Antiviraux ciblant les polymérases virales

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1 Antiviraux ciblant les polymérases virales Barbara Selisko Research Group Viral Replicases: Structure, Function & Drug Design Head: Bruno Canard Architecture et Fonction de Macromolécules Biologiques (AFMB) Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Université de la Mediterranée Aix-Marseille II Marseille, France Antiviraux = médicaments (composés chimiques) qui empêchent 1. une infection virale 2. la réplication de virus dans les cellules infectées baissent la virémie guérissent le patient infecté préviennent ou arrêtent une épidémie virale Alternative ou complément aux vaccines 1. pendant la phase d éradication (poliovirus) 2. développement impossible ou difficile (rhinovirus ou dengue virus) 3. vaccination exhaustive est couteux ou difficile (fièvre jaune, rougeole) 2 1

2 Cycle viral de Flavivirus (+ssrna) Interférence possible d antiviraux 3 Antiviraux - spécifiques contre un type de virus Acyclovir inhibiteur DNA polymérase Herpes virus Adefovir inhibiteur RT HBV Efavirenz inhibiteur RT HIV - à large spectre Cidofovir inhibiteur DNA polymérases Favipiravir (T-705) inhibiteur RNA polymérases Ribavirin 4 2

3 Exemples d antiviraux en clinique ou en développement virus infection médicament protéine ou étape cible aigüe ou chronique Herpes chronique Acyclovir polymérase (Herpesviridae) Tromantadine entrée (fusión) HIV(Retroviridae) chronique Enfurvitive entrée (GP41 fusion) Efavirenz polymérase Ritonavir protease Hepatitis B chronique Adefovir polymérase (Hepdnaviridae) Influenza A aigüe Amantadine M2 (Orthomyxoviridae) Onseltamivir neuraminidase (sortie) Arbidol entrée (fusión) HCV chronique Ribavirin polymérase / réplication (Flaviviridae) En développement Variole aiguë ST-246 F13L (maturation) (Poxviridae) Herpes chronique PNU polymérase HIV chronique Vicriviroc CCR5 (co-receptor) Influenza A, B aigüe Peramivir neuraminidase (sortie) Favipiravir (T-705) polymérase HCV chronique Valopicitabine polymérase VX-950 protease Rhinovirus aigüe WIN uncoating (Picornaviridae) Pleconaril VP1 (receptor-binding) 5 à large spectre Polymerases virales cibles d antiviraux par excellence activité primordiale pour la réplication des virus interviennent plusieurs fois pendant la réplication virale pour la génération d une copie du génome 7,000 à 250,000 réactions enzymatiques du transfert d un NTP ou dntp absence d homologues cellulaires (RdRp, RT) cibles antivirales établies (herpes, HIV, HBV) 6 3

4 23/09/09 Polymérases EC 2. Transferases EC 2.7. Transferases transferring phosphorus-containing groups EC Nucleotidyltransferases template-dependent EC EC EC EC DNA-directed RNA polymerase (DdRp) DNA-directed DNA polymerase (DdDp) RNA-directed RNA polymerase (RdRp) RNA-directed DNA polymerase (RdDp or RT) template-independent EC Polynucleotide adenylyltransferase (poly(a) polymerase) 7 Polymérases virales 250nm, 250kb DNA-directed RNA polymerase (DdRp) - variole (small pox) virus (dsdna) DNA-directed DNA polymerase (DdDp) - variole (small pox) virus (dsdna) - herpesvirus, varicella-zoster virus (dsdna) RNA-directed RNA polymerase (RdRp) - poliovirus (+ssrna) - flavivirus (+ssrna) - influenzavirus (-ssrna) 170nm, 125kb 50nm, 11kb 100nm, 13kb RNA-directed DNA polymerase (RdDp or RT) - HIV (+ssrna) - HBV (dsdna) 80nm, 10kb 42nm, 3kb 8 4

5 Rôle de polymérases pendant la réplication virale Replication production d une copie du génome (DdDp, RdRp) dsdna +/-ssrna dsrna new dsdna new +/-ssrna Transcription production des ARN messagers (DdRp, RdRp) mrna dsdna -ssrna mrna mrna Retro-transcription production d ADN complémentaire a partir d ARN (RT) +ssrna ou mrna dsrna/dna dsdna 9 Synthèse d ARN ou ADN toujours directionnelle du 5 au dépendent d une amorce DNA 5 pppa-pg-pc-pt-oh RNA 5 pppa-pg-pc-pu-oh Protéine NH NH 2 -Gly-Ala-Trp-Glu-NH-CH-CH HC H 2 C 2 C=O CO OH Ser-Pro----Asp-COOH ou de novo NTP as primer OH OH 10 5

6 Mécanisme commun pour tous les polymérases NTP «de novo» Protein R(D)NA 5 NTP à incorporer Active site contains two conserved Asp Template and primer are bound Mg 2+ A is bound and lowers the pka of the -OH facilitating catalysis NTP enters the active site with Mg 2+ B site actif nucleophilic attack of O at the αp formation de la liaison phosphodiester et du pyrophospate PPi incorporated NMP is moved out of the catalytic into the priming site a new cycle starts 11 5 matrice De novo initiation 5 site actif ppp PPP 2ème nucléotide à incorporer ppp PPP nucléotide amorce élément stabilisateur du NTP amorce Elongation mouvement de l élément stabilisateur 5 matrice site actif PPP +pp i 5 matrice amorce amorce 5 distributive 5 processive dissociation du complexe ternaire possible complexe ternaire stable accumulation de produits courts «abortifs» synthèse continue jusqu à la fin PPP 12 6

7 23/09/09 Structures des polymérases virales Exemple: RdRp phage 6 Cystoviridae (dsrna) RNA template NTP fingers thumb élémentdsrna stabilisateur du NTP amorce exit platform d initiation palm Asp catalytiques 13 Nter 30 kda not shown RdRp (55 kda) poliovirus (+ssrna) + dsrna product DdRp (98 kda) T7 bacteriophage (dsdna) + dsdna + RNA RNAseH Exonuclease p51not shown RT (heterodimer 66kDa + 51kDa) HIV (+ssrna) DNA/RNA primer/template RNAseH? DdDp (110 kda) herpes simplex virus (dsdna) + dsdna product 14 7

8 23/09/09 Polymérases virales même principe catalytique (deux Asp catalytique, Mg2+-dépendent) motifs catalytiques conservées (sous-domaine paume) grands principes d architecture similaires (fold «main droite», doigt-paume-pouce, position du template, entrée des (d)ntp, sortie du duplex) mais aussi beaucoup de différences entre eux (complexité) et des différences vers les enzymes cellulaires DdRp et RdRp cellulaire 3 six-stranded double psi-beta-barrel 15 Acyclovir (Aciclovir) Zovirax ou Activir acycloguanosine 2-amino-9-((2-hydroxyethoxy)methyl)-1H-purin-6(9H)-one Premier médicament antiviral (découverte 1977, premièrs essais cliniques 1982) Inhibiteur DdDp Herpesviridae (dsdna) HSV-1 - herpès oro-faciaux, HSV-2 - herpès génital VZV (varicella-zoster virus) varicelle, zona (éruption cutanée localisée et des douleurs à type de brûlures) EBV (virus d'epstein-barr) - mononucléose infectieuse (MNI) est une infection généralement bénigne, états grippales Infection aigüe, persistante (latente) 16 8

9 Acyclovir (Aciclovir) Mode of action HO Inhibiteur DdDp sous forme triphosphate Inhibition de la synthèse d ADN, compétitive versus dntps K i = 3 nm HSV-1 et HSV-2 DdDp (comparaison DdDp alpha humaine K i = 180 nm) Incorporation dans la chaine nascente terminaison de la polymérisation Accumulation de molecules d ADN courtes HSV DdDp haute affinité pour matrice/amorce finit par acyclo-gmp produits reste fixé dans le site actif Acyclo-GMP ne peut pas être excisé par l activité exonuclease -5 formation d un complexe «dead-end» 17 Derse et al. (1981) Journal Biological Chemistry 256:11447 Acyclovir (Aciclovir) Model of the «dead-end complex» en présence du prochain dntp 18 Liu et al. (2004) J Biol Chem 281:

10 Acyclovir (Aciclovir) Spécificité et absence de cytotoxicité Administration sous forme hydroxyle (molécules chargées ne traverse pas la membrane cellulaire) Conversion en monophosphate par la thymidine kinase virale (3000 plus effective que TK cellulaire) Conversion en di- et triphosphate par les kinases cellulaires thymidine Transport du ACVtriphosphate dans le nucleus inhibition de HSV DdDp 19 Acyclovir (Aciclovir) Problème de résistance Drug résistance - réponse naturelle à la pression sélective d un médicament - apparition des virus mutés plus sensible au médicament - plus rapide chez le virus ARN que ADN (DdDp avec correction par l activité exonucléase) - plus importante chez les personnes immunodéficientes la réplication virale est inhibé par le médicament mutations constantes pendant la réplication = quasi-espèces sélection des mutants résistants Mutants de résistance Herpesviridae - thymidine kinase n est pas active sur Acyclovir - DdDp n est pas affecté (mutations near the active site and at allosteric sites) 20 10

11 Acyclovir (Aciclovir) Alternatives Développement d inhibiteurs 2004 DdDp non-nucleosidiques criblage sur essai enzymatique DdDp 2002 interactions DdDp facteur processivité UL42 criblage sur essai interaction UL42-peptide DdDp 2002 helicase-primase criblage sur essai helicase La recherche de nouveaux inhibiteurs des Herpesviridae a repris! 21 Crumpacker et al. (2002) Nature Med 8:327 Efavirenz Sustiva ou Stocrin (4S)-6-chloro-4-(2-cyclopropylethynyl)-4-(trifluoromethyl)-2,4-dihydro-1H-3,1- benzoxazin-2-one Inhibiteur non-nucléosidique de la reverse transcriptase (NNRTI) Dicovery 1995 by drug design based on known NNRTIs chemical synthesis of variants «second generation» K i = 2.93 nm wild-type RT HIV-1 (in cell culture EC 50 <1.5 nm) inhibited RT mutants resistants against «first generation» NNRTIs 22 11

12 Efavirenz - Mode of action Inhibition de la synthèse d ADN, non-compétitive versus dntps et matrice Liaison à un site allostérique 10 Å du site active changement de la conformation des Asp catalytiques baisse d activité RT fingers thumb close-up backview palm efavirenz Cœur de la RT Asp catalytiques, RNA/DNA DNA 23 site actif normal site actif changé Efavirenz Utilisation Problème des NNRTIs développement rapide de résistance Utilisation en bi- ou tri-therapie = HAART (highly active antiretroviral therapy) efavirenz + zidovudine (NRTI azido-thymidine (AZT)) + lamivudine (NRTI - 2',3'-didéoxy-3'-thiacytidine (3TC)) efavirenz + tenofovir (NRTI adenosine analog) + emtricitabine (NRTI cytidine analog) Autres combinaisons possible La recherche des nouveaux inhibiteurs de la RT et de HIV est toujours très active! 24 12

13 O Ribavirin N NH 2 Rebetol, Copegas HO O N N 1-(β-D-Ribofuranosyl)-1H-1,2,4-triazole-3-carboxamid OH OH guanosine Antiviral à large spectre - découvert en 1972, active contre 16 virus DNA et RNA 2009 utilisé contre Respiratory syncytial virus (RSV) -ssrna (Paramyxoviridae) Lassa virus (LASV) -ssrna (Arenaviridae) Hanta virus -ssrna (Bunyaviridae) Hépatite C (HCV) +ssrna (Flaviviridae) HCV 170 millions de personnes infectées Chronicité dans 70-80% des cas Atteintes hépatiques graves Traitement interferon-α + ribavirin efficace dans 42 à 82% des cas (genotype!) 25 Ribavirin Mode of action complexe! ribavirin extracellulaire change la balance T-helper 1 et T-helper ribavirin intracellulaire induit la interferon signalling cascade (ISG) ribavirin-p inhibe inosine monophosphate dehydrogenase qui est responsable de la formation du GTP intracellulaire effet indirecte sur la RdRp virale 4. ribavirin-ppp est substrat et/ou inhibiteur de la RdRp 5. incorporation de ribavirin-ppp par la RdRp provoque de mutations 3 de 5 effet ne sont pas spécifique (large spectre) 26 13

14 Ribavirin Mode of action sur la RdRp ribavirin a une affinité pour la RdRp competition avec les NTP site actif ribavirin est incorporé en face de C et U ribavirin semble pas avoir un effet inhibiteur 27 Ribavirin perspective Tri-thérapie ribavirin interferon STATC (inhibiteurs spécifiques) Telaprevir (VX-950) Protease inhibitor Phase III clinical trial Johnson&Johnson Boceprevir Protease inhibitor Phase III clinical trial Schering-Plough Plus efficaces en tri-therapie avec interferon et ribavirin 28 14