MYCOTOXINES : changements règlementaires et analytiques

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1 MYCOTOXINES : changements règlementaires et analytiques E. MARENGUE ( LDA22 ) et S. HULOT ( IDAC )

2 PLAN 1) La problématique 2) Les évolutions règlementaires 3) L échantillonnage : étape clé 4) Les techniques d analyses 5) Conclusion

3 1) Problématique 25 % des denrées alimentaires seraient contaminées par des moisissures : Moisissures = mycotoxines? bénéfiques (fermentation ) ou nuisibles (altération des aliments, production de mycotoxines )!!!

4 Les mycotoxines : métabolites secondaires de diverses moisissures. Malgré des niveaux extrêmement élevés de mycotoxines dans certains grains, la concentration moyenne dans un lot est souvent très faible. Attention : même à des niveaux très bas, les mycotoxines affectent la santé des hommes et des animaux.

5 Analyse de traces : le µg/kg Kg g mg µg 1 µg/kg = 1 mm sur l axe Brest-Strasbourg 1 grain de maïs dans 3,5 wagons 1 plant de maïs dans hectares

6 Conséquences économiques du développement des moisissures DIRECTES - Marchands de grains : Qualité pauvre en apport nutritionnel. INDIRECTES Prix de revient augmenté - Eleveurs : Réduction de la performance, Diminution de la reproduction, Pertes nombreuses dues aux maladies. Dépenses pour les soins des animaux - Industries alimentaires : Substances non vendables d aspect et de caractère organoleptique altéré

7 Localisation dans la chaîne alimentaire (complexité des différents types d échantillons) CHAMP Pathogène des Plantes Fusarium graminearum Colonise la plante Fusarium roseum Plantes stressées Fusarium moniliforme RÉCOLTE TRANSFORMATION Sol, ventilation, Aspergillus Penicillium STOCKAGE Viande, lait, oeufs Frigidaire ALIMENTATION HUMAINE!!! FOURRAGE

8 Moisissures, mycotoxines et denrées Champignons Toxines Denrées Aspergillus Aflatoxines Stérigmatocystine Ochratoxine A Maïs, cacahuètes, graines de coton, graines de potiron, riz, haricots, tissus d animaux (jambon, lard, saucisses), lait et dérivés Penicillium Patuline, Citrinine, Pénitrem A, Acide cyclopiazonique, ochratoxine A Fruits et jus de fruits, blé, riz, fromage, noix Alternaria Alternariol Acide Tenuazonique Fruits, légumes et produits dérivés de pomme et tomates Claviceps Alcaloïdes de l Ergot Blé et dérivés, seigle Fusarium Trichothécènes (DON, NIV, Toxine T-2, DAS) Zéaralénone, Fumonisines, Fusarine, Moniliformine Blé, Maïs, orge, riz, seigle, avoine, noix

9 2) Evolutions règlementaires L arsenal règlementaire s étoffe, notamment au niveau européen ( années 1980). Les derniers textes publiés en 2005 concernent les toxines de Fusarium : la DON (Déoxynivalénol), la zéaralénone, les fumonisines (B1+B2) et les toxines T-2 et HT-2 (règlement CE n 856/2005) : mise à jour envisagée au 01/07/2007 (alimentation humaine). et l ochratoxine A (règlement CE n 123/2005 alimentation humaine)

10 (réglementation suite) Cette évolution règlementaire concerne : les teneurs maximales à ne pas dépasser par type d aliments/matières premières mais également les conditions de prélèvement/représentativité des échantillons pour analyses ainsi que les performances des méthodes analytiques. Exemples : toxines de Fusarium (directive 2005/38 CE) et règlement CE N 401/2006 (23/02/06) «portant fixation des modes de prélèvement d échantillons et des méthodes d analyse pour le contrôle officiel des teneurs en mycotoxines des denrées alimentaires».

11 3) Un prélèvement représentatif?

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13 Risque d erreur à l échantillonnage Analyse correcte = contamination de l ensemble du lot mesurée. Si procédure d échantillonnage non correctement suivie, les résultats représentant l échantillon reçu au laboratoire vont soit sous estimer ou surestimer la contamination. Notion de faux négatifsn (prélèvement, préparation, sous échantillonnage..) et de faux positifs (moins fréquent mais tout aussi préjudiciable).

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16 4) Les techniques d analyse Préparation Extraction Purification optionnelle Dosage & résultats

17 Les différentes techniques à votre disposition Méthodes semi-quantitatives : technique immunologique : ELISA et CCM (Chromatographie sur Couche Mince). Techniques de screening! Méthodes quantitatives : techniques chromatographiques : CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) ou CG (Chromatographie gazeuse) + SM ou SM/SM (couplage pour la détection à la spectrométrie de masse)

18 Méthodes quantitatives : chromatographie Analyse chromatographique = séparation des composés avant leur détection Injection Séparation Détection

19 Comparatif des techniques analytiques Sensibilité Spécificité Avantage Inconvénient CLHP/FLUO Sensibilité Dérivation Purification CLHP/UV Pas de dérivation Peu spécifique Purification ELISA Coût (si série) Peu spécifique : risque de faux négatif/faux positif CCM Simple Sensibilité / spécificité GC/MS ou MS/MS Sensibilité spécificité HPLC/MS/MS Sensible Spécifique Dérivation Purification Coût appareil Coût appareil

20 Mono ou multi-résidus? Méthode mono-résidu : mise en œuvre d une méthode analytique pour rechercher une seule molécule ou une même famille (ex. : aflatoxines B1/B2/G1/G2). ELISA/CCM/CLHP fluo. ou UV/CG coût! Méthode multi-résidus : recherche de plusieurs molécules de différentes familles en une seule analyse! LC/MS/MS

21 Exemple de méthode semi quantitative : Analyse de trichotécènes A et B par Chromatographie Couche Mince CCM)

22 Exemple de méthode quantitative : Analyse aflatoxines B et G par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP)

23 Exemple de méthode quantitative : Analyse zéaralénone et fumonisines par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP)

24 Méthode de Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse en tandem (LC-MS/MS) pour analyser les mycotoxines But : - Domaine d application: l ensemble des molécules organiques => molécules mères et métabolites - Analyses multi-résidus ( sensible spécifique et robuste ) - Résultat : sécurité dans l identification de la molécule détectée par le spectre de masse

25 ?

26 Spectre de masse = identité / spécificité ( empreinte chimique de chaque molécule )

27 LC/MS/MS Avantages : Domaine d application analytique très large Pas ou peu de préparations Méthodologie simple et reproductible Pas ou peu de consommable Utilisation simple et routinière : appareillage robuste et fiable Inconvénients : Coût de l appareillage ( > H.T) Formation des techniciens

28 5) Conclusion Avant toute analyse de mycotoxines : nécessité d un diagnostic en amont (vétérinaire ) pour orienter le type de mycotoxines à rechercher ou l établissement d un cahier des charges réaliste. Méthode mono-résidu. En l absence de symptômes caractéristiques : Méthode multi-résidus (LC/MS/MS)

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