VII LES LECTEURS DE FLUORESCENCE

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1 Page : 64/ 77 VII LES LECTEURS DE FLUORESCENCE Un lecteur de fluorescence, aussi appelé fluorimètre, est un appareil qui permet d exciter des échantillons contenant des fluorophores, à des longueurs d ondes précises et de mesurer l intensité de la fluorescence émise. Il existe différents types de fluorimètres mais nous ne ferons référence ici qu'aux fluorimètres utilisés pour des mesures en microplaques sur la plateforme ARPEGE. Ces lecteurs sont automatisés et capables de mesurer l intensité de la fluorescence provenant d échantillons disposés dans des microplaques de différents formats 45. On peut distinguer différents types de fluorimètres en fonction de la source lumineuse excitatrice, du type de filtre, de la présence ou non de monochromateur et du type de détecteur. Les éléments du système optique d un fluorimètre à filtre sont schématiquement représentés sur la Figure 46 et seront plus amplement détaillés dans ce chapitre. Figure 46. Système optique d un fluorimètre. La lumière provenant d une lampe passe d abord au travers d un filtre qui ne laisse passer que les longueurs d ondes d excitation souhaitées correspondant à la gamme d absorption du fluorophore d intérêt contenu dans l échantillon. Le faisceau lumineux filtré est ensuite réfléchit dans les puits d une microplaque grâce à un miroir dichroïque 46. Une partie seulement de la fluorescence émise par les fluorophores présents dans 45 Les formats les plus couramment utilisés sont les plaques 96 et 384 puits. 46 Le miroir dichroïque réfléchit la lumière d excitation vers l échantillon et laisse passer la fluorescence émise par les fluorophores vers le détecteur.

2 Page : 65/ 77 l échantillon traverse le miroir dichroïque. Afin de précisément sélectionner les longueurs d ondes d émission que l on souhaite analyser, un deuxième filtre est placé après le miroir dichroïque. L intensité du signal émis est mesurée au niveau d un détecteur qui convertit l énergie des photons de fluorescence en un signal électrique. A) LES DIFFERENTES SOURCES D EXCITATION 1) LES LAMPES PULSEES AU XENON ET AU MERCURE (PHERASTARFS, INFINITE F500, FLEXSTATION) Les lampes au Xénon et au Mercure émettent sur une gamme étendue de longueurs d onde (Figure 47). La lampe au Xénon équipe la plupart des fluorimètres car elle délivre une lumière homogène en intensité de 250 à 700 nm qui permet d exciter une large gamme de fluorophores. Néanmoins, l énergie que délivre cette lampe est faible 47 par rapport à d autres sources lumineuses comme le LASER 48 et la durée d un pulse d excitation est relativement long 49. (XBO) (HBO) Figure 47. Les lampes pulsées au Xénon et au Mercure (schéma tiré de Xénon : la lumière de sortie est constante de 250 nm à 700 nm. Mercure : plus énergétique que le Xénon, cette lampe peut mieux convenir pour exciter des fluorophores dont les pics d absorption correspondent aux pics de la lampe. 47 L efficacité d excitation des fluorophores sera donc moindre. 48 LASER : Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation. 49 Quelques microsecondes pour une lampe pulsée au Xénon contre quelques nanosecondes pour un LASER classique. Certains lasers ont des pulses encore plus court (picosecondes femtosecondes).

3 Page : 66/ 77 2) LES LAMPES HALOGENES (MITHRAS LB940) Les lampes halogènes sont plus énergétiques que les lampes pulsées entre 450 et 700 nm (Figure 48-a). L excitation de fluorophores absorbants dans le rouge et dans le proche infrarouge est donc plus efficace avec cette lampe. Toutefois, les lampes halogènes émettent une lumière de plus faible énergie en dessous de 450 nm. Elles ne sont donc pas idéales pour exciter des fluorophores absorbant dans l ultraviolet. Figure 48-a. Les lampes halogène (schéma tiré de Le spectre de la lampe halogène est représenté en rouge. Le spectre de la lampe au Mercure est représenté en bleu. 3) LES LASERS OU LAMPES CONTINUES (PHERASTARFS ET RUBYSTAR) Il existe de nombreux lasers (Argon, Hélium-Néon, etc.). Le PHERAstar et le RUBYstar sont équipés d un laser à azote qui délivre une lumière monochromatique 50 dans l ultraviolet de forte énergie à 337 nm. Contrairement aux lampes pulsées, les lasers délivrent un pulse d excitation qui est très court (Figure 48-b). 50 Une seule longueur d onde.

4 Page : 67/ 77 Lampe flash pulsée LASER Amplitude (Volt) Amplitude (Volt) Temps s Temps ns Figure 48-b. Forme d une impulsion d une lampe flash pulsée et d un laser. B) LES FILTRES (PHERASTARFS, RUBYSTAR, INFINITE F500, MITHRAS LB940) Les filtres permettent de sélectionner les longueurs d onde d intérêt en réduisant les longueurs d ondes parasites : - Les filtres d excitation sont placés entre la source lumineuse et l échantillon à exciter. Ils permettent de sélectionner les longueurs d onde d excitation du fluorophore utilisé pour l expérience en éliminant les autres longueurs d ondes délivrées par la source lumineuse. - Les filtres d émission sont placés entre l échantillon et le détecteur. Ils permettent de restreindre les longueurs d ondes qui atteignent le détecteur en sélectionnant les longueurs d émission du fluorophore et en bloquant les longueurs d ondes parasites (Figure 49). Filtre d excitation Intensité Spectre d émission de la lampe Spectre d absorption du fluorophore Spectre d émission du fluorophore Intensité Filtre d excitation Filtre d émission Longueur d onde Figure 49. Les filtres. Il ne doit pas y avoir de recouvrement entre les longueurs d ondes sélectionnées à l excitation et à l émission. Les longueurs d ondes de la lampe qui sont sélectionnées par le filtre d excitation correspondent à la gamme d absorption du fluorophore.

5 Page : 68/ 77 Il existe deux types de filtres utilisés dans les fluorimètres : - Des filtres passe haut, - Des filtres à bande passante. Sur les fluorimètres à microplaques ce sont les filtres à bande passante qui sont généralement utilisés. Le filtre passe haut (Long-Pass, LP) Ce filtre permet d isoler des régions spécifiques du spectre. Il est définit par : - un seuil de coupure au-dessous duquel la lumière ne passe pas - un pourcentage de transmission maximal (%T) % T Filtre % Transmission Tmax/2 20 transmises Longueur d onde (nm) Figure 50. Le filtre passe haut. Il laisse passer les longueurs d ondes supérieures à une valeur et bloque les autres. La valeur indiquée sur le filtre correspond à la longueur d onde pour laquelle la transmission du filtre est de 50% (Tmax/2 = seuil de coupure). Un bon filtre doit avoir un % de transmission élevé et un seuil de coupure franc (forte pente). Le filtre à bande passante (Band-Pass, BP) Il est le plus utilisé sur les fluorimètres de microplaques. Ce filtre laisse passer les longueurs d ondes comprises entre deux valeurs et bloque les autres. Il est définit par : - une longueur d onde : Central WaveLength (CWL) - un pourcentage de transmission maximal (%T) - une bande passante (BP)

6 Page : 69/ CWL % T Filtre % Transmission Tmax/2 BP = 10 nm transmises Longueur d onde (nm) Figure 51. Filtre à bande passante. Un bon filtre à bande passante doit posséder une transmittance élevée, une bande passante étroite avec des seuils de coupure francs. Par exemple, un filtre BP535/10 centré sur 535 nm avec une bande passante de 10 nm laisse passer les longueurs d onde entre 530 nm et 540 nm. Par rapport aux filtres passe haut, le filtre à bande passante permet de sélectionner précisément les fenêtres de longueurs d ondes les mieux adaptées à l excitation d un fluorophore d intérêt et à la mesure de l émission de sa fluorescence. Idéalement, à l émission, la bande passante est centrée sur le pic d émission du fluorophore et couvre une partie de son spectre. Plus une bande passante est large, plus grand est le nombre de photons collectés. Cela a une influence directe sur la sensibilité de la détection du fluorophore. Néanmoins, l utilisation d un filtre d émission à large bande passante augmente le risque de mesurer des signaux parasites (signal moins résolutif). Par conséquent, si le signal est suffisant, il vaut mieux toujours limiter la largeur de la bande passante pour améliorer le signal sur bruit de la lecture. Dans la pratique, lorsque deux ou plusieurs fluorophores avec des propriétés optiques différentes se trouvent dans le même échantillon, il faut utiliser des bandes passantes relativement étroites pour sélectionner les longueurs d onde spécifiques de chacun des fluorophores et réduire la contamination croisée.

7 Page : 70/ 77 La largeur de la bande passante doit essentiellement tenir compte de deux paramètres : - la brillance des fluorophores, - les propriétés optiques des différents fluorophores présents dans l échantillon : le filtre à bande passante doit permettre de séparer les longueurs d ondes des différents fluorophores en évitant, si cela est possible, la contamination croisée (voir chapitre III). Le monochromateur remplace les filtres sur les Flexstation 1et 3 Sur les Flexstations 1 et 3 les longueurs d ondes d excitation et d émission ne sont pas sélectionnées par des filtres mais par des monochromateurs. Un monochromateur est utilisé pour séparer les différentes longueurs d ondes d un faisceau lumineux. Pour cela, le faisceau lumineux est envoyé soit sur un cristal qui va diffracter la lumière soit sur un prisme qui va la disperser en donnant à chaque longueur d onde une direction qui lui est propre (Figure 52). Il est ainsi possible de sélectionner une longueur d onde très précisément en positionnant la fente de sortie (au niveau du lecteur de plaque) à la position voulue. dispersion prisme Figure 52. Monochromateur à prisme (adapté de L avantage du monochromateur par rapport au filtre est qu il permet de sélectionner avec une haute précision n importe quelle longueur d onde (bande passante étroite, +/- 1 nanomètre en général). Par contre, par rapport à un filtre équivalent, on perd beaucoup d énergie avec le monochromateur ce qui se traduit par une importante perte de sensibilité.

8 Page : 71/ 77 C LE MIROIR DICHROÏQUE (PHERASTARFS, RUBYSTAR, INFINITE F500, MITHRAS LB940) Il sert à réfléchir le faisceau d excitation dans le puits de la microplaque et à transmettre au niveau du détecteur une partie de la fluorescence émise par les fluorophores présents dans l échantillon. Il est défini par : - un seuil de coupure - un niveau de transmission par longueur d onde (%T) 100 Détecteur 80 % T Source lumineuse % Transmission Tmax/2 20 Echantillon réfléchies transmises 500 Longueur d onde (nm) Echantillon Figure 53. Miroir dichroïque. Le miroir dichroïque fonctionne à l émission un peu comme un filtre Long-Pass sauf qu il réfléchit à 45 les longueurs d onde qu il ne laisse pas passer. En coupant les longueurs d onde d excitation (Figure 53), le miroir dichroïque contribue avec les filtres à limiter les bruits à l émission. Il existe différents miroirs dichroïques. Tous ne séparent pas les faisceaux comme cela est représenté sur la figure 53. Pour exemple voir Figure 54.

9 Page : 72/ 77 Ne réfléchit sur l échantillon que 50% de la lumière du LASER azote à 337 nm Ne transmet pas une émission à 540nm Figure 54. Miroirs dichroïques. Deux exemples de miroirs dichroïques différents. Sur l axe des ordonnées est représenté le % de transmission du miroir dichroïque. D LE SEPARATEUR DE FAISCEAU OU BEAM SPLITTER (PHERASTARFS, RUBYSTAR) La mesure est réalisée simultanément sur deux longueurs d ondes à 620 nm et 665 nm pour les mesures de FRET en temps résolu. Pour réaliser ces mesures un séparateur de faisceau est placé après le miroir dichroïque. Comme son nom l indique, cet élément optique sépare un faisceau lumineux en deux autres faisceaux présentant la même composante spectrale mais avec une intensité divisée de moitié (50/50). En théorie, par rapport au miroir dichroïque, le séparateur de faisceau est plus universel car il permet de séparer n importe quelles longueurs d ondes à l émission. En pratique, il ne peut être utilisé que pour des mesures avec de très forts signaux puisque par définition il ne renvoie que la moitié du signal incident. Pour réduire cette perte de sensibilité on peut le remplacer par un second miroir dichroïque avec un seuil de coupure judicieusement placé entre les deux longueurs d onde d émission à séparer. Le séparateur de faisceau 50/50 présente tout son intérêt lorsqu il est couplé à un monochromateur même s il contribue à diminuer encore la sensibilité de la détection.

10 Page : 73/ 77 Figure 55. Miroir dichroïque couplé à un séparateur de faisceau pour une mesure à double longueur d onde. Ce système est utilisé pour les mesures de FRET en temps résolu. NB. Sur l Infinite F500 les deux longueurs d ondes à 620 nm et 665 nm sont mesurées séquentiellement car le système ne possède pas de séparateur de faisceau et est équipé d un seul détecteur. Le temps de mesure sur ce système est donc plus long. E LES DETECTEURS Le photomultiplicateur (PMT) est le mode de détection le plus utilisé pour les lecteurs de fluorescence en plaque. Tous les lecteurs de la plateforme sont équipés d un ou plusieurs photomultiplicateurs. Ce type de détecteur présente une grande sensibilité grâce à une amplification du signal par cascade d électrons (Figure 56). Le signal émis sous forme de photons est converti en un signal électrique quantifiable.

11 Page : 74/ 77 Figure 56. Schéma d un photomultiplicateur. Dans le tube à vide, sous l action des photons incidents provenant de l échantillon, un photoélectron est arraché du métal semi-conducteur de la photocathode. Le faible courant généré est ensuite amplifié dans le photomultiplicateur pour créer un signal électrique détectable et quantifiable électroniquement. La sensibilité du PMT dépend de la longueur d onde.