - Développer une carte génétique canine avec des marqueurs espacés environ de 20 centimorgan (cm). 1. Développement du caryotype du chien domestique La présence de 78 chromosomes dans les noyaux de cellules du chien a été déterminée par des études sur des cellules en méiose (Minouchi 1928) et confirmée en utilisant des cultures de lymphocytes circulants (Gustavsson 1964). Le caryotype comprend 38 paires de chromosomes acrocentriques, un chromosome X submétacentrique de grande taille, et un petit chromosome Y métacentrique ; restant le plus petit élément du caryotype. La morphologie très similaire partagée par les autosomes du chien constitue un défi important pour l identification des chromosomes mise en œuvre dans les analyses cytogénétiques conventionnelles. 32

33 Figure 5 : Préparation de chromosomes en métaphase (Breen 2008a) Les chromosomes du chien sont désignés par un acronyme dérivé du nom latin de l espèce (Canis familiaris) CFA. Le plus grand autosome, ou chromosome 1 (CFA 1) mesure environ 125 Mb (Lindblad-Toh et al. 2005) et reste bien plus petit que le chromosome 12 humain. Les préparations de chromosomes non colorées (cf. Figure 5) permettent d identifier uniquement les chromosomes sexuels et les chromosomes 1 (125 Mb) et 38 (26 Mb). La reconnaissance de paires homologues est quasiment impossible du fait de la décroissance graduelle de la taille des différents chromosomes. Le développement des techniques de coloration en bandes des chromosomes au début des années 1970 a permis d identifier les paires de chromosomes homologues chez de nombreuses espèces de mammifères et a initié la mise en place d un procédé de dénombrement et de nomenclature de bandes reconnu internationalement. Un nombre important de caryotypes de chromosomes colorés en bandes a été proposé durant les 30 dernières années. Cependant, les techniques de marquage ne sont pas suffisantes pour différencier les plus petits autosomes canins. Afin d assurer une constance dans la description chromosomique, le Committee for the Standardized Karyotype of the Dog (Canis familiaris) fut établi au début des années 1990, sous la direction du Dog Map Workshop. En utilisant les techniques de cytogénétiques conventionnelles, ce comité établit un consensus sur l identification des chromosomes 1-21 et reconnut qu un caryotype complet nécessite l utilisation de la cytogénétique moléculaire (Switonski et al. 1996). Simultanément Langford et al. (1996) produisirent un panel de sondes chromosomiques pour l hybridation in situ fluorescente (FISH). Ces sondes permirent le développement d un consensus pour la nomenclature des chromosomes (Breen et al. 1999). 33

34 Un système de numérotation complet des chromosomes fut proposé plus tard et accepté par le International Society of Animals Genetics (ISAG) DogMap Workshop à Minnéapolis en juillet 2000 en combinant les différents systèmes de numérotation proposés par le Committee for the Standardized Karyotype of the Dog (Breen et al ; Switonski et al. 1996). 2. Décryptage du génome canin a) Stratégies d analyses du génome canin Le décryptage d un génome passe par l élaboration d une carte génétique et d une carte physique. Une carte génétique est une représentation simplifiée du génome qui consiste à jalonner l ensemble des chromosomes de points de repères (appelés marqueurs) et à déterminer les distances qui les séparent. L unité de mesure utilisée est le centimorgan, cm, ou unité de distance génétique qui est calculée à partir de la fréquence de recombinaison des loci pris deux à deux. La cartographie physique cherche à positionner des fragments d ADN clonés les uns par rapport aux autres et permet de déterminer une distance réelle en nucléotides entre les clones. Les points de repères sur la molécule d ADN sont des séquences particulières et les distances exprimées en paires de bases. (1) Relation entre carte génétique et carte physique L intégration de la carte physique et de la carte génétique d un même génome consiste à placer de nombreux points de repères sur les deux cartes. La difficulté réside dans le fait que les deux cartes utilisent deux systèmes de mesures non colinéaires. L intérêt de disposer à la fois de cartes génétiques et physiques d un même génome est de : - à partir de la position de locus intéressants sur la carte génétique, donner un accès facilité aux gènes correspondants, - ou à l inverse, obtenir la position génétique d une séquence d ADN quelconque. 34

35 Marqueurs génétiques Carte génétique (cm) Carte physique (Mpb) Banque d ADN génomique (BAC, YAC ) Cgtgtctcgaagtcatcagcttttaacc..ctgaaagtcgagtctgtctagcgtcg Séquence d ADN Figure 2 : Relations entre séquence d ADN, Carte physique et Carte génétique (Tagu et al. 1999) (2) Etablissement d une carte génétique (i) Réalisation et intérêt d une carte génétique La carte génétique a pour but de placer les gènes les uns par rapport aux autres. L établissement d une carte génétique doit passer par 3 grandes étapes (Gellin et Chevalet 1994) : - la constitution d un réseau homogène de marqueurs génétiques polymorphes. Le niveau des liaisons entre marqueurs est quantifié par une distance génétique calculée à partir de la fréquence des recombinaisons (ou crossing-over) qui se produisent entre les chromosomes homologues lors de la gamétogénèse, - la mise en évidence et la localisation de gènes par hybridation in situ, - la caractérisation de ces gènes. La localisation des gènes par des méthodes d hybridation peut se faire selon deux stratégies majeures : - l hybridation in situ fluorescente (FISH), - l utilisation d hybrides d irradiation. 35

36 (ii) Description de la technique d hybrides d irradiation Les cartes d hybrides d irradiation ou RH pour l anglais «radiation hybrids» reposent sur l analyse de la fréquence des cassures chromosomiques induites artificiellement observées chez des hybrides d irradiation. Ces hybrides sont obtenus à partir des cellules donneuses lourdement irradiées qui fusionnent à des cellules receveuses de hamster ou de souris (cf. Figure 7). Rayons X Fibroblaste Canin Cellule de Hamster FUSION Hybride d irradiation Figure 7 : Schéma des mécanismes d élaboration d hybrides d irradiation (Chantry-Darmont 2005) Au cours de leur prolifération en culture, les clones de cellules hybrides perdent aléatoirement des chromosomes de la lignée primaire donneuse, alors que les chromosomes de la lignée receveuse sont conservés. Une collection de clones de cellules hybrides contenant chacun une combinaison différente de chromosomes de la lignée donneuse est ainsi obtenue (Chantry-Darmont 2005). L ADN de chacun des clones est extrait et l ensemble des ADN constitue la collection d hybrides. Les collections d hybrides sont analysées par PCR avec ces amorces spécifiques de marqueurs connus. Les cellules d hybrides d irradiation possèdent des fragments chromosomiques très remaniés, d autant plus que la dose d irradiation de départ est élevée (3000 à Rad). 36

37 Les distances calculées sont exprimées en centirays (cr), avec 1 cr(nrad) qui correspond à une fréquence de cassure de 1 % entre deux marqueurs dans une collection construite avec une dose d irradiation de N Rad de rayons X (Chantry-Darmont 2005). L'équivalence avec la distance physique réelle n'est pas stricte et dépend de l'intensité d'irradiation et du nombre de lignées. Ainsi 1cR pour 3000 rad équivaut à 200 kb et 1cR pour 9000 rad équivaut à 55 kb. (iii) Historique du développement des cartes génétiques chez le chien Diverses cartes génétiques ont été proposées durant la fin des années Ces cartes sont basées soit sur l utilisation de l hybridation in situ fluorescente, soit sur celle des hybrides d irradiation. (α) Hybridation in situ fluorescente (FISH) L hybridation moléculaire in situ permet la localisation de sondes d ADN sur les chromosomes. Jusqu en 2001, environ 300 marqueurs génétiques sont répertoriés sur les chromosomes canins (Breen et al. 2001). La grande majorité d entre eux est constituée de clones de BAC arborant des microsatellites. Cependant le nombre de gènes cartographié reste relativement faible, soit moins de 80 gènes. Plus récemment, de nouvelles localisations ont été décrites (Switonski 2004). Chaque chromosome possède actuellement au moins un marqueur assigné par FISH. Cependant le nombre de marqueurs varie de 40 pour le chromosome X à un unique marqueur pour le CFA- 32. Les plus petits chromosomes (CFA -32 à 38) ne sont que peu cartographiés par rapport à ceux de grande taille. (β) Carte d hybrides d irradiation La première étape de l élaboration des cartes d hybrides d irradiation fut d établir des panels d hybrides d irradiation pour l ensemble du génome ou WGRH (pour whole-genome radiation hybrid). Le premier panel fut établi à partir de fibroblastes canins irradiés avec 5000 rads puis fusionnés avec des cellules de hamster (Vignaux et al. 1999). Ce panel, composé de 126 collections d hybrides d irradiations, permit d établir la première carte RH (Priat et al. 1998). Cette carte comprend 400 marqueurs et la distance moyenne entre chaque marqueur est de 23 crays. La cartographie de ces marqueurs couvre environ 80% du génome. 37

38 Plusieurs cartes furent ainsi proposées avec un nombre de marqueurs croissant : 1800 marqueurs (Breen et al. 2001); marqueurs (Guyon et al. 2003) et 4249 marqueurs (Breen et al. 2004). Une carte à haute densité comprenant plus de marqueurs est élaborée un an plus tard (Hitte et al. 2005). Ces marqueurs correspondent à des gènes canins identifiés à partir d'un séquençage aléatoire, et pour lesquels les gènes orthologues (deux gènes sont orthologues s'ils sont homologues et déviés d'une spéciation) humains étaient tous identifiés. Résultat de la collaboration internationale de quatre laboratoires, ce travail a utilisé un nouveau panel d'hybrides d'irradiation plus résolutif (cellules canines irradiées à rads). Cette carte de haute densité a apporté beaucoup d éléments en cartographie comparée entre le chien et l homme. De plus, cette carte haute densité a servi de trame pour l assemblage de la séquence du génome canin publié en (3) Etablissement d une carte physique (i) Réalisation d une carte physique L établissement d une carte physique consiste à reconstruire un génome en un ensemble ordonné de fragments d ADN comme ils sont ordonnés sur les chromosomes. Les vecteurs de clonage utilisés sont de type cosmide, BAC (Bactérial Artificial Chromosome) ou YAC (Yeast Artificial Chromosome). Ces vecteurs permettent l intégration de grands fragments d ADN. En pratique, l élaboration de la carte passe par le «balisage» de chaque clone par des marqueurs, si possible ceux utilisés dans la carte génétique. On peut ainsi ordonner les clones entre eux afin de retrouver leur agencement initial sur le chromosome. (ii) Développement d une carte physique chez le chien La mise au point de ces cartes est passée par la réalisation de banques de BAC. La première construite fut RPCI-81 (Li et al. 1999) à partir d un Doberman mâle et représente une couverture 8.1X du génome avec une taille moyenne de segment de 155kb. Un grand nombre de ces clones furent utilisés pour déterminer la localisation cytogénétique de gènes d intérêt ou associés à une maladie. Les clones de la bibliothèque BAC RPCI-81 ont également été utilisés pour générer un panel de sondes FISH spécifiques de chromosomes. Une sélection de 41 clones fut décrite (Thomas et al. 2003) et permit d identifier chaque chromosome canin par la position de la fluorescence sur les chromosomes. De plus, toujours à partir de cette bibliothèque, un groupe de 80 clones BAC, assemblés en groupe de 1 à 3 clones par chromosome canin, fut développé et autorise l identification simultanée de tous les chromosomes du chien en une seule hybridation (Courtay-Cahen et al. 2007). 38

39 Une seconde bibliothèque BAC fut construite à partir d une femelle Boxer, nommée Tasha. Cet assemblage contient environ clones avec une taille moyenne de fragments de 172 Kpd. Cette bibliothèque a été utilisée pour le premier séquençage du génome canin (Mellersh 2008). b) Séquençage du génome canin (1) Demande de financement par la communauté scientifique La communauté scientifique canine avait produit en juin 2002 un «livre blanc» à l intention du National Institute of Health (NIH) en faveur d une analyse de la séquence du génome canin (Ostrander et al. 2002). Trois arguments forts y étaient avancés, plaidant pour cette nécessité: - L interprétation de la séquence du génome humain nécessite la réalisation de nombreuses expériences de biologie qui doivent s appuyer sur des prédictions et des hypothèses de travail compte tenu de l importante «hétérozygotie» des populations humaines ; seule la comparaison des séquences de plusieurs génomes de mammifères et d espèces placées sur des branches phylogénétiques différentes peut les produire, - Le chien offre une diversité phénotypique et comportementale incomparable, dont il est extrêmement intéressant de mettre en évidence l origine en termes de gènes et d allèles, - Le chien paye un lourd tribut aux maladies génétiques simples et complexes et, de ce point de vue, cette espèce offre un modèle biologique différent et complémentaire d étude. (2) Premier séquençage complet du génome d un chien Dès 2003, le chien est le premier animal domestique de compagnie à avoir bénéficié d un séquençage léger de son génome. Le génome d un caniche mâle a été séquencé à une profondeur de 1,5X ce qui signifie que chaque nucléotide est séquencé en moyenne 1,5 fois (Kirkness et al. 2003). Un fort investissement financier du NIH, soit environ trente millions de dollars américains, a permis l accumulation de connaissances sur le génome canin et a permis la construction d une carte à haute résolution (Hitte et al. 2005). Le génome analysé par le Whitehead Institute (Cambridge, MA, USA) est celui d un boxer femelle, Tasha (Lindblad-Toh et al. 2005). En effet, le choix de la race boxer résulte de travaux préalables (Parker et al. 2004) ayant démontré le faible taux d hétérozygotie de cette race. Cette sélection permit de réduire au maximum les problèmes d assemblage des quelques 35 millions de séquences produites. La possibilité de disposer de deux copies du chromosome X renforce l intérêt de travailler à partir d un organisme femelle, au détriment du séquençage du chromosome Y. 39

40 Figure 3 : Tasha, la femelle Boxer, dont l ADN a été utilisé pour le projet financé par le NHI pour séquencer le génome canin complet (Mellersh 2008). Ce séquençage a été réalisé par la méthode dite «shotgun». Il s'agit d'une méthode de séquençage d ADN génomique initialement imaginée dans le laboratoire de Frederick Sanger à Cambridge à la fin des années 1970 pour séquencer les premiers génomes de virus. La première application fut le séquençage de génomes bactériens, puis du génome de la drosophile et enfin du génome humain et murin. Pour réaliser un séquençage de génome complet à l'aide de cette technique, deux à trois banques composées de fragments aléatoires d'adn génomique sont réalisées. Entre les banques, les fragments divergent aussi bien en taille qu'en localisation sur le génome. À partir de ces banques, de nombreux clones sont séquencés puis assemblés. La séquence totale est obtenue en traitant l'ensemble des banques à l'aide d'outils bio-informatiques, en alignant les fragments à l'aide des séquences chevauchantes. ADN Figure 4 : La méthode Shotgun L ADN est fragmenté au hasard. Chaque fragment est amplifié puis séquencé. La séquence totale est reconstituée grâce aux chevauchements recherchés par bioinformatique. CAATGCATTA ATGCTACAATGC Fragments Séquences 40

41 Les avantages par rapport au séquençage par ordonnancement hiérarchique sont la rapidité de la technique et un coût plus faible. L'inconvénient est que le traitement informatique ne permet pas d'aligner des fragments comportant des séquences répétées de grande taille qui sont fréquemment présentes dans les génomes des mammifères. Cette méthode est couramment désignée sous le nom de shotgun (fusil à canon scié), ou encore Whole Genome Shotgun (WGS). Cette métaphore illustre le caractère aléatoire de la fragmentation initiale de l'adn génomique : on «arrose» tout le génome, un peu comme se dispersent les plombs de ce type d'arme à feu. (3) Caractéristique du génome canin Le séquençage du génome du chien a engendré 36 millions de séquences qui ont, ensuite, été assemblées par le programme ARACHNE (Batzoglou et al. 2002). La taille totale du génome canin est déterminée à 2,41 Gb dont 2,38 Gb de séquences nucléotidiques, les 1% restant correspondant à des vides de séquence ( gaps ). Le processus d assemblage a été facilité par la mise à disposition des cartes du génome. En effet, les cartes RH développées (Breen et al ; Hitte et al. 2005) ont, d une part, servi d ossature à l assemblage des milliers de contigs générés, et d autre part, ont permis de guider l orientation des supercontigs le long des chromosomes. La taille du génome canin est sensiblement inférieure à celle de l homme. Ceci s explique, en partie, par la plus faible présence de séquences répétées spécifiques à la lignée canine (334 Mb vs 609 Mb pour l homme). On a estimé qu'au moins 650 Mb de séquences d'adn du génome canin coïncidaient de façon unique avec des séquences du génome humain, avec notamment des fragments de probables gènes orthologues pour des gènes humains, ce qui confirme l intérêt que suscite l espèce canine comme modèle en génétique. (4) Cartes de synténie En 1971, J.H. Renwick introduit le terme de synténie, étymologiquement sur le même brin, pour désigner des loci localisés sur le même chromosome. En génomique comparative, ce terme décrit des régions chromosomiques conservées entre plusieurs espèces. Pour des espèces relativement proches au niveau phylogénétique, l organisation spatiale des gènes au sein de ces régions est souvent conservée en blocs au cours de l évolution. Si l ordre comparé des gènes entre deux génomes est linéaire (colinéarité), on parle alors de segments conservés ordonnés (CSO pour Conserved Segment Ordered) (O Brien et al. 1999) ou segments synténiques (Waterston et al ; Gibbs et al. 2004). Plus généralement, des régions 41

42 contiguës entre deux génomes, où l ordre des gènes peut être altéré, seront définies par le terme de segments conservés (CS pour Conserved Segment) ou blocs de synténie. Des réarrangements chromosomiques peuvent survenir au cours de l évolution aboutissant à des altérations de l ordre des gènes entre deux génomes appelées ruptures de synténie. En se basant sur la méthode d'identification des blocs de synténie développée par Pevzner (Pevzner et al. 2003), les auteurs ont construit des cartes de synténie multi-espèces comprenant les génomes du chien, de l homme, de la souris et du rat. Tous les segments conservés (reflétant les réarrangements inter-chromosomiques) et les segments conservés ordonnés (correspondant aux réarrangements intra-chromosomiques) d une taille supérieure à 0,5 Mb ont été identifiés. Ainsi, 183 CSs et CSOs sont synténiques entre les génomes canin et humain alors que plus de 260 CSs- CSOs sont recensés entre les génomes humains et murins. Ces résultats confirment le fort taux de réarrangements spécifiques de la lignée des rongeurs, préalablement mis en évidence lors du séquençage du génome de la souris (Waterston et al. 2002). De manière intéressante, le nombre de cassures intra-chromosomiques est plus faible chez l homme (83) comparé aux autres génomes du chien, du rat et de la souris (respectivement 100, 161 or 176). Les régions de cassures chromosomiques sont significativement associées à une composition de séquence particulière avec un fort taux de divergence nucléotidique (comparé à des séquences ancestrales) et un fort taux de G+C. La découverte des anomalies cytogénétiques et leur mise en relation avec certaines affections en particulier avec des cancers a conduit au développement de la cytogénétique humaine dans les années Basée initialement sur l utilisation des caryotypes associés à des techniques de colorations en bandes, cette discipline a connu un essor remarquable grâce au développement de la cytogénétique moléculaire, avec en chefs de files les techniques FISH et CGH. Ces techniques ont été utilisées dans un second temps pour l étude du patrimoine génétique canin. Ces recherches ont été permises grâce à l émergence de la génomique comparée et largement financées par les organismes nationaux de la santé humaine en particulier américains. Dans les années 2000, la standardisation du caryotype canin (Breen et al. 1999) a précédé le séquençage complet du génome canin (Lindblad-Toh et al. 2005). Le développement des techniques cytogénétiques et de génomiques comparées a permis l étude des anomalies cytogénétiques chez l espèce canine. Les hémopathies malignes sont historiquement connues pour être porteuses d anomalies cytogénétiques. Ces dernières sont particulièrement bien étudiées dans les LNHs de l espèce humaine et prennent une part importante dans la classification de l OMS de

43 III. Anomalies cytogénétiques associées aux LNHs humains Les classifications actuelles des lymphomes non hodgkiniens humains soulignent l importance d un abord pluridisciplinaire. Le diagnostic et le pronostic résultent de la confrontation des données cliniques, immunologiques, morphologiques et génétiques. Par ailleurs, comme nous l avons vu précédemment l analyse cytogénétique des tumeurs malignes révèle leurs caractères acquis, clonaux et limités à la tumeur. Dans les LNHs, l analyse cytogénétique a largement participé aux démembrements de groupes hétérogènes en entités distinctes. Environ 90% des lymphomes humains américains sont de phénotype B, alors que seulement 10% sont de phénotype T ou nul (Morton et al. 2006). Comme la plupart des syndromes lymphoprolofératifs malins, les LNHs sont porteurs de réarrangements des gènes des récepteurs à l antigène, les gènes d immunoglobulines pour les lymphomes B et les gènes du récepteur T à l antigène ou TCR pour les lymphomes T. Dans les lymphomes B, l implication des gènes d immunoglobulines dans un certain nombre de translocations récurrentes représente également un mécanisme majeur dans l initiation tumorale par le biais d un mécanisme nommé «substitution de promoteur». A. Translocations chromosomiques : Les translocations chromosomiques sont les anomalies cytogénétiques les plus fréquemment retrouvées dans les cas d hémopathies malignes (Kuppers 2005). Elles correspondent à un échange de matériel chromosomique entre des chromosomes non homologues. Environ 90% des cas de lymphomes et plus de 50% de ceux de leucémies présentent des translocations (Lobato et al. 2008). Cependant, un grand nombre de cancers peuvent porter des translocations chromosomiques récurrentes qui sont aujourd hui bien définies et fichées (Sanger Institute 2012). Ces anomalies nécessitent certaines conditions à leur apparition : - La formation de lésions double brins (DSBs pour double strand DNA break) sur des chromosomes séparés, - La proximité spatiale des embouts lésés (au moins de façon transitoire), - La liaison des embouts d ADN provenant de chromosomes hétérologues. 43

44 Les translocations chromosomiques non aléatoires impliquant les gènes des immunoglobulines (Ig) ou le TCR et des oncogènes partenaires sont la marque de fabrique des tumeurs lymphoïdes (Kuppers 2005). Ces translocations sont considérées comme des erreurs durant les réarrangements physiologiques des gènes codant pour les immunoglobulines et le TCR. Ces réarrangements font partis du processus de maturation des lymphocytes T et B. 1. Les réarrangements normaux durant la maturation a) Mécanismes de réarrangement des gènes des immunoglobulines (Ig) et de leur produit Les immunoglobulines assurent des fonctions uniques et peuvent reconnaître une quasi-infinité d antigènes (le nombre de ces derniers est estimé à ). Pour cela les gènes codant pour les Ig subissent des réarrangements pendant la maturation des lymphocytes. Ce processus est connu sous le nom de recombinaison somatique de l ADN. Il s agit de modifications très finement régulées et qui constituent une étape indispensable pour obtenir une expression normale de ces gènes. Ces réarrangements n ont lieu que dans les cellules de la lignée lymphoïde et l ADN des immunoglobulines reste donc en configuration germinale dans toutes les autres lignées cellulaires. (1) Structure des Immunoglobulines : Les Ig se caractérisent par une structure globuleuse contenant des domaines, c'est à dire des zones de repliement de la séquence indépendantes sur le plan structural et fonctionnel. La synthèse d'une protéine de type Ig résulte de l'assemblage de plusieurs gènes pour former une chaîne comprenant plusieurs domaines. La structure de base des immunoglobulines est un complexe de 4 chaînes protéiques identiques 2 à 2 (2 chaînes H =Heavy et 2 chaînes L=Light κ ou λ), fixées par des ponts disulfure inter et intra-caténaires. Chaque chaîne d'ig contient des domaines constants et variables (Lefranc et Duprat 2010). On identifie 2 régions distinctes sur chaque anticorps (en les fractionnant à l aide d enzymes.): - la région Fc ("fragment cristallisable") contient les domaines constants, et assure des fonctions communes à tous les anticorps, - la région Fab ("antigen binding fragment") contient des domaines constants et variables, et fixe l'antigène. 44

45 Région variable Région constante Fc Fab Fab Figure 10 : Structure générale d une immunoglobuline : Organisation en sous unités (Lefranc et Duprat 2010) Chez l'homme, les gènes des chaînes lourdes (locus IGH), les gènes des chaînes légères κ (locus IGK) et les gènes des chaînes légères λ (locus IGL), sont respectivement situés sur les chromosomes 14q32.3, 2p11.2 et 22q11.2. La synthèse des immunoglobulines nécessite des réarrangements des gènes des locus H, κ et λ durant la différenciation des lymphocytes B. Chronologiquement, dans les cellules pré-b, la biosynthèse de la chaîne lourde précède celle de la chaîne légère. (2) Synthèse des chaînes légères et lourdes (Bach et Chatenoud 2002) (i) Réarrangement de la chaîne légère κ Le locus de la chaîne légère κ possède l organisation la plus simple (cf. Figure 11). En effet, l ADN codant la région variable est séparé en 2 segments : le segment et le segment Le segment code la plus grande partie de la région variable (environ acides aminés N-terminaux). Chez le lymphocyte pro-b, il existe une quarantaine de copies fonctionnelles disposées dans la partie du locus de la chaine κ. Chaque segment est précédé d un exon individualisé codant le peptide signal permettant la translocation de la chaîne protéique naissante. Le segment code les acides aminés restant de la partie variable (à la jonction avec la région constante). On en retrouve 5 copies dans le locus de la chaine κ dont 4 sont fonctionnelles. La région constante est codée par un exon unique. 45

46 Les segments sont dispersés sur une grande distance, tandis que les segments et sont physiquement proches. Lors de la différenciation lymphocytaire B, l un des segments se rapproche d un des 5 segments pour ne former qu un seul segment génique codant la totalité de la région variable. Suite à la recombinaison somatique, tout l ADN intermédiaire est excisé et irrémédiablement perdu. Ainsi le gène fonctionnel de la chaîne possède le segment génique réarrangé, les segments en aval, l intron entre et et l exon. Il s agit du gène qui sera transcrit, puis épissé de façon à disposer en continuité les segments dans l ARN messager mature. Cellule souche 5 3 Recombinaison somatique Lymphocyte B : gène fonctionnel 5 3 Transcription Transcrit primaire 5 Poly A Epissage de l ARN ARN messager 5 Poly A Traduction Préprotéine Maturation protéique Chaîne légère κ mature Figure 11 : Réarrangement du locus de la chaîne κ (Bach et Chatenoud 2002) 46

47 (ii) Réarrangement de la chaîne légère λ Le gène fonctionnel de la chaîne λ suit le même principe de réarrangement en mettant en rapport un segment créant un ensemble codant pour le domaine variable de la chaîne λ. Seule l organisation du locus λ diffère légèrement. Ainsi il existe une quarantaine de copies fonctionnelles de segments disposée dans la partie du locus de la chaine λ. Les segments géniques et les exons sont appariés ensemble : il existe sept couples - mais seulement quatre d entre eux sont fonctionnels. (iii) Réarrangement du locus de la chaîne lourde Le domaine variable de la chaîne lourde est codé par 3 segments. Entre les 2 segments V et J se place un troisième segment D, dit de diversité. L organisation du locus de la chaîne lourde ressemble à celle de la chaîne κ. En allant de l extrémité 5 vers l extrémité 3, on retrouve une succession de gènes dont une cinquantaine sont fonctionnels, les segments au nombre d une trentaine, 6 segments regroupés et proches des segments codant la région constante. Les segments sont précédés d un exon codant un peptide signal propre. Lors du réarrangement du locus de la chaîne lourde, deux étapes de recombinaison se succèdent. La première recombinaison permet d assembler les segments et tandis que la seconde met en continuité le segment et. Cette succession de recombinaison permet d obtenir un gène fonctionnel qui est transcrit selon les mêmes étapes que pour le locus des chaînes légères. (iv) Les séquences signal de recombinaison (SSR) Les séquences nucléotidiques encadrant les segments géniques V, D, J sont très conservées. Il s agit de motifs composés d un heptamère palindromique (CACTGTG), séparé par une séquence intercalaire d un nonamère palindromique (ACAAAAACC). La séquence intercalaire possède une composition nucléotidique très variable mais sa longueur est précisément de 12 ou 23 nucléotides (cf. Figure 12). Le motif formé par l association d un heptamère, une séquence intercalaire et d un nonamère est nommée séquence signal de recombinaison (SSR). La recombinaison somatique ne peut avoir lieu qu entre un segment flanqué d un heptamère séparé par une séquence intercalaire de 12 nucléotides du nonamère et un segment dont l heptamère et le nonamère sont séparés par une séquence de 23 nucléotides. On parle de la règle dite de «12/23». Les segments et étant bordés par des séquences intercalaires de 47

48 23 pb et les segments par des séquences de 12 pb, le locus de la chaîne lourde ne peut pas donner lieu à des réarrangements VJ, DD. Lors d un réarrangement, l ADN est clivé sur les 2 brins précisément au niveau des heptamères. Les deux brins des extrémités codantes forment une boucle d épingle à cheveux et du côté des heptamères, les deux extrémités se lient pour former un cercle qui sera dégradé. Locus de la chaîne légère κ : heptamère 12 nonamère nonamère 23 heptamère CACAGTG ACAAAAACC GGTTTTTGT CACTGTG Locus de la chaîne légère λ : heptamère 23 nonamère nonamère 12 heptamère CACAGTG ACAAAAACC GGTTTTTGT CACTGTG Locus de la chaîne lourde : heptamère 23 nonamère nonamère 23 heptamère CACAGTG ACAAAAACC GGTTTTTGT CACTGTG CC nonamère 12 heptamère heptamère 12 nonamère GGTTTGGGG G CACAGTG CACTGTG CC TCAAAAACC Figure 12 : Organisation des séquences signal de recombinaison (SSR) selon le locus de la chaîne concernée (Bach et Chatenoud 2002) Les recombinaisons mettent en jeu un complexe enzymatique dont tous les composants ne sont pas encore connus. Les protéines CC RAG-1 et RAG-2 (pour recombination-activating gene), Ku70, Ku86 et la protéine kinase ADN-dépendante sont des acteurs de la recombinaison somatique. 48 CC

49 (v) Système de régulation de la recombinaison somatique Les recombinaisons des segments géniques V, D et J sont responsables de l immense diversité des immunoglobulines et des récepteurs à l antigène des lymphocytes T. Les gènes d activation de recombinaison (Complex RAG : Rag-1 et Rag-2) reconnaissent les séquences signal de recombinaison (SSR) adjacentes aux séquences codantes à joindre et s y lient (Lieber 2010). Elles sont alors rapprochées, le complexe RAG est activé et coupe un des brins de l ADN précisément à l extrémité des séquences heptamétriques (cf. Figure 13). L extrémité 5 du brin d ADN, dégagé par ce clivage, entreprend une réaction chimique avec le brin opposé et non coupé, rompant ce brin pour obtenir d une part une lésion double brin d ADN (DSBs) précisément à l extrémité de la séquence heptamétrique, et d autre part une épingle à cheveux d ADN reliant l extrémité coupée avec son brin d ADN complémentaire (Charles et al. 2001). Ces lésions de l ADN sont traitées par la machinerie de réparation de l ADN non-homologous end joining (NHEJ), qui se compose d un grand nombre de protéines tel que Ku70:Ku80, les protéines-kinase dépendantes de l ADN, Artemis, XLF/Cernunnos, XRCC4 et l ADN ligase IV. Ainsi, grâce à l action de protéines supplémentaires indispensables, telle que Ku70 :Ku80 qui se fixent au complexe, le long des protéines RAG, l épingle à cheveux est clivée au hasard et libère une extrémité d ADN double brin. Cette extrémité est modifiée par la TdT (déoxynocléotidyl-transférase terminale) et l exonucléase, qui créent de façon aléatoire des extrémités diverses et imprécises. Finalement, sous l action de l ADN-ligase IV, les deux séquences heptamétriques qui n ont pas été modifiées se liguent pour former le signal de jonction précis, tout comme les segments de gènes pour former la jonction codante. (3) Réarrangement intervenant dans les centres germinatifs (i) L hypermutation somatique Ce processus de diversification du répertoire concerne des gènes d immunoglobulines déjà réarrangés au sein de lymphocytes différenciés et activés par la rencontre avec l antigène. Il consiste en des mutations ponctuelles sur les segments codants les régions variables des chaînes lourdes et légères et de façon préférentielle les régions hypervariables. Le mécanisme de ces mutations n est pas connu. Ces mutations s accumulent de façon considérable au fur et à mesure du développement de la réponse immune et permettent une augmentation de l affinité des anticorps vis-à-vis de l antigène. Ce phénomène, aussi appelé maturation d affinité, a lieu dans les centres 49

50 germinatifs, ou follicules secondaires, des ganglions lymphatiques. Il aurait ainsi pour finalité la sélection positive des régions variables les plus affines pour l antigène mais également la sélection négative des anticorps exprimant une spécificité indésirable. (1) Les complexes protéiques RAG(en bleu) se lient à des séquences signal de recombinaison (SSR) espacées de 12 et 23 pb (flèches vertes et jaunes) (2) Les complexes protéiques se lient l un à l autre et rapprochent les segments à joindre (3) L ADN est clivé pour créer des structures en épingle à cheveux aux extrémités des segments de gènes des immunoglobulines (4) D autres protéines symbolisées en rouge (Ku70 :Ku80, XRCC4 et des protéines-kinases dépendantes de l ADN) se lient aux structures en épingle à cheveux et aux extrémités des SSR clivées (5) Les structures en épingles à cheveux sont clivées au hasard. Des bases supplémentaires peuvent être ajoutées par la TdT ou éliminées par une exonucléase au niveau des extrémités imprécises générées (6) L ADN-ligase IV relie les extrémités des segments de gènes pour former la jonction codante et les extrémités des SSR pour former le signal de jonction Figure 13 : Les étapes enzymatiques des réarrangements des segments géniques des immunoglobulines (Charles et al. 2001) (ii) Commutation isotypique La séquence du gène codant de la région variable n est plus modifiée, une fois les réarrangements des segments V, D, J effectués, à l exception des mutations ponctuelles dues à l hypermutation somatique. En revanche, des régions constantes différentes correspondant 50

51 aux différents isotypes peuvent être associées successivement à une même région variable dans un clone lymphocytaire : il s agit du phénomène de commutation isotypique. L ADN codant les régions constantes est situé en aval de celui codant les régions variables des chaînes lourdes. La commutation isotypique met en jeu un processus de recombinaison somatique semblable à celui des segments V, D et J. Les signaux de reconnaissance permettant la recombinaison, ou région «switch», sont des séquences homologues répétitives de motifs simples situées en amont de chacun des gènes codant pour un isotype. La recombinaison prend place entre la séquence «switch» et celle de l isotype vers lequel la commutation s opère. Elle s accompagne de la perte irréversible de tout l ADN intermédiaire. La commutation isotypique n est observée que pour la chaîne lourde et ne concerne pas les chaînes légères. b) Mécanismes de réarrangement des récepteurs pour l antigène des lymphocytes T (TCR) Les lymphocytes T jouent un rôle central dans la réponse immune. Ils interviennent au niveau de la reconnaissance de l antigène et de la phase effectrice. Pour la reconnaissance antigénique, les lymphocytes T possèdent des récepteurs membranaires spécialisés. Ils possèdent de nombreuses similitudes avec les immunoglobulines mais aussi des différences fondamentales comme le mode de reconnaissance des antigènes. En effet les immunoglobulines sont capables de reconnaître des multitudes de structures, protéiques ou non, de tailles très variables (de l haptène au complexe multimoléculaire de plusieurs centaines de KDa). Tandis que les lymphocytes T reconnaissent des peptides de petite taille (8 à 15 acides aminés) présentés par les molécules du complexe majeur d histocompatibilité présents à la surface des cellules présentatrices d antigène. (1) Structure des TCR : La structure de l'hétérodimère TCR en domaines est caractéristique des protéines appartenant à la superfamille des Ig. Il existe ainsi quatre chaînes pouvant composer le récepteur T : α, β, γ et δ. Elles présentent une organisation similaire de leur structure primaire, avec un domaine variable et un domaine constant. Les différentes chaînes s associent pour former deux types de récepteurs à l antigène : le récepteur αβ et le récepteur γδ. 90 à 95 % des lymphocytes T périphériques expriment les TCR αβ dans les conditions normales. Ce récepteur permet la reconnaissance simultanée de l antigène et du CMH qui le présente. 51

52 On retrouve les récepteurs γδ sur une population de lymphocytes particulière, ce sont des lymphocytes T exprimant CD3 mais aucun des marqueurs CD4 ni CD8. Ils forment une lignée T CD3/ γδ avec une localisation épithéliale majoritaire. Leur rôle n est pas parfaitement connu mais l hypothèse principale est qu ils joueraient un rôle de défense de première ligne face aux antigènes extérieurs. (2) Organisation et réarrangement des gènes du récepteur T Les gènes codant pour chacune des chaînes des TCR présentent une organisation similaire entre eux. Un réarrangement somatique est nécessaire pour assurer leur fonctionnalité, cet élément est caractéristique des gènes de récepteurs des cellules lymphoïdes. Il se déroule pour la lignée T dans le thymus. Chez l homme, les gènes du TCR sont retrouvés sur différents chromosomes, 7q35 et 7p14 pour les locus β et γ, tandis que le gène δ est encastré à l intérieur du locus de la chaîne α sur le chromosome 14q11-q12. Une fois réarrangé, le gène devenu fonctionnel est composé d une partie variable en amont et constante en aval. La partie variable résulte en fait de l assemblage de deux ou trois segments géniques : V, D (pour Diversité) et J (pour Jonction) uniquement pour les chaînes α et δ (Bach et Chatenoud 2002). En configuration germinale, ces 3 segments sont séparés par de grandes distances. Le réarrangement somatique s accompagne de l excision et donc la disparition du matériel génétique intermédiaire. L organisation des loci des chaînes est très ressemblante de celle des gènes des immunoglobulines mais elle présente quelques particularités. La plus remarquable reste l insertion du locus de la chaîne δ au sein de celui de la chaîne α, entre les segments et. Les segments sont ainsi dispersés parmi les segments. Le réarrangement est initié dans une cellule progénitrice commune aux lymphocytes αβ et γδ. Les loci γ, δ et β se réarrangent en premier simultanément. Ainsi si les réarrangements des gènes γ et δ forment un récepteur γδ fonctionnel, le précurseur s engage dans la lignée γδ. De même, en cas de réarrangement efficace de la chaîne β, la chaîne est synthétisée et peut s apparier avec un substitut invariant de la chaîne α. Cette association engage la cellule dans la lignée αβ, en stoppant le réarrangement du locus de la chaîne β et en déclenchant celui de la chaîne α. Le locus de la chaîne γ est alors excisé (Bach et Chatenoud 2002). De par sa faculté de présenter une grande variété de récepteurs de reconnaissance de l antigène, les gènes codant pour les immunoglobulines et les TCR suivent de nombreux remaniements durant le processus de maturation des lymphocytes. Cependant des erreurs durant les processus physiologiques de réarrangement peuvent aboutir à des aberrations chromosomiques à fort pouvoir oncogène. Dans le cas de lymphomes non-hodgkiniens, les translocations chromosomiques sont les anomalies les plus fréquentes. 52

53 LNHs 2. Les translocations chromosomiques dans les cas de L idée que les recombinaisons des gènes codant pour les immunoglobulines puissent initier des translocations fut consolidée quand la première translocation associée à une tumeur lymphoïde fut caractérisée. La fusion entre le gène c-myc et la zone de recombinaison au niveau du locus du gène codant pour l IgH suggère que la translocation c-myc/igh correspond à une conséquence d une recombinaison aberrante au niveau de ce locus (Jankovic et al. 2007). Par la suite, de nombreuses translocations associées à des lymphomes non- Hodgkiniens de type B furent documentées et dans la plupart des cas au moins un des partenaires étaient un gène codant pour les immunoglobulines. Les translocations dont aucun des acteurs n est un gène codant pour les immunoglobulines sont d intéressantes exceptions. Cependant ce groupe de translocations peut être également une conséquence indirecte d une déstabilisation du génome suite à des anomalies des protéines de régulation de la recombinaison somatique. Les mécanismes de la plupart des translocations ne sont encore que partiellement connus. Nous présenterons ci-dessous quelques aspects généraux de ces mécanismes. Durant la maturation des lymphocytes B, il existe trois phases où les gènes codant pour les immunoglobulines sont particulièrement vulnérables et pendant lesquels des changements peuvent aboutir à une translocation chromosomique. Ce sont les recombinaisons des régions V, D et J (dans la moelle osseuse mais pas exclusivement), l hypermutation somatique et la commutation isotypique (dans les centres germinatifs). a) Translocations chromosomiques durant les recombinaisons des régions V, D et J Il existe au moins deux sous-types de lymphomes de type B, dont les translocations caractéristiques semblent apparaître au moment de la recombinaison somatique des segments V, D et J. Il s agit des lymphomes folliculaires et la translocation t(14 ;18), et les lymphomes à cellules du manteau et la translocation t(11 ;14). La preuve que ces translocations résultent d erreurs du complexe RAG a été documentée par séquençage des points de rupture dans les translocations Bcl-2/IgH des lymphomes folliculaires. Les protéines RAG 1 et 2 sont responsables de la rupture du double brin d ADN (Raghavan et al. 2004). Les protéines RAG, de par leur capacité à cliver l ADN, sont suspectes d être l inducteur de translocations. Plusieurs hypothèses de mécanismes ont été proposées : - le complexe RAG reconnaît des séquences ressemblant aux SSR normaux sur d autres gènes, et y induit des ruptures converties en épingles à cheveux. Ces dernières peuvent être traitées par les mécanismes impliquant le NHEJ. Ainsi des gènes comme LMO2, 53

54 TTG1, SIL, SCL ont été décrits comme possédant des séquences mimant les SSR à l origine de translocations ou de délétions (Marculescu et al. 2002), - Le complexe RAG reconnaît des séquences ADN non spécifiques de la maturation des lymphocytes B, en particulier au niveau d un nucléotide cytosine. Ainsi les protéines RAG sont capables d induire des ruptures de la séquence d oncogènes, comme Bcl-2 (Raghavan et al. 2004), - Les transpositions provoquées par le complexe RAG peuvent introduire une instabilité du génome. Les protéines RAG peuvent agir comme une transposase et introduire des extrémités de signaux dans des chromosomes hétérologues au niveau d un autre locus, - Un nouveau mécanisme fut démonté récemment à partir de la corrélation de la présence de sites CpG à proximité des régions cibles de translocations. Les cytosines de ces sites peuvent être les cibles d enzymes comme l AID (activation-induced cytidine deaminase), ayant la capacité de les désaminer. Ces anomalies sont détectées par des nucléases, comme par exemple le complexe RAG, à l origine de ruptures doubles brins de l ADN (Tsai et al. 2008). b) Translocations chromosomiques durant l hypermutation somatique et la commutation isotypique Après avoir atteint les centres germinatifs, les lymphocytes B sont soumis à deux phases distinctes de rupture de l ADN, l hypermutation somatique et la commutation isotypique, tous les deux sous médiation de l AID (activation-induced cytidine deaminase). Cette enzyme possède la capacité de désaminer les cytosines en uracile, causant un défaut d appariement. Ce dernier sera traité par l uracile N-glycolase/Alkaline Phosphatase endonucléase, aboutissant à une mutation ou une rupture double brin de l ADN. La rupture de l ADN est un intermédiaire de la commutation isotypique mais qui en cas d erreur de liaison peut aboutir à une translocation (Bagg 2008). Il a été démontré que les ruptures dans la séquence du gène c-myc lors des translocations t(8 ;14) caractéristiques des lymphomes de Burkitt sont induites par l AID (Robbiani et al. 2008). De plus lors d hypermutation somatique, un certain nombre de gènes (Bcl-6, Cd10, Cd79A, Cd79B et Cd95) ne codant pas pour les immunoglobulines peuvent muter (Klein et al. 2008). Ils sont la cible de l hypermutation somatique car ils sont transcrits dans les centres germinatifs et présentent des séquences pouvant diriger l activité de l AID. Ce dernier est donc nécessaire à l activité d hypermutation somatique à l origine de la diversité des anticorps mais il peut aussi générer des mutations à l origine d un processus oncogénique. c) Conséquences génétiques des translocations (Nambiar et al. 2011) 54

55 Les translocations chromosomiques aboutissent finalement à la dérégulation de protéines cellulaires clés, et particulièrement celles codées par les proto-oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs qui sont les régulateurs fonctionnels de la cellule. On trouve ainsi deux voies de modification. Dans un premier cas, l ensemble de la région codante est juxtaposée au promoteur ou «enhancer» d un autre gène. Ce mécanisme aboutit à l expression anormale du gène concerné par la translocation. Dans les cas de lymphome de type B, un oncogène est placé sous le contrôle des éléments régulateurs des gènes codant pour les immunoglobulines. Ex : gène MYC rencontré très fréquemment dans les cas de lymphomes de Burkitt. Dans un second scénario, la translocation résulte en la formation d un gène fusion unique, qui code pour une protéine chimérique avec une activité oncogénique. Ex : le chromosome de Philadelphie retrouvé dans les cas de leucémies myéloïdes chroniques possède un gène fusion BCR-ABL codant pour une protéine dérégulant le cycle cellulaire (Kuppers 2005) De façon occasionnelle, les translocations peuvent inactiver des gènes suppresseurs de tumeurs. Enhancer Gène B Expression modifié du gène B Gène B Gène fusion Co-produit Gène A Co-produit Figure 14 : Conséquences des translocations chromosomiques (Nambiar et al. 2011) 55

56 B. Anomalies chromosomiques retrouvées dans les différents sous-types de LNHs humains Comme nous l avons vu précédemment, les lymphomes non-hodgkiniens présentent de façon récurrente des anomalies cytogénétiques et, parmi elles, les plus fréquentes sont les translocations chromosomiques. Nous allons nous intéresser ici à décrire les anomalies cytogénétiques spécifiques à certains sous-types de lymphomes, apportant des informations intéressantes dans leur classification. Ainsi, depuis la fin des années 1990, un grand nombre d anomalies a pu être rattaché à un sous-type de lymphome et certaines anomalies sont retrouvées dans plus de 80% des patients. Ex : 80% des lymphomes folliculaires présentent une translocation t(14 ;18)(q21 ;q32) ou une de ses variantes. On retrouve également la translocation t(8 ;14)(q24 ;q32) dans 90% des cas de lymphomes de Burkitt (Bastard 2003). Type de lymphome Translocation Gène Fonction normale Disfonctionnement CLL/SLL t(11;14)(q13;q32) BCL1 Régulation cycle cellulaire Dérégulation de transcription t(14;19)(q32;q13) BCL3 Régulation transcription Dérégulation de transcription LPL t(9;14)(p13;q32) PAX5 Régulation transcription Dérégulation de transcription PCM (MM) t(11;14)(q13;q32) BCL1 Régulation cycle cellulaire Dérégulation de transcription t(4;14)(p16,3;q32) FGFR Régulation croissance Dérégulation de transcription t(6;14)(p16;q32) MUM1 Régulation transcription Dérégulation de transcription MALT t(11;18)(q21;q21) CIAP2/MLT Régulation apoptose Transcription protéine fusion t(1;14)(p22;q32) BCL10 Régulation apoptose Dérégulation de transcription MCL t(11;14)(q13;q32) BCL1 Régulation cycle cellulaire Dérégulation de transcription FL t(14;18)(q32;q21) BCL2 Régulation apoptose Dérégulation de transcription t(3;14)(q27;q32);t(3q27) BCL6 Régulation transcription Dérégulation de transcription DLBCL t(14 ;18)(q32 ;q21) BCL2 Régulation apoptose Dérégulation de transcription t(8 ;14)(q24 ;q32) MYC Régulation transcription Dérégulation de transcription t(8;12;14)(q24;q24;q32) BCL7A? Transcription protéine fusion t(3;14)(q27;q32);t(3q27) BCL6 Régulation transcription Dérégulation de transcription t(10;14)(q24;q32) NFKB2 Régulation transcription Dérégulation de transcription t(14;15)(q32;q11-13) BCL8? Dérégulation de transcription t(1 ;14)(q21 ;q32) MUC1 Croissance tumorale Dérégulation de transcription t(1;22)(q21;q11) FCGR2B Réponse immune Dérégulation de transcription t(1;14)(q21;q32) BCL9? Dérégulation de transcription BL t(8 ;14)(q24 ;q32) MYC Régulation transcription Dérégulation de transcription ALCL t(2;5)(p23;q25) ALK/NPM Tyrosine kinase Transcription protéine fusion Abréviations : CLL/SLL : Leucémie lymphocytique chronique/ Lymphome lymphocytique ; LPL : lymphome lymphoplasmocytaire ; PCM (MM) : Myélome multiple ; MALT : Lymphome extraganglionnaire de la zone marginale du tissu lymphoïde associé aux muqueuses ; MCL : Lymphome du manteau ; FL : Lymphome 56

57 folliculaire ; DLBCL : Lymphome B diffus à grandes cellules ; BL : Lymphome de Burkitt ; ALCL : Lymphome anaplasique à grandes cellules. Tableau 3 : Gènes dérégulés dans les cas de LNHs : Fonction cellulaire normale et Fonction après translocation (Chaganti et al. 2000) de type B 1. Anomalies cytogénétiques rencontrées dans les LNHs a) Lymphomes lymphocytiques : Ces lymphomes sont très proches des leucémies lymphoïdes chroniques (LLC), dont ils sont parfois indiscernables. L anomalie la plus caractéristique de ce groupe est la délétion 14q (Tilly et al. 1988). Cette anomalie est une délétion interstitielle du chromosome 14, del(14)(q23 ;q32). Cette anomalie peut être associée à une trisomie 12, habituellement secondaire et résultante d une évolution clonale. Les analyses par Hybridation in situ Fluorescente (FISH) confirment l implication des gènes d immunoglobulines dans ce réarrangement. Un certain nombre d anomalies cytogénétiques secondaires est également rapporté dans les cas de lymphomes lymphocytaires et présente des similitudes avec les réarrangements observés chez les patients atteints de LLC. Il est ainsi décrit : - Trisomie 12 isolée, - Délétions 11q, soit terminales et impliquant q14 ou q21 ; soit interstitielles del(11)(q13,q23), - Délétions 13q partielles (Bastard 2003). Dans un certain nombre de cas, les patients sont porteurs d anomalies de nombre isolées, majoritairement la trisomie 3. b) Lymphomes à cellules du manteau (LCM) Ce sous-type est relativement rare et de mauvais pronostic. Le lymphome à cellules du manteau représente 5 % des cas de LNHs (Zucca et al. 1995). L infiltration concerne des cellules lymphoïdes issues de la zone du manteau des follicules ganglionnaires. (1) Translocation t(11 ;14)(q13 ;q32) L anomalie cytogénétique caractéristique des lymphomes du manteau est la translocation t(11 ;14)( q13 ;q32). Il en résulte une juxtaposition génétique entre le promoteur des chaînes lourdes d immunoglobuline en 14q32 ( ) et le locus du gène codant la protéine du cycle 57

58 cellulaire BCL1 ou cycline D1 en 11q13 (juxtaposition -cycline D1). Les gènes des chaînes lourdes sont les plus fréquemment concernés, alors que les translocations impliquent les gènes des chaînes légères des immunoglobulines de façon exceptionnelle. La translocation t(11,14)( q13 ;q32) est une des premières translocations récurrentes identifiées et ceci dès 1985 (Tsujimoto et al. 1985). Le gène responsable du développement de cette tumeur fut identifié plus tardivement, sous le nom de Prad1, par un groupe de recherche travaillant sur les adénomes de la parathyroïde associant une inversion péricentrique du chromosome 11 (Motokura et al. 1991). Différentes techniques ont été développées pour mettre en évidence cette anomalie cytogénétique. Par étude conventionnelle du caryotype, la t(11;14) (q13;q32) est retrouvée dans 50 à 70 % des cas (Williams et al. 1993). L hybridation in situ en fluorescence interphasique (FISH) est significative dans 50 à 75 % des cas (Siebert et al. 1998). Un réarrangement du gène bcl-1 est retrouvé dans environ 50 % des cas par méthode de Polymerase Chain Reaction (PCR) (Luthra et al. 1999). Sur le chromosome 11, plus de 80% des points de cassures sont localisés sur un segment d ADN de 300 paires de bases, nommé le Major Translocation Cluster ou MTC (cf. figure 15). Le séquençage de la région du MTC a permis le développement d amorce de la région utilisées dans la réalisation de PCR pour mettre en évidence la juxtaposition -BCL 1 à partir du tissu ganglionnaire, sur la moelle osseuse ou des cellules lymphocytaires circulants dans le sang (Rimokh et al. 1994). La cycline D1 (ou protéine BCL-1) participe au contrôle de la transition G1-S du cycle cellulaire. Dans le cas de la translocation t(11,14)(q13 ;q32), une hyperexpression de la cycline D1 (acide ribonucléique messager [ARNm] et protéine) est retrouvée dans 90 à 100 % des cas (Rimokh et al. 1993). Cette anomalie contribue à maintenir en cycle une cellule normalement quiescente. Le diagnostic de lymphome du manteau est renforcé par la détection d une hyperexpression de la cycline D1 mesurée au niveau protéique soit par western-blot, soit plus simplement au niveau de l ARN soit par slot-blot de l ARN, ou par RT-PCR compétitive. Cette dernière méthode permet par une amplification compétitive entre les trois cyclines D de mesurer la quantité relative des trois ARNm. En effet, si l expression de la cycline D1 est dérégulée suite à une translocation, l ARNm de la cycline D1 est en quantité supérieure à celles des ARNm des autres cyclines D2 et D3. Cette méthode permet une réponse rapide (Uchimaru et al. 1997). 58

59 MTC mtc1 mtc2 mtc3 20 kpb 100 kpb Locus BCL1 MTC 120 kpb BCL1-IgH Figure 15 : Structure du locus BCL1 avec la représentation des points de cassure MTC, mtc1, mtc2 et mtc3 et du réarrangement IgH-BCL1 de type MTC (mise sous contrôle de la cycline D1 par l enhancer de la chaîne lourde des IgH ( (Rimokh et al. 1994) La translocation t(11,14)(q13 ;q32) peut également se rencontrer dans d autres proliférations lymphoïdes malignes, en particulier les LLC, lymphomes spléniques de la zone marginale, et surtout le myélome multiple. (2) Del 11q22 Récemment, une délétion de la région q22 du chromosome 11 a été mise en évidence dans environ 50 % des patients porteurs de LCM (Monni et al. 1999). Cette délétion concerne le gène Atm (ataxia-telangiectasia mutated) dont la protéine ATM, une protéine-kinase. Après une lésion de l ADN, la protéine ATM intervient dans sa réparation et le contrôle de cycle cellulaire par phosphorylation de P53, qui commande l arrêt du cycle cellulaire à la transition G1/S et l activation de c-abl, responsable d un arrêt à la transition G2/M (Decaudin 2004). Cette atteinte du gène Atm, par mutation ou délétion, correspond à l événement déclencheur de la lymphomogénèse. Cette anomalie entraîne une perte de la fonction du gène particulièrement impliqué dans les recombinaisons (D)J (Liao et Van Dyke 1999) à l origine de la translocation (11;14)(q13;q32) responsable d une expression constitutive de la protéine BCL-1/PRAD1/CCND1. Ces protéines permettent une activation du cycle cellulaire des cellules centrocytiques caractéristiques des lymphomes du manteau typiques. On retrouve dans un troisième temps l apparition des anomalies cytogénétiques secondaires. 59

60 Figure 16 : Lymphomogenèse des lymphomes du manteau : (1) perte de fonction du gène Atm (2) translocation (11;14) (q13;q32) impliquant le gène Bcl-1, translocation tolérée ou induite par la perte de fonction du gène (3) anomalies chromosomiques additionnelles, telles une del (13q14) ou une del p16 ou une mutation du gène p53 (Decaudin 2004) (3) Aberrations chromosomiques secondaires associées au lymphome du manteau D autres anomalies cytogénétiques ont été décrites, moins récurrentes mais probablement de plus grande valeur pronostique pour l histoire naturelle de la maladie. En association avec la (11;14)(q13;q32), de nombreuses anomalies secondaires sont souvent retrouvées lors de l analyse cytogénétique (Decaudin 2004) : - Une délétion 13q14 a été retrouvée dans environ 40 à 70 % des cas, avec une valeur pronostique péjorative dans les séries publiées (Khoury et al. 2003), - Une mutation du gène p53, associée ou non à une hyperexpression de la protéine P53, est observée dans 5 à 30 % des LCM et s associe à une présentation clinique plus agressive de la maladie et à une survie diminuée, - De même, une inactivation du gène Cdkn2/p16, inhibiteur de la cycline D1, a été observée chez environ la moitié des patients et s accompagne d un pronostic moins favorable (Dreyling et al. 1997), - Enfin, une hyperexpression du gène c-myc sans mutation a été retrouvée dans 38% des LCM étudiés. Cette hyperexpression a un impact péjoratif sur la survie des patients et est associée à une hyperexpression de la protéine RB (Hernandez et al. 1999). 60

61 c) Lymphomes folliculaires (LF) Les lymphomes folliculaires se développent à partir des cellules des centres germinatifs ganglionnaires. Ce sous-type correspond à environ 25% des cas de lymphomes non- Hodgkiniens diagnostiqués en Europe et aux Etats-Unis (Jaffe et al. 2001). Les lymphomes folliculaires sont généralement disséminés et indolents au moment du diagnostic mais il a été reconnu que la majorité des lymphomes folliculaires évoluent vers la transformation en lymphome diffus à grandes cellules B de haut grade. (1) Translocation t(14 ; 18)(q21 ;q32) Ils sont caractérisés dans 80 à 90% des cas par la présence d une translocation t(14 ;18)(q21 ;q32) ou l une de ses translocations variantes t(2 ;18)(p12 ;q21) ou t(18 ;22)(q21 ;q11) (Bakhshi et al. 1985) L ensemble de ces translocations dérégule l expression du gène Bcl-2, localisé en 18q21, dont le produit est une protéine anti-apoptotique (Korsmeyer 1992). Cette protéine est fonctionnellement impliquée dans le processus de sélection des lymphocytes par l antigène dans les centres germinatifs. Il s agit d une étape clé de la différentiation lymphocytaire qui aboutit à la mort par apoptose des lymphocytes dont l immunoglobuline membranaire ne reconnaît pas d antigène lors de la transition d une cellule prégerminale en une cellule postgerminale ; alors que les lymphocytes dont l immunoglobuline reconnaît un antigène sont conservés. Ces derniers subissent un processus de maturation d affinité et se transforment en lymphocytes mémoires. Le gène Bcl-2 permet donc de prévenir les cellules d une mort programmé ou apoptose par opposition à la plupart des oncogènes qui autorise une prolifération sans contrôle. Les translocations citées plus haut placent l expression de Bcl-2 sous le contrôle des séquences régulant l expression du gène d immunoglobuline, ayant pour conséquence une production continue et importante d une protéine anti-apoptotique très facilement mise en évidence par immunomarquage. Les points de cassure au niveau du locus Bcl-2 sont principalement regroupés en deux régions, la première dans la région 3 non traduite de l ARN messager dénommée MBR (Major breakpoint region) et la seconde dénommée mcr (minor breakpoint region) située à environ 20 kpb en 3 de MBR (Korsmeyer 1992). On retrouve ainsi 70% des lymphomes folliculaires positifs en utilisant le système MBR- et seulement 15% avec le système mcr- (Doyen et al. 2004). D autres points de cassure ont été décrits en 5 du gène BCL2 et entre MBR et mcr (Korsemeyer 1992). 61

62 Exon 1 Exon 2 Exon 3 MBR mcr 225 kpb 20 kpb BCL 2 ADN BCL2 ARN BCL2 - IgH Exon 1 Exon 2 Exon 3 Figure 17 : Structure du locus BCL2. Les points de cassure MBR et mcr sont indiqués. La séquence codante est indiquée en rouge. Le réarrangement IgH-BCL2 de type MBR est schématisé montrant la mise sous contrôle de BCL2 par l enhancer de la chaîne lourde des IgH ( ) (Korsmeyer 1992) La contribution de la translocation t(14;18) au développement du lymphome folliculaire est complexe. Les souris transgéniques IgH/Bcl-2 développent une hyperplasie de cellules B mûres des centres germinatifs (hyperplasie lymphoïde bénigne). Seules 10 % progressent vers un lymphome agressif, associé avec un réarrangement de c-myc dans 50 % des cas. L activation de Bcl-2, via la translocation t(14;18) ne semble pas suffisante pour développer un lymphome, d autres facteurs génétiques ou liés à l hôte semblant nécessaires (Doyen et al. 2004). Quatre-vingt-dix pour-cent des lymphomes folliculaires ont d autres anomalies chromosomiques (médiane de six anomalies) (Viardot et al. 2003). (2) Anomalies structurales secondaires La translocation t(14 ;18) est rarement isolée (Viardot et al. 2003) et ces anomalies secondaires retrouvées dans les lymphomes folliculaires sont récurrentes et non aléatoires. Le plus souvent des pertes chromosomiques concernant les chromosomes 1p, 6q, 10q, 13q, 17p ou des gains sur les chromosomes X, 1q, 2q, 7q, 7, 12q, 18q (de 10 à 20 % des cas pour chacune des anomalies) sont notés. 62

63 Certaines d entre elles semblent donner des éléments de pronostic de la maladie. Ainsi les patients possédant des anomalies en région 6q23-26 et sur le bras court du chromosome 17 ont un temps de transformation du lymphome significativement plus court associé à un temps de survie plus court (Tilly et al. 1994). (i) Del 6q Les délétions del(6q) ont pu être mises en relation avec différents sous-types de LNHs. On les retrouve ainsi entre 14% et 31% des cas de LNHs selon 6 séries de données (Offit et al. 1991) et dans 15 à 38% des lymphomes folliculaires (Ross et al. 2007) mais également dans un certain nombre d autres néoplasies comme les leucémies lymphoblastiques aigues, les mélanomes, les carcinomes rénaux et les adénocarcinomes de glandes salivaires (Offit et al. 1991). Les régions de délétion sur le HSA 6 ont été recherchées et plusieurs études proposent des régions minimales de délétions (MDR) (Offit et al ; Henderson et al. 2004). Ainsi la région MDR1 est localisée en position HSA 6q13-15 (Limites physiques : 73,69-88,07 Mb) et la région MDR2 en position HSA 6q (Limites physiques 132,45-138,31 Mb). L anomalie del 6q est associée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de FL, cependant aucun gène responsable n a pu être identifié (Ross et al. 2007). Cependant la région HSA 6q , délétée dans 8% des FL comporte les gènes A20, régulateur négatif du gène Nfκb, et Perp, effecteur du gène p53 (Ross et al. 2007). Ces deux gènes constituent des gènes d intérêt potentiel dans la pathogénie des FL. (ii) Gène p53 Le gène p53 se localise sur le bras court du chromosome 17. Ce gène code pour la protéine P53 qui a un rôle central dans le cycle cellulaire (Bogard et Lamoril 1999). La protéine P53 est très importante et assure des rôles très variés dans la régulation du cycle cellulaire : - Arrêt du cycle de division en G1 pour une cellule dont le matériel génétique est endommagé, par activation des gènes Cdk-I, - Activation des gènes de réparation de l ADN (gène Gadd-45), - Activation des gènes de l apoptose si nécessaire (gène Bax). Ainsi l inactivation de ce gène par mutation procure un avantage pour l expansion clonale des néoplasies. La mutation de p53 est retrouvée dans 10% des LNHs de type B ; y compris les lymphomes folliculaires et du manteau (Koduru et al. 1997). 63

64 La présence de mutations du gène p53 est significativement associée à l observation d un caryotype complexe. Le rôle de la protéine P53 dans la réplication de l ADN et le cycle cellulaire suggère que les mutations sont à l origine des multiples anomalies chromosomiques observées. Ainsi la mutation p53 est un facteur pronostic négatif pour la survie et la période de rémission complète (Ichikawa et al. 1997) chez les lymphomes de type B de haut grade. Dans les cas de lymphomes folliculaires, les mutations du gène p53 sont associées à une transformation histologique dans approximativement 25% à 30% des cas. La présence de la mutation du gène P53 et de la délétion del(6q) dans les cas de lymphomes de bas grade augmente significativement le risque de transformation du lymphome et donc péjore le pronostic (Sander et al., 1993). Les mutations du gène p53 ne sont que rarement associées à des altérations de la région 17p. Ainsi sur un lot de 6 patients atteints de LF présentant une mutation du gène p53, un seul présente une altération notable de la région 17p (Ross et al. 2007). d) Lymphome de Burkitt (LB) Ce sous-type correspond à des lymphomes très agressifs. Chez l enfant, ils font partie des cancers pour lesquels les plus forts taux de guérison peuvent être obtenus à condition d utiliser une chimiothérapie extrêmement lourde. Les résultats thérapeutiques sont beaucoup moins bons chez l adulte. Un certain nombre de lymphomes de Burkitt est associé à la présence du virus d Epstein Barr. Le paludisme pourrait également jouer un rôle dans l épidémiologie du lymphome de Burkitt endémique africain (Bastard 2003). Ces lymphomes sont caractérisés par la présence de la translocation t(8 ;14)(q24 ;q32) ou l une de ses variantes t(2 ;8)(p12 ;q24) et t(8 ;22)(q24 ;q11). Cette translocation est historiquement une des premières à avoir été étudiées. C est à partir de l étude de ces 3 translocations qu a pu être mis en évidence le rôle des gènes d immunoglobulines dans la genèse des LNHs. Ces translocations mettent ainsi en cause un gène codant les chaînes légères ou les chaînes lourdes d immunoglobuline et l oncogène c-myc. Ce gène est impliqué dans le contrôle de la transition G1-S du cycle cellulaire (Bastard 2003). Le proto-oncogène c-myc fait partie d une famille de gènes incluant L-myc, N-myc, s-myc, and B-myc (Henriksson et Luscher 1996). Ce dernier code pour une phosphoprotéine nucléaire de demi-vie courte ayant un rôle central dans la régulation du cycle cellulaire. L expression du gène c-myc inhibe la sortie du cycle cellulaire ainsi que la différenciation cellulaire. De plus, son expression est suffisante pour conduire des cellules quiescentes à entrer en division en absence de facteurs de croissance, mais favorise l apoptose en cas d absence de facteurs de survie (Evan et al. 1992). 64

65 La dérégulation de l expression du gène c-myc est très fréquente en cancérologie. L activation du gène c-myc par insertion virale, amplification de gènes ou translocation chromosomique a été décrite dans un certain nombre de tumeurs chez différentes espèces, y compris l homme. La surexpression du gène c-myc chez des souris transgéniques est à l origine du développement de cancers (Gregory et Hann 2000). La translocation la plus fréquente c-myc/igh est détectée dans environ 80% des lymphomes de Burkitt. Ces variantes t(2 ;8)(p12 ;q24) et t(8 ;22)(q24 ;q11) sont observées à une fréquence de respectivement 10% (Sanchez-Beato et al. 2003). Ces translocations sont également retrouvées dans les lymphomes B diffus à grandes cellules avec une fréquence de 6% et d autres hémopathies malignes, reportées dans le Tableau 4. Hémopathies lymphoïdes malignes Implication du gene Myc Lymphome B diffus à grandes cellules Lymphome de Burkitt Translocation du gène c-myc (6-16%) Amplification du gène combiné à une surexpression d ARNm (38%) Expression de la protéine c-myc(25%) Translocation et surexpression du gène MYC (> 90%) Leucémie lymphoblastique aigue Translocations impliquant le gène c-myc (5%) Si type B : réarrangement et amplification c-myc Myélome multiple Translocations impliquant le gène c-myc (15-50%) Leucémie à plasmocytes Translocations impliquant le gène c-myc (13%) Leucémie lymphocytaire chronique Expression faible de la protéine c-myc Tableau 4 : Résumé des altérations du gène MYC dans les hémopathies lymphoïdes humaines (d après Delgado et Leon 2010) L anomalie chromosomique la plus fréquemment associé à la translocation t(8 ;14) est une duplication 1q, de taille variable (Bastard 2003). e) Lymphomes B diffus à grandes cellules (LDGC) (1) Classification des LDGC Ils représentent environ le tiers des lymphomes diagnostiqués en France et c est la forme la plus fréquente chez l'adulte. Les LDGC sont des proliférations clonales de 65

66 lymphocytes B. Ces lymphomes sont toujours de haut grade et de ce fait, le doublement de la masse tumorale est rapide, de l'ordre de 15 jours à un mois. Il s agit d un groupe hétérogène de lymphomes B et la classification de l'oms 2008 reconnaît ainsi des variantes et des sous-types de la maladie (Swerdlow et al. 2008): - Les variantes : centroblastique, immunoblastique, riche en cellules T, de type granulomatose lymphomatoïde, anaplasique, plasmablastique, - Sous-types, en fonction de la localisation préférentielle du lymphome : médiastinale, des séreuses (plèvre, péritoine, méninges, ), intravasculaire. (2) Anomalies cytogénétiques récurrentes Dans 50% des cas environ, ces lymphomes sont associés à une translocation chromosomique récurrente correspondant de façon probable à l événement initial responsable du développement de la tumeur (Bastard 2003). Les réarrangements du gène Bcl-2, dus à la translocation t(14 ;18) sont détectés dans 20-30% des cas de LDGC, suggérant une transformation d un lymphome folliculaire chez ces patients (Weiss et al. 2010). 33% des cas de LDGC révèlent une translocation réciproque de la région 3q27 (Ye et al. 1993). Il s agit du locus des gènes Bcl-6/Laz-3 codant pour un facteur de transcription de doigts de zinc. Ces derniers sont des petits motifs structuraux trouvés dans les protéines et capables d'ordonner en complexe un ou plusieurs ions zinc pour stabiliser leurs plis. Il s agit le plus souvent d une translocation t(3 ;14) mais les translocations variantes ne sont pas rares en particulier la translocation t(3 ;22). Ces translocations ont pour conséquence la perte des régions régulatrices de Bcl-6, ainsi le premier exon non codant du gène partenaire et ses séquences régulatrices viennent se placer en 5 du second exon de Bcl-6. Il en résulte une protéine BCL6 normale, mais synthétisée à un moment inapproprié. La partie 5 non codante de Bcl-6 est également la cible de mutations proches de celles impliquées dans la maturation d affinité des gènes Ig. Le rôle de ces mutations somatiques reste hypothétique (Gatter et Pezzella 2009). La présence d altération du gène Bcl-6 dans les cas de LDGC est fortement corrélée avec une infiltration extra-nodale et est considérée de meilleur pronostic que l altération du gène Bcl-2 ou l altération conjointe de Bcl-6 et Bcl-2 (Offit et al. 1994b). Approximativement 10-20% de ce sous-type de lymphome présente une translocation impliquant le locus du gène c-myc (Delgado et Leon 2010). Les réarrangements concomitants des gènes Bcl-6 et Bcl-2 sont quasiment exclusifs aux lymphomes B diffus à grandes cellules (Gatter et Pezzella 2009). 66

67 (MALT) f) Lymphomes des tissus lymphoïdes associés aux muqueuses Ces tumeurs sont essentiellement localisées aux glandes salivaires, à la thyroïde, ou à la muqueuse gastrique. Dans ce dernier cas, le développement du lymphome est étroitement lié à la présence de la bactérie Helicobacter pylori, dont l éradication précoce peut suffire à amener à une rémission complète du lymphome (Bastard 2003). Lorsqu il n est pas associé à ce germe, ce sous-type de lymphome est souvent associé à une translocation récurrente t(11 ;18)(q21 ;q21), aboutissant à la formation d un transcrit de fusion API2-MLT. La présence de cette anomalie génétique est de mauvais pronostic (Maes et al. 2000) Parmi la multiplicité des sous-types de lymphomes de type B, seul un petit nombre est associé à des translocations récurrentes. On peut y inclure les lymphomes de Burkitt et t(8 ;14)(q24 ;q32) et ses variantes, les lymphomes folliculaires et t(14 ;18)(q32 ;q21) et les lymphomes des cellules du manteau avec la translocation t(14 ;18)(q32 ;q21). Ces translocations sont des résultats d erreurs dans les réarrangements accompagnant la maturation des lymphocytes B et particulièrement les gènes codant pour les immunoglobulines. Cependant, contrairement à certaines néoplasies myéloïdes et leucémies lymphoblastiques, aucune de ces translocations n est complètement spécifique du sous-type de lymphome auquel elle est associée. On retrouve ainsi 15% de lymphomes folliculaires sans anomalies du gène Bcl-2, alors qu on retrouve cette anomalie dans 25% des LDGC. On peut ainsi retrouver dans 10% des LDGC une translocation t(8 ;14) dite caractéristique des lymphomes de Burkitt. Seulement, Les LDGC sont 15 à 20 fois plus fréquents que les lymphomes de Burkitt. Ainsi un cas de lymphome présentant une t(8 ;14) est plus probablement un LDGC. La notion de translocation récurrente ne permet donc pas à elle seule de déterminer le sous-type mais doit être associée à des données morphologiques, immunologiques et moléculaires. 2. Anomalies cytogénétiques rencontrées dans les LNHs de type T Dans les lymphomes B, la mise en évidence de l implication des gènes codant les Ig a rapidement indiqué où rechercher les événements récurrents responsables du développement tumoral. La situation reste plus difficile dans les lymphomes T où l implication des gènes du récepteur T n est pas un événement fréquent. 67

68 Les lymphomes T constituent un groupe hétérogène dont l analyse morphologique reste difficile et subjective. On reconnaît, depuis la classification OMS revue en 2008, 18 entités pathologiques distinctes et un groupe d entités provisoires (Swerdlow et al. 2008). Quelques entités sont cependant bien définies et en particulier présentent des anomalies cytogénétiques récurrentes. Type de Type d anomalie Gène Fréquence lymphome ALCL, ALK+ t(2 ;5)(p23 ;q35) ALK/NPM 100% T-PLL TRA@/TCL1A/B 80% PTCL, NOS Amplification génique Réarrangement CDK6 IRF4 23% Rare t(5;9)(q33;q22) ITK/SYK Rare ALCL cutané CIAP2/MLT 50% Abréviations : ALCL, ALK+ : Lymphome anaplasique à grandes cellules ALK+ ; T-PLL : Leucémie prolymphocytaire T; PTCL, NOS : Lymphome T périphérique sans autre spécification. Tableau 5 : Aberrations chromosomiques récurrentes dans les cas de lymphomes de type T (Dogan et Feldman 2010) a) Lymphome anaplasique à grandes cellules Ce sous-type de lymphome est formé par un groupe hétérogène de lymphomes de haut grade sur le plan morphologique et se présente le plus souvent comme une maladie systémique avec une atteinte ganglionnaire non systématique. Les cellules tumorales des ALCL (Anaplastic large cell lymphoma) furent caractérisées par l expression de l antigène CD30/Ki-1 par Stein et al. (Stein et al. 1985). On reconnaît deux entités : les ALCL ALK+ et ALK-. Le premier est caractérisé par l expression dérégulée de protéines chimères traduites à partir du gène Alk (Anaplastic lymphoma kinase). Dans la dernière édition de la classification WHO, l ALK- ALCL est considéré comme une entité provisoire (Delsol et al ; Mason et al. 2008). (1) Les ALCL ALK+ Les ALCL ALK+ sont des néoplasmes impliquant des lymphocytes T matures, présentant des translocations impliquant le gène Alk. Le pronostic associé à ce sous-type de lymphomes est parmi les meilleurs des lymphomes de type T, avec un taux de survie à 5 ans de 70 à 80% (Dogan et Feldman 2010). 68

69 (i) Translocation ALK/NPM Les ALCL ALK+ sont associés à une translocation récurrente t(2 ;5)(p23 ;q35), impliquant le gène Alk fusionnant avec le gène de la nucléophosmine (Npm), mise en évidence par Morris et al. (1994). Les réarrangements du gène Alk sont retrouvés dans environ 60-65% des cas d ALCL (Morris et al. 1994, Salaverria et al. 2008). La protéine NPM est une protéine nucléaire de 38 kda codée sur le chromosome 5 ayant un rôle actif dans le déroulement du cycle cellulaire. Le gène Alk situé sur le chromosome 2q23 code pour un récepteur à la tyrosine kinase. La translocation t(2 ;5)(p23 ;q35) aboutit à l expression d une protéine fusion de 80kDa contenant les 117 premiers acides aminés de NPM fusionnés avec la partie C-terminale de ALK (Dyester et al. 2001) NPM TK K Kk K ALK NPM-ALK TK K 1 117/ Figure 18 : Illustration schématique de la protéine fusion NPM-ALK résultant de la translocation t(2 ;5) (TK : protein kinase catalytic domain) ( Dyester et al. 2001) NPM-ALK est un potentiel oncogène capable de provoquer la transformation in vitro d un grand nombre de types cellulaires, incluant des fibroblastes de rats ou de souris mais également de certaines cellules lymphoïdes et myéloïdes (Dyester et al. 2001). La translocation t(2,5) met le gène Alk tronqué sous le contrôle du puissant promoteur du gène NPM, aboutissant à une expression en très grande quantité de la protéine fusion NPM- ALK dans les cellules lymphomateuses. La fusion du gène Npm à la région du gène Alk codant le domaine cytoplasmique de la tyrosine kinase mène à l activation de la fonction de cette protéine. Les ALCL ALK+ présentent un certains nombres d anomalies cytogénétiques secondaires communes. En particulier, le gain récurrent de la région 17p et 17q24 et la perte des régions 4q13-q21 et 11q14 ont été décrits (Salaverria et al. 2008). 69

70 (ii) Autres fusions oncogéniques impliquant Alk Des variantes des translocations chromosomiques impliquant le locus du gène Alk ont aussi été observées, suggérant l existence de gènes partenaires de fusion autres que le gène Npm. Depuis le début des années 2000, de nouveaux partenaires du gène Alk ont été identifiés dont certains sont spécifiques des ALCL comme les gènes Atic, Tgf ainsi que d autres pouvant également être retrouvés dans des cas de tumeurs myofibroblastiques comme les gènes Tpm-3 et Cltc (Piccaluga et al. 2010). Translocation chromosomique Gène partenaire Gène fusion Fréquence Localisation t(2;5)(p23;q35) Npm-1 Npm-1/Alk Cytoplasmique/Nucléaire t(1;2)(q25;q23) Tmp-3 Tmp-3/Alk Cytoplasmique inv(2)(p23;q35) Atic Atic/Alk 2 Cytoplasmique t(2;3)(p23;q21) Tgf Tgf/Alk 2 Cytoplasmique t(2;17)(p23;q25) Cltl Cltl/Alk 2 Cytoplasmique t(2;17)(p23;q25) Alo-17 Alo-17/Alk <1 Cytoplasmique t(2;19)(p23;p13) Tpm-4 Tpm-4/Alk <1 Cytoplasmique t(2;22)(p23;q11.2) Myh9 Myh-9/Alk <1 Cytoplasmique t(2,x)(p23;q11-12) Msn Msn/Alk <1 Membranaire Tableau 6 : Principales translocations impliquant le gène Alk documentées dans les cas de ALCL ALK+ (Piccaluga et al. 2010) La caractérisation moléculaire de ces entités permet maintenant le développement de thérapies moléculaires ciblées. Depuis que la cellule lymphomateuse est distinguable par l expression d une protéine ALK oncogénique, l élaboration d inhibiteurs spécifiques comme le NVP- TAE684 contre ces cellules semble envisageable (Galkin et al. 2007). (2) Lymphomes ALK- ALCL Les lymphomes anaplasiques à grandes cellules ALK- sont morphologiquement indistinguables des ALK+ mais ne synthétisent pas la protéine ALK et ne présentent pas de translocation du gène Alk. Aucune anomalie primaire récurrente n est rapportée pour ces lymphomes. Certaines anomalies secondaires sont récurrentes telles le gain de la région 1q et 6p21 (Salaverria et al. 2008). 70

71 b) Lymphadénopathies angio-immunoblastiques Ce groupe de lymphomes est caractérisé par la présence presque constante de plusieurs clones cytogénétiques sans relation les uns avec les autres. A noter que, dans un quart des cas, on démontre la présence d un clone de type B. Aucune anomalie spécifique des lymphadénopathies angio-immunoblastiques n a été décrite. Cependant, un certain nombre de cas montre une trisomie des chromosomes 3 et 5, un gain du chromosome X, le gain de la région 22q19 et 11q13 ou une délétion de la région 13q (Dogan et Feldman 2010). NOS) c) Lymphome T périphérique sans autre spécification (PTCL, Les PTCL, NOS forment un groupe hétérogène de lymphomes dérivant de lymphocytes T matures qui ne possèdent aucun critère d un autre sous-type de lymphome T spécifique défini par la classification OMS (Swerdlow et al. 2008). Cette catégorie inclut une diversité de présentations cliniques avec envahissement ganglionnaire ou non, de présentations morphologiques et immunophénotypiques et représente une vaste corbeille pour inclure des cas non classés. Les réarrangements clonaux des gènes TCR sont ainsi retrouvés dans une majorité des cas de PTCL, NOS. La PCR des gènes codant pour le TCR est très intéressante dans la mise en évidence de ce sous-type (Dogan et Feldman, 2010) De rares cas présentent une translocation t(5 ;9)(q33 ;q22) aboutissant à la fusion de gènes codant pour des tyrosines kinases, ITK et SYK. La protéine fusion résultante possède des propriétés oncogéniques démontrées in vitro (Rigby S, 2008), suggérant que cette translocation pourrait intervenir de façon discriminante dans la pathogénie de ces cas de lymphomes. Néanmoins, l incidence de la translocation impliquant les gènes Itk/Syk est très faible dans les PTCL, NOS. Il apparaît que, contrairement aux lymphocytes T normaux, la plupart des cas de PTCL présente une surexpression de la SYK kinase, dont des études in vitro lui attribuent une activité oncogénique similaire à celle de la protéine fusion ITK/SYK (Feldman et al. 2008). Contrairement aux lymphomes de type B dont la gestion clinique et la compréhension se sont considérablement consolidées dans les dernières années, l étude des lymphomes de type T/NK révèle de plus grandes lacunes. Ceci est en partie explicable par la connaissance incomplète de la pathogénie moléculaire de ces lymphomes. Cependant certaines altérations génétiques spécifiques ont pu être identifiées mais ne sont pas encore reliées à des informations cliniques. La description génétique des ALCL ALK+ a permis d ouvrir la porte à une thérapie ciblée, incluant des molécules inhibitrices et peut être, à terme, une vaccination bloquant la fonction des protéines ALK. 71

72 Les données cytogénétiques sont particulièrement développées dans la classification de l OMS et permettent, au même titre que les données histopathologiques, immunophénotypiques épidémiologiques et cliniques, la distinction des différents soustypes de lymphomes. Les ALCL ALK+, définis exclusivement par la présence de translocations impliquant le gène Alk, sont la preuve des progrès récents dans le domaine de la cytogénétique et leurs applications. L étude des anomalies cytogénétiques s intercale également dans la recherche des mécanismes de la lymphomogénèse. Cependant l étude de la population humaine est rendue complexe par sa très grande hétérogénéité. Les lymphomes canins sont ainsi des sujets de comparaison pertinents qui peuvent aider à la discrimination des mécanismes primaires de la carcinogénèse des lymphomes. IV. Anomalies cytogénétiques associées aux Lymphomes non-hodgkiniens canins A. Intérêt du modèle canin dans l étude des LNHs humains 1. Besoin de nouveaux modèles pour étudier les maladies complexes En médecine humaine, la compréhension des bases génétiques de maladies complexes reste un véritable challenge, et cela malgré de nombreuses avancées en particulier dans les technologies génétiques. Ceci est en partie dû à des interactions géniques ténues et des effets environnementaux partiellement compris (Rowell et al. 2011). L identification de ces facteurs est rendue difficile par l important niveau d hétérogénéité génétique de la population humaine (Karlsson et Lindblad-Toh, 2008). La plupart des études 72

73 génétiques n ont pu identifier qu une petite partie des bases génétiques des maladies humaines complexes. Actuellement, la plus grande part des recherches sur les bases génétiques de maladies repose sur des modèles animaux. La souris, l animal le plus fréquemment utilisé, présente les avantages d avoir une petite taille, un temps de gestation court et un grand nombre de technologies génétiques (transgénèse animale) contrôlé dans cette espèce. Cependant, ce modèle présente plusieurs limites. Notamment dans le cas de l étude des tumeurs : les tumeurs se développent spontanément chez l homme alors qu elles nécessitent d être induites chez la souris (Karlsson et Lindblad-Toh 2008). D autres espèces animales ont été utilisées pour mieux comprendre les mécanismes génétiques des maladies humaines. 2. Intérêt du modèle canin Le chien domestique (Canis lupus familiaris) est un excellent modèle d étude des maladies humaines. On note ainsi une grande accessibilité et un statut reconnu dans la plupart des cultures. Le chien partage l environnement de son propriétaire, ce qui peut être exploité dans des études épidémiologiques des maladies communes aux chiens et aux hommes (Rowell et al. 2008). Le chien domestique présente en effet 360 maladies analogues aux maladies humaines et plus de 40 maladies canines présentent des mutations sur des gènes homologues à ceux associés à une maladie humaine similaire (Wayne et Ostrander 2007). En tant que modèle spontané de beaucoup de maladies humaines, au contraire de la souris, le chien devient un excellent système d identification et d étude des loci de ces maladies. De plus, le chien présente une structure de population unique, avec chaque race développée à partir d un nombre restreint d individus. Chaque race forme alors une population fermée, avec une faible hétérogénéité génétique et pathologique (Ostrander et Wayne 2005). En conséquence, les études génétiques chez le chien sont théoriquement plus simples et plus directes que celles reposant sur des populations humaines complexes. D autres avantages du modèle canin résident dans la structure même du génome canin. Ce dernier présente ainsi cent fois plus de déséquilibre de liaison que son homologue humain, réduisant le nombre de marqueurs nécessaire à son investigation. De plus, l analyse de la séquence complète du génome canin a montré de plus grandes homologies dans la conservation de la séquence par rapport à l espèce humaine que l espèce murine (Lindblad- Toh et al. 2005). 3. Intérêt du modèle canin dans l étude des cancers a) Homologies des maladies humaines et canines 73

74 Le chien forme un modèle exceptionnel pour l étude des cancers car il développe naturellement les mêmes néoplasies que l homme comme le carcinome transitionnel de la vessie, les leucémies, LNHs, ostéosarcome, mélanome oral, etc (Shearing et Ostrander 2010). Les tumeurs du chien domestique sont, de plus, histologiquement proches des tumeurs humaines et répondent de façon similaire aux thérapies conventionnelles (Paolini et Khanna 2008). Ces maladies sont reportées comme étant plus agressives chez le chien que chez l homme. Cette donnée n est cependant pas clairement expliquée. Elle est, de plus, compliquée par l utilisation de protocoles thérapeutiques beaucoup moins agressifs chez le chien que chez l homme, pouvant être à l origine de temps de survie plus court chez le chien (Rowell et al. 2011). Il a été montré que certaines tumeurs présentent les mêmes anomalies cytogénétiques chez l homme et le chien, comme certains sous-types de cancers colorectaux. Cela laisse supposer un même mécanisme oncogénique dans les deux espèces (Rowell et al. 2011). b) Homologies entre les LNHs dans les deux espèces Les grandes homologies de ces maladies entre les espèces canines et humaines ont été traitées en partie I.B.2. Nous allons ici reprendre les plus grandes similitudes. L incidence des lymphomes non-hodgkiniens chez l homme et le chien est similaire : 20,21 et 19,9 pour , respectivement (Howlader et al. 2009, Merlo et al. 2008). Le sous-type le plus fréquent chez ces deux espèces est le lymphome B diffus à grandes cellules, qui répond aux mêmes agents de chimiothérapie (Cancer trends Progress report 2010). De plus, le modèle canin comporte l avantage de présenter une prévalence accrue de lymphomes chez certaines races (notamment les races Boxer, Bullmastiff et Bouvier Bernois) (Villamil et al. 2009). ]. Une étude menée sur le territoire français démontre l existence d une prédisposition raciale en particulier pour les races Boxer, Setter, Cocker et Berger Allemand (Pastor et al. 2009) A ceci, une distribution du type de lymphome en fonction de la race est décrit, en particulier une incidence élevé des lymphomes T est notée dans 10 races de chiens parmi lesquelles l Irish Wolfhound, le Siberian husky et le Shih Tzu (Modiano et al. 2005). Pastor et al. notent une forte prédisposition de la race Boxer pour les lymphomes de types T et une forte prédisposition des races Berger allemand et Rottweiler pour les lymphomes de type B (Pastor et al. 2009). 74

75 Avantages de Canis familiaris en tant que modèle pour la description génétique d une maladie (Shearing et Ostrander 2010) : - Le génome canin présente une plus grande homologie avec le génome humain que les autres modèles animaux - La population canine est divisée en races, créées à partir d un petit nombre de fondateurs et se reproduisant avec un réservoir de géniteurs de petite taille créant un fort taux d homogénéité génétique et réduisant l hétérogénéité des maladies. - Le chien est affecté par un grand nombre de maladies similaires à l homme, en particulier les maladies complexes comme les cancers. - Les cancers se déclarent de façon spontanée chez le chien, avec une prévalence proche de celle des cancers humains. - - Le chien et l homme partagent le même environnement, qui influence la déclaration des maladies et leur développement. B. Données cytogénétiques chez le chien B. Etudes des anomalies cytogénétiques associées aux LNHs canins 1. Observations d anomalies cytogénétiques à l aide des techniques conventionnelles La mise en évidence des premières anomalies chromosomiques associées aux LNHs canins date de la fin des années 1960 (Basrur et Gilman 1966) (Miles et al. 1970). Cependant, seul un petit nombre de cas est étudié, et aucune corrélation avec le sous-type ou le pronostic n est établie. Il s agit principalement d anomalies structurales, détectables à l aide d un caryotype seul, associées à des anomalies de nombre. Il est important de noter qu aucune coloration en bandes n est alors disponible et que la dénomination des chromosomes canins n est pas encore standardisée au niveau international. La première étude d envergure est réalisée en 1994 par Hahn KA sur un effectif de 61 chiens (Hahn et al. 1994). Les anomalies ont été observées sur des caryotypes avec colorations en bandes. Cependant, comme aucune nomenclature internationale n est encore disponible, les chromosomes sont classés par taille décroissante. L aneuploïdie est l anomalie la plus fréquente (43 sur 61 cas) et dans les 30 % restant, des translocations, résultant de la fusion centrale de deux chromosomes acrocentriques, sont observées (18 sur 61 cas). 75

76 Dans cette enquête, l anomalie chromosomique principale est majoritairement numérique plutôt que structurale. Les anomalies de nombre les plus fréquentes sont la trisomie 13 (15 sur 61 cas) et la monosomie 15 (9 sur 61 cas). 2. Observations d anomalies cytogénétiques à l aide des techniques de cytogénétique moléculaire a) Etudes des anomalies de nombre (1) Développement de technologies de cytogénétique moléculaire Les anomalies de nombre sont les plus fréquentes dans les LNHs canins, par opposition à leurs homologues humains. Leur description complète s est heurtée au manque de technologies cytogénétiques disponibles chez le chien. Ainsi, le développement des techniques d hybridation génomique comparative (CGH) (Dunn et al. 2000; Thomas et al. 2001) et des cartes cytogénétiques comparatives (Yang et al. 1999) a permis de poursuivre la caractérisation des anomalies cytogénétiques associées aux LNHs canins. (i) Hybridation génomique comparative L utilisation de l hybridation génomique comparative (CGH) (cf. II.B.2.b) est mise en place chez le chien. Il s agit d une appellation générique d un ensemble de techniques qui vise à comparer le nombre de copies d une séquence d ADN dans un échantillon avec celui d un ADN témoin. Cette technique permet une identification rapide, compréhensible du matériel génétique de l ADN des cellules cancéreuses (Dunn et al. 2000). La CGH ne permet en aucun cas de détecter les anomalies structurales sans changement du nombre de copies, en particulier les translocations. Cette technique est complétée par l utilisation de sondes FISH spécifiques de chromosomes pour identifier chaque chromosome canin (Thomas et al. 2001). Ce sont notamment 41 clones BAC issus de la bibliothèque de clones BAC RPCI-81 (Li et al. 1999). Le séquençage 7,6X du génome canin a permis d accroître considérablement la résolution de cette technique. Une sélection de clones BAC, issus de la bibliothèque CHORI-82 (Lindblad-Toh et al. 2005), espacés en moyenne d une mégabase, est utilisée pour confectionner une puce à ADN représentative du génome du chien pour la CGH. Cette technique, aussi appelée acgh, permet de détecter les délétions et amplifications partielles avec une très grande résolution (Thomas et al. 2003b). En médecine humaine, il est possible de détecter des anomalies à partir d une taille de 5 à 10 Kb. 76

77 (ii) Cartes cytogénétiques comparatives L étude des anomalies chromosomiques du chien est essentiellement abordée par comparaison avec les données humaines publiées. Ceci est permis par la conception de cartes cytogénétiques comparatives entre les deux espèces. Ces cartes montrent que le caryotype canin est parmi l un des plus réarrangés chez les mammifères (Yang et al. 1999). Sur les 22 autosomes humains, la synténie de seulement trois chromosomes (14, 20 et 21) est maintenue à l identique dans le génome canin (Derrien 2007). Ces cartes permettent de relier évolutivement certaines régions des chromosomes canins avec ces régions du génome humain. Un serveur internet AutoGRAPH, permettant la visualisation de cartes génomiques comparatives multi-espèces et identifiant les segments conservés et les points de cassures, a été développé et autorise ainsi une comparaison simple des séquences (Derrien 2007). (2) Analyses des anomalies de nombre récurrentes dans les LNHs canins Seul un petit nombre d études a été réalisé sur la caractérisation des anomalies de nombre. Elles sont menées par Racheal Thomas, exerçant au Department of Molecular Biomedical Sciences de l Université de l Etat de Caroline du Nord, USA. La mise en pratique de la CGH est utilisée sur une série de 25 cas de lymphomes nonhodgkiniens canins (Thomas et al. 2003a). Cette étude confirme la fréquence élevée de la trisomie du chromosome 13 (12 sur 25 cas, soit 48%). Ces observations seront complétées par l utilisation de l acgh sur une population de 150 chiens atteints de LNHs (Thomas et al. 2011). (i) Caractérisation des anomalies de nombre selon le phénotype Le niveau global d instabilité génomique observé dans les lymphomes non- Hodgkiniens canins (clnhs) est bas avec une proportion limitée du génome présentant une aneuploïdie hautement récurrente, quelques délétions homozygotes apparentes et pas de haut niveau d amplification génomique (Thomas et al. 2011). L aneuploïdie est restreinte de façon prédominante à une augmentation du nombre de copies des chromosomes 13 et 31. Les aberrations chromosomiques primitives récurrentes associées aux lymphomes de type B canins (cbcl) sont le gain des chromosomes 13 et 31 et une perte partielle du chromosome 26. Ce type de lymphome présente peu de déséquilibres génomiques. 77

78 L anomalie chromosomique la plus significativement associée à ce type de lymphomes est la délétion partielle du chromosome 26, détectée dans 69,8% des cas (Thomas et al. 2011). Les lymphomes de type T (ctcl) canins présentent une plus grande fréquence et une distribution plus importante d anomalies chromosomiques récurrentes, incluant le gain du CFA 6, 9, 13, 20, 29, 31, 36 et la perte des CFA 11, 17, 22, 28 et 38. On retrouve ainsi le gain des CFA 13 et 31 dans les deux phénotypes. La majorité des anomalies génomiques est observée dans les ctcl. L anomalie chromosomique de nombre la plus fréquente des ctcl est la délétion d une partie du chromosome 11, retrouvée dans 55,6% avec une plus grande prévalence dans les lymphomes T de haut grade (Thomas et al. 2011). La plus grande complexité et instabilité du génome des ctcl par rapport aux cbcl est retrouvé chez leurs homologues humains (Seto et al. 2010). (ii) Caractérisation des anomalies de nombre selon la race Les données sur la différence de prévalence spécifique de race des LNHs de type B et T (Modiano et al ; Pastor et al. 2009) ont amené à rechercher des anomalies génétiques spécifiques de races pouvant expliquer ces variations. (α) Relation Race-Phénotype Les données disponibles concernent 3 races : Le Golden Retriever, le Labrador Retriever et le Boxer (Thomas et al. 2011). Aucune anomalie chromosomique des cbcl n est significativement associée à une de ces trois races. Le nombre de copies du génome semble très conservé chez ces animaux. Les anomalies associées aux ctcl semblent plus fortement influencées par la race (pvalue faible). En particulier, la race Boxer présente une incidence importante du gain de chromosomes : CFA 6, 12, 20 et 31. (β) Cas de la Race Golden Retriever Dans une étude basée sur l analyse par CGH des anomalies récurrentes liées aux cbcl, une délétion au niveau du CFA 14 est objectivée (Modiano et al. 2005) avec une région minimale de perte située en CFA 14q Cette anomalie est spécifique des cbcl et est détectée dans la totalité des Golden Retriever du groupe d étude (7 cas sur 7) et chez 78

79 seulement 13% des chiens de races différentes (4 cas sur 31). Cette anomalie est significativement plus commune aux LDGC des Golden Retrievers qu à ceux d autres races. Cette région du chromosome 14 est reliée à deux régions distinctes du HSA 7 : 7p21- p15.1 et 7q21-q21.3. La délétion de la région HSA 7q21 a été documentée dans diverses hémopathies malignes humaines, incluant les leucémies myéloïdes aigues à prédisposition familiale tandis que la délétion 7p21-15 a été documentée dans un unique cas de MALT. Le bras court du chromosome 7 humain contient plus de 160 gènes et parmi eux les gènes codant la diacylglycérol kinase-β et l histone deacetylase-9 (Modiano et al. 2005). Deux autres anomalies significativement plus présentes dans les ctcl des Golden Retriever sont mises en évidence. Il s agit du gain des chromosomes CFA 15 et CFA 36. Ces chromosomes sont respectivement reliés aux régions chromosomiques HSA 4q31-21-q32.3 et 2q24.1-q32.2. Les gains de régions chromosomiques sont des événements rares impliqués dans les hémopathies malignes humaines. L étude de Thomas R, 2011, basée sur l analyse par acgh de 150 cas de clnhs dont 68 Golden Retriever, ne met en évidence aucune anomalie de nombre récurrente significativement plus présente chez les individus de race Golden Retriever (Thomas et al. 2011). (iii) Etude des anomalies récurrentes (α) Trisomie du CFA 13 Le gain du chromosome CFA 13 est retrouvé dans les deux phénotypes et dans six sous-types de LNHs canins et représente l anomalie de nombre la plus fréquente (12 sur 25 cas, soit 42%) (Thomas et al. 2003). Cette donnée est confirmée par une étude récente (Thomas et al. 2011) dans laquelle le gain du CFA 13 est détecté dans 55 cas des clnhs sur 150 soit environ 37%. Des études de cartographie comparative utilisant des techniques de peintures chromosomiques (Yang et al. 1999) et de cartes d hybrides d irradiation (Breen et al. 2001) révèlent que le chromosome 13 partage une synténie avec des sites de deux chromosomes humains : HSA 8q23-qtel et HSA 4pprox-qprox. La première de ces régions arbore l oncogène c-myc et la seconde l oncogène c-kit (HSA 4q12), Chic-2 (HSA 4q11-Q12) et Kdr (HSA 4q11-q12) (Mitelman et al. 2012). L activation de l oncogène c-myc est décrite comme un événement commun dans les LNHs humains. En effet, ce gène est très fréquemment impliqué dans des phénomènes de fusions aberrantes avec les loci des Ig dans les lymphomes B (cf. III). Le gain du chromosome 13 semble associé aux cbcl et aux ctcl avec des incidences comparables (respectivement 38,9% et 29,7% (Thomas et al. 2011)). De plus, le gain chromosomique semble similaire dans les deux phénotypes avec un gain de 39,7 Mb 79

80 dans les cbcl et 41,7 Mb dans les ctcl, ce qui constitue une longueur bien supérieure aux 10 Mb du locus du gène c-myc. Le gain du chromosome CFA 13 est un événement commun à un large spectre de cancers canins parmi lesquels l ostéosarcome, le gliome et les tumeurs prostatiques. Cette anomalie numérique est considérée comme intimement associée à la progression tumorale mais elle n est peut-être pas aussi fondamentale dans l oncogenèse que ne le suggère sa fréquence. (β) Gain du CFA 31 Le gain du CFA 31 est retrouvé dans les cbcl et ctcl. Le chromosome CFA 31 partage une synténie conservée avec le HSA 21 (Yang et al. 1999). L amplification du HSA 21 est fréquente dans bon nombre d autres cancers (les leucémies myéloïdes aigües par exemple). Certains gènes impliqués dans les hémopathies malignes humaines sont aussi arborés par cette région chromosomique : Olig-2 (HSA 21q22.1), Erg (HSA 21q22.3), Runx-1 (HSA 21q22.3) (Mitelman et al. 2012). (γ) Perte du CFA 11 Les analyses basées sur les techniques d hybridation génomique comparative (CGH) montrent que la perte du chromosome canin 11 (CFA 11) est l une des anomalies numériques les plus fréquentes dans les cas de ctcl (Thomas et al. 2003b). Conséquences moléculaires de la perte du chromosome CFA 11 Ce chromosome comprend le locus du gène Cdkn-2A (CFA 11q15dist-q16prox) et partage des régions extensives de synténie avec le chromosome humain 9 (HSA 9) (Thomas et al. 2005). Le gène Cdkn-2A (Cyclin-dependant kinase inhibitor 2A) est un gène suppresseur de tumeurs codant pour la protéine CDN2A/, ou MTS-1 (Multiple Tumeur suppressor 1) (Stone et al. 1995). Cette protéine joue un rôle important dans la régulation du cycle cellulaire. En effet, il s agit d un inhibiteur des kinases cycline-dépendantes (CDK). Ces dernières permettent la transition dans le cycle cellulaire des lymphocytes T par phosphorylation de la protéine suppresseur de tumeur Retinoblastoma (Rb) au niveau de sites spécifiques S249/T252 et/ou T826. En effet, le Rb est une protéine cruciale de la sénescence cellulaire. Son activité est très finement régulée par de multiples modifications post-transcriptionnelles, telles la phosphorylation ou l acétylation. L action supposée de Rb est de bloquer la cellule en phase 80

81 G1. La phosphorylation permise par les kinases cycline-dépendantes (CDK2, CDK4 et CDK6) lève l action de Rb, libérant le facteur de transcription E2F permettant l expression de gènes nécessaires à la réplication de l ADN (Ohtani et al. 2004). Figure 19 : Régulation du cycle cellulaire par la voie Rb (Lebart et al. 2012) L inactivation de cet inhibiteur est suspectée comment étant primordiale dans la pathogénie des hémopathies malignes humaines de type T (Even et Gartenhaus 2003). Ainsi la délétion ou la méthylation de est documentée dans les leucémies aiguës de type T et les lymphomes de type T de l adulte secondaires à l infection par le Virus T- lymphotropique humain de type 1 (HTLV-1), mais son importance dans la pathogénie des LNHs de type T non viraux n est pas déterminée. Distribution de cette aberration en fonction du sous-type Fosmire et al s intéressent à l exploration de l inactivation de la protéine dans les cas de LNHs canins. La sélection des cas de cette étude est centrée autour d une race majeure (32 individus sur 48 sont des Golden Retriever, chez qui la prévalence des lymphomes T et B est égale) mais la perte du chromosome 11 n apparaît pas comme spécifique de cette race. Cependant la taille modeste de la population étudiée ne permet pas de l exclure totalement. En revanche, la perte du CFA 11 et la diminution d expression de la protéine p16 est restreinte aux lymphomes T de haut grade (Lymphome T lymphoblastique et Lymphome T périphérique sans autre spécification). Cependant la diminution d expression de p16 est plus fréquente que la perte du CFA 11 (respectivement 100% et 66% des cas de lymphomes T de 81