MÉMOIRE DU DIPLÔME D ÉTUDES SPÉCIALISÉES DE BIOLOGIE MEDICALE

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1 UNIVERSITÉ DE NANTES UFR SCIENCES PHARMACEUTIQUES ET BIOLOGIQUES ANNÉE 2013 N 061 MÉMOIRE DU DIPLÔME D ÉTUDES SPÉCIALISÉES DE BIOLOGIE MEDICALE Soutenu devant le jury interrégional Le 2 décembre 2013 Par Pauline COMACLE Conformément aux dispositions du Décret n du 3 février THÈSE POUR LE DIPLÔME D ÉTAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE Apport de la PCR et du séquençage au diagnostic de sinusite fongique : à propos de 42 cas diagnostiqués au laboratoire de Parasitologie-Mycologie du CHU de Rennes Président : M. le Professeur Patrice Le pape Directeur de thèse : Mme le Docteur Florence Robert-Gangneux Membres du jury : M. le Professeur Franck Jegoux M. le Docteur Christophe Ruault M. le Professeur Jean-Pierre Gangneux 1

2 Remerciements A Monsieur le Professeur Patrice Le pape, Vous me faites l'honneur d'être mon président de thèse, veuillez trouver ici l'expression de ma reconnaissance et de mon profond respect. Merci de vous être déplacé jusqu à Rennes pour ma soutenance. A Madame le Docteur Florence Robert-Gangneux, Ça a été un véritable plaisir pour moi de travailler avec toi tout au long de se projet. Merci pour ta disponibilité, tes conseils avisés et tes précieuses relectures. A Monsieur le Docteur Ruault, Merci pour votre accueil chaleureux à la clinique où vous m avez même laissé travailler dans votre bureau. Grâce à vous j ai pu assister à une méatotomie, une expérience très enrichissante pour ce travail. A Monsieur le Professeur Franck Jegoux, Merci d avoir accepté de faire partie du jury de cette thèse et de juger mon travail. J ai apprécié vos conseils au début de cette étude qui m ont bien orientée pour la suite. A Monsieur le Professeur Jean-Pierre Gangneux, Trouve ici ma reconnaissance pour les ouvrages prêtés mais aussi pour ce coup de pouce dans ma bibliographie : un mars et ça repart! Merci aussi pour tes conseils pour mon voyage. 2

3 Je remercie également tous les membres du service de Parasitologie-Mycologie et plus particulièrement Sylviane qui m a beaucoup appris en Mycologie, Sorya qui est l assistante que tous les internes rêvent d avoir dans leur service! Je remercie l équipe de biologistes de Virologie pour m avoir permis de dégager du temps pour ce projet et pour vos encouragements. Vous êtes une équipe formidable, tant par votre dynamisme et votre bonne humeur que j ai beaucoup appréciés. Je tiens également à remercier tous les techniciens du plateau de biologie moléculaire, toujours prêt à me donner des conseils pour que je puisse réaliser au mieux mes manips, et plus particulièrement Daniel, Philippe, Jimmy, et aux techniciens de mycologie (Merci Martine pour cette belle tête!) A tous mes amis pharmaciens qui me sont très chers et avec qui j ai énormément partagé tout au long de ces années! On a fait bien plus que d aller en cours ensemble, et on est une team d enfer!! J ai hâte de vous retrouver à Giverny avant notre grand départ : Bertillon, Moutmout, Laeti, Cons, PO, Adri, et bien sure Alice qui a été une colloc et surtout une amie toujours présente! 3

4 Table des matières Liste des Figures 6 Liste des Tableaux 7 Liste des abréviations 8 1. Introduction Bibliographie des sinusites fongiques Anatomie du nez et des sinus Le nez et les cavités paranasales Les sinus paranasaux Les différents types de sinusites fongiques : présentations cliniques et diagnostic Sinusites chroniques non invasives Sinusites invasives Les principaux agents des sinusites fongiques Généralités sur les champignons Classification des espèces fongiques d intérêt médical d après leur mode de reproduction asexué Les principales espèces d Aspergillus Les hyalohyphomycètes autres qu Aspergillus Les phaéohyphomycètes ou dématiés Les mucorales Diagnostic des sinusites fongiques Techniques chirurgicales d exérèse Examen anatomopathologique Examen mycologique des prélèvements de sinus Matériels et méthodes Population d étude Examen mycologique Examen direct et culture Identification des champignons en culture Diagnostic moléculaire Extraction de l ADN à partir des prélèvements de sinus Quantification de l ADN extrait Amplification des régions ITS 1 et ITS

5 Migration des produits de PCR en gel d agarose Purification des produits de PCR Séquençage Généralités : la technique de séquençage PCR de séquençage Protocole de séquençage et analyse Résultats Description de la population Résultats des techniques mycologiques usuelles et de l anatomopathologie Résultats des techniques moléculaires Pour les prélèvements avec examen direct positif Pour les prélèvements avec examen direct négatif Tableaux cliniques des sinusites fongiques Discussion 73 5.Conclusion 81 Références bibliographiques 83 5

6 Liste des Figures Figure 1 : Coupe latérale de la face ( 13 Figure 2 : Vue de face : les sinus paranasaux ( 15 Figure 3 : Tomodensitométrie sinusienne montrant un comblement complet de la cavité sinusienne maxillaire droite avec présence d un corps étranger de tonalité métallique (flèche rouge) (collection Dr Ruault) 19 Figure 4 : Radio panoramique dentaire montrant une communication bucco-sinusienne après extraction, d après [16] 19 Figure 5 : Filaments mycéliens enchevêtrés dans une balle fongique, colorés au PAS (Anofel) 20 Figure 6 : Aspect macroscopique de truffe aspergillaire extraite d un sinus (collection Dr Ruault) 21 Figure 7 : Cascade d inflammation responsable des SFA, d après Marple et al. * Figure 8 : Mucine allergique coloré à l acide périodique Schiff ( 100), d après Chakrabarti et al. [11] 24 Figure 9 : Sinusite fongique invasive due à une zygomycose chez un patient diabétique de 57 ans 26 Figure 10 : IRM du massif facial en coupes coronale (a) et sagittale (b) en séquence pondérée T1 après injection de Gadolinium. Processus tumoral prenant toutes les cavités nasosinusiennes (flèche jaune) avec une extension orbitaire et endocrânienne (flèche rouge), d après Zainine et al.[29]. 28 Figure 11 : Schéma de la paroi des micromycètes ( 30 Figure 12 : Schéma de thalle cœnocytique [30] 32 Figure 13 : Schéma de thalle levuriforme [30] 32 Figure 14 : Schéma de thalle septé [30] 33 Figure 15 : Schéma récapitulatif de la classification des champignons d intérêt médical 33 Figure 16 : Appareil reproducteur des Aspergillus, d après Chabasse et al * Figure 17 : Appareil reproducteur asexué des mucorales, d après Chabasse et al [32] 41 Figure 18 : Méatotomie moyenne droite, TDM coronale en fenêtre osseuse 44 Figure 19 : Etapes de la méatotomie moyenne vues par voie endoscopique, d après Facon et al. [33] 44 Figure 20 : Abord du sinus maxillaire par voie endo-buccale, d après Delbet et al [35] 46 Figure 21: Examen direct de sinus positif avec têtes aspergillaires (photo prise au laboratoire) 48 Figure 22 : Schéma explicatif de la technique du drapeau, d après Guillaume et al [36] 49 Figure 23 : Représentation schématique des différentes régions de l ADN ribosomique * Figure 24 : Population d étude de prélèvements de sinus 55 Figure 25 : Diagnostic mycologique au laboratoire, exemple d Aspergillus fumigatus 56 Figure 26 : Schéma explicatif du principe du séquençage ( 59 Figure 27 : Types de prélèvements envoyés au laboratoire de mycologie de mai 2010 à avril Figure 28 : Résultats de mycologie et d anatomopathologie 65 6

7 Liste des Tableaux Tableau 1 : Caractéristiques des principales espèces d Aspergillus, d après Chabasse et a *33+l. 36 Tableau 2 : Caractéristiques de Fusarium solani et Scedosporium apiospermum, d après Chabasse et al * Tableau 3 : Caractéristiques des principales espèces de dématiés, d après Chabasse et al * Tableau 4 : Caractéristiques des principales espèces de mucorales, d après Chabasse et al * Tableau 5 : Caractéristiques cliniques des patients avec examen direct positif 64 Tableau 6 : Performances de la culture et de la PCR sur les prélèvements positifs au direct 66 Tableau 7 : Résultats mycologiques détaillées pour les 42 patients avec examen direct positif 68 Tableau 8 : Type de champignon en fonction de la positivité des cultures 68 Tableau 9 : Comparaison des caractéristiques (types de sinus atteints, signes cliniques, anatomopathologie et scanner) en fonction du type de sinusite 70 Tableau 10 : Comparaison des caractéristiques (type de sinus atteint, type de sinusites, signes cliniques, anatomopathologie et scanner) selon le terrain d immunodépression 71 7

8 Liste des abréviations Anb: assez nombreux Anti-TNF: Tumor necrosis factor BF: balle fongique CE: corps étranger CTC : corticoïdes ED : examen direct FTA : filament type aspergillaire ID : immunodépression ITS: Internal Transcriber Spacer MM : méatotomie moyenne Nb : nombreux NR : non réalisé NS : non significatif ON : obstruction nasale ORL : oto-rhino-laryngologie PCR : polymerase chain reaction PNE : polynucléaire éosinophile Qq : quelques RIMS : remaniement inflammatoire de la muqueuse sinusienne RFIMS : remaniement fibro-inflammatoire de la muqueuse sinusienne Rpm : rotations par minute Rr : rare RSC : rhino-sinusite chronique SCF : sinusite chronique fongique SF : sinus frontal SFA : sinusite fongique allergique SIL : système d information du laboratoire SMD : sinus maxillaire droit SMG : sinus maxillaire gauche SS : sinus sphénoïde TDM: tomodensitométrie Tnb: très nombreux 8

9 INTRODUCTION 9

10 1. Introduction Les sinusites se définissent comme une inflammation de la muqueuse d un ou plusieurs sinus paranasaux, ainsi que de la muqueuse nasale dans la majorité des cas ; c est pourquoi le terme rhinosinusite (RS) est plus approprié. On distingue les RS aigues des formes chroniques, dont la durée d évolution est supérieure à 12 semaines. Douleurs, troubles olfactifs, obstruction et écoulement nasal sont des symptômes caractéristiques de RS chroniques, qui affectent considérablement la qualité de vie des patients [1]. Avec une prévalence estimée à 10 % en Europe et 17 % aux Etats-Unis, la RS chronique atteint le rang de deuxième maladie inflammatoire chronique la plus fréquente dans les pays industrialisés et constitue la 5 ème cause de prescription d antibiotiques par les médecins généralistes [2]. L étiologie de ces RS semble être multifactorielle : inflammation d origine mécanique secondaire à des malformations anatomiques, dysfonctionnement du transport mucociliaire, allergie, immunodépression, infections d origine virale, bactérienne ou fongique. Ces dernières années, les sinusites fongiques ont fait l objet de nombreuses publications, et sont fortement suspectées par les cliniciens lors de sinusite maxillaire unilatérale chronique, puisqu elles représentent 15 à 20% des sinusites chroniques maxillaires [3]. Toutefois, la confirmation diagnostique de RS fongique s appuie sur les examens anatomopathologique et mycologique. Une quantité non négligeable de prélèvements de sinus envoyés à des fins diagnostiques au laboratoire de mycologie ne poussent pas sur les milieux de culture usuels de mycologie, quand bien même l examen direct est positif. Cette constatation nous a conduits à nous intéresser aux méthodes de biologie moléculaire afin de permettre l identification des champignons en cause. Ainsi, après quelques rappels anatomiques, nous détaillerons les différentes formes de sinusites fongiques et leurs présentations cliniques ainsi que les principaux agents fongiques responsables. Enfin nous détaillerons le diagnostic de ces sinusites au laboratoire, et plus particulièrement le diagnostic moléculaire. 10

11 BIBLIOGRAPHIE DES SINUSITES FONGIQUES 11

12 2. Bibliographie des sinusites fongiques 2.1. Anatomie du nez et des sinus Le nez et les cavités paranasales Anatomie du nez Le nez comporte une charpente osseuse dans la partie supérieure, et cartilagineuse dans la partie inférieure, délimitant l entrée des fosses nasales. Les fosses nasales ellesmêmes, droites et gauches sont séparées sur la ligne médiane par le septum nasal ostéocartilagineux, mesurant 3cm de hauteur et 8cm de profondeur Fonctions du nez Le nez est un organe essentiel de la respiration. Il appartient à l étage supérieur des voies aériennes. Il permet le passage de l air inspiré de l extérieur jusqu au rhino-pharynx. Il représente à lui seul 90% des résistances des voies respiratoires. Il a un rôle de filtration et de protection : les formations pileuses du vestibule nasal (vibrisses) assurent un filtre capturant les particules inhalées telles que les spores fongiques aéroportées. Le film muco-ciliaire assure le transport antéropostérieur de l ensemble de ces particules. Par ailleurs, une barrière supplémentaire est assurée par la présence de glycoprotéines de type lysozyme, qui agissent comme barrière défensive conjointement avec les IgA sécrétoires. Il a également un rôle d humidification et de réchauffement : l air inspiré est réchauffé à 30 C et humidifié à 95%, grâce à une importante vascularisation ainsi qu à de nombreuses glandes muco-sécrétantes. Les variations d humidité et de température de l air inspiré sont donc limitées. Enfin, le nez est l organe de l odorat, les neurones olfactifs étant situés à hauteur du cornet supérieur [3] Les parois latérales du nez La paroi latérale des cavités nasales comporte une série de reliefs appelés cornets. 12

13 Les cornets Les cornets sont des formations osseuses enroulées sur elles-mêmes, à concavité latérale. Classiquement, trois cornets sont dénombrés de chaque côté : inférieur, moyen et supérieur. Ils sont recouverts d un épithélium de type respiratoire et comportent un tissu érectile. Entre ces cornets, existent des espaces appelés méats, qui sont le lieu de drainage de la voie lacrymale et des sinus Les méats de drainage Les méats sont les espaces aménagés sous les concavités des cornets. On distingue 3 méats différents : Le méat inférieur : il est situé sous le cornet inférieur et reçoit le canal lacrymal. Il permet de drainer les larmes dans le nez. Le méat moyen : il est situé entre le cornet inférieur et le cornet moyen. C est le lieu de drainage de tous les sinus antérieurs de la face soit le sinus maxillaire, le sinus frontal et la partie antérieure du sinus ethmoïdal. Le méat supérieur : il est situé entre les cornets moyen et supérieur. Il draine les sinus postérieurs de la face, soit la partie postérieure du sinus ethmoïdal. Par ailleurs, le sinus sphénoïdal possède un orifice propre, indépendant de ces méats. Figure 1 : Coupe latérale de la face ( 13

14 Les sinus paranasaux Définition des sinus Les sinus paranasaux sont des cavités osseuses aériennes, recouvertes d une muqueuse respiratoire, avec un drainage mucociliaire unidirectionnel vers le nez. Ils sont reliés aux fosses nasales par un orifice de drainage, l ostium, qui s abouche au niveau des méats nasaux et qui permet l écoulement des sécrétions et leur aération Anatomie des différents sinus paranasaux Les sinus ethmoïdaux Ils sont constitués de cavités cellulaires situés en dedans des orbites et sous l étage antérieur de la base du crâne, et sont divisés en deux parties, une antérieure et une postérieure. Les cellules ethmoïdales antérieures se drainent dans le méat moyen et les cellules ethmoïdales postérieures se drainent dans le méat supérieur. Ils sont les seuls sinus entièrement pneumatisés dès la naissance, et grandissent jusqu à l âge de 12 ans Les sinus maxillaires Les sinus maxillaires sont les sinus les plus grands et ont une forme de pyramide triangulaire. Ils sont présents dès la naissance mais s individualisent vers l âge de six ans. La face postérieure répond aux espaces profonds de la face. La face supérieure entre dans la composition du plancher de l orbite et contient le canal du nerf sous-orbitaire. Le plancher du sinus maxillaire (ou paroi inférieure) est en rapport avec les alvéoles dentaires qui y font une saillie plus ou moins marquée. Les dents sinusiennes sont la deuxième prémolaire et les deux premières molaires de l arcade dentaire supérieure. A l état physiologique, une mince couche de tissu spongieux sépare les dents sinusiennes de la cavité du sinus maxillaire. Au niveau des fosses nasales, l orifice de drainage est situé dans le méat moyen Les sinus frontaux Ils sont situés entre l orbite en bas et l étage antérieur de la base du crâne en arrière. Ils apparaissent vers l âge de 2 ans et s individualisent vers l âge de 8 ans. Il existe de grandes variations de taille des sinus frontaux d un individu à l autre et d un côté à l autre. L orifice de drainage se situe dans le méat moyen via l ethmoïde antérieur. 14

15 Les sinus sphénoïdaux Les sinus sphénoïdaux sont creusés dans l os sphénoïde. Ils sont bilatéraux et fréquemment asymétriques en taille Ce sont les sinus les plus enfouis dans le massif facial. Ils se situent au-dessus du rhinopharynx et en arrière des fosses nasales et apparaissent annexés à l ethmoïde postérieur. Leur développement débute vers un an et se poursuit jusqu à l adolescence. Figure 2 : Vue de face : les sinus paranasaux ( Fonction des sinus paranasaux Les sinus ont plusieurs fonctions : Alléger la tête : il s agit d une évolution phylogénétique l os n étant pas plein, la tête moins lourde, autoriserait ou faciliterait la bipédie. Protéger : ils permettraient de protéger le cerveau des chocs, au même titre que la boîte crânienne, en aménageant des ligues de force au sein du massif facial. Sécrétions sinusales : la sécrétion d eau participerait à l humidification de l air inhalé. 15

16 2.2. Les différents types de sinusites fongiques : présentations cliniques et diagnostic Il existe deux types de sinusites fongiques : les sinusites fongiques invasives et les sinusites chroniques non invasives comprenant les balles fongiques (BF) et les sinusites fongiques allergiques (SFA) [4] Sinusites chroniques non invasives Les sinusites chroniques sont diagnostiquées lorsque des symptômes nasosinusaux, confirmés par endoscopie nasale, persistent pendant plus de douze semaines. L académie américaine d oto-rhino-laryngologie propose des critères diagnostiques de sinusite chronique [5] : Durée 12 semaines de 2 des symptômes suivants : -Drainage mucopurulent -Obstruction nasale -Douleur/pression/ impression de plénitude faciale -Diminution de l odorat ET Inflammation objectivée par un ou plusieurs critères -Endoscopie: pus, œdème de la muqueuse ou polypes -Image montrant une inflammation des sinus paranasaux Sinusites chroniques type balle fongique Physiopathologie La balle fongique, ou mycétome est une masse mycotique, due le plus souvent au développement de champignons de type Aspergillus dans le tractus naso-sinusien [6]; c est pourquoi elles sont parfois nommées aspergillome de manière abusive par les cliniciens sans preuve mycologique. Les sinusites fongiques sont très souvent rattachées à une origine dentaire, dans 84% des cas de sinusites fongiques pour certains auteurs [7], du fait du rapport anatomique étroit des sinus maxillaire avec les dents et liées à un dépassement de pâte dentaire au niveau apical intrasinusien [8]. La présence d un corps étranger dentaire non 16

17 résorbable et irritant, contenant différents métaux dont du zinc en général associé à de l eugénol, du formaldéhyde, du chlorure de benzalkonium, entretiendrait des phénomènes inflammatoires et/ou infectieux au sein d un écosystème favorable au développement local d une mycose sinusienne. En effet, le zinc, présent sous forme d oxyde de zinc dans la pâte canalaire des traitements endodontiques, est un facteur de croissance pour les Aspergillus sp [9], malgré son association à l eugénol (eugénate de zinc) qui a des propriétés fongistatiques et fongicides [10]. En revanche, l origine dentaire des balles fongiques du sinus sphénoïde semble exclue; c est la voie aérienne qui semble la plus probable [7] Clinique Le tableau clinique de la balle fongique est aspécifique et concerne exclusivement l adulte immunocompétent. Il s agit d une sinusite chronique paucisymptomatique, rebelle au traitement médical (qui comporte des antibiotiques, des vasoconstricteurs locaux et/ou des corticoïdes locaux). L unilatéralité des symptômes tels que rhinorrhée purulente ou mucopurulente antérieure ou postérieure, mouchage de croûtes, cacosmie ou dysosmie sont des signes qui orientent les cliniciens [6]. Les céphalées et algies faciales sont plus fréquentes dans les localisations sphénoïdales [4]. Dans certains cas, il s agit d une découverte radiologique fortuite, lors d un examen systématique avant chirurgie cardio-thoracique, ou recherche de foyer infectieux avant la mise sous traitement immunosuppresseur. Certains auteurs décrivent une infestation fongique saprophyte qui correspond à une simple colonisation du nez ou des sinus paranasaux, sans symptômes, qui peuvent être détectés par endoscopie. Il a été décrit qu'une croissance supplémentaire du champignon peut conduire à la formation d'une balle fongique [11] Localisation des balles fongiques L atteinte unilatérale du sinus maxillaire est majoritaire mais quelques cas de sinusite maxillaire bilatérale ont été rapportés [11]. Les localisations sphénoïdales isolées occupent la deuxième position en termes de fréquence [6,12]. Les mycoses non invasives isolées des sinus frontaux, des sinus ethmoïdaux et des cavités nasales sont beaucoup plus rares [13]. 17

18 Imagerie : tomodensitométrie Le scanner ou TDM, utilise les rayons X qui traversent les tissus en fonction de leur densité, afin de réaliser des images en coupes axiales et fines. En permettant de visualiser les parois et le contenu des principaux sinus de la face, il est l examen de choix pour réaliser un bilan lésionnel précis des cavités sinusiennes. Certains signes, et plus encore leur association, font évoquer une étiologie fongique de la sinusite : -comblement unilatéral, souvent hétérogène d une, ou plus rarement de plusieurs cavités nasosinusiennes [14,15], -présence de corps étranger intrasinusien de tonalité métallique, -existence de calcifications ou de microcalcifications au sein du comblement sinusien, signe pathognomonique de l atteinte fongique, -épaississement des parois osseuses de la cavité infectée, avec destruction éventuelle de la paroi médiale du sinus maxillaire, qui sont des signes de chronicité de l atteinte sinusienne. Par ailleurs, les aspects TDM de polysinusite ou de pansinusite unilatérale sont assez fréquents mais l atteinte ethmoïdale ou ethmoïdo-frontale paraît le plus souvent réactionnelle (non fongique) à la sinusite maxillaire fongique [4]. 18

19 Figure 3 : Tomodensitométrie sinusienne montrant un comblement complet de la cavité sinusienne maxillaire droite avec présence d un corps étranger de tonalité métallique (flèche rouge) (collection Dr Ruault) Figure 4 : Radio panoramique dentaire montrant une communication bucco-sinusienne après extraction, d après [16] Examen anatomopathologique L exérèse de la balle fongique permet de réaliser les examens anatomopathologiques et mycologiques. Dans les cas de sinusite de type balle fongique, la muqueuse sinusienne n est pas envahie par les filaments mycéliens, contrairement aux formes invasives. Cependant 19

20 une inflammation de la muqueuse sinusienne, caractérisée par un infiltrat lymphoplasmocytaire et de polynucléaires neutrophiles, avec parfois quelques éosinophiles peut être observé [17]. L analyse microscopique permet de mettre en évidence une masse contenant des filaments mycéliens enchevêtrés, localisés soit dans le mucus, soit posés sur la muqueuse [18]. Figure 5 : Filaments mycéliens enchevêtrés dans une balle fongique, colorés au PAS (Anofel) Examen mycologique Le champignon le plus souvent mis en cause est Aspergillus fumigatus [4,19,20].Cependant, d autres espèces d Aspergillus (A.flavus, A.niger, A.nidulans..) ainsi que d autres champignons tels que Scedosporium apiospermum, sont retrouvés [20]. 20

21 Traitement Le traitement consiste en l ablation de la balle fongique de la, ou des cavités sinusiennes infectées. Il est donc chirurgical, le plus souvent par voie endoscopique endonasale sous contrôle optique et anesthésie générale [6]. Le but de la chirurgie est d élargir les méats du sinus maxillaire afin de drainer le sinus et de permettre l exérèse de la masse mycotique. Aucun traitement antifongique par voie locale ou générale n est nécessaire. Figure 6 : Aspect macroscopique de truffe aspergillaire extraite d un sinus (collection Dr Ruault) Sinusites fongiques allergiques (SFA) Physiopathologie Le concept de SFA est encore discuté et n a toujours pas trouvé de critères diagnostiques consensuels. Il s inspire du modèle de l aspergillose broncho-pulmonaire allergique (ABPA) puisque pour certains auteurs, la SFA serait un équivalent ORL de l ABPA. Une des premières hypothèses physiopathologiques a été avancée par Manning et al. en 1989 [21]. Certains individus à terrain atopique, exposés à des champignons via la respiration normale et l inhalation de spores, développeraient une stimulation antigénique. Il s ensuit une réaction inflammatoire médiée par les réactions d hypersensibilité de type I (IgEdépendante) et III (IgG dépendante) de la classification de Gels et Coombs. Cette inflammation conduirait à une obstruction du sinus, qui peut être accentuée par des facteurs anatomiques tels qu une déviation septale. Plus récemment, il a été suggéré que la cascade inflammatoire décrite dans la figure 7, menant à une SFA, est multifactorielle et requièrt une hypersensibilité médiée par les IgE 21

22 (atopie), une exposition à certains champignons, et une mauvaise défense locale des muqueuses [22]. Figure 7 : Cascade d inflammation responsable des SFA, d après Marple et al. [22] Clinique La symptomatologie clinique de la SFA est celle d une sinusite fongique chronique rebelle aux traitements médicamenteux et chirurgical. Des signes aspécifiques de sinusite tels que mouchage purulent, obstruction nasale, anosmie, voire algies faciales sont retrouvés. Une polypose nasosinusienne est souvent observée [22] Critères diagnostiques Certaines équipes ont proposé des critères diagnostiques se rapprochant des critères diagnostiques de l ABPA. Pour Schubert et al [23], les patients ayant une SFA, présentent une rhinosinusite chronique avec des polypes nasaux, un taux élevé d IgE totales dans le sérum, des images caractéristiques au scanner tel qu un comblement polysinusien, et la présence dans le sinus d une mucine allergique «peanut buttery» contenant du matériel riche en polynucléaires éosinophiles et en filaments mycéliens. En réalité, les critères diagnostiques sont mal définis et changent selon les études. Pour certaines équipes, seule la présence d une mucine allergique contenant des filaments mycéliens est indispensable [24]. Granville et al. considèrent même que les patients ayant un infiltrat d éosinophiles sans filaments mycéliens 22

23 sont atteints de SFA [24]. C est pourquoi Chakrabati et al. proposent plusieurs dénominations selon les critères diagnostiques : SFA caractérisée par une mucine allergique, des filaments mycéliens à l examen direct ou à la culture et augmentation des IgE spécifiques dirigés contre certaines moisissures, ainsi que sinusite fongique à éosinophiles (SFE) et sinusite à mucine éosinophile (SME). Les deux dernières entités sont caractérisées par un taux d IgE spécifique dirigés contre des moisissures normal, et diffèrent par la présence (SFE) ou l absence (SME) d éléments fongiques à l examen direct [11] Imagerie : tomodensitométrie L imagerie prise isolément n est pas spécifique de la SFA mais elle peut être évocatrice dans un contexte donné : -imagerie de pansinusite ou de polysinusite uni- ou bilatérale, symétrique ou non, avec parfois un aspect pseudotumoral -image de comblement souvent hétérogène des cavités sinusiennes, et de remaniements osseux -image de rétention liquidienne avec bulles d air et contour finement festonné de la muqueuse sinusienne [15] Anatomopathologie Macroscopiquement, la mucine allergique des sinus a une consistance épaisse et très visqueuse et sa couleur varie de l ocre clair au brun ou vert fonçé [22]. L examen microscopique de la mucine allergique met en évidence des agrégats de polynucléaires éosinophiles altérés, des cristaux de Charcot Leyden, ainsi que des filaments mycéliens en général en faible quantité. L examen de la muqueuse ne montre pas d envahissement tissulaire. 23

24 Figure 8 : Mucine allergique coloré à l acide périodique Schiff ( 100), d après Chakrabarti et al. [11] Tests immunologiques Plusieurs tests immunologiques sont disponibles afin d étayer la nature allergique de la sinusite chronique. Cependant, il n existe pas de critères stricts qui permettent de classer la RSC en SFA en fonction des résultats des différents dosages. Le nombre de polynucléaires éosinophiles dans le sang, les IgE totales dans le sérum et les IgE spécifiques de certaines moisissures telles que Aspergillus fumigatus, Alternaria peuvent, en cas d augmentation, orienter le clinicien vers une réaction d hypersensibilité de type I Mycologie La SFA est essentiellement liée à Aspergillus sp (A.fumigatus, A.flavus) en France, et à des dématiés (Alternaria sp, Bipolaris spicifera, Curvularia lunata) aux Etats-Unis [20,23] Traitement Il n y a pas d étude prospective contrôlée publiée pour le traitement des SFA. La première étape du traitement consiste à retirer chirurgicalement le maximum de mucus, et à rétablir la ventilation et le drainage des cavités sinusiennes infectées. De plus, en post-opératoire, une corticothérapie par voie locale mais aussi générale est mise en route, en s inspirant de protocoles utilisés dans l ABPA. Faute d études à long terme, les doses et la durée de cette corticothérapie ne sont pas précisées. Les antifongiques locaux et systémiques sont inefficaces [22]. 24

25 Sinusites invasives Les sinusites fongiques invasives sont classées en deux catégories, les sinusites fulminantes d évolution très rapide et de très mauvais pronostic, et les sinusites chroniques invasives d évolution beaucoup plus lente. La présence de filaments mycéliens au sein des muqueuses, sous-muqueuses, vaisseaux, ainsi que des os, à l examen anatomopathologique signe une forme invasive [6] Sinusites fongiques invasives fulminantes Définition Les sinusites invasives fulminantes sont rares et touchent en premier lieu les patients immunodéprimés (malades neutropéniques atteints de maladies hématologiques, greffés de moelle osseuse, décompensation acido-cétosique de diabète). Leur pronostic est très sévère avec une mortalité pouvant atteindre 80% [15,25] Clinique La survenue d une tuméfaction jugale chez un patient immunodéprimé est très évocatrice, surtout si elle est associée à une fièvre et à des signes nasaux (congestion, rhinorrhée, épistaxis) [20]. Par ailleurs, l apparition d un œdème palpébral, d une exophtalmie, d une ophtalmoplégie, d une diminution de l acuité visuelle peuvent être les signes d une infection de l orbite [25]. L invasion tissulaire par le champignon entraine des lésions rapidement évolutives, responsables de nécrose extensive vasculaire et osseuse, entraînant de graves troubles oculaires et cérébraux. En effet, l invasion et la nécrose tissulaires gagnent les structures de voisinage des sinus (orbite, palais, base du crâne), et sont à l origine de troubles visuels, d une thrombose du sinus caverneux, voire d un envahissement méningo-encéphalique qui alourdissent notablement le pronostic Imagerie : endoscopie, TDM et IRM L endoscopie permet de mettre en évidence des modifications de la muqueuse nasale à type d ulcérations, de granulations ou de décoloration avec souvent présence de croûtes. 25

26 L imagerie TDM permet le bilan d extension en visualisant les opacités nasosinusiennes, les lyses osseuses et l extension orbitaire, voire endocrâniennes. L imagerie IRM permet de préciser les extensions en particulier orbitaire et intracrâniennes mais évalue moins bien les lésions osseuses que le TDM [15]. Figure 9 : Sinusite fongique invasive due à une zygomycose chez un patient diabétique de 57 ans (a) La TDM montre une augmentation de l atténuation des cellules ethmoïdales antérieures et postérieures gauches avec une destruction de la paroi interne de l orbite gauche au niveau de la flèche. (b) Abcès sous-périosté de l orbite gauche. A noter également la destruction de l étage orbitaire et l atténuation accrue des sinus maxillaires gauches adjacents, d après Aribandi et al. [14] Anatomopathologie Les biopsies multiples cherchent à identifier un envahissement fongique des tissus, une atteinte osseuse et des thromboses vasculaires. Ainsi, l examen histologique permet de visualiser la croissance des champignons au niveau de l intima des vaisseaux qui entraîne une dissection de la media. C est la prolifération du champignon dans la lumière des vaisseaux sanguins qui est responsable d une dysfonction endothéliale entraînant des vascularites avec thromboses et hémorragies [11] Mycologie Les champignons les plus souvent mis en cause, sont les mucorales (Rhizopus, Absidia, Rhizomucor et Mucor), les Aspergillus sp [18,25,26] et plus rarement les dématiés (Alternaria sp, Bipolaris) [27]. 26

27 Traitement Le traitement associe chirurgie d exérèse des lésions tissulaires et traitement antifongique par voie générale. La diversité clinique des sinusites fongiques et le statut immunitaire des patients conduit à des traitements empiriques, le plus souvent par l amphotéricine B, antifongique à large spectre utilisé par voie IV sous forme liposomale. En fonction de l antifongigramme ou de l évolution clinique, d autres antifongiques de la famille des azolés, tels que le voriconazole, plus actif sur les Aspergillus sp et utilisable par voie IV ou per os ou, le posaconazole, l itraconazole peuvent être utilisés en relais de l Amphotéricine B [20] Sinusites chroniques invasives granulomateuses Les sinusites chroniques invasives granulomateuses sont rares en France et sont principalement décrites sous des climats tropicaux secs, en Inde, au Soudan, en Arabie Saoudite, avec quelques cas décrits aux Etats Unis. Elles touchent en général des patients jeunes et immunocompétents [28] Clinique L aspect clinique est peu spécifique, il s agit d une sinusite chronique unilatérale d allure progressive, dont l atteinte maxillaire est la localisation la plus fréquemment rapportée. Le développement peut se faire à bas bruit sur des mois voir des années. Des signes cliniques non spécifiques tels qu obstruction nasale, rhinorrhée, et douleurs sont fréquents. Plus tardivement la sinusite peut se révéler sous la forme d un bombement vestibulaire jugal ou d une exophtalmie. Dans les formes très évoluées, des extensions basicrâniennes sont possibles avec une atteinte des paires crâniennes [15] Imagerie : tomodensitométrie La TDM met en évidence une opacité sinusienne souvent irrégulière, avec lyse osseuse très évocatrice et extension vers les organes adjacents. 27

28 Figure 10 : IRM du massif facial en coupes coronale (a) et sagittale (b) en séquence pondérée T1 après injection de Gadolinium. Processus tumoral prenant toutes les cavités nasosinusiennes (flèche jaune) avec une extension orbitaire et endocrânienne (flèche rouge), d après Zainine et al.[29] Examen anatomopathologique Les biopsies mettent en évidence dans les formes typiques, des granulomes inflammatoires à cellules géantes, avec une fibrose. L infiltrat inflammatoire est polymorphe sans spécificité, et la présence de foyer nécrotique est fréquente. La présence de filaments mycéliens permet de confirmer l origine fongique Examen mycologique Aspergillus flavus est le plus souvent mis en cause mais des infections dues à Aspergillus fumigatus ont également été rapportées [11,29] Traitement Le traitement de l aspergillose nasosinusienne invasive granulomateuse nécessite une exérèse chirurgicale la plus complète possible, associée à un traitement antifongique par voie générale Sinusites chroniques invasives non granulomateuses Ce type de sinusite est assez peu décrit dans la littérature. Il touche des patients immunodéprimés traités au long cours par corticoïdes, ou des diabétiques. Il s agit d un 28

29 processus lent de destruction des sinus qui touche principalement les sinus ethmoïdaux et sphénoïdaux, mais tous les sinus peuvent être touchés [28] Clinique Les symptômes sont ceux d une rhinosinusite chronique avec des signes cliniques tels que décharge nasale, fièvre, épistaxis intermittents. Les patients non traités ont des risques de complications tels que le syndrome de l apex orbital qui est responsable d un trouble de la motilité oculaire associé à une diminution de l acuité visuelle et qui reflète l envahissement de l orbite, ainsi que de séquelles neurologiques [25] Imagerie : tomodensitométrie La littérature sur les résultats de l imagerie dans les cas de sinusites chroniques invasives est limitée et les différences entre les formes chroniques invasives granulomateuses et non granulomateuses restent floues [25] Examen anatomopathologique L histologie permet de visualiser une réaction inflammatoire modérée, centrée autour d une accumulation d hyphes pouvant simuler un mycétome ; cependant, la présence d éléments fongiques à l intérieur des vaisseaux plaide pour une atteinte invasive Examen mycologique L agent le plus décrit est Aspergillus fumigatus, mais les dématiés tels que Bipolaris, Alternaria, Curvularia, peuvent également être mis en cause [11,25] Traitement Le traitement est le même que celui décrit pour les sinusites chroniques invasives granulomateuses. 29

30 2.3. Les principaux agents des sinusites fongiques Généralités sur les champignons Les mycoses sont des infections provoquées par des champignons microscopiques appelés micromycètes. Ces champignons d intérêt médical appartiennent au règne des fungi, et sont des organismes eucaryotes cosmopolites unicellulaires (levures), ou pluricellulaires (champignons filamenteux). Ils nécessitent pour se nourrir, et ainsi se développer, une source de carbone qui provient de matières organiques en décomposition (saprophytes) ou d êtres vivants (parasites). La notion de mycose implique le développement, ou au moins le maintien du champignon chez son hôte. Une des particularités des champignons réside dans la structure de leur paroi, caractéristique exploitée pour la synthèse d antifongiques. Le principal stérol de la membrane est l ergostérol, et celle-ci est, par ailleurs, riche en polysaccharides, dont la chitine et des β- glucanes. Figure 11 : Schéma de la paroi des micromycètes ( L appareil végétatif des champignons filamenteux, appelé thalle ou mycélium, est constitué par un réseau dense de filaments mycéliens ou hyphes. Il permet la production d un 30

31 grand nombre de spores disséminées dans l environnement, ce qui assure aux champignons un pouvoir de diffusion et de contamination considérables. Certains champignons peuvent également se propager grâce à une reproduction sexuée, il s agit de la classe des fungi perfecti ou eumycètes. Les champignons n ayant qu un mode de reproduction asexué sont appelés les fungi imperfecti, dont font partie les deutéromycètes. C est dans cette dernière catégorie que se situe la grande majorité des champignons d intérêt médical. En réalité, il existe certaines exceptions au sein de la classe des fungi imperfecti puisque que pour certains champignons, il a été découvert en plus de la forme asexuée connue anamorphe, une forme à reproduction sexuée dite téleomorphe. Le champignon a alors une appellation différente, avec par exemple Aspergillus nidulans qui devient Emericella nidulans. Ainsi, la morphologie du thalle, le mode de production des spores, et les structures les produisant, issues de la reproduction sexuée ou asexuée, permettent de classer et d identifier les micromycètes Classification des espèces fongiques d intérêt médical d après leur mode de reproduction asexué Selon la morphologie de leur thalle végétatif, les filamenteux sont classés en deux groupes, ainsi on distingue : Les siphomycètes (dont font partie les zygomycètes), ou champignons inférieurs, qui se caractérisent par un thalle siphonné, ou thalle cœnocytique, constitué de filaments mycéliens larges, irréguliers et non cloisonnés (cf figure 12). Ce type de thalle est observé chez les mucorales. 31

32 Figure 12 : Schéma de thalle cœnocytique [30] Les septomycètes ou champignons supérieurs, qui présentent un thalle septé ou cloisonné (cf figure 14). Leurs filaments mycéliens sont fins, de diamètre régulier et divisés par des cloisons, ou septa. Parmi les champignons supérieurs, la classe des deutéromycètes comprend la majorité des champignons d intérêt médical, eux-mêmes divisés en trois groupes : les blastomycètes : qui rassemblent les levures asexuées. Le thalle est levuriforme (cf figure 13) et les spores sont formées par bourgeonnement sur la levure (blastospores). Figure 13 : Schéma de thalle levuriforme [30] les hyphomycètes : qui rassemblent les hyalohyphomycètes dont les filaments sont hyalins et incolores, et les phaeohyphomycètes ou dématiés dont les filaments sont pigmentés en brun. Les thalles sont septés (cf figure 14) et il n y a pas d organes protecteurs des cellules conidiogènes. 32

33 Figure 14 : Schéma de thalle septé [30] les cœlomycètes : dont les thalles sont septés et les cellules conidiogènes sont produites à l intérieur de pycnides ou d acervules [31]. Figure 15 : Schéma récapitulatif de la classification des champignons d intérêt médical 33

34 Les principales espèces d Aspergillus Les aspects microscopiques tels que longueur du conidiophore, morphologie de la tête aspergillaire avec la forme de sa vésicule, la présence ou non de métules (têtes aspergillaires respectivement bisériées ou unisériées), le type d insertion des phialides, la taille et la couleur des conidies ainsi que les caractères culturaux macroscopiques, sont des éléments qui permettent aux mycologues d identifier les différentes espèces d Aspergillus. Les Aspergillus sont des champignons cosmopolites très répandus dans le milieu extérieur. Ce sont des champignons ubiquistes : on les rencontre aussi bien en milieu rural (paille tassée et humide, fruits moisis, matières organiques en décomposition) qu en milieu urbain, et aussi bien à l extérieur qu à l intérieur des habitations (poussières, conduits d aération). Les différentes enquêtes aéromycologiques révèlent que les spores aspergillaires se situent au 4 ème rang des spores fongiques de l air (après les spores fongiques d Alternaria, de Cladosporium et de Penicillium) [31]. Figure 16 : Appareil reproducteur des Aspergillus, d après Chabasse et al [32] Les critères d identification macroscopique et microscopique des principales espèces d Aspergillus (Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus versicolor) sont résumés dans le tableau 1. 34

35 Caractères culturaux Aspergillus fumigatus Aspergillus flavus Aspergillus nidulans Aspergillus niger Aspergillus versicolor Recto Colonies blanches puis bleu-vert, virant au vert fonçé Colonies duveteuses à poudreuses, d abord blanches puis jaunesverts Couleur vert fonçé ou vert cresson, parfois jaunâtre Colonies d abord blanches puis granuleuses noires Colonies peu extensives d abord blanches puis de couleur varié : rosée, jaunâtre ou verte Verso Majoritairement jaune (d autres aspects sont possibles selon les souches) Incolore, rosé ou brun (selon les souches) Rougeatre, pourpre Incolore à jaune pâle Incolore ou variant du jaune au brun Optimum thermique de croissance C 37 C C C C Vitesse de croissance Très rapide à 37 C (24-48h) Rapide (48-72h) Rapide (3à 5j) Rapide (48-72h) Lente (5 à 7 j) 35

36 Critères microscopiques Aspergillus fumigatus Aspergillus flavus Aspergillus nidulans Aspergillus niger Aspergillus versicolor Conidiophore Vésicule Phialides Conidies Tête aspergillaire Reproduction sexuée Court, 300µm, lisse et incolore, avec évasement progressif au sommet Hémisphérique, 20-30µm Directement portées par la vésicule, dressées, densément groupées Globuleuses, échinulées Long, 1mm, hyalin, verruqueux avec des aspérités Très petit (75 à 100 µm en moyenne), brun, lisse et sinueux Très long (1,5 à 3mm), lisse, hyalin ou brunâtre. Généralement long (500 à 700 µm), lisse, jaunâtre Sphérique, µm Sphérique Globuleuses : 30 à 100µm Ovale, 12 à 16µm Directement insérées sur la vésicule ou portées par des métules Globuleuses, vert pâle, échinulées Portées par des métules insérées sur la partie supérieure de la vésicule Rondes, vertes, échinulées, souvent disposées en chaîne Insérées sur la vésicule par l intermédiaire de métules, disposées sur tout le pourtour de la vésicule Globuleuses, brunes échinulées, souvent disposées en chaînes Bisériée radiée, noire à maturité Unisériée Unisériée ou bisériée Bisériée en colonne, courte et compacte Non connue Non connue Emericella nidulans et présence de «Hülle cells» Non connue Tableau 1 : Caractéristiques des principales espèces d Aspergillus, d après Chabasse et a [32]l. Portées par des métules insérées sur tout le pourtour de la vésicule Présence de pinceaux évoquant un Penicillium (bouquets de 2à 3 phialides à l extrémité de conidiophores courts, fins et cloisonnés) Globuleuses, de 2 à 3,5µm de diamètre, échinulées Bisériée, radiée Non connue 36

37 Les hyalohyphomycètes autres qu Aspergillus Seules les espèces Fusarium et Scedosporium, intéressantes dans le contexte de sinusite, sont détaillées dans cette partie. Les Fusarium sont des champignons cosmopolites. Près de 40 espèces sont distinguées et répandues dans la nature. Depuis une vingtaine d années, il a été établi que certaines espèces de Fusarium sont susceptibles de créer de graves infections chez les immunodéprimés ; les plus souvent rencontrées étant Fusarium solani, Fusarium oxysporum, et Fusarium verticilloides. La plupart des espèces de Fusarium appartiennent aux deutéromycètes ; seules quelques espèces ont une reproduction sexuée connue et appartiennent à la classe des ascomycètes. Le genre Fusarium tire son nom du latin fusus car son principal caractère morphologique est la présence de macroconidies fusiformes et cloisonnées. Scedosporium apiospermum est un champignon tellurique rencontré dans les eaux polluées, les boues et les sols fortement contaminés. La reproduction asexuée peut s effectuer selon deux modalités distinctes, l une sur le mode thallique solitaire, l autre faisant intervenir des annellides groupées en corémies (stade Graphium). Les principales caractéristiques de ces espèces sont résumées dans le tableau 2. 37

38 Critères microscopiques Caractères culturaux Fusarium solani Scedosporium apiospermum Recto Colonies duveteuses à cotonneuses, couleur blanche ou crème Colonies cotonneuses blanchâtres devenant grises en vieillissant Verso Optimum thermique de croissance Vitesse de croissance Verso brun-chamois Optimum thermique : 25 C Assez rapide : 4j Fusarium solani Verso foncé à noir Optimum thermique : C Croissance possible jusqu à 40 C Pousse bien sur les milieux usuels Scedosporium apiospermum Conidies Conidiogenèse Reproduction sexuée Nombreuses microconidies oblongues disposées en fausse tête ou glissant le long des phialides. Macroconidies en forme de fuseaux, pluricellulaires comportant au maximum 6 logettes. Clamydospores parfois présentes. Type phialidique Non connue Conidies ovoïdes hyalines puis brunes, de 6 à 10 µm de long sur 5µm de large. Aleuries terminales ou latérales naissent directement sur les côtés des filaments végétatifs ou à l extrémité de courts conidiophores *Type thallique solitaire avec production d aleuries toujours unicellulaires *Types blastique annellidique pour certaines souches Pseudallescheria boydii : formation de cléistothèces globuleux, brun jaunâtre avec production d asques Tableau 2 : Caractéristiques de Fusarium solani et Scedosporium apiospermum, d après Chabasse et al [32]. 38

39 Les phaéohyphomycètes ou dématiés Les dématiés sont des moisissures issues du sol, de la terre ou de végétaux en décomposition. Ils sont parfois parasites de plantes, et certains sont de véritables opportunistes pour l homme. Leur caractéristique commune est de produire des pigments de type mélanine qui imprègnent la paroi des filaments, d où l aspect foncé ou noir des filaments. Au laboratoire, il s agit le plus souvent de «contaminants» de culture, en raison de leur abondance dans l environnement et notamment les espèces du genre Cladosporium, très répandues en zones tempérées. Néanmoins certains dématiés peuvent être rencontrés en situation pathogène, l espèce la plus souvent mise en cause comme agent de phaéohyphomycose en France étant Alternaria. Les critères d identification macroscopiques et microscopiques des principales espèces de dématiés (Alternaria sp, Exophiala sp, Curvularia sp, Cladosporium sp) sont résumés dans le tableau 3. 39

40 Critères microscopiques Caractères culturaux Alternaria sp Exophiala sp Curvularia sp Cladosporium sp Recto Colonie blanc-gris au départ, devient rapidement fonçée, texture duveteuse à laineuse Colonies d'aspect levuriforme (à 37 C), brun foncé à noir de texture mucoïde Colonies blanche puis brun olive, texture laineuse Vert olive au brun noir très fonçé Verso Comme le recto Verso foncé Verso foncé Verso brun noir Optimum t de croissance Vitesse de croissance C (inhibée à 37 C) Optimum t =25 C Aspect levuriforme à 37 C 25 C C Croissance rapide Croissance lente Croissance rapide Croissance lente Conidiophores Conidies Cloisonnés, bruns septés, simples ou ramifiés Brunes, pluricellulaires, aspect piriforme ou ovoïdes. A maturité : cloisons transversales, obliques ou longitudinales Sporulation assurée par des annelides produisant des spores unicellulaires groupées en amas et d'aspect levuriforme Bruns, simples ou non ramifiés Brunes, pluricellulaires et légèrement incurvées, cloisonnées seulement transversalement. Rare, Cochliobolus lunatus Conidies à l extrémité du conidiophore = grande taille ; les suivantes = plus petites. Forment longues chaines acropètes ramifiées Reprod. Rare Rare, genre Capronia Non connue sexuée (Ascomycètes) (Ascomycètes) (Ascomycètes) Tableau 3 : Caractéristiques des principales espèces de dématiés, d après Chabasse et al [32]. 40

41 Les mucorales Les mucorales sont des champignons cosmopolites très répandus. Saprophytes du sol, où ils se nourrissent à partir des végétaux, céréales ou excréments, ils contaminent fréquemment les denrées alimentaires. Redoutables opportunistes, les mucorales sont des agents de zygomycoses, notamment chez les sujets diabétiques et les patients atteints d hémopathies. Ils sont à l origine d atteintes rhinocérébrales, cutanées (chez les grands brûlés) et viscérales. Chez les mucorales, les spores asexuées sont produites de façon endogène à l intérieur des sporocystes. Ce sont des endospores (contrairement aux conidies exospores des hyphomycètes). Figure 17 : Appareil reproducteur asexué des mucorales, d après Chabasse et al [32] Les critères d identification macroscopiques et microscopiques des principales espèces de Mucorales, Lichtheimia (Absidia), Mucor, Rhizomucor et Rhizopus sont résumés dans le tableau 4. 41

42 Critères microscopiques Caractères culturaux Espèce Lichtheimia sp Mucor sp Rhizomucor sp Rhizopus sp Recto Colonies grises, texture floconneuse Colonies grises à brun, texture laineuse Colonies bruns pâle puis deviennent brun sombre en vieillissant, texture laineuse Colonies blanches devenant grises et fonçées en vieillissant, texture cotonneuse Verso Optimum thermique de croissance Vitesse de croissance incolore Incolore Pousse plus rapidement à 37 C qu à T optimale = 25 C T optimale =37 C T optimale = 25 C ou 37 C 25 C Croissance rapide Croissance très rapide Croissance très rapide et Croissance très rapide et extensive extensive Sporocystophores Sporocystes Spores Rhizoïdes et stolons Chlamydospores Isolés ou groupés, fixés au milieu des stolons et ramifiés en grappe. Ils se terminent par une large apophyse conique De 10 à 120 µm de diamètre, aspect piriforme, columelle hémisphérique Issus le plus souvent du thalle végétatif. Ils se terminent par une columelle ovoïde sans apophyse Courts, avec des ramifications subterminales en sympodes Bruns, isolés ou disposés en bouquets de 2 à 6 éléments Globuleux Foncés, recouverts d aspérités Globuleux, columelle globuleuse et cylindrique, apophyse courte et anguleuse Rondes à ellipsoïdale, lisses ou Globuleuses (3 à 4 µm), lisses et Ovoïdes ornementées de spicules hyalines Pas de stolons ni de rhizoïdes Présents mais parfois difficiles à Sont biens différenciés et naissent Cylindriques, lisses jaunâtre, de 3,4 à 4,6 de long sur 2,8 à 3,8 de largeur Peu nombreux, situés sur les stolons à distance des sporocystophores reconnaître d une même origine, le nœud Absentes ou peu nombreuses Parfois présentes et abondantes Peuvent être présentes, isolées ou disposées en chaîne Tableau 4 : Caractéristiques des principales espèces de mucorales, d après Chabasse et al [32]. 42

43 2.4. Diagnostic des sinusites fongiques Techniques chirurgicales d exérèse L exérèse de la balle fongique ou de la mucine allergique permet en premier lieu de traiter la pathologie sinusienne. Par ailleurs, le prélèvement est envoyé aux laboratoires d anatomo-pathologie et de mycologie à des fins diagnostiques pour affirmer ou infirmer la cause fongique et identifier le champignon responsable de la pathologie nasosinusienne. Le but de ce traitement, que se soit une voie d abord endonasale ou via la fosse canine, voire un combiné des deux, consiste en une éradication complète de la balle fongique d une part, et l assurance d un drainage et d une aération du sinus pour éviter toute récidive d autre part Méatotomies moyenne et inférieure La muqueuse altérée par un processus de sinusite chronique peut retrouver ses propriétés après un drainage aboutissant à une ventilation correcte. Ces constatations ont donné naissance au concept de FESS (Functional Endoscopic Sinus Surgery). Le principe de la chirurgie du sinus maxillaire repose sur l ouverture de 1 à 2 cm de diamètre au niveau des méats inférieur et surtout moyen. L utilisation d endoscopes à 30, 45 et 70 d angle rend accessible l ensemble des régions des sinus maxillaires Méatotomie moyenne La méatotomie moyenne s enchaine en différentes étapes : -luxation du cornet moyen en-dedans à l aide d une spatule de Freer -résection de la partie inférieure de l unciforme -repérage de l ostium principal du sinus maxillaire et de la bulle (devant rester intègre) -agrandissement des berges de la méatotomie en avant avec une pince rétrograde -visualisation et réalisation du geste spécifique intra-maxillaire avec des optiques de 30, 45 voire 70 -mise en place d un méchage hémostatique pendant 48h entre cornet moyen et orifice de méatotomie moyenne [33]. 43

44 Figure 18 : Méatotomie moyenne droite, TDM coronale en fenêtre osseuse Elle consiste en un élargissement du méat physiologique (astérisque) avec ablation du processus unciné (pu), et dans ce cas précis, du cornet moyen (cm) et ouverture de la bulle (b), d après Guichard et al. [34]. A B C D A. Vue endoscopique de la fosse nasale gauche. Luxation ducornet moyen et visualisation del unciforme. (1)cornet moyen ; (2)unciforme ; (3)cloison nasale. B. Vue endoscopique de la fosse nasale gauche. Repérage de l unciforme avant son incision. C. Vue endoscopique de la fosse nasale gauche. Unciformectomie. D. Élargissement à la pince rétrograde du méat moyen droit. M. moy : méatotomie moyenne Figure 19 : Etapes de la méatotomie moyenne vues par voie endoscopique, d après Facon et al. [33] 44

45 Méatotomie inférieure Ses indications diffèrent et sont complémentaires de la méatotomie moyenne. Isolée ou associée à la méatotomie moyenne, elle offre une voie d abord de la moitié inférieure du sinus maxillaire. Elle permet d ouvrir la cloison nasosinusienne sous le cornet inférieur pour l extraction d un corps étranger non accessible par voie de méatotomie moyenne Autres types de chirurgie L ethmoïdectomie antérieure associe une méatotomie moyenne et une ablation des cellules ethmoïdales antérieures. L ethmoïdectomie totale est une ethmoïdectomie antérieure associée à une résection de la racine cloisonnante du cornet moyen et des cellules ethmoïdales postérieures. La sphénotomie est l ouverture du méat sphénoïdal qui est pratiquée en cas de pathologie isolée de ce sinus. La sphéno-ethmoïdectomie est l association de l intervention précédente à une ethmoïdectomie complète en cas d atteinte mixte ou en cas de difficulté d accès [34] L examen de Cadwell-Luc Son but est de réaliser une ouverture et un abord du sinus maxillaire par voie buccale via la fosse canine à travers la paroi antérieure du sinus (et non via les orifices nasaux naturels). Cette intervention s adresse aux sinusites maxillaires chroniques qui ne peuvent être résolues par voie endonasale de méatotomies moyenne et inférieure. Sous anesthésie générale, le chirurgien pratique une incision de la muqueuse buccale afin de permettre un abord, puis une ouverture de la paroi antérieure du sinus maxillaire (cf figure 21). Une fois l ouverture obtenue, l inspection de la muqueuse est nécessaire avant de pratiquer son éventuelle éradication. Un curetage complet, avec des curettes de différentes courbures, de cette muqueuse et du contenu du sinus est alors pratiqué. Avant la fermeture, une méatotomie inférieure est parfois réalisée pour la mise en place du drainage du sinus maxillaire. Ce geste permet l éradication des lésions infectieuses et l ablation d éventuel corps étranger d origine dentaire [33]. 45

46 Figure 20 : Abord du sinus maxillaire par voie endo-buccale, d après Delbet et al [35] Examen anatomopathologique L examen anatomopathologique des biopsies de sinus est essentiel pour faire le diagnostic de sinusite fongique. Une description macroscopique comprenant la couleur, l aspect ainsi que la taille des différents morceaux est réalisée. Les biopsies sont fixées avec du formol, puis inclues dans des blocs de paraffine. L inclusion nécessite le passage préalable des prélèvements dans une série de solvants organiques, afin de les déshydrater et de dissoudre les graisses. Une décalcification peut être nécessaire si les prélèvements renferment des os ou des matières calcaires. Le bloc de paraffine est ensuite coupé au microtome pour réaliser des coupes très fines de 3 à 5 µm d épaisseur. Les sections sont alors étalées sur lame, colorées puis lues au microscope. Différentes colorations sont utilisées lorsqu une sinusite fongique est suspectée : -HES : coloration standard -PAS, ou coloration à l acide périodique-schiff : colore en rose rouge les éléments fongiques -Gomori-Grocott : colore en noir les champignons par imprégnation argentique. L examen anatomo-pathologique des prélèvements de biopsie de sinus permet donc de visualiser grâce aux colorations spécifiques, la présence ou non de filaments mycéliens et 46

47 ainsi d affirmer l étiologie fongique de la sinusite. Il possède différents avantages par rapport à l examen mycologique en permettant la visualisation de : -l envahissement de la muqueuse sinusienne, afin de déterminer s il s agit d une sinusite invasive ou non. -la présence ou non de polynucléaires éosinophiles altérés ou non, afin d orienter le clinicien vers une étiologie allergique de la sinusite fongique (mucine allergique). -l état inflammatoire du sinus. D autre part, en décrivant l aspect des thalles : septé ou coenocytique, l examen anatomo-pathologique permet parfois d orienter le diagnostic vers les Mucorales ou les Hyphomycètes, bien que l examen des filaments au sein des tissus soit difficile. Par ailleurs, l examen en lumière polarisée permet de mettre en évidence des corps étrangers biréfringents, comme c est le cas des corps étrangers iatrogènes d origine dentaire, ce qui permet d orienter le diagnostic, lorsqu ils sont présents, vers les balles fongiques. Cependant l analyse anatomo-pathologique des prélèvements de biopsie de sinus, a pour désavantage de ne pas pouvoir identifier de manière précise le champignon en cause Examen mycologique des prélèvements de sinus Modalités diagnostiques mycologiques L examen direct L examen direct est indispensable au diagnostic. En cas de positivité, il oriente le clinicien et reste parfois le seul argument biologique en faveur d une mycose. Les modalités de réalisation de l examen direct sont fonction du type de prélèvement et de sa consistance. Il consiste à déposer une petite quantité de prélèvement entre lame et lamelle et à rechercher des levures ou filaments au microscope. Il est même possible de voir dans certains prélèvements (cf figure 22) des têtes aspergillaires. 47

48 Figure 21: Examen direct de sinus positif avec têtes aspergillaires (photo prise au laboratoire) La culture La culture est indispensable pour isoler et identifier le champignon en cause. Les milieux de culture les plus utilisés sont les milieux gélosés de Sabouraud additionnés d antibiotiques (chloramphénicol, gentamicine ou une association des deux). Deux types de milieux peuvent être utilisés : les milieux de culture en boîte de pétri, ou les géloses en pente. Les boîtes de pétri sont préférables pour les espèces fongiques à croissance rapide. L ensemencement est aisé, et il est possible pour les liquides biologiques d effectuer des ensemencements en quadrants pour obtenir des colonies isolées pour évaluer la charge fongique. En revanche, le risque d avoir des contaminations avec les moisissures de l environnement est plus important qu avec les géloses en pente et leur desséchement est plus rapide. Les fragments biopsiques sont découpés au bistouri ou broyés dans un peu d eau stérile et ensemencés sur gélose en pente. Les cultures sont incubées en étuve à 37 C pour les prélèvements profonds et entre 20 et 30 C pour les prélèvements superficiels Identification L identification a tout d abord lieu grâce aux critères macroscopiques des colonies tels que vitesse de pousse, couleur des colonies, texture. Ces critères ont été détaillés dans la partie sur les principaux agents des sinusites fongiques. 48

49 De manière complémentaire, les caractères microscopiques permettent l identification du champignon selon le type et la couleur des thalles, la forme des têtes aspergillaires pour les champignons de type Aspergillus. C est grâce à la technique du drapeau que l appareil reproducteur des champignons est déposé sur lame et est visualisé au microscope. Figure 22 : Schéma explicatif de la technique du drapeau, d après Guillaume et al [36] 49

50 Avantages et limites de l examen mycologique de routine L examen direct des prélèvements de sinus permet, au même titre que l analyse anatomo-pathologique, de visualiser la présence ou non de filaments mycéliens et ainsi d affirmer l étiologie fongique de la sinusite. L examen mycologique a pour avantage d effectuer des cultures à partir des prélèvements afin d identifier le champignon en cause. Cependant, cette identification n est possible que si la pousse sur les milieux usuels de mycologie a lieu. Or, de nombreuses équipes rapportent une sensibilité médiocre de la culture. Polzehl et al. ont fait une étude sur les lavages nasaux de 77 patients atteints de rhinosinusite chronique et ont retrouvé une culture positive dans seulement 25% des prélèvements, alors que le diagnostic moléculaire par PCR était positif dans 44% des cas [37]. La viabilité des champignons dans les balles fongiques est faible, ce qui explique que les cultures à partir du matériel d exérèse chirurgical peuvent rester négatives. C est pourquoi il faut privilégier l ensemencement de la partie externe du prélèvement [20]. Par ailleurs d autres inconvénients du diagnostic classique de mycologie sont à évoquer, comme la croissance lente ou les exigences nutritionnelles de certains champignons (Scedosporium), et les similarités morphologiques microscopiques de certaines espèces qui peuvent induire le mycologue en erreur lors de l identification. Toutes ces contraintes ont amené les mycologues à se tourner vers la biologie moléculaire afin de rendre le diagnostic plus rapide et plus performant Méthodes d identification moléculaire et cibles utilisées Les techniques de biologie moléculaire s intègrent progressivement aux côtés des méthodes diagnostiques mycologiques classiques, et tendent à se généraliser dans le diagnostic des infections fongiques profondes. Cette évolution a été rendue nécessaire afin de diagnostiquer plus précocement les infections fongiques invasives, en recrudescence avec l augmentation de patients fortement immunodéprimés tels que les greffés de moelle osseuse, et de garantir l identification précise des champignons afin d orienter le traitement antifongique [38]. Le principe du diagnostic moléculaire consiste à amplifier par PCR des régions d acide désoxyribonucléique (ADN) présentes chez tous les champignons et dont les séquences sont suffisamment différentes entre espèces pour permettre de les identifier précisément par séquençage. 50

51 De nombreuses cibles dans le génome fongique ont été évaluées, avec pour la grande majorité des études récentes, l utilisation de séquences de l ADN ribosomal (ADNr) [39]. Il s agit d une cible de choix, puisque qu elle est présente chez tous les micro-organismes. Cette section du génome inclut les gènes 18S (petite sous-unité), 5,8S et 28S (grande sous-unité). Il s agit d une famille de gènes répétés en tandem plusieurs dizaines de fois. Chaque unité comprend des régions codantes et non codantes puisqu elle inclut respectivement entre les gènes 18S et 5,8S, et, 5,8S et 28S les séquences d ADN variables des régions ITS1 et ITS2 («Internal Transcribed Spacer»). Transcrites mais non traduites en protéines, les régions ITS ont un rôle essentiel dans le développement d ADNr fonctionnel avec des variations de séquences entre les espèces, et sont situées entre des régions IGS («Internal Gene Spacer») [40]. Les gènes de l ADNr sont donc des cibles intéressantes car ils sont présents en grande quantité, ont des régions conservées pour designer des amorces assez larges, et ont des régions plus variables pour distinguer différents types de champignons [41,42]. Dans la figure 23, les rectangles bleus indiquent les régions codantes. Les amorces consensus sont illustrées par des flèches bleues : Figure 23 : Représentation schématique des différentes régions de l ADN ribosomique [38] 51

52 Cependant, les régions ITS1 et ITS2 ne permettent pas en pratique d identifier tous les champignons d intérêt médical [43]. En effet, la variabilité inter-espèces est insuffisante pour permettre l identification de certaines espèces, en particulier au sein des genres Aspergillus et Fusarium. Cette région du génome ne permet par exemple, la distinction entre Aspergillus fumigatus et Aspergillus lentulus, qui sont deux espèces étroitement liées, et qui n ont pas une différence suffisante de nucléotides permettant de les différencier [44]. C est pourquoi il est actuellement proposé d utiliser les gènes de la β tubuline, et le gène du cytochrome mitochondrial b pour typer les Aspergillus [45,46]. Par ailleurs, la fiabilité des séquences ITS déposées dans la banque de données de référence GenBank est actuellement mise en cause. Certains auteurs estiment que séquences de champignons sont disponibles sur GenBank, avec une proportion d erreurs d annotations taxonomiques estimée entre 10 et 21 % [39]. Pour pallier ce problème, une banque de données spécifique a été crée par des mycologues, avec un contrôle de la fiabilité des séquences. Ce site ( permettrait actuellement d analyser les séquences ITS1 et ITS4 avec une qualité satisfaisante. Certaines équipes ont également utilisé des amorces situées dans le gène 28S de l ADNr. Ce gène, encore assez inexploré, est de pb et possède deux régions hypervariables, D1 et D2 [41]. Willinger et al. a pris le parti d utiliser des amorces ciblant le gène 28S de l ADNr afin de détecter et d identifier des micromycètes provenant de balle fongique [47]. Sa grande taille ainsi que les variations importantes de nucléotides entre les espèces dans les régions D1/D2 lui permet de distinguer des espèces fongiques étroitement liées. Cette région est parfois même utilisée lorsque l identification du champignon réalisée par la culture et le séquençage des régions ITS1 et ITS2 est discordante [48]. 52

53 MATERIELS ET METHODES 53

54 3. Matériels et méthodes 3.1. Population d étude Cette étude rétrospective concerne les prélèvements de sinus, envoyés à des fins diagnostiques, au laboratoire de Parasitologie Mycologie de Pontchaillou, de mai 2010 à fin avril Pour chaque prélèvement avec reliquat, 300µl de broyat ainsi qu un morceau de sinus ont été stockés dans des tubes Eppendorf au congélateur à -20 C. Au total, 70 prélèvements de 61 patients ont été conservés. Une extraction de données, à partir du SIL, de tous les prélèvements de sinus et de fosses nasales envoyés au laboratoire de mai 2010 à avril 2013 révèle que notre laboratoire a traité 54 prélèvements dont l examen direct était positif, soit 77 prélèvements au total. 7 prélèvements (de 5 patients) n ont donc pas été conservés et ne font pas partis de notre étude. Une requête de tous les prélèvements de sinus ou de fosses nasales envoyés au laboratoire d anatomopathologie avec pour indication sinusite chronique ou polype a été effectuée. Lors de la période d avril 2010 à avril 2013, 85 prélèvements provenant du service d ORL de Pontchaillou ont été envoyés au laboratoire d anatomopathologie. La figure 24 permet de décrire la population de sinus étudiée par notre étude. 54

55 QI=quantité insuffisante Figure 24 : Population d étude de prélèvements de sinus 3.2. Examen mycologique Examen direct et culture Sous hotte, un morceau de sinus est découpé au scalpel, en prenant de préférence dans les zones où le sinus est noirci, afin d augmenter la sensibilité de l examen direct. Afin de constituer un broyat, le morceau de sinus est mis dans un micro-broyeur avec un peu d eau physiologique, puis écrasé au pilon. Deux lames préparées à partir du broyat et d un morceau de sinus dans de la potasse (éclaircissant) permettent d effectuer l examen direct. S il est positif, le stade de l élément fongique (filaments, spores ou têtes aspergillaires) est renseigné. L examen direct permet de rendre un résultat positif (avec quantité et stade du champignon) ou négatif, de manière rapide dès la réception du prélèvement. 55