Faire un membre: les mains sont plus récentes que les bras

Transcription

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2 Le plan d'organisation du membre antérieur comprend trois régions : le stylopode (le bras) contenant l'humérus, le zeugopode (l'avant bras) regroupant les radius et le cubitus, l'autopode (la main) constitué par les os du poignet (les carpes) et des doigts (les métacarpes et les phalanges). S'organisent dans l'espace selon trois axes : l'axe proximo-distal de l'épaule aux phalanges, l'axe antéro-postérieur du pouce à l auriculaire et l'axe dorso-ventral. La mise en place du membre requiert une séquence morphogénétique régulée dans l'espace et le temps. Elle est conservée chez les tétrapodes.

3 L organogénèse des membres commence lorsque des cellules de la somatopleure, structure mésodermique issue des lames latérales se détachent de cette structure et se rassemblent sous l épiderme. Elles formeront les éléments squelettiques des membres. Elles sont rejointes par les cellules qui se détachent de la région ventrale du somite. L accumulation de ces deux types cellulaires conduit à un soulèvement de l épiderme sus-jacent.

4 Il apparaît alors à la surface de l embryon une saillie circulaire appelée le bourgeon du membre ou bourgeon appendiculaire. Les bourgeons des membres antérieurs se forment dans la région adjacente aux somites 7-12 et à 9-9,5 jours de développement. Les bourgeons des membres postérieurs font saillis au voisinage des somites à 9,5-10 jours de développement.

5 Le bourgeon appendiculaire à l origine des membres est une structure très organisée : une partie centrale mésenchymateuse d'origine mésodermique recouverte par l ectoderme. L'ectoderme situé à l'extrémité du bourgeon s'épaissit pour former une structure spécialisée : la crête apicale ectodermique. Cette structure maintient une croissance continue du bourgeon de membre le long de l'axe proximo-distal. AER

6 Croissance proximo-distale Prolifération du mésoderme : zone de progression 1mm/jour

7 Le bourgeon de membre s'aplatit le long de l'axe dorso-ventral et devient asymétrique par rapport à l'axe antéro-postérieur. Les éléments les plus proximaux sont les premiers à se différencier suivi des structures plus distales. Cette organogenèse dépend de la mise en place et du maintien de trois centres signalisateurs : la crête ectodermique apicale, la zone d'activité polarisante et l'ectoderme du bourgeon de membre. La zone d'activité polarisante

8 AER : contrôle la croissance proximo-distale (épaule! doigts) en stimulant la prolifération des cellules du mésenchyme. Ectoderme de surface : signaux contrôlant l axe dorso-ventral (dos de la main! paume). ZPA : induit la polarité antéro-postérieure ( pouce! auriculaire).

9 les mains sont plus récentes que les bras D après Zeller et al., Nature reviews genetis 10,

10 Souris Poulet Deux modèles d étude D après Bénazet et Zeller Cold Spring Harb Perspect Biol., 1, 1-14.

11 Polydactylie Préhistoire Huit doigts de pied Chat d Hemingway Méthodes d étude : ablations, greffes, inactivations, billes, distribution des gènes

12 Quel rôle pour la crête apicale ectodermique : analyses expérimentales : Ablation de l AER La CAE : Chez le poulet L AER permet la croissance du membre selon l axe proximo-distal La crête ectodermique apicale est donc responsable de la croissance continue et du développement du membre.

13 Quel rôle pour la crête apicale ectodermique : analyses expérimentales : Chez le poulet Interactions épithélium mésenchyme Le mésenchyme induit la formation de la CAE assure la survie détermine le type de membre D après Wessells, 1977

14 Quel rôle pour la crête apicale ectodermique : analyses expérimentales : Chez le poulet Est ce la CEA qui fournit au mésenchyme les informations quand aux structures à fabriquer? Transplantations réciproques CEA âgée et mésenchyme jeune : membre correctement formé mésenchyme âgée et CEA jeune : membre normal CEA et mésenchyme jeune greffé sur bourgeon de membre âgée : structures proximales apparaissent CEA et mésenchyme âgée greffé sur bourgeon de membre jeune : structures distales apparaissent Le mésenchyme spécifie la polarité proximo distale : deux modèles

15 Quel rôle pour la crête apicale ectodermique : hypothèse Hypothèse de la zone de progression La spécification de chaque cellule mésodermique dépend du temps qu elle passe à se diviser dans la ZP. Plus elle réside, plus elle accumule de mitoses et plus elle acquiert un caractère distal Les première qui quittent la ZP formeront le stylopode Si on maque une cellule dans la ZP, les descendants restent confinés dans un segment délimité du membre Les cellules de la pointe du bourgeon contribuent qu à la formation de l autopode.

16 Quel rôle pour la crête apicale ectodermique : hypothèses Hypothèse de la programmation précoce et de l expansion de la descendance L affectation des cellules est spécifiée très tôt dans la ZP. Les divisions fournissent les précurseurs de chaque région du membre

17 Quel rôle pour la crête apicale ectodermique : Analyses moléculaires FGF 8 souris FGF8 ectoderme FGF8 dans la CAE au début de sa formation et tout au long du développement du membre

18 Quel rôle pour la crête apicale ectodermique : Analyses moléculaires FGF 10 Présent dans le mésenchyme. Expression plus marquée dans le mésenchyme dorsal Ohuchi et al., 1997, Development

19 Quel rôle pour la crête apicale ectodermique : analyses expérimentales : FGF10 Quand le mésenchyme du bourgeon de membre est formé, les cellules sécrètent du FGF 10 qui induit l ectoderme pour former la crête apicale Si l on greffe une bille imprégnée de FGF10 formation d un membre ectopique hybridation

20 Quel rôle pour la crête apicale ectodermique : analyses expérimentales : rôles FGF 8/10 Ablation CAE hybridation FGF10 (24h) 7 jours Absence des structures distales Ablation partielle + cellules hybridation FGF8 (24h) hybridation FGF10 Exp contrôle Ablation partielle + cellules hybridation FGF8 (24h) hybridation FGF10 FGF8 restaure l expression de FGF10 Ohuchi et al., 1997, Development

21 Quel rôle pour la crête apicale ectodermique : analyses expérimentales : rôles FGF 8/10 Ablation partielle + cellules hybridation FGF10 (24h) hybridation FGF 8 contrôle (bourgeon contra-latéral) Les cellules FGF10 induisent l ectoderme adjacent à exprimer FGF8. expression discontinue -> locale Ohuchi et al., 1997, Development

22 La crête apicale ectodermique : analyses expérimentales : un modèle possible En retour la crête sécrète FGF8 souris mésenchyme crête FGF8 FGF 10 FGF 8 Maintien de la prolifération du mésenchyme : zone de prolifération proximo distale

23 La crête apicale ectodermique : analyses expérimentales Bille FGF ou cellules Membre antérieur ou postérieur? chimère

24 La crête apicale ectodermique : analyses moléculaires Les gènes Tbx 4 et 5. Facteurs de transcription Tbx5 : membre antérieur Tbx4 membre postérieur Perte de fonction : Tbx5 pas de membre antérieur Perte de fonction : Tbx4 membre postérieur incomplet

25 La crête apicale ectodermique : analyses moléculaires Pitx1, facteur de transcription Membre postérieur Gain de fonction : expression ectopique Dans l aile chez le poulet transformation en patte

26 La crête apicale ectodermique : analyses moléculaires Tbx4 Inactivation Tbx5

27 La crête apicale ectodermique : analyses expérimentales Membre antérieur ou postérieur? Tbx5 Gènes Tbx, facteur de transcription Tbx4 Ébauche induite Ébauche induite Bille FGF bille bille Partie antérieure de l ébauche induite Membre chimère Tbx5 spécifie le membre antérieur Partie postérieure de l ébauche induite Membre chimère Tbx4 spécifie le membre postérieur

28 La crête apicale ectodermique : bilan Détermination Induction réciproque

29 Quel rôle pour la zone d'activité polarisante Centre organisateur localisé dans le mésenchyme au bord postérieur du bourgeon La zone d'activité polarisante

30 Quel rôle pour la zone d'activité polarisante La zone d'activité polarisante est localisée dans le mésenchyme au bord postérieur du bourgeon et contrôle la mise en place de la polarité antéro-postérieure. Antérieur greffe Duplication en miroir Antéro ZPA Postérieur Postérieur

31 La zone d activité polarisante : données expérimentales Comment la ZP exerce t-elle cet effet polarisant? Shh est localisée dans le mésenchyme au bord postérieur des bourgeons Shh

32 Schéma de la synthèse et de la maturation de Shh. Outre le clivage du peptide signal (PS), la protéine Shh subit un clivage autoprotéolytique au niveau d un motif Gly/ Cys/Phe (GSF), qui génère le peptide amino-terminal (Shh-N). Une molécule de cholestérol est fixée à l extrémité C- terminale du peptide Shh-N. Le peptide Shh-N est palmitoylé sur l extrémité N-terminale. La libération du peptide Shh-N à l extérieur des cellules dépend de l activité de Dispatched qui présente une homologie de séquence avec Patched, le principal récepteur de Shh sur les cellules cibles de la voie.

33 Modèle simplifié de la voie de signalisation Shh chez les vertébrés. En absence de Shh, Patched (Ptc), une protéine présentant 12 domaines transmembranaires (DTM) réprime l activité de Smoothened (Smo), un récepteur à 7 DTM. Une forme répressive de Gli est ainsi libérée après la phosphorylation de la protéine kinase A (PKA), et déplacée vers le noyau, où elle inhibe les gènes cibles. La réception du signal Shh (flèche rouge) par Ptc lève l effet inhibiteur exercé par Ptc sur Smo. L activation d un complexe macromoléculaire conduit à la production de la forme activatrice de Gli qui induit les gènes cibles parmi lesquels Ptc et Gli1. Le signal Shh sur la cellule cible est inhibé lorsque Shh se lie à Hip (flèche bleue).

34 Modèle simplifié de la voie de signalisation Shh chez les vertébrés. Modèle d action du récepteur PTCH Lorsque la voie de signalisation HH est inactive, PTCH Lorsque le ligand Shh se fixe à PTCH, les molécules restent pompe de petites molécules vers le milieu extracellulaire. Ces dans le cytoplasme. SMO n est plus inhibé et peut molécules inhibent SMO en s y fixant transmettre le message d activation de la voie shh. D après van den Brink, 2007.

35 Modèle simplifié de la voie de signalisation Shh chez les vertébrés. Shh peut induire la transcription de Gli1 et Gli2, alors qu il réprime Gli3. Gli1/SHH et Gli3 s antagonisent les uns les autres. SHH affecte le choix de la fonction Gli répressive ou activatrice. La signalisation SHH peut réprimer la formation des répresseurs Gli3, et influence la formation des activateurs Gli2 et Gl1. D après Ruiz i Altaba et al, 2002.

36 La zone d activité polarisante : données expérimentales Résultats identiques avec des billes imprégnées de Shh

37 Tout indique que SHH est la molécule active de la ZP. Mais comment est elle produite si localement??? Données expérimentales Ablation de la ZPA Puis billes de FGF Bille FGF bille

38 La zone d activité polarisante : données expérimentales Hybridation FGF 10 Hybridation FGF 8 SHH induit ectopiquement l expression de FGF 10 et FGF 8

39 La zone d activité polarisante : données expérimentales Ablation de la CAE postérieure Hybridation SHH L expression de SHH disparait Ablation de la CAE postérieure Cellules sécrétant FGF 10 Hybridation SHH L expression de SHH est activée dans la région de la greffe Ablation de la CAE postérieure Cellules sécrétant FGF 8 Hybridation SHH cellules L expression de SHH est activée dans les régions proximale et distale de la greffe de cellules

40 La zone d activité polarisante : données expérimentales Chez la souris Shh Chez la souris, mutation de Shh génère une troncation des membres avec une réduction ou disparition des doigts

41 La zone d activité polarisante : données expérimentales Shh -/- Shh -/- Membre antérieur Membre postérieur Témoin Gli3 -/- D après Robert et Lallemand, Dev Dyn., 235,

42 La crête apicale ectodermique : bilan Détermination Induction réciproque Croissance polarité

43 La zone d activité polarisante : données expérimentales FGF 8 FGF 8 ZPA Shh FGF 8 + FGF 4 Asymétrie moléculaire Shh FGF 4 La protéine Shh provoque ensuite une cascade d'activation qui conduit les cellules de la crête apicale à synthétiser un autre facteur de croissance : le FGF4 En synergie avec FGF8, il induit également une prolifération des cellules de la zone de progression.

44 prépatterning Perte de fonction shh Gradient spatial Gradient temporel D après Bénazet et Zeller Cold Spring Harb Perspect Biol., 1, 1-14.

45 L ectoderme D'autres protéines sont également nécessaires à l organisation générale du membre. Les protéines En1 et Wnt-7a qui sont liées à la détermination des régions ventrales et dorsales du futur membre. Elles sont produites par le troisième centre de signalisation : l ectoderme. Inactivation de Wnt7a chez la souris Deux paumes

46 Les gènes Hox Des sondes nucléiques dérivées des homéoboites ont été utilisées pour rechercher des séquences homologues chez les vertébrés puis chez d autres invertébrés. 4 complexes : les Hox, homologues du complexe HOM-C de la drosophile : sur des chromosomes différents ordre des gènes identique

47 Les gènes Hox Génes paralogues : chez la souris, 13 groupes de paralogie (ou sous-classes). Par exemple, les gènes Hoxa-4, Hoxb-4, Hoxc-4 et Hoxd-4 sont des gènes paralogues. Ils forment un sous-groupe.

48 Les gènes Hox

49 Les gènes Hox : expression

50 Les gènes Hox : les Hox d et a L activation de la transcription des gènes Hox d un même complexe au cours du développement embryonnaire est séquentielle. Elle suit la règle dite de colinéarité : plus un gène Hox est proche de l extrémité 3 du complexe, plus sa transcription est précoce plus la frontière antérieure de son domaine d expression est localisée vers l extrémité antérieure de l embryon. Il y a une colinéarité spatiale et temporelle entre le patron d expression des gènes d un complexe Hox et leur disposition sur le chromosome. Combinatoire d expression des gènes Hox imprime aux cellules une information de position selon l axe antéro-postérieur ou proximo-distal.

51 Les gènes Hox : les Hox d et a Expression antéropostérieur

52 Analyses moléculaires Les gènes Hox Les facteurs de transcription

53 Hox a13 Hox d13 Hox d11 Hox a11

54 Les gènes Hox : les Hox d et a Distribution selon deux axes : Proximo distal : Hox a Cranio caudal : Hox d

55 Les gènes Hox

56 Les gènes Hox Les gènes Hoxd-9 et Hoxd-10 qui s'expriment de manière précoce dans le domaine proximal du bourgeon de membre a une fonction primordiale dans la mise en place du bras.

57 Les gènes Hox Les gènes Hoxd-11, Hoxd-12 et Hoxd-13 qui s'expriment de manière plus tradive dans le domaine proximal du bourgeon de membre ont une fonction primordiale dans la mise en place de l avant bras.

58 Les gènes Hox Les gènes Hoxa-13, Hoxd-13, Hoxa-12, Hoxd-10, Hoxd-11 et Hoxd-12 qui s'expriment en dernier lieu dans le domaine proximal du bourgeon de membre ont une fonction primordiale dans la mise en place de la main.

59 Les gènes Hox Souris

60 Les gènes Hox * Méromélie: Absence d'une partie d'un membre * Amélie: absence d'un ou de plusieurs membres * Phocomélie: absence des structures proximales des membres * Hémimélie: absence des structures distales des membres * Syndactylie:fusion des orteils ou des doigts * Polydactylie: Présente de doits ou d'orteils surnuméraires

61 Les gènes Hox Hiérarchie fonctionnelle dans la fonction de ces gènes. En effet, une mutation des gènes des groupes de paralogie 11 ou 12 provoquera des malformations des autopodes moins prononcées qu'une mutation qui affecte les gènes du groupe 13. Tout se passe comme si les gènes du groupe 13 exerçaient une action dominante sur le fonctionnement des autres gènes pour assurer la mise en place des structures finales de la main

62 Les gènes Hox Hiérarchie fonctionnelle des paralogues

63 Morts cellulaire programmée apoptose

64 Morts cellulaire programmée apoptose Acridine orange

65 Morts cellulaire programmée apoptose Mise en évidence de l apoptose

66 Morts cellulaire programmée apoptose E 11.5 E 13.5 Rouge neutre D après Fernandez-Teran at al., Dev Dyn. 235, TUNEL

67 Mort cellulaire programmée dans le mésenchyme Membre antérieur Membre postérieur D après Fernandez-Teran at al., Dev Dyn. 235,

68 Mort cellulaire programmée dans le mésenchyme Acridine orange Rôle BMP?? Antagonistes de BMP : chordin, noggin Pas de signalisation

69 Morts cellulaire programmée apoptose Le rôle des BMP Microbilles chargé d inhibiteur Inhibition de BMP Inhibition de BMP bloque l apoptose Patte de poulet (témoin) Les espaces interdigitaux sont le siège de l apoptose La palmure persiste si l on insère dans le mésoderme interdigital des billes diffusant un inhibiteur des BMP

70 Morts cellulaire programmée apoptose Témoin Surexpression noggin

71 Morts cellulaire programmée apoptose Apoptose Témoin Surexpression noggin Pas, peu d apoptose articulations Pas d articulations cartilage espaces interdigitaux Une interprétation possible: en présence de noggin, BMP a converti la totalité du mésenchyme en cartilage

72 D après Zeller et al., Nature reviews genetis 10,

73 D après Zeller et al., Nature reviews genetis 10,

74 Prolifération et expansion D après Zeller et al., Nature reviews genetis 10,

75 Détermination terminale qui donne une identité aux doigts D après Zeller et al., Nature reviews genetis 10,