Techniques de transgénèse chez la souris
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- Christophe Hébert
- il y a 8 ans
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1 UER Stratégies en Histologie Moléculaire Techniques de transgénèse chez la souris Christel BAUDET Dr. Sc. MCF Biologie cellulaire et Développement Mécanismes Centraux de Sensibilisation à la douleur
2 Récapitulatif : Transgénèse additive par micro-injection pro-nucléaire a) Surexpression b) Expression tissu-spécifique c) Étude de promoteur Day 1 Week 3 Week 7 Week 12 Week 15 Week 19 Week n Week n+3 Cloning Microinjection and Oviduct-Transfer Birth of pups Identification of Founder Mating of Founder Birth of pups Identification of het. mice Mating of het. mice Birth of hom. mice
3
4 La transgénèse chez la souris additive Au stade 1-cellule Insertion aléatoire Micro-injection pro-nucléaire ciblée Electroporation dans les cellules souches embryonnaires (cellules ES) Recombinaison homologue Injection dans blastocyte Infection lentivirale
5 Récapitulatif : Transgénèse ciblée par electroporation de cellules ES
6 La transgénèse ciblée Les constructions électroporées a) Knock-in b) Knock-out : Mutation nulle c) Knock-out Conditionnel : Mutation conditionnelle
7 La transgénèse ciblée b) Knock-out : Mutation nulle locus cible I II III Recombinaison homologue X gene d intérêt X vecteur de ciblage neo II III tk exon remplacé par le gène neo locus ciblé neo II III neo tk Gène de la Néomycine phosphotransferase (résistence au G418) Gène de la Thymidine kinase ( sensible au Gancyclovir) Régions homologues Regions non-homologues
8 Exercice de génotypage Choix des amorces! Souris A: +/- Souris B: +/+ Souris C: -/-
9 c) Mutation conditionnelle Modification génétique in vivo sous dépendance spatio-temporelle Spécificité spatiale : Systèmes Cre-Lox et Flp-frt (tissulaire) + Spécificité temporelle : Systèmes de Cre inductible Cre-ER Tet-on/Tet-off
10 Spécificité tissulaire Système Cre-Lox Dérivé du bactériophage P1 Vecteur de ciblage floxé, contenant deux sites loxp site loxp séquence spécifiques de 34 paires de bases L enzyme Cre recombinase reconnait les sites loxp et les apparie ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT TATTGAAGCATATTACATACGATATGCTTCAATA Cre recombinase loxp site
11 Spécificité tissulaire Système Cre-Lox La transgénèse ciblée Deletion / Integration Inversion A A Situation 3: Translocation
12 La transgénèse ciblée Délivrance de la Cre recombinase Injection de la protéine directement (in utéro) Délivrance par vecteurs viraux inhalation, injection intra-veineuse Croisement avec des lignées activatrices Souris transgéniques Cre
13 Puissance de l outil Cre-Lox en transgénèse murine Lignées activatrices (transgénèse additive ou ciblée) ubiquitaire inductible tissu-spécifique X Lignée foxée (transgénèse ciblée) Knock-out Knock-out conditionnel inductible Knock-out conditionnel
14 La transgénèse ciblée c) Mutation conditionnelle Modification génétique in vivo sous dépendance spatio-temporelle Spécificité spatiale : Systèmes Cre-Lox et Flp-frt (tissulaire) Spécificité temporelle : Systèmes de Cre inductible Cre-ER Tet-on/Tet-off
15 La transgénèse ciblée c) Mutation conditionnelle Modification génétique in vivo sous dépendance spatio-temporelle Spécificité spatiale : Systèmes Cre-Lox et Flp-frt (tissulaire) Spécificité temporelle : Systèmes de Cre inductible Cre-ER Tet-on/Tet-off
16 Spécificité temporelle La transgénèse ciblée Système inductible Cre-ER Système Cre/lox inductible par le Tamoxifène ER: Récepteur aux oestrogènes HSP: Heat Shock Protein
17 STOP LacZ
18 La transgénèse ciblée c) Mutation conditionnelle Modification génétique in vivo sous dépendance spatio-temporelle Spécificité spatiale : Systèmes Cre-Lox et Flp-frt (tissulaire) Spécificité temporelle : Systèmes de Cre inductible Cre-ER Tet-on/Tet-off
19 Spécificité temporelle La transgénèse ciblée Système tet-on / tet-off 1. Protéine de fusion (Tétracycline Activator : TA) VP16 tetr Domaine activateur Répresseur tétracycline 2. TATA Cre recombinase poly A Operon tet Promoteur minimal tétracycline = Doxycycline
20 Système tet-off La transgénèse ciblée En absence de tétracycline tta { VP16 tetr expression TATA Cre recombinase poly A tet Operon minimal Promotor En absence de tétracycline, la protéine de fusion peut se fixer et le gène rapporteur est exprimé. En présence de tétracycline Tétracycline (Doxycycline) VP16 tetr x Pas d expression TATA Cre recombinase poly A En présence de tetracycline, la proteine de fusion ne peut se fixer aux séquences teto et le gene rapporteur n est pas exprime.
21 Système tet-on En présence de tétracycline rtta { VP16 tetr* Tétracycline (Doxycycline) expression TATA Cre recombinase poly A En présence de tétracycline, la protéine de fusion peut se fixer aux séquences teto et le gène rapporteur est exprimé. En absence de tétracycline VP16 tetr* x no gene expression TATA Cre recombinase poly A En absence de tétracycline, la protéine de fusion ne peut se fixer et le gène rapporteur n est pas exprime.
22 Un modèle murin de tumeurs pancréatiques 1 souris / 3 transgènes K-Ras (LSLG12Vgeo) K-Ras (+) K-Ras (+/LSLG12Vgeo);ElastTA;Tet- O- Cre mice V12 ATG TGA * φ STOP A 4B 3 UTR IRES LacZ-neo φ A 4B 3 UTR K-Ras p21 3 UTR TetOff Cre bitransgénqiue Elastase tetr tta VP16 Doxycyclin (PJ Grippo & EP Sandgren) teto P CMV Cre
23 Etablissement d une lignée transgénique congénique Transgénèse ciblée Clônage (months) Sélection ES Day 1 ES-Cell Injection and Uterus-Transfer Week 3 Birth of pups Week 4-5 Identification of chimeric offspring by coat color Week 12 Breeding of chimeras Week 15 Birth of pups Week 16-17? Identification of germline transmission (agouti) Week 19 Identification of +/- mice Week n Mating of het. mice Week n+3 Birth of hom. mice (months)
24 Méthode alternative à l injection de cellules ES dans un blastocyste hôte Agrégation d embryons au stade morula 8 cellules avec des cellules ES recombinées
25 Influence du fond génétique Effects Alcohol preference Susceptible Strain C57Bl/6 Resistant Strain DBA/2J Asthma A/J C57Bl/6 Atherosclerosis C57Bl/6 BALB/c, A/J Morphin preference Visual problems Poor hippocampaldependent learning C57Bl/6 BALB/c, C3H 129, DBA DBA/2J
26 Les innovations en transgénèse murine
27 Souris Knock-Down (KD) Transgénèse classique (Lentiviral) ou ciblée
28 Souris Transgéniques BAC
29 1 Recombinaison homologue bactérienne 3 Croisement Gène endogène GabaB1 +/BAC-eGFP X Construction (transgène) BAC GabaB1-eGFP GabaB1 -/- 2 Transgénèse classique GabaB1-eGFP Construction (transgène)
30 4 Analyse des souris GABAb1- egfp
31 TAL-effector = TALE (specific DNA-binding domain) TALE: Proteins that are secreted by Xanthomonas spp. bacteria to alter gene transcription in host plant cells TALEN structure TALE structure
32 Talen ARNm injectés au stade 1 cellule Mosaïcisme fréquent des fondateurs (F0) car l ARNm serait souvent traduit après la première division non-homologous end-joining (NHEJ) Without the template for HR-mediated DNA repair, DSB will be repaired through error-prone NHEJ pathway, frequently resulting in deletion, insertion or substitution Ce qui existe: Random KO NHEJ: homme, bovin, C. Elegans, cricket, drosophile, xénope, levure, poisson zèbre Targeted in human cells by HDR
33
34 Une révolution: La méthode CRISPR/Cas9 Dérivée d un système de défense bactérienne contre l invasion de virus CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Cas protein: CRISPR associated (Cas) nuclease Protospacer Adjacent Motif (endogenous bacterial RNA)
35 Une révolution: La méthode CRISPR/Cas9 Adaptation pour la transgénèse The Cas9 nuclease is guided to the target DNA by a guide RNA (grna) which contains a sequence that matches the sequence to be cleaved. Efficient cleavage also requires the presence of 5 -NGG-3 Protospacer Adjacent Motif (PAM) sequences following the guide sequence. RNA-guided Cas9 creates site-specific double-stranded DNA breaks, which are then repaired by either non-homologous end joining (InDels) or homologous recombination. (Jinek et al., 2012).
36 Une révolution: La méthode CRISPR/Cas9 Un seul plasmide contenant les deux cassettes ou deux plasmides séparés
37 Low occurrence rate Anticancer drug Increasing effeciency
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