Comment mesurer la résistance aux antiviraux???

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1 Comment mesurer la résistance aux antiviraux??? Dr Marie-Laure Chaix Laboratoire de Virologie Hôpital Necker DIU de physiopathologie et thérapeutique des maladies infectieuses et tropicales (Module 1)

2 Pression de sélection antirétrovirale Début du traitement Variants sensibles Variants résistants Charge virale Suppression incomplète Défaut de puissance Taux plasmatiques insuffisants Défaut d observance Pré-existence de résistance Sélection de variants résistants Temps

3 TESTS DE RESISTANCE 3 APPROCHES Tests phénotypiques Tests génotypiques Test de phénotype virtuel

4 1 approche : les tests phénotypiques Définition: Test permettant de définir le caractère sensible ou résistant de la souche vis à vis de l antiviral après mise en culture Mesure des CI 50 et CI90%: concentrations d antiviral capables d inhiber de 50 à 90% la réplication du virus

5 Tests phénotypiques classiques Isolement VIH Surnageant (pic TI) Culture de l isolat viral en présence de concentration croissante de drogues Pur lymphocytes de donneur 2x10 6 /ml x 3ml Infection 2 heures-37 C 2 lavages ( λ ) AZT : Concentrations (125 µl/puits) concentrations finales (µm) : 0 0,01 0, 0 5 0,25 1,25 6,25 lymphocytes non infectés

6 Tests Phénotypiques : mesure directe de la sensibilité du virus Détermination de l IC50 (concentration de l'antiviral nécessaire pour inhiber 50% de la réplication du virus in vitro) Evaluation par rapport à une souche de référence IC 50 > 10 fois IC 50 virus sauvage Résistant

7 Tests phénotypiques Avantages : mesure directe de la sensibilité utile pour les virus qui poussent vite en culture 1 ou 2 antiviraux à tester Limites : Virus cultivable technique lourde et longue, laboratoire spécialisé évaluation d un seul antiviral à la fois Problème des lignées cellulaires Biais introduit par la sélection possible en culture cellulaire Index de sensibilité peut être difficile à définir (INTI) Intérêt dans la prise en charge non démontré (VIH) Coût très élevé

8 2 approche : les tests génotypiques Définition: test permettant de définir à certaines positions du génome, si les populations virales sont de type sauvage, mutées ou mixtes aux différents codons de résistance = détection des mutations impliquées dans la résistance Evaluation indirecte de la résistance Application aux Herpes virus, VHB, VIH, grippe

9 2 techniques Séquence des gènes impliqués dans la résistance (gène pol pour le VIH, VHB, CMV, gène thymidine kinase pour HSV, gène hémaglutinine pour la grippe..) Méthode de référence Recherche directe à partir des prélèvements Recherche spécifique de mutations «enzymes de restriction» Analyse de profils de restriction après amplification => mutation fréquente, environnement conservé ex : mutation de UL97 (R du CMV au ganciclovir) positions 460, 594, 595 modifiées dans 80% des souches résistantes

10 Résistance à la lamivudine VHB (mutation YMDD) TP spacer RT RNaseH Y63 YMDD a.a A B C D E NTP binding catalysis template and primer positioning

11 Mutations Mutations Associated Associated with with Resistance Resistance to to nrtis/ntrtis ntrtis nrtis/ntrtis ntrtis Version 2 Version 2 Zidovudine Zidovudine Didanosine Didanosine Zalcitabine Zalcitabine M M 41 L 41 L D K D 67 K 70 N 67 R 70 K N RL 65 K L 74 R 65 V 74 R V K T L 65 K 69 T 74 L R 65 D 69 V 74 R D V M M 184 V184 V M 184M V184 V L T K L T K W210 YF215 QE219 W YF QE Stavudine Stavudine M 41 M L 41 L D K V 67 D 70 K 75 V N 67 R 70 TMSA 75 N R TMSA L T K 210 L215T219K W210 YF215 QE219 W YF QE M K D K L Abacavir 41 M K D 70 K 74 L Abacavir L 41 R 65N 67 R 70V 74 L R N R V K Tenofovir K 65 Tenofovir R 65 E R Lamivudine 44 E Lamivudine D 44 D Updated on June Updated on June Y 115 Y F115 F V 118V I 118 I M L T K 184 M V L215T219K W210 YF215 QE219 V W YF QE M 184M VI 184 VI The International AIDS Society USA The International AIDS Society USA The International AIDS Society USA

12 Mutations sélectionnées par les NNRTI Efavirenz (EFV) L K V V Y Y G P I N M I CI L SA H P NVP L K V V Y Y G I N AM I CI CLH A Les mutations de résistance aux NNRTI sont localisées dans une région très étroite de la transcriptase inverse Une seule de ces mutations induit un changement conformationnel très important de l enzyme qui entraîne une résistance croisée aux molécules présentées ici

13 Mutations de résistance dans la protéase d après Kovari et al. HIV Res Wkp 2003

14 les mutations de résistance dans la protéase ont pour effet d agrandir le site de fixation des IP qui se fixent alors moins efficacement Protease sensible Protease résistante d après Kovari et al. HIV Res Wkp 2003

15 Tests génotypiques Recherche d une ou plusieurs mutations sur les gènes codant pour les gènes cibles des ARV (transcriptase inverse, protéase du VIH et gp41) reconnues comme étant associées à la résistance phénotypique aux différents antirétroviraux

16

17 ANRS AC 11 : GROUPE RESISTANCE INTERPRÉTATION DU GENOTYPE : ANALOGUES NUCLEOSIDIQUES ET NUCLEOTIDIQUES : VERSION 10; 0902 AZT 3TC ddi ddc d4t ABC TDF Mutations associées à la résistance V75M/S/A/T T215Y/F 2 mutations parmi : M41L, D67N, K70R, L210W, Q151M Insertion au codon 69 T215D/C/S, K219Q/E > 4 mutations parmi : M41L, D67N, L74V, M184V/I, L210W, T215Y/F T215Y/F > 2 mutations parmi : M41L, D67 N, K70R, L210W, T215D/C/S,K219Q/E Q151M Insertion au codon 69 M184V/I Insertion au codon 69 L74V > 2 TAMs dont T215Y/F Q151M Insertion au codon 69 Données insuffisantes pour établir des recommandations K65R + L74V + Y115F + M184V/I Q151M Insertion au codon 69 Insertion au codon 69 3 TAMs dont M41L ou L210W K65R Mutations associées à une «résistance possible» T215D/C/S Q151M K65R Données in suffisantes pour établir des recommandations L210W et au moins 2 parmi K219Q/E T215D/C/S : M41L, D67N, K70R, 4 mutations parmi : M41L, D67N, L74V, M184V/I, L210W, T215Y/F K65R TAMs = M41L, D67N, K70R, L2 10W, T215Y/F, K219Q/E

18 Les tests génotypiques Avantages standardisation, reproductibilité (évalué par des contrôles de qualité) aptitude à prédire la résistance clinique (réponse cv) aide à la décision (80%) Limites La qualité des résultats est liée à l expérience du laboratoire interprétation difficile des réactions croisées, nécessité de mise à jour pour l élaboration d un algorithme d interprétation (Groupe ANRS AC11) techniques longues (20 tests / semaine / technicien) ne détecte pas les populations virales minoritaires (<20%)

19 Indications du phénotype et du génotype HSV VZV CMV Phénotype facilité d isolement /- délai Génotype polymorphisme +++ +/- + diversité des mutations

20 Limites de l Interprétation des tests de résistance Site du prélèvement : souche de CMV étudiée est-elle la souche responsable de la symptomatologie? Niveau de résistance in vitro : concentration in vivo du médicament au site de l infection (exemple des implants oculaires) Intérêt de l association d antiviraux : GCV + foscarnet études insuffisantes aux résultats contradictoires Rôle des nouvelles mutations

21 Quelles sont les mutations à prendre en compte pour définir une résistance génotypique à 1 antiviral? 1. Les mutations identifiées à partir des tests phénotypiques (cad après la culture de la souche en présence d antiviral) «Mutations sélectionnées in vitro» 2. Construction de virus recombinants par mutagénèse dirigée et impact in vitro 3. Les mutations portées par les virus résistants sélectionnés chez les patients en échec de traitement «Mutations sélectionnées in vivo» 4. Les mutations de résistance qui ont un impact sur la réponse virologique (peuvent être identiques ou différentes des mutations sélectionnées in vitro ou in vivo)

22 Comment construire une règle d interprétation des tests génotypiques: construction d un algorithme Etablissement des règles Identifier les mutations ou les ensembles de mutations associés à la réponse virologique Bâtir le meilleur score possible de mutations Déterminer des classes de réponse virologique pertinentes cliniquement Prendre en compte les facteurs de confusion Validation Confirmer la capacité prédictive de la règle sur un échantillon indépendant Actualisation

23 JAGUAR trial overview (AI ) Randomized multicenter, double-blind, placebo-controlled Phase IV study Patients under stable antiretroviral therapy and virologic failure : plasma HIV RNA between 1, ,000 cp/ml CD4 cell count > 100/mm 3 no ddi nor tenofovir in baseline regimen ddi EC (400 or 250 mg qd according to weight) or placebo was added to baseline antiretroviral regimen (randomization 2/1) for 4 weeks Plasma HIV RNA levels (baseline, W2 and W4) and genotypic resistance testing (baseline and W4) were centralized and batched Primary endpoint: change in plasma HIV RNA from baseline to week 4 4

24 Mean Change in plasma HIV RNA from baseline (intent-to-treat analysis) Delta log HIV RNA 0,2 ddi Placebo 0-0,2-0, p < ,6-0, Week 0 Week 2 Week 4 n=109/58 n=108/55 n=106/55 5

25 Distribution of NRTI mutations at baseline ddi Placebo Mutations 9

26 Median decrease in HIV-1 RNA at week 4 and corresponding to a p-value 0.20 according to the presence or absence of the variant codon in the reverse transcriptase gene. Codons N Median decrease in HIV RNA 10 p value (Mann Whitney) M41 M 53-0,85 L 49-0,28 <.0001 D67 D N T69 T D L74 L V V118 V I L210 L W T215 T Y, F K219 K Q, E K70 K R M184 M V

27 Exemple Mutation à impact négatif Mutation à impact positif Site Codon No of isolates Median VL reduction at week 4 Wilcoxon P value M41 K70 M L K R < mutations were retained 8 with a negative impact (41, 67, 69, 74, 118, 210, 215, 219) 2 with a positive impact (70 and 184)

28 Combinations of mutations : P values of the univariate analysis (Jonckheere( Jonckheere-Tepstra) ) assessing the median decrease in viral load according to the number of mutations used in the step by step procedure of incorporation of mutations to the final set Combinations of mutations P value M41L M41L M184V/I M41L M184V/I + L74V M41L M184V/I + L74V + T69D M41L M184V/I + L74V + T69D + T215Y/F M41L M184V/I + L74V + T69D + T215Y/F K70R M41L M184V/I + L74V + T69D + T215Y/F K70R + K219Q/E

29 Réduction médiane de la charge virale à S4 selon le score génotypique de ddi M41L M184V/I + L74V + T69D + T215Y/F K70R + K219Q/E Décroissance de la CV plasmatique VIH-1 (log 10 ) p = Score génotypique Patients (n) Marcelin et al., AAC 2005

30 3 approche : Le phénotype virtuel (Virco) Définition: Test permettant de prédire la sensibilité phénotypique d un isolat en se basant sur son test génotypique de résistance Ce n est pas un test de sensibilité à chaque drogue (phénotype) mais un système d interprétation d un test génotypique

31 Database Virco Routine clinical testing Clinical trials Research collaborations Nucleotide sequence ( AAGTCT CCGCATGC ATA ) Genotypic data >224,000 Phenotypic data >72,000 >42,000 matched G/P samples virtualphenotype TM engine Clinical Outcomes Database Predicted mean foldchange values in IC 50

32 Phénotype Virtuel PLASMA (> 200 µl) Viral PR/RT gene isolation total RNA cdna extraction RT PCR PR/RT GENES (amplicon) PATIENT from plasma VirtualPhenotype TM input from sequence T C G A T G T A C Sequence Analysis Automated DNA sequencing

33 Poids des mutations de résistance Drogue-spécifique Contribution d une mutation est différente pour chaque drogue et peut être positive ou négative 184V: log FC pour AZT mais log FC pour 3TC Prise en compte des mutations individuelles et des interactions entre mutations Mise à jour de la database géno/phéno (6000 TPV NVP) Génotype AZT mutations RWF 35R,67N,69N,70R,103N, 122K,123E,135T,181C,1 84V,196E,215F,219Q,22 8H,272A,286A/T,293V,2 97A,348V,357M/R,360T, 376S,390R,399G 67N 70R 103N 181C 184V 215F 67N&122K 67N&184V 67N&272A 67N&390R 70R&184V 70R&215F 70R&219Q 184V&215F 215F&219Q NO MUTATIONS 0.03 LOG (FC) 0.76 FC 5.8

34 HAVANA Trial results: Patients with HIV RNA <400 c/ml at Week 24 (ITT) Genotype No Genotype Expert 69 % 49 % 59 % p = No Expert 46 % 36 % 41 % 58% p = % Tural, 4th ICAAC 2000,

35 Herpès simplex et résistance à l ACV Etude française (15 centres) Mai 1999-avril 2002 Résultats globaux Virus IC ID total Pts Souches Pts Souches Pts S HSV (3 [0,2%]) (36 [3%]) (39 [1,6%]) 2848 HSV (3 [0,5%]) (18 [5,4%]) (21 [2,2%]) 1075 Total 1855 (6 [0,3%]) (54 [3,6%]) (60 [1,8%]) 3923 Distribution des infections résistantes chez les immunodéprimés Nb de Pts % ACV résistant Greffe de moelle ,9 VIH 310 4,2 Hémopathie 512 2,1 Tr organe 201 2,5 J Clin Microbiol, 2004

36 Indications des tests génotypiques de R aux antirétroviraux Primo-infection Infection récente Initiation d un traitement Echec thérapeutique

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