Récepteur soluble de la transferrine : Intérêt chez l hémodialysé chronique

Transcription

1 INTRODUCTION 1

2 Au Maroc, les maladies rénales touchent plus d un million de personnes. Ils aboutissent au dialyse chez 4000 malades chaque année, actuellement on compte, d après le registre MAGREDIAL près de 9000 patients dialysés, ce chiffre progresse de 5 à 8% par an. A ce rythme, en 2012, environ patients auront besoin de dialyse. Ces statistiques édifiantes tirent la sonnette d alarme et doivent inciter les professionnels de la santé à s engager fortement dans la prise en charge adéquate de ce type de pathologies, de son retentissement et de ses complications. L anémie est une des complications inéluctables du patient IRC hémodialysé, cette association anémie-irc est évoquée pour la première fois en 1836 par BRIGHT qui décrit la pâleur progressive des patients urémiques [1]. La sévérité de cette complication à caractère multifactoriel est grossièrement proportionnelle à la gravité et au stade de l insuffisance rénale [2]. La prise en charge de l anémie des patients IRC hémodialysés a été révolutionnée par l introduction de la rhu-epo dans les années 90. L apport de cette molécule a été spectaculaire par l amélioration des capacités physiques et intellectuelles des patients, la correction des anomalies cardiaques comme l hypertrophie ventriculaire gauche et la quasi-disparition des besoins transfusionnels. Néanmoins, ce traitement a changé la problématique du statut martiale et la balance du métabolisme de fer est passée du risque de surcharge en fer liée à la transfusion itérative au risque de carence martiale par déficit fonctionnel. Ils ont résulté des situations de résistance à l rhu-epo en raison d une stimulation importante de l EPO qui augmente d autant les besoins en fer. De plus, la présence fréquente d un syndrome inflammatoire diminue également la biodisponibilité de fer par séquestration macrophagique. 2

3 Pour corriger l anémie et ainsi améliorer la qualité de vie des patients, il est donc nécessaire de porter le diagnostic de cette carence martiale. L enjeu est aussi économique, puisqu il faut éviter que cette carence n entraîne pas une surconsommation de la rhu-epo. L évaluation du statut martial et notamment le dépistage du déficit fonctionnel en fer chez l hémodialysé chronique reste problématique dans la mesure où les marqueurs classiques du bilan martial sont souvent pris en défaut pour les raisons déjà évoquées. Les nouvelles recommandations sur le traitement de l anémie chez cette catégorie de patients incluent de nouveaux paramètres (pourcentage de globules rouges hypochromes, teneur réticulocytaire en hémoglobine) qui ne sont malheureusement pas disponibles dans tous les laboratoires. Certaines études ont évaluées un nouveau paramètre de bilan martial, le récepteur soluble de la transferrine. C est un paramètre qui a la propriété de refléter non pas les réserves en fer mais la concentration intracellulaire en fer, notamment des précurseurs érythroblastiques. Il reflète donc l apport effectif du fer à la moelle. Il dépend aussi de l activité érythropoïétique qui est stimulée par la rhu-epo. Nous nous sommes intéressés à ce paramètre chez la population d IRC hémodialysé suivis dans le service de néphrologie, dialyse et transplantation rénale de l HMIMV et dans un autre centre privé de dialyse. Nous avons étudiés son rôle comme marqueur du statut martial et de l érythropoïèse et nous l avons comparé aux marqueurs habituels du bilan martial. 3

4 Partie théorique Revue de la littérature 4

5 I- METABOLISME DU FER A- Physiologie 1. Répartition du fer dans l organisme Le stock en fer global de l organisme est d environ 4 g (l équivalent du poids d un petit clou) chez l homme adulte normal. Le fer se répartit quantitativement dans l organisme entre des sites d utilisation et des sites de stockage. Soixante-dix pour cent du fer de l organisme est utilisé dans la moelle osseuse, pour être incorporé dans l hème au cours de la synthèse de l hémoglobine. Le muscle est le deuxième site d utilisation de fer (10-20 % du fer total), où il est nécessaire à l activité de certaines protéines (myoglobine en particulier). Le foie peut capter et stocker des quantités importantes de fer (1g), notamment lorsque ce dernier est présent en excès dans le plasma [3] (Fig. 1). Figure 1 : Schéma illustrant la répartition du fer dans l organisme [4] 5

6 Après avoir pénétré dans la cellule, le fer doit être correctement réparti entre trois pools différents, représentés par le pool fonctionnel, le pool de réserve et le pool de transfert [5]. 1.1 Pool fonctionnel Ce pool correspond à la quantité de fer nécessaire et suffisante pour assurer les différentes voies métaboliques indispensables à la survie propre des cellules. Ce pool concerne également les communications intercellulaires. Il s agit, plus particulièrement, du fer incorporé dans les protéines héminiques dont l hémoglobine, la myoglobine et les cytochromes mais aussi du fer cofacteur de multiples réactions enzymatiques comme, par exemple, la ribonucléotide réductase [5]. 1.2 Pool de réserve Dans les conditions physiologiques, le pool du fer de stockage représente environ 1g chez l adulte, soit 25% du stock total. Ces réserves se situent essentiellement dans les cellules du système monocytaire-macrophagique et dans les hépatocytes sous deux formes quantitativement égales : La ferritine hydrosoluble qui constitue une réserve échangeable, L hémosidérine non hydrosoluble, plus riche en fer, produit de dégradation partielle de la ferritine dans laquelle le fer est peu mobilisable et qui constitue une réserve martiale stable [6]. 1.3 Pool de transfert Encore appelé pool de fer de «bas poids moléculaire» ou pool de fer labile, il ne représente que 0.1% du total de fer, soit environ 4 mg. Dans le plasma, il n ya pas de fer libre en circulation, car cette forme est trop toxique, il est 6

7 presque exclusivement lié à la transferrine ou sidérophiline. Ce pool constitue une plaque tournante à partir de laquelle le fer est transporté soit vers le pool fonctionnel, soit vers le pool de stockage [7]. 2. Mouvement du fer : Apports et besoins Le métabolisme du fer se fait en circuit clos, avec échange entre les différents compartiments de l organisme [7]. Les apports, qui compensent simplement les pertes, représentent une part minime de la masse totale. 2.1 Pertes de fer Les pertes sont faibles de 1 à 2 mg/jour, l organisme étant avare de son fer. Ces pertes sont essentiellement liées à la desquamation cellulaire, digestive et cutanée. Cependant une très faible quantité de fer est aussi perdue par les voies biliaire et urinaire. Chez la femme s y ajoutent les pertes gynécologiques qui représentent environ 12 à 15 mg par cycle menstruel, et les pertes liées au transfert du fer au fœtus lors de la grossesse, ainsi que celles en rapport avec l allaitement. Enfin, lors du don de sang puisque, 500 mg de fer sont retirés chaque fois que 1 litre de sang est soustrait [8, 9, 10]. 2.2 Apport de fer Un à deux mg de fer sont quotidiennement absorbés au niveau du duodénum, ce qui représente environ 10 % du fer contenu dans une alimentation normale. La captation de fer peut s adapter, au moins en partie, aux besoins de l organisme qui peuvent varier dans différentes situations physiologiques : augmentation lors de la croissance, la grossesse et l allaitement. Le pourcentage de fer extrait de l alimentation par le tube digestif peut alors augmenter. 7

8 Le fer alimentaire présent sous forme héminique (viande rouge, poisson par exemple.) a une biodisponibilité supérieure à celle du fer non héminique (végétaux, œufs, produits laitiers) et se lie à un récepteur membranaire qui permet son internalisation. L hème est alors dégradé sous l action de l hèmeoxygénase libérant le fer dans l entérocyte. L absorption du fer non héminique nécessite une phase de solubilisation qui est facilitée par l acidification se produisant au niveau de l estomac. Ainsi le fer héminique représente environ 2/3 du fer absorbé alors qu il ne constitue qu un tiers des apports [11]. 2.3 Mouvements internes La boucle la plus importante est réalisée par le circuit de l érythropoïèse. L incorporation du fer pour la synthèse quotidienne de l hémoglobine est identique à la qualité libérée par l hémolyse physiologique, c est-à-dire 20 à 50 mg/jour. Le macrophage reconnaît diverses modifications biochimiques au niveau de la membrane des globules rouges sénescents. Il phagocyte alors le globule rouge à éliminer, induisant la formation d un érythrophagolysosome dans lequel un complexe enzymatique constitué de cytochrome réductase, d héme-oxygénase et de biliverdine réductase, va cataboliser l hémoglobine. Ce catabolisme libère du CO, de la bilirubine et du fer. Ce fer recyclé, alors à l état ferreux Fe 2+, va être soit capté par l apoferritine intracellulaire pour former de la ferritine (stock de réserve en fer), soit être exporté par la ferroportine vers le plasma où il sera oxydé en fer ferrique Fe 3+ par la céruléoplasmine, une ferroxydase cuivre-dépendante, pour être fixé par la transferrine qui le distribue alors aux tissus qui en ont besoin, essentiellement les précurseurs érythroblastiques [12]. 8

9 3. Régulation de l homéostasie martiale Les mécanismes de régulation des mouvements du fer sont restés très longtemps méconnus. Depuis quelques années, la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent l homéostasie du fer a considérablement progressé grâce au clonage et à la caractérisation d un grand nombre de protéines effectrices impliquées dans le métabolisme du fer [5, 13]. L absorption intestinale est une étape capitale, car la régulation de l homéostasie du fer n est possible qu à ce niveau [6]. 3.1 Régulation de l absorption intestinale du fer L absorption intestinale du fer varie d une manière inversement proportionnelle à la quantité de fer stockée et, en revanche, de façon proportionnelle à l activité de l érythropoïèse. À cet égard, Finch [14] a proposé l existence de deux régulateurs: un régulateur stock-dépendant qui serait contrôlé par le contenu en fer de l organisme et un régulateur érythro-dépendant régulé par les besoins de l érythropoïèse. Ces derniers agiraient sur un processus de contrôle intestinal commun (informeraient les cellules cryptiques) mais de façon séquentielle et avec des effets quantitatifs différents. Ainsi, le facteur stock-dépendant permettrait d augmenter l absorption intestinale du fer lorsque les besoins restent limités à 1 ou 2 mg par jour. Son intervention serait typiquement nécessaire lors des pertes menstruelles. Des besoins plus importants, de l ordre de 3 à 4 mg par jour, déclencheraient l activation du facteur érythrodépendant. Ce serait notamment le cas lors des soustractions sanguines volontaires (donneurs de sang) ou curatives. Ces deux régulateurs doivent être représentés par des agents plasmatiques solubles capables de communiquer avec 9

10 les différents sites impliqués dans l utilisation, la mobilisation et l absorption du fer; sites relativement éloignés les uns des autres [5]. L absorption du fer alimentaire s effectue au niveau de la partie proximale de l intestin grêle, par les entérocytes matures des villosités duodénales (Fig. 2). Le fer alimentaire non héminique est réduit par Dcytb puis absorbé au niveau de la bordure en brosse intestinale, par l action coordonnée d une réductase et du transporteur de fer Nramp2/DMT1. L absorption du fer héminique s effectue par le transporteur apical spécifique HCP1 [15]. Le catabolisme successif de l hème par HO-1 libère le fer ferreux, qui peut ainsi rejoindre le pool de fer non héminique internalisé par Nramp2/DMT1. Le fer est ensuite soit stocké dans la ferritine (ou l hémosidérine), soit exporté au pôle basolatéral de l entérocyte (par l action coordonnée de la ferroportine et de l héphaestine, voire de la céruléoplasmine) pour rejoindre la circulation sanguine [16] (Fig. 2). 10

11 Figure 2 : Représentation schématique de l absorption du fer au niveau du tube digestif [17] CYBRD1 : Cytochrome b réductases 1 ; DMT1 : dimetal transporter 1; FPN : ferroportine; HEPH : Hephaestine; Tf : transferrine ; HO : Hème oxygénase ; CO : monoxyde de carbone ; BVD : biliverdine ; Ferr : ferritine; HJV : hémojuvéline ; TfR2 : récepteur à la transferrine Protéine HFE Le modèle de programmation des cellules de la crypte. Modulé par HFE, le contrôle de la pénétration du fer liée à la transferrine en présence de Rtf et de Rtf2 se ferait au niveau des cellules cryptiques intestinales. Ce contrôle aboutirait à la programmation de l expression des gènes impliqués dans l absorption du fer non héminique au niveau des entérocytes matures. Au cours de la maturation des entérocytes, des expressions différentielles de gènes se produisent (par exemple, HFE et Rtf ne sont plus synthétisés dans les 11

12 entérocytes matures alors que l inverse se produit pour DMT1). Pour certaines protéines telles que Rtf et DMT1, la présence d IRE sur les gènes codant ces protéines (soumis donc à une régulation post-transcriptionnelle de ces gènes) expliquent au moins en partie leur régulation différentielle dans un même entérocyte [18]. 3.3 Hepcidine Synthétisée par le foie sous forme d un précurseur de 84 acides aminés, l hepcidine est une hormone peptidique de 25 acides aminés, sécrétée dans le plasma et éliminée dans les urines. Elle possède une structure très particulière, compacte, conférée par quatre ponts disulfures formés à partir de huit cystéines conservées dans l évolution [19]. D abord identifiée pour son activité antimicrobienne, l hepcidine s est révélée jouer un rôle central dans le métabolisme du fer, en inhibant l absorption intestinale du fer alimentaire et le recyclage du fer héminique des macrophages. L action de l hepcidine passe par sa liaison à la ferroportine et par l internalisation intralysosomale de l exporteur, conduisant ainsi à sa dégradation [20, 21]. L expression de l hepcidine est augmentée par un régime riche en fer et par l inflammation (chronique ou aiguë) et le gène est au contraire réprimé par l hypoxie, la carence en fer et l anémie (Fig. 3) [19]. 12

13 Figure 3 : Schéma illustrant la relation entre la concentration plasmatique en Hepcidine et la disponibilité en fer [21] 3.4 Le système IRE-IRP Il existe un système moléculaire, contrôlant la régulation posttranscriptionnelle de certains gènes, dont l activité est directement corrélée à la charge intracellulaire libre en fer. Ce système fait intervenir une séquence spécifique de l ARNm, nommée IRE, sur laquelle se lie une protéine cytoplasmique, baptisée IRP. Les éléments, appelés IREs, sont des séquences nucléotidiques particulières avec des structures secondaires en épingle à cheveux. Elles sont présentes au niveau des régions 5 ou 3 non traduites de certains ARNm. Les IRPs sont, d où leur nom, des protéines cytoplasmiques qui vont lier la séquence IRE si la concentration cellulaire en fer est basse et, au contraire, ne peuvent s y associer si la concentration cellulaire est élevée (Fig. 4). 13

14 Une augmentation de la concentration cellulaire en fer a pour conséquence : D une part, de diminuer la quantité d ARNm du récepteur 1 de la transferrine ; ces derniers sont, en effet, rapidement détruits par une ribonucléase (ceci a pour effet de limiter l entrée du fer dans la cellule). D autre part, d augmenter la traduction des ARNm de la ferritine, permettant ainsi de produire suffisamment de protéine pour stocker les atomes de fer présents en excès et limiter leur toxicité potentielle. À l inverse, lorsque la cellule est carencée en fer, les IRPs présentent alors une forte affinité pour les IREs. Ceci facilite l entrée du fer en permettant une expression plus importante du récepteur 1 de la transferrine et une diminution de la synthèse de ferritine, rendue inutile puisqu il n existe pas d atome de fer en excès [5]. La force de ce système est qu il régule le taux de protéines directement liées au métabolisme du fer, dont le récepteur 1 de la transferrine (entrée du fer), la ferritine (stockage du fer), la ferroportine (export du fer), DMT1 (absorption de fer) et l ALAS (synthèse de l hème) [23]. 14

15 Figure 4 : Représentation schématique des principes de la régulation post transcriptionnelle par le système IRE/IRP [17] 4. Erythrophagosytose et recyclage du fer héminique La reconnaissance spécifique d un globule rouge vieilli par un macrophage tissulaire est suivie de l internalisation du globule rouge par phagocytose. La maturation de l érythrophagosome permet le recrutement des enzymes nécessaires à la dégradation des constituants du globule rouge. L hémoglobine provenant de l érythrocyte est dégradée en biliverdine et CO par l hème oxygénase, libérant ainsi le fer. Ce fer peut être stocké sous forme de ferritine ou peut être exportée par l intermédiaire de la ferroportine dans le milieu extérieur. Le fer sous forme ferreux est oxydé en forme ferrique par la céruléoplasmine avant d être transporté par le récepteur à la transferrine. Ce fer peut de nouveau servir pour l érythropoïèse. La ferroportine est régulée par l hepcidine (Fig. 5). 15

16 Ce processus permet de recycler 25 à 30mg de fer par jour, correspondant aux besoins en fer nécessaires pour produire environ 200 milliards de nouveaux érythrocytes/ jour [24]. Figure 5 : Fer et système des phagocytes mononuclées [17] Clp : céruloplasmine ; HO : hème oxygénase; CO : monoxyde de carbone ; BVD : biliverdine ; FPN : ferroportine ; Tf : transferrine. 5. Erythropoïèse L'érythropoïèse est la production continue de globules rouges régulée par la moelle osseuse permettant de compenser quotidiennement la perte de 1/120 ème de la masse globulaire totale due à l'hémolyse physiologique. 100 à 250 milliards de globules rouges sont ainsi produits chaque jour chez le sujet normal. En cas de besoins accrus, la production peut être multipliée de façon considérable, jusqu'à 10 fois [25]. La voie de l érythropoïèse est un enchaînement de processus associant divisions cellulaires, apoptose et différenciation. Elle commence avec le progéniteur engagé dans la lignée myéloïde, dénommé CFU-GEMM. Les 16

17 premiers stades de la lignée érythroblastique sont les BFU-E précoces, suivis des BFU-E tardives et des CFU-E, auxquelles succèdent les premières cellules identifiables morphologiquement sur le frottis médullaire, de l érythroblaste à l érythrocyte. L EPO stimule l érythropoïèse à partir du stade de BFU-E tardive. L ensemble du processus qui conduit de la BFU-E précoce aux réticulocytes, puis aux hématies, dure environ 20 jours en situation stable. En délivrant aux cellules cibles un signal de survie et de prolifération, l EPO est l élément clef de la régulation de l érythropoïése [26]. B- Perturbations du métabolisme martial 1. Carences La carence martiale est de loin la cause la plus fréquente d anémie microcytaire hypochrome sidéropénique. Selon l OMS la carence martiale concerne 20% de la population mondiale. La sidéropénie peut relever d une insuffisance d apport, d une malabsorption digestive ou de pertes excessives, notamment hémorragiques, le plus souvent répétées et distillantes [27]. 2. Surcharges Les surcharges de l organisme en fer ou hémochromatoses sont définies par le dépassement d une masse de réserve considérée comme normale (de 10 à 15 mg/kg) et sont classiquement divisées en deux catégories [23]. i) Les hémochromatoses primaires sont des maladies héréditaires dans lesquelles une mutation sur un gène codant pour une protéine effectrice du métabolisme du fer provoque un trouble de l absorption ou de la redistribution du fer. l exemple le plus représentatif est l hémochromatose 17

18 de type 1 causé par une mutation sur le gène de la protéine HFE régulant l absorption intestinale du fer [28, 29, 30, 31, 32]. ii) Les formes secondaires sont dues schématiquement à deux grands mécanismes [17, 33, 34]: - La répétition d apports transfusionnels (1 ml de GR apportant environ 1 mg de fer) nécessaire dans les situations d hypoplasie médullaire (aplasies congénitales ou acquises, IRC réfractaires à l érythropoïèse...), de dysérythropoïèse à moelle riche (β-thalassémies majeurs ). - L hyperabsorption digestive secondaire à une érythropoïèse inefficace et accélérée qui nécessite des apports en fer augmentés. 3. Déficits fonctionnels En dehors de ce schéma dichotomique de l état des réserves (carence ou surcharge), il y a tout un ensemble de situations moins faciles à classer. Ce sont les situations où l organisme n arrive pas à fournir assez de fer aux tissus, donc essentiellement aux érythroblastes, pour la synthèse de l hémoglobine malgré des réserves non épuisées [35]. 3.1 Fer et inflammation Les mécanismes physiopathologiques en cause ne sont encore, à l heure actuelle, que partiellement élucidés. Schématiquement, l anémie inflammatoire ou anémie des maladies chroniques peut s expliquer par la combinaison de trois phénomènes résultant d une sécrétion d IL- 1, de TNF-α et d interféron : Une inhibition et une résistance à la sécrétion d érythropoïétine responsables d une érythropoïèse anormale ; 18

19 Des anomalies du métabolisme du fer avec une diminution de la redistribution du fer vers la moelle en raison d une séquestration macrophagique et d une baisse de l absorption intestinale du fer. On attribue maintenant ces effets à l hepcidine. Une diminution de la durée de vie des globules rouges [36]. Cette production d IL-1 stimule également la sécrétion d apolactoferrine qui, une fois couplée au fer, empêche l utilisation de ce dernier pour la synthèse de l hème. L anémie qui en résulte est classiquement modérée, normocytaire normochrome, voire à terme microcytaire hypochrome. Du plus, au cours du syndrome inflammatoire, la concentration de la ferritine augment sans lien avec une augmentation des réserves (protéine "positive" de l inflammation) et le catabolisme de la transferrine est accélérée (protéine "négative" de l inflammation). Il ya a donc une diminution de la biodisponibilité du fer pour les érythroblastes, définissant une carence fonctionnelle contrastant avec ferritinémie élevée et une transferrine sérique diminuée. Il est donc difficile de mettre en évidence cette carence fonctionnelle avec les marqueurs classiques du bilan martial. 3.2 Fer et érythropoïèse accélérée Le terme de déficit fonctionnel a été largement utilisé dans la littérature en néphrologie en référence aux patients IRC qui reçoivent de l EPO. En effet, chez ces patients, l administration d une érythropoïétine augmente la production de globules rouges et donc l utilisation du fer [37]. Ce dernier peut devenir insuffisant même si les stocks ne sont pas épuisés. Le bilan martial classique se 19

20 trouve en défaut, tout comme lors du syndrome inflammatoire, pour évaluer cette situation [38]. II- LES MARQUEURS BIOLOGIQUES DU METABOLISME MARTIAL Nous avons vu que les échanges de fer s opèrent entre trois compartiments métaboliques principaux : fonctionnel, de transport et de réserves. A chaque compartiment correspond des tests d exploration spécifiques qui relèvent de la biochimie et de l hématologie. A- Lesquels? 1. Paramètres évaluant le compartiment fonctionnel L exploration biologique du fer fonctionnel consiste à évaluer le fer hémoglobinique. Deux sortes de paramètres étroitement associés doivent être distinguées, le taux d Hb et les indices érythrocytaires (VGM, TCMH et IDGR) [39]. De nouveaux marqueurs se développés et sont candidats à une évaluation plus spécifique de la carence martiale. Il s agit du pourcentage de globules rouges hypochromes et du contenu réticulocytaire en hémoglobine. Ces paramètres mettent en évidence, non pas une diminution du stock en fer de l organisme, mais une baisse de la disponibilité du fer pour les tissus utilisateurs. 2. Paramètres évaluant le compartiment de transport Pour ce type de fer, l exploration biologique est focalisée sur les dosages suivants : le fer sérique, la transferrine, le CST, et le Rs-Tf. 20

21 2.1 Le fer sérique Chez le sujet normal, le fer circulant sous une autre forme que l hémoglobine est presque exclusivement du fer lié à la transferrine (et très peu à la lactoferrine ou à la ferritine). Par contre à l état pathologique, on peut trouver aussi du fer d origine hémoglobinique (hémolyse), du fer lié à la ferritine en quantité élevée (nécrose hépatique, surcharge), une forme atypique de fer non lié à la transferrine (hémochromatose) ou du fer chélaté sous forme de ferrioxamine [39]. 2.2 La transferrine La transferrine ou sidérophiline est une glycoprotéine assurant le transport du fer depuis les entérocytes intestinaux jusqu aux érythroblastes médullaires et la récupération du fer après destruction des érythrocytes par le système macrophagique. Il s agit d une β globuline synthétisée par le foie et présentant une très forte affinité pour les ions Fe 3+. Chaque molécule possède deux sites de fixation du fer indépendants, si bien que l on peut trouver à tout moment dans le plasma trois formes moléculaires distinctes de transferrine : di ferrique (ayant fixé le fer sur les deux sites), mono ferrique (n ayant fixé le fer que sur l un ou l autre des deux sites), apo transferrine (n ayant pas fixé de fer) (Fig. 6) [39]. 21

22 Figure 6 : Représentation schématique de la transferrine [40] 2.3 Le Rs-Tf C est un paramètre d utilité importante dans l exploration du statut martial. Objet de ce travail, nous lui consacrons tout un chapitre pour bien l étudier en détail. 2.4 Ferritine érythrocytaire La ferritine érythrocytaire est un résidu de la ferritine érythroblastique, dont la concentration est influencée par deux facteurs essentiels : La saturation en fer de la transferrine, Le niveau de synthèse de l Hb. Afin de s affranchir de l influence du VGM et de l hématocrite, la concentration est rapportée à l érythrocyte, d où la nécessité d une numération globulaire effectuée le jour du dosage. Les résultats, exprimés en attogramme/cellule (10-18 g/cellule), sont obtenus après le calcul suivant : 22

23 Ferritine du lysat x Hb du sang total Ferritine érythrocytaire = GR du sang total x Hb du lysat Néanmoins, son dosage demeure peu pratiqué car plus délicat [6]. 2.5 Les paramètres calculés Ils sont représentés par la CTST, le CST, l index du Rs-Tf. 3. Paramètres évaluant le compartiment des réserves Ce compartiment contient le fer séquestré sous forme non toxique, ferritine et hémosidérine, comme cela a été précisé. Seule la ferritine est accessible au dosage. 3.1 Ferritine sérique La ferritine est un hétéropolymère constitué de 24 sous-unités formant une coque, pouvant accueillir en son centre jusqu à atomes de fer (Fig. 7). Ses sous-unités sont de deux types : la chaîne légère ou L-ferritine (FTL) (ferritin light chain) qui est la plus impliquée dans le stockage du fer proprement dit, et la chaîne lourde ou H-ferritine (FTH1) (ferritin heavy chain), qui a une activité ferroxydase permettant l intégration du fer dans la ferritine [41]. L association de 2 chaines peut donner lieu à 25 formes moléculaires possibles (L24, L23H1,..., H24) qui constituent la famille des isoferritines et déterminent la grande hétérogénéité moléculaire de la ferritine [42]. Dans les tissus, dont la capacité de stockage en fer est élevée comme le foie ou la rate, la ferritine est surtout constituée de L-ferritine. Outre son rôle cytoplasmique dans le stockage du fer, la ferritine (50% de réserve soit 15% du fer total) peut être sécrétée, et sa quantité dans le plasma sera alors le reflet de la charge en fer hépatique, ou se lier à l ARN ou l ADN (Fig. 7) [41]. 23

24 Figure 7 : Représentation schématique de la structure de la ferritine [43, 44] 3.2 Ferritine glycosylée La ferritine sérique est constituée par 60 à 80% de ferritine glycosylée (provenant d un phénomène de sécrétion-glycosylation par les monocytesmacrophages) et de ferritine non glycosylée, issue de l excrétion des cellules parenchymateuses. La demi-vie de la ferritine glycosylée est plus longue et sa détermination reflète la lyse tissulaire lors des surcharges en fer ou des affections malignes. Le dosage de la ferritine glycosylée trouve son indication dans l interprétation d une hyperferritinémie difficile à cerner. Dans les hyperferritinémie d origine inflammatoire, le pourcentage de glycosylation reste normal. Plusieurs maladies s accompagnent d une augmentation préférentielle de la ferritine non glycosylée : hépatite aiguë, tumeur, maladie de still. 24

25 Le dosage différentiel des ferritines glycosylée et non glycosylée repose sur l affinité élective de la ferritine glycosylée pour la concanavaline A [6]. Cette technique délicate, mise au point par différentes équipes (Worwood, Cazzola) n est pratiquée que dans quelques laboratoires spécialisés [45, 46]. 3.3 Fer médullaire Le gold standard pour l étude des réserves en fer de l organisme reste la coloration de Perls au bleu de Prusse sur ponction de moelle osseuse qui met en évidence l hémosidérine contenue par les érythroblastes et permet de voir également le fer macrophagique [47]. Cependant, cette technique de référence demande un prélèvement invasif et sa lecture est sujette à une grande variabilité interindividuelle. De plus, elle perd sa valeur après administration parentérale de fer [48]. B- Aspects analytiques 1. Exploration du compartiment fonctionnel 1.1 Phase pré analytique Ce dosage requiert un prélèvement sanguin réalisé sur un tube avec EDTA comme anticoagulant. 1.2 Phase analytique Taux d Hb Il s agit d un dosage spectrophotométrique bien standardisé consistant à transformer l Hb en cyanméthémoglobine et à lire l absorbance à 540 nm. Un standard international est largement utilisé pour la calibration. En fait, cette mesure est depuis longtemps intégrée dans les automates électroniques de cytologie. 25

26 Le taux d Hb ne doit pas être interprété isolément, mais en relation avec les deux indices érythrocytaires ci-dessous [39] VGM Il s agit d un indice mesuré pendant une courte période au cours de laquelle les globules rouges en suspension dans un liquide de dilution passent à travers un orifice et déclenchent une impulsion électronique. Le nombre d impulsions enregistrées correspond au nombre de globules rouges et l amplitude de l impulsion permet de mesurer le VGM. Le VGM est aussi donné par les automates électroniques de cytologie [39] TCMH Indice calculé en divisant le taux d Hb (exprimé en g/l) par le nombre de globules rouges (exprimé par µl) [39]. La TCMH est aussi donnée par les automates électroniques de cytologie IDGR Certains automates donnent un indice érythrocytaire appelé IDGR. Un IDGR augmenté (> 15%) traduit une anisocytose et incite à examiner attentivement les frottis [39] Pourcentage de GR hypochromes De nouveaux modules utilisant la technologie de cytométrie en flux, permettent d évaluer le pourcentage de globule rouges circulants dont la teneur en hémoglobine est faible (CCMH<28 g/dl). Ce paramètre est plus sensible que la TCMH qui ne s abaisse que lorsque l hypochromie concerne un grand nombre de cellules. Des études ont montré qu un pourcentage supérieur à 10% était bien corrélé à la carence martiale [49, 50]. 26

27 1.2.6 Contenu réticulocytaire en Hb Si le pourcentage d hématies hypochromes permet de détecter un état d érythropoïèse inefficace en raison d un déficit en fer, la méthode idéale pour effectuer ce dépistage de manière plus précoce, étant donne la longue durée de vie du globule rouge, serait l étude des globules rouges nouvellement formé tout juste relargués dans le sang périphérique par la moelle osseuse : les réticulocytes. Ces cellules représentent la première forme circulante de globules rouges, présents dans le sang pour une durée qui n excède pas 24 heures en moyenne avant de perdre leurs mitochondries et ribosomes pour devenir des cellules matures de la lignée rouge. De nouveaux automates permettent l analyse des cellules réticulocytaires sans modifier leurs différents indices cellulaires. Il s agit d une technique de cytométrie de flux qui permet d étudier le volume réticulocytaire moyen et la concentration en hémoglobine des réticulocytes. A partir de ces mesures, il est possible de calculer la teneur en hémoglobine de chaque réticulocyte, celle-ci étant égale au produit du volume cellulaire par la concentration en hémoglobine au sein de chaque cellule. Le contenu en hémoglobine des réticulocytes semble être un meilleur indice que le volume réticulocytaire ou que la concentration cellulaire en hémoglobine, car il est plus stable [51]. La mesure du contenu en Hb des réticulocytes disponible sur certain analyseur (Siemens Medical Solution Diagnostics et Sysmex) constitue un examen spécifique et utilisable en routine. Les valeurs usuelles s étendent de 28 à 35 pg/cellule [52, 53]. 27

28 1.3 Phase post analytique Hb - Homme : 13-17,5 g/dl - Femme : 11,5-16 g/dl - Femme enceinte : 10,5-11g/dl - Enfant (à partir d un an) : 11,5-14,5 g/dl VGM fl (10-15 l) TCMH pg/gr L intérêt de l exploration de ces paramètres réside presque exclusivement dans le diagnostic de l anémie par carence en fer (anémie hypochrome ferriprive) où ils sont abaissés (sauf l IDGR qui est augmenté). Ces résultats indiquent une diminution de la livraison du fer aux érythroblastes, mais ne signifient pas obligatoirement qu il n existe plus de réserves en fer. A noter que la TCMH est le premier paramètre à baisser, suivi par le VGM puis par le taux de l Hb. Ces paramètres peuvent être aussi de quelque utilité dans l évaluation de la réponse à une thérapeutique martiale [39]. En effet, la TCMH est également le premier marqueur à se corriger en cas de supplémentation en fer. 2. Exploration du compartiment de transport 2.1 Fer sérique Phase pré analytique Le prélèvement doit être réalisé sur tube sec (les anticoagulants peuvent entraîner des interférences), à jeun le matin entre 8h et 10h et toujours à la même 28

29 heure s il s agit d un suivi. Le fer sérique présente en effet d importantes variations nycthémérales [39] Phase analytique Le fer fait partie des éléments traces et son dosage présent donc deux difficultés : i) Contamination éventuelle (matériel de prélèvement, cupules de dosage soulignant l intérêt de la bonne gestion de la phase pré analytique), ii) Détermination précise des faibles concentrations. La méthode de référence a été décrite par l ICSH. Elle consiste en une précipitation des protéines sériques avec relargage du fer de la transferrine par un agent réducteur. Après centrifugation, le fer ferreux est détecté dans le surnageant par une technique faisant appel à un chromogène (ferrozine ou férène, plus sensible). A partir de cette technique, diverses variantes ont été développées, visant à automatiser, éviter la précipitation des protéines, minimiser les interférences avec les chromogènes et travailler sur des quantités minimes de sérum [6]. L interprétation de la sidérémie est souvent délicate. Le fer sérique suit un rythme circadien, avec un maximum le matin (entre 8 12 H) et un minimum vers 20 H. Ces variations sont considérablement amoindries en cas de franches hypo ou hypersidérémies. La sidérémie diminue également au cours des règles. La prise médicamenteuse de fer ou un repas riche en fer augmente la concentration post prandiale de fer sérique [6]. 29

30 2.1.3 Phase post analytique - Nouveau-né : 10 à 36 µmol/l - Nourrisson, enfant : 11 à 23 µmol/l - Homme : 10 à 30 µmol/l - Femme : 8 à 28 µmol/l [39] S il est certain que le dosage de le sidérémie fournit un message aisément appréhendable pour les patients. Sa variabilité et son défaut de sensibilité en tant qu indicateur d hémochromatose ou de carence martiale limitent considérablement son intérêt clinique. L hyposidérémie s observe dans deux situations : i) Les anémies par carence martiale : Au début de l installation d une carence en fer, la sidérémie est maintenue constante aux dépens de réserves échangeables. La synthèse de la transferrine augmente dans un 2 ème temps. Ce n est que tardivement que la sidérémie diminue avec apparition d une anémie hypochrome, ii) Les syndromes inflammatoires : Par le jeu des cytokines inflammatoires, les états inflammatoires induisent la synthèse d hépcidine et détournent le fer libre de son utilisation habituelle pour l érythropoïèse au profit de sa mise en réserve. Ils agissent sur la synthèse des différentes protéines liant le fer (la transferrine diminue et la ferritine augmente) [54]. 30

31 2.2 Transferrine Phase pré analytique La transferrine est dosée sur un échantillon de plasma ou sérum obtenu à partir d un prélèvement sanguin réalisé respectivement sur tube contenant l heparinate de Li comme anticoagulant ou tube sec sans anticoagulant Phase analytique Le dosage préconisé pour la transferrine est un dosage immunochimique direct par immunoprécipitation en phase liquide (immuno-néphélémétrie, immuno-turbidimétrie) [39] Phase post analytique - Nouveau-né : 1,6 à 2,8 g/l - Nourrisson, enfant : 2 à 4 g/l - Adulte : 2 à 3,2 g/l [55] La quantité totale de transferrine présente dans l organisme est inversement corrélée avec l état des réserves en fer. Ainsi, la synthèse de la transferrine augmente lorsque les réserves diminuent, et ceci bien avant l apparition de l anémie. C est par ailleurs le degré de saturation en fer de la transferrine circulante qui conditionne sa fixation sur les récepteurs membranaires des érythroblastes. Cette fixation est meilleure et la livraison du fer se fait avec plus d efficacité lorsque prédominent les formes di ferriques [39]. C est une protéine négative de l inflammation. 31

32 2.3 Paramètres calculés La CTST et CST sont deux paramètres calculés suivant les relations : CTST = Tf (en µmol/l) x 2 CTST = Tf (g/l) x 25 CST = fer sérique (µmol/l) / CTST (µmol/l) Valeurs usuelles CTST Adulte (H et F) : µmol/l Enfant (1 an puberté) : µmol/l CST Homme : % Femme : % Enfant (1 an puberté) : % Utilité pratique Le CST (et non la CTST qui est plutôt corrélée avec les réserves, comme nous le verrons plus loin) est un bon indicateur du transport du fer et de son alimentation tissulaire. Toute diminution de ce coefficient au dessous de 15% traduit sans aucun doute une diminution de la livraison du fer à l érythropoïèse (ce qui ne signifie pas forcément que l on se trouve en présence d une anémie carentielle, car cela se voit aussi dans les anémies inflammatoires). A l opposé, toute augmentation de ce coefficient au-delà de 55% témoigne d un danger de 32

33 surcharge tissulaire en fer du type hémochromatose. Son emploi reste fréquent dans le «screening» de l hémochromatose génétique [39]. 3. Exploration du compartiment de réserve : Dosage de la ferritine sérique 3.1 Phase pré analytique La ferritine est dosée sur un échantillon de plasma ou de sérum obtenu à partir d un prélèvement sanguin réalisé respectivement sur tube contenant l heparinate de Li comme anticoagulant ou tube sec sans anticoagulant. 3.2 Phase analytique Le dosage de la ferritine est réalisé par immunoenzymologie, chimi- ou électrochimiluminescence, immunonéphélémétrie et immunoturbidimétrie. Les standards doivent être calibrés par rapport au 2 ème étalon international (OMS ). Cependant, selon la nature de l immunogène utilisé (hétérogénéité des ferritines de foie et de rate), le type d anticorps (poly ou monoclonal) et la nature du marqueur ; les résultats peuvent différer d une technique à l autre, particulièrement dans les valeurs élevées. Il est donc recommandé d assurer le suivi des patients par le même réactif. En cas de traitement martial, il est conseillé de doser la ferritine à quelques jours de distance [6]. 33

34 3.3- Phase post analytique Tableau I : les valeurs moyennes de la ferritine [55] Homme Femme Enfant 0-10 j j 1-3 m 3-6 m 6-15 m Ferritine (ng/ml) j : jour ; m : mois La ferritine sérique présente, chez l homme normal, une corrélation étroite avec le fer des réserves. Toute diminution en deçà des valeurs précédentes évoque une baisse des réserves en fer et une évolution possible vers l anémie hypochrome ferriprive. Le mécanisme est différent dans l inflammation et l infection où, le fer étant transféré directement de l Hb aux réserves réticulohistiocytaires, la ferritine sérique peut être normale ou même augmentée. Lorsque les réserves en fer augmentent, la ferritine sérique augmente aussi, mais cette élévation n est pas spécifique puisqu elle est retrouvée dans d autres éventualités non liées au métabolisme du fer, telles que la nécrose hépatique et certaines tumeurs [39]. L hypoferritinémie est un indicateur fiable de la carence martiale (la seule circonstance pathologique où il existe une baisse de la ferritine). C est le premier signe biologique et infra clinique de la carence avant la baisse des constantes érythrocytaires (TCMH et VGM) et le stade ultime d anémie microcytaire hypochrome. Lors des traitements supplétifs, les paramètres érythrocytaires s élèvent en premier avant la correction de 34

35 l anémie. L augmentation de la ferritine qui témoigne de la restauration des réserves nécessite deux à quatre mois de traitement. Néanmoins, la carence martiale peut être masquée par l augmentation de la ferritine lors d un syndrome inflammatoire associé. Dans ce cas, l augmentation du taux du Rs-Tf présente un grand intérêt diagnostique. L hyperferritinémie associée à un taux de fer sérique bas évoquant un syndrome inflammatoire, la ferritine est une protéine de la phase aiguë de l inflammation. L hyperferritinémie associée à un taux de fer sérique normal ou augmenté peut relever d étiologies diverses : Une lyse cellulaire conséquente induisant une hyperferritinémie. C est le cas des hépatites aigues où la ferritine peut dépasser µg/l mais aussi des hépatites chroniques, des hémolyses, des nécroses médullaires et myocardiques ainsi que des rhabdomyolyses, L alcoolisme caractérisé par l hyperferritinémie, un fer sérique élevé et un CST augmenté. Les causes rares sont représentées par les hyperthyroïdies, les tumeurs malignes (carcinome hépatocellulaire, pulmonaire et mammaire), les maladies hématologiques malignes (LMNH, leucémies, syndrome hyperferritinémiecataracte lié à la présence de mutation dans l IRE du gène L-ferritine) [54]. C- Etude critique des paramètres classiques du bilan martial Pour rappel, nous allons envisager un à un les différents indicateurs classiques du statut martial en signalant les limites de chacun. 35

36 1. Hémogramme Le dosage de l hémoglobine, à la recherche d une anémie, n est perturbé qu à un stade tardif de la carence et témoigne déjà des réserves effondrées. Il ne présente donc qu un faible intérêt dans un bilan systématique de première intention. Les autres paramètres érythrocytaires tels que VGM, TCMH bien que variant plus précocement que l Hb, restent insuffisants pour le diagnostic précoce de la carence martiale. De plus une macrocytose d origine alcoolique par exemple rend ininterprétable la valeur du VGM. 2. Fer sérique Trop souvent prescrit en première intention dans le cadre d un bilan de dépistage d une carence martiale, son dosage est en pratique très décevant du fait de nombreuses variabilités : Variabilité individuelle liée d une part au rythme circadien (concentration maximale à midi, minimale à minuit, avec une amplitude de 30 à 40% en moyenne) [39] et d autre part de l extrême labilité du pool sérique circulant [56], Variabilité interindividuelle et en fonction du sexe, Enfin et surtout, variabilité en fonction de nombreux facteurs de méprise : hémolyse, nécroses, syndrome inflammatoire. En résumé, la sidérémie est une investigation qui manque à la fois de spécificité et de sensibilité pour le dépistage des carences martiales, tout en conservant un intérêt certain dans celui des surcharges en fer. 36

37 En pratique, le dosage isolé du fer ne se justifie que couplé à celui de la transferrine afin d apprécier son coefficient de saturation. Dans l exploration du fer, il faut tout faire sauf le fer. 3. Transferrine Sa détermination immunologique sert à calculer la capacité totale de fixation puis, couplée à celle du fer sérique, le coefficient de saturation de la transferrine [57]. Ce dernier étant entaché par les variations de la sidérémie et de la transferrine elle-même. Les variations en sont plus précoces que celle de l Hb (augmentation de la CTST et diminution du CST en cas de carence). Mais l interprétation devient difficile en cas de pathologies associées qui peuvent fausser sa véritable signification : par exemple dans le cadre d une carence martiale associée à un syndrome inflammatoire, la concentration de la transferrine peut être normale, son augmentation par la carence étant masquée par sa diminution. Ces facteurs de variations sont essentiellement : Un syndrome inflammatoire, Une insuffisance hépato-cellulaire, Une dénutrition, Une hyperandrogénie, Les fuites urinaires, gastro-intestinales et cutanées. A l inverse, une imprégnation oestrogénique peut élever la transferrine et faire évoquer une carence en fer qui n existe pas (Tableau II) [57]. 37

38 Tableau II : Principaux facteurs de variation de la transferrine [57] Facteurs de variation variations observée Variations pré analytiques et analytiques Efforts violents Garrot si pose prolongée Variations analytiques / Variations biologiques Age nouveau-né personnes âgées Sexe féminin Grossesse Médicaments Contraceptifs oraux Danazol L-asparaginase D-péniccillamine Variations intra-individuelles / Variations pathologiques Inflammations chronique et aigue Insuffisance hépato-cellulaire Dénutrition Fuites urinaire, gastro-intestinale et cutannée Hyperandrogénie 38

39 4. Ferritine Malgré les imperfections méthodologiques de sa détermination, le dosage de la ferritine sérique constitue un examen biologique primordial dans la carence martiale. En effet, une hypoferritinémie signe toujours une carence: une ferritine inférieure à 12 µg/l confirme une déplétion en fer. Par contre, une ferritinémie normale ou augmentée ne permet pas d exclure une carence martiale dans un contexte où existe une cause d augmentation de la ferritine [58]. Ainsi, avant d interpréter un dosage de ferritine, il faut s assurer de l absence de syndrome inflammatoire associé (Tableau III). Tableau III : Causes d élévation de la ferritine sérique [58] Syndrome inflammatoire (Insuffisance rénale) Hépatopathies Néoplasies viscérales ou hémopathies malignes Thalassémie majeure Ethylisme chronique Hyperthyroïdie Cytolyse hépatique Nécrose tissulaire Hémolyse Syndrome d activation des macrophages En somme, il apparaît que tous les paramètres cités précédemment ne semblent pas performants pour le diagnostic d une carence martiale, particulièrement dans certaines situations de méprise (coexistence d un 39

40 syndrome inflammatoire). Le besoin d un test plus spécifique et plus précoce se fait sentir. C est dans ce contexte qu une équipe japonaise, détectant pour la première fois en 1986, le récepteur soluble de la transferrine dans le sérum de sujets sains, propose une méthode immuno-radiométrique de dosage et décrit les variations de cette protéine dans certaines maladies hématologiques [59]. Depuis, de nombreuses publications concernant le sujet, sont apparues et il semblerait que le Rs-Tf puisse jouer un rôle prépondérant dans le diagnostic précoce de la carence martiale. Il est temps de discuter de ce marqueur du bilan martial, certes non récent à l échelon international mais tout nouvellement introduit dans la pratique quotidienne du laboratoire de biochimie de l HMIMV. D- Le récepteur soluble de la transferrine 1. Le récepteur de la transferrine (Rtf) : Structure et origine La plupart des cellules des mammifères expriment à la surface de leurs membranes des récepteurs pour la transferrine [60, 61]. L expression la plus large a lieu sur les cellules nécessitant un apport important et continu en fer [61]. Le Rtf est une protéine très ubiquitaire, présente sur toutes les cellules à l exception des érythrocytes matures [62]. Les précurseurs érythroblastiques portent 2/3 à 4/5 de ces récepteurs. Le Rtf est une glycoprotéine transmembranaire de structure homodimérique, de masse moléculaire égale à 190 KDa. Chaque monomère contient 760 acides aminés répartis en trois domaines (Fig. 8) [62]: i) Le domaine cytoplasmique comporte l extrémité amino-terminale. Il contient 61 acides aminés. La sérine en position 24 est un site de phosphorylation. Une séquence peptidique particulière (tyrosine-thréonine- 40

41 arginine-phénylalanine) est considérée comme signal indispensable à l endocytose [63]. L acylation par l acide palmitique en position 52 résulte d une modification post-traductionnelle. les récepteurs non acylés subissent une endocytose plus rapide. ii) Le domaine transmembranaire contient 28 acides aminés à prédominance hydrophobique. Il fonctionne durant la phase de synthèse comme signal de translocation à travers le réticulum endoplasmique. iii) Le domaine carboxyterminal extracellulaire contient 671 acides aminés. Les deux monomères sont unis par deux ponds disulfure en position 89 et 98. Il existe trois sites de N-glycosylation en position 251, 317 et 727 et un seul site de O-glycosylation sur un résidu thréonine en position 104. Chaque molécule de récepteur peut fixer deux molécules de transferrine, mais le site de liaison est actuellement inconnu. Figure 8 : Structure du récepteur de transferrine [64] Le rôle du Rtf est de lier la transferrine di-ferrique et d internaliser le fer transferrinique [61]. L affinité du récepteur pour son ligand varie avec le 41

42 contenu en fer de la transferrine. En effet, au ph physiologique, l affinité est maximale pour la transferrine di-ferrique [65, 66]. Le passage dans le milieu intracellulaire du fer apporté par la transferrine se fait par un mécanisme d endocytose [65]. Le complexe transferrine-rtf est internalisé par suite de l invagination de la membrane cellulaire qui s organise en puits tapissés d une couche de molécules de clathrine. L invagination aboutit à la formation d une vésicule d endocytose ou endosome dont le ph est acide, le fer est libéré. Une vésicule reformée ramène vers la membrane cellulaire le complexe apotansferrine-rtf où il sera disponible pour un nouveau cycle d endocytose (Fig. 9). Figure 9 : Cycle d endocytose-recyclage du récepteur de la transferrine [62] Une deuxième voie métabolique mineure consiste en la production de nombreuses vésicules par invagination de la membrane de la vésicule d endocytose [63, 65]. Cette structure est appelée «endosome multivésiculaire», chaque microvésicule portant un récepteur à la surface est appelée «exosome». 42

43 2. Le Rs-Tf 2.1 Synthèse Les précurseurs médullaires érythroïdes constituent la source principale des Rs-Tf [62, 63]. Le Rs-Tf résulte du clivage protéolytique à la surface de l exosome dans la structure multi vésiculaire. La présence d une chaîne glycanique en position 104 protège le récepteur de la protéolyse [61]. L élimination du site de O-glycosylation sur un résidu thréonine en position 104 augmente la susceptibilité du récepteur de la transferrine au clivage [61, 67]. Ce clivage postérieur à l ancrage du récepteur dans la membrane cellulaire a lieu entre l arginine en position 100 et la leucine en position 101 par une sérine protéase (Fig. 10) [64]. Figure 10 : Production du récepteur soluble de transferrine [64] 2.2 Structure Le Rs-Tf est une forme tronquée du récepteur membranaire [61, 68] ayant perdu ses domaines cytoplasmiques et transmembranaires. Il s agit d une forme 43

44 monomérique de daltons portant une seule molécule de transferrine (Fig. 10) [61, 58]. La concentration des Rs-Tf est proportionnelle à la quantité totale de récepteurs membranaires [61, 66, 69]. Les récepteurs circulants représentent 6% de la totalité des récepteurs tissulaires sous forme essentiellement tronquée [65]. Chez les sujets normaux, il existe moins de 1% de récepteurs intacts. 2.3 Dosage Prélèvement Le dosage peut être réalisé sur sérum ou plasma hépariné de préférence. D autres anticoagulants peuvent être utilisés (EDTA, citrate), mais on doit tenir compte de l effet de dilution lié à l anticoagulant. Les échantillons peuvent être conservés 8 jours à +4 C et 3 semaines à - 20 C. Au-delà, les échantillons doivent être congelés à -80 C et n être décongelés qu une seule fois [66] Méthodes de dosage La première méthode de dosage mise au point par des japonais [59] était une méthode immuno-radiométrique (IRMA) utilisant des anticorps monoclonaux anti-récepteur libre. En 1987, Huebers [70] utilise une technique ELISA mais avec des anticorps polyclonaux d origine placentaire. La même technique ELISA, mais cette fois ci avec des anticorps monoclonaux a été utilisée en 1989 par Flowers [71]. Depuis, de nombreuses techniques ont été décrites [60, 61, 72]. Elles diffèrent par : 44

45 La nature des anticorps, monoclonal ou polyclonal ; La nature du standard : récepteur soit libre, soit complexé à la transferrine ou récepteur tronqué isolé du sérum [73] ; Le marquage : I 125, sel d europium, enzyme (phosphatase alcaline ou peroxydase) ; Le signal mesuré : radioactivité, photométrie, fluorescence, néphélémétrie, luminescence ; Le chromogène utilisé pour les techniques photométriques. Actuellement, les techniques qui dominent le marché en France font appel principalement à des techniques ELISA en micropuits [74]. L automatisation totale est disponible depuis peu sur certains automates d immunochimie (néphélémétries) et de chimiluminescence avec comme avantage la stabilité de la calibration, le dosage au coup par coup, une excellente précision et un rendu rapide des résultats. Des adaptations immuno-turbidimétriques [75] sur automates de biochimie sont également disponibles Variations biologiques et Valeurs de références Variations biologiques En période néonatale, la concentration du Rs-Tf est étroitement liée à l activité érythropoïétique. Chez le nouveau-né, les valeurs de Rs-Tf sont deux fois plus importantes que celles de l adulte [76]. Puis la concentration diminue progressivement de la période néonatale à l adolescence pour atteindre les valeurs de l adulte vers l âge de 16 ans [77]. Chez le sujet âgé, la concentration 45

46 de Rs-Tf est généralement plus faible [77, 78]. Par ailleurs ; il n existe pas de différence liée au sexe. Des variations durant la grossesse en fonction de l âge gestationnel ont été observées. Durant le premier trimestre, les concentrations ne diffèrent pas significativement des valeurs observées chez les femmes en dehors de toute grossesse. Les valeurs augmentent pendant le deuxième trimestre pour atteindre une concentration maximale durant le troisième trimestre [79]. Des différences de concentration sont observées en fonction de la race, les sujets de race noire ayant des concentrations plus élevées de 10% [73] que les sujets de race blanche. Des concentrations plus élevées sont aussi notées pour des individus vivant à haute altitude par rapport à des sujets vivant au niveau de la mer. Valeurs de référence Les valeurs de référence varient de façon importante entre les différentes trousses. Ceci est lié au choix des calibrants et à l immunoréactivité des réactifs utilisés. La première technique de dosage de Rs-Tf qui utilise des anticorps monoclonaux donnait des valeurs moyennes de 250 µg/l chez les adultes des deux sexes. Une technique ELISA utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre le Rs-Tf placentaire donnait des valeurs 20 fois plus élevées (moyenne égale à 5,6 mg/l) avec une différence liée au sexe [71]. Une autre technique ELISA employant des anticorps polyclonaux retrouvait des valeurs similaires [80]. 46

47 Avec l apparition de nouveaux tests sur le marché, on observe toujours une grande disparité quant aux valeurs normales : 0,70-2,80 mg/l [81], 1,3-3 mg/l [82], 0,83-1,76 mg/l [83]. Il est donc nécessaire d assurer le suivi d un patient avec le même réactif et il devient impératif de développer un standard international [84]. 2.4 Applications cliniques Le dosage du Rs-Tf revêt une importance indéniable dans des situations où les paramètres biochimiques classiques de l exploration du fer sont pris en défaut Rs-Tf et carence en fer Une élévation du taux du Rs-Tf a été rapportée par plusieurs auteurs [71, 79]. Chez des patients ayant une carence en fer, durant la déplétion des réserves, on observe une chute de la ferritine. La concentration en Rs-Tf reste constante tant que les réserves en fer ne sont pas épuisées. L augmentation des Rs-Tf est proportionnelle à l importance du déficit en fer dans les tissus (fer fonctionnel) et intervient plus précocement que la chute de l hémoglobine [61] Rs-Tf et les carences en fer associées à une maladie chronique La ferritine ne reflète pas les stocks de fer en présence d inflammation. Elle perd sa sensibilité et peut conduire à une sous-estimation du déficit. Le dosage du Rs-Tf apparaît donc comme un très bon outil, sa concentration reste normale dans les maladies chroniques et elle augmente lors d une carence en fer isolée ou associée à une maladie chronique. 47

48 2.4.3 Rs-Tf et érythropoïèse L'activité érythropoïétique est le déterminant le plus important des valeurs sériques de Rs-Tf. Les taux diminués de Rs-Tf sont observés en cas d'hypoplasie érythroïde (Fig. 11), comme celle induite par les transfusions itératives, l'insuffisance rénale chronique par diminution de production d EPO, une aplasie ou hypoplasie médullaire ou après une chimiothérapie intensive [85]. AA : anémie aplasiques, IRC : insuffisants rénaux chroniques, Chimio : chimiothérapie intensive Figure 11 : Hypoplasies érythroïdes à Rs-Tf bas [85] Des taux élevés de Rs-Tf sont observés en cas de stimulation de l'érythropoïèse (Fig. 12), lors d'une anémie par dysérythropoïèse congénitale, hémolyse (acquise ou sphérocytose héréditaire, drépanocytose), beta thalassémie majeure ou intermédiaire, une anémie mégaloblastique ou une polyglobulie secondaire [85]. AHAI : anémie hémolytique auto-immune, SH : sphérocytose héréditaire, THAL : β-thalassémie majeure, HbH : hémoglobinose H, 48 PG : polyglobulie

49 Figure 12 : Hyperplasies érythroïdes à Rs-Tf élevé [85] Dans l insuffisance rénale chronique Chez les insuffisants rénaux traités par l rhu-epo [86], le dosage du Rs-Tf permet de suivre la réponse à l érythropoïétine et d évaluer la probabilité de réponse à la mise en place du traitement [72, 86]. La concentration initiale du Rs-Tf et sa variation au cours des premières semaines permet de classer les malades en répondeurs et non répondeurs au traitement. Une concentration en Rs-Tf augmentée avec une valeur basse de ferritine (<50 ng/ml) prédit un manque de réponse au traitement, et suggère d instaurer au préalable un traitement substitutif par le fer pour reconstituer les stocks. En revanche, une ferritine normale avec un Rs-Tf bas prédit une bonne réponse [61]. III- INSUFFISANCE RENALE CHRONIQUE TERMINALE A- Définition L insuffisance rénale chronique terminale correspond à une altération des fonctions d épuration des déchets du métabolisme cellulaire, du maintien de l homéostasie du milieu intérieur et des fonctions endocrines. 49

50 Elle se définit par un débit de filtration glomérulaire (DFG) strictement inférieur à 15 ml/min/1,73 m 2. Le plus souvent, elle est synonyme de «mort rénale» avec la nécessité vitale de recourir à une technique de suppléance de la fonction rénale. Le recours à la dialyse (hémodialyse ou dialyse péritonéale) permet de corriger une partie de ces anomalies, notamment l élimination des déchets, la transplantation rénale restant la solution thérapeutique idéale. Si l IRC terminale est la partie visible de l iceberg, l IRC modérée et préterminale est bien la partie immergée [87, 88, 89]. Les maladies du rein chroniques comprennent cinq stades. Ces stades sont illustrés dans le tableau ci-dessous (Tableau IV). Tableau IV : Représente les différents stades de maladie du rein [90] Stades de maladie du rein Stade Description Débit de filtration glomérulaire (DFG) en ml/min/1,73m 2 50

51 1 Atteinte rénale avec DFG normal 90 2 Atteinte rénale et faible diminution du DFG Diminution modérée du DFG Grave diminution du DFG Insuffisance rénale terminale < 15 B- Physiopathologie Le rein est potentiellement exposé à de nombreuses agressions. Bien que le parenchyme rénal possède des capacités d adaptation et de régénération extraordinaires, les maladies rénales chroniques sont capables de détruire progressivement les structures fonctionnelles du rein. Très diverses et multiples de par leurs mécanismes physiopathologiques, elles ont une conséquence fonctionnelle commune : l IRC. Parmi les mécanismes physiopathologiques des maladies rénales on cite [87] : - Néphropathies glomérulaires - Néphropathies interstitielles chroniques - Néphropathies vasculaires - Néphropathie diabétique - Polykystose C- Anémie rénale 51

52 L anémie est l une des complications inéluctable de l IRC. Elle est responsable de multitude de symptôme particulièrement invalidant pour les patients (asthénie, mauvaise tolérance à l effort..). 1. Définition L anémie est définie par une diminution de l hémoglobine inférieure à un seuil limite qui varie en fonction de l âge et du sexe. Ainsi, d après l OMS, ce seuil est fixé à 12 g/dl pour les femmes non enceintes, 10 g/dl pour les femmes enceintes et 13 g/dl pour les hommes. Une anémie par carence martiale est due à une déplétion des réserves de l organisme se traduisant par une microcytose [91]. Dans la population des IRC hémodialysés, les recommandations de bonne pratique proposent également une définition de l anémie dans ce contexte. Multifactorielle, l anémie du sujet IRC dialysé relève de mécanisme divers et varie [92] : Une insuffisance de l érythropoïèse en rapport avec un déficit de synthèse d érythropoïétine, une action directe inhibitrice des toxines urémiques, la fibrose médullaire favorisée par l hyperparathyroïdie, la carence en fer et en vitamines (B12 et folates) [93], Une diminution de la durée de vie des hématies (membrane érythrocytaire fragilisée par les toxines urémiques) dont l importance est bien moindre, Présence d une inflammation chronique, Accumulation du fer dans le système des phagocytes mononuclées : l anémie due à la diminution de l érythropoïèse s accompagne d une 52

53 séquestration du fer présent dans les globules rouges dans le système des phagocytes mononuclées [94], Des pertes sanguines augmentées [95, 96], Surcharge aluminique. 2. Mécanismes La figure 13 illustre les principaux mécanismes impliqués dans le développement de l anémie chez l IRC hémodialysé que nous avons cités et nous nous proposons de détailler ici. Figure 13 : Représentation schématique de la physiopathologie de l anémie du sujet IRC [95] 53

54 TGF-β : transforming growth factor-bêta ; TNF-α : tumor necrosis factor-alpha ; IL-1 : interleukine-1 ; EPO : érythropoïétine ; BFU-E : burst forming unit-erythroid ; CFU-E : colony forming unit-erythroid ; NO : oxyde nitrique. 1) Réduction inappropriée de la production d EPO. 2) Croissance diminuée des précurseurs érythropoïdes. 3) Accumulation du fer dans le système des phagocytes mononuclées. 4) Réduction de la durée de vie des hématies. 2.1 Le déficit en EPO Le déficit en érythropoïétine a principalement pour origine la réduction de la masse néphronique. Certaines études suggèrent l existence d éléments toxiques. On peut par exemple mentionner le rôle des cytokines : IL-1 et TNF-α qui diminuent la production endogène d EPO. Ces cytokines réduisent aussi la réponse des précurseurs médullaires à l action de l EPO Structure L érythropoïétine (EPO) naturelle est un glycopeptide dont le poids moléculaire est de 30 kda. Elle se compose de 165 acides aminés richement glycosylés, les sucres représentant 40 % du poids moléculaire (Fig.14). Le taux sérique d EPO endogène en situation stable est de 10 à 30 mu/ml. Sa demi-vie est de 4 à 11 heures [26]. 54

55 Figure 14 : Chaînes glycosilées de l'érythropoïétine [97] Métabolisme Le rein est le principal site de production d EPO chez l adulte. Le rein contribue pour 85 % à la production d EPO, le foie n assure qu une contribution mineure, et le poumon et la rate jouent un rôle accessoire [98]. Les cellules fibroblastiques spécialisées qui produisent l EPO se situent juste au voisinage des tubes proximaux [99]. Le catabolisme de l EPO endogène passe par trois voies : d abord médullaire, mais aussi hépatique et rénale. Dans la circulation, l EPO peut être déglycosylée (surtout désialylée) par des glycosidases et en partie dégradée par des protéinases. L EPO désialylée est captée par les hépatocytes, via leur récepteur pour le galactose, et catabolisée. Une autre partie est filtrée par le glomérule puis réabsorbée et catabolisée par le tube proximal. Le catabolisme rénal est aboli au cours de l insuffisance rénale terminale et chez les sujets dialysés [26]. En réalité, la plus grande partie de l EPO endogène est dégradée dans les cellules cibles elles-mêmes [100] Actions L EPO agit sur les progéniteurs érythroïdes médullaires : BFU-E et CFU-E. L EPO agit sur les stades tardifs de leur développement en stimulant leur prolifération et leur maturation. Cette stimulation se fait en réalité par une inhibition de l apoptose [98]. L action de l EPO se fait par liaison à des récepteurs de surface présents sur les BFU-E et surtout sur les CFU-E. Le nombre de récepteurs de l EPO décroît 55

56 au cours de la différenciation des cellules érythroïdes. Les réticulocytes et les érythrocytes matures ne contiennent pas de récepteurs de l EPO [98]. Le récepteur de l EPO (EPO-R) est un homodimère transmembranaire comportant deux sous-unités. Il comporte 508 acides aminés pour un poids moléculaire de 66 à 78 kda [26]. L amélioration de la qualité de vie des patients anémiques IRC traités par l EPO a été objectivée. Cette molécule à un rôle non seulement sur le plan neurotrophique mais possède également des propriétés de neuro-protection. On peut décliner les effets neuro-protecteurs de l EPO sous différents aspects complémentaires incluant notamment un effet antagoniste sur le glutamate, une augmentation d enzyme antioxydant, un impact sur la production de neurotransmetteur et une induction de neuroglobine. Dans ce cas l EPO pourrait contribuer, à améliorer l apport de l oxygène au niveau des cellules nerveuses [101]. 2.2 La baisse de la durée de vie des GR La durée de vie des globules rouges diminue avec l aggravation de l insuffisance rénale. Elle peut même atteindre un tiers de la valeur normale [102, 103]. Plusieurs hypothèses sont rapportées pour expliquer cette hémolyse : La présence d anomalies biochimiques intrinsèques des hématies : Les cellules urémiques semblent plus sensibles au stress mécanique, osmotique et oxydatif comme en témoigne l étude de Rosemund et coll [104]. Mais, les anomalies biochimiques restent à ce jour inconnues. 56

57 L existence d un conflit immunologique : Avant l ère de l EPO, les transfusions à répétition étaient responsables de la stimulation de la production d anticorps, ce qui conduisait à un hypersplénisme. Avec l abandon des transfusions, ce phénomène est en net recul. Pour les patients hémodialysés, la dialyse elle-même. Des accidents hémolytiques en rapport avec la séance de dialyse sont décrits. Ils ont pour origine la présence d éléments contaminants dans l eau (zinc, cuivre, nitrates), ou la persistance de chloramine après désinfection [105]. Des cas d hémolyse mécanique sont imputés à l écrasement excessif des tubulures de circulation extracorporelle par les corps de pompe ou au débit insuffisant de la connexion vasculaire. 2.3 L hyperparathyroïdie L hyperparathyroïdie tertiaire peut être à l origine d une fibrose médullaire et ainsi réduire la masse des progéniteurs de l érythropoïèse. Le nombre de cellules sensibles à l action de l EPO endogène ou exogène est diminué. C est un des mécanismes de résistance à l EPO [106]. 2.4 La surcharge aluminique Actuellement les traitements par sels d alumine sont impliqués dans cette surcharge ; les cas de contamination à l eau ont quant à eux quasiment disparu. Un phénomène de compétition entre l aluminium et le fer a été rapporté tant au niveau de l absorption intestinale que du transport plasmatique ou de la liaison avec la ferritine. 2.5 Les carences vitaminiques 57

58 La malnutrition, fréquente chez les patients insuffisants rénaux chronique, est à l origine de carences vitaminiques (vit C, acide folique). On connaît par exemple l importance de la vitamine C pour mobiliser le fer à partir des réserves. 2.6 L inflammation chronique 35 à 65 % des patients hémodialysés ont des signes biologiques d inflammation (CRP élevée). La prévalence serait un peu moindre en prédialyse [107, 108]. Les facteurs impliqués sont les suivants : - Le défaut de clairance rénale des cytokines, - L accumulation des AGE S (advanced glycation end products) [109], - Des infections occultes. Pour les patients en hémodialyse, on citera aussi - Les infections des voies d abord, - La réponse inflammatoire au contact des membranes bioincompatibles, - La présence d endotoxines dans le dialysat. Plusieurs mécanismes sont proposés pour relier l anémie et les cytokines. Si la diminution de la production endogène reste à ce jour controversée [110, 111], certaines auteurs ont pu monter que l IL-1 et le TNF-α inhibent l érythropoïèse. Cela dépendrait surtout de la balance entre les différentes cytokines pro et antiinflammatoire [112, 113]. 58

59 Les cytokines pourraient aussi contribuer à l aggravation de saignements digestifs. L implication du TNF-α dans la pathogénie des lésions gastriques induites par les anti-inflammatoires non stéroïdiens a été décrite. Enfin, les cytokines augmentent la synthèse de la ferritine par une action au niveau transcriptionnel et diminuent la synthèse de la transferrine. La ferritine est donc une protéine positive de l inflammation et la transferrine une protéine négative de l inflammation. Ces différents mécanismes sont responsables du défaut de relargage du fer stocké dans le système des phagocytes mononuclées grâce à la ferritine. 2.7 La carence martiale De multiples facteurs favorisent l apparition d une carence martiale chez les IRC dialysés : Des pertes sanguines répétées : les pertes digestives souvent occultes jouent un rôle important de même que celles secondaires à l hémodialyse (sang piégé dans les lignes, les aiguilles, le dialyseur après restitution). On citera aussi les prises de sang fréquentes indispensables pour le suivi des patients. Un défaut d absorption intestinale imputable à l IRC. Dans ce domaine les différents études sont contradictoires ; certaines concluent à 59

60 une absorption normale [114, 115] d autres montrent qu elle est significativement abaissée [116, 117]. Quoi qu il en soit, le taux de ferritine élevée en rapport avec l inflammation chronique empêche le rétrocontrôle normal qui devrait augmenter l absorption du fer. Un défaut de mobilisation des stocks du fait de l inflammation chronique. La supplémentation en EPO exogène qui va augmenter les besoins en fer et diminuer les stocks. 3. Prise en charge thérapeutique La prise en charge de l anémie de l IRC reposait sur une multitude de mesure plus ou moins efficaces : - Epuration extrarénale de qualité, - Réduction au strict minimum des pertes sanguines et des prélèvements sanguins pour bilans biologiques, - Supplémentation par du fer par voie parentérale, ainsi que par l acide folique et vit B 12. Les néphrectomies étaient évitées et les transfusions réalisées le moins souvent possible pour éviter de supprimer la production endogène d EPO. Le traitement par EPO a révolutionné la prise en charge de l anémie de l IRC [118]. 3.1 Agents stimulants de l érythropoïèse Avant l ère de l EPO recombinante, les patients présentaient souvent des taux d Hb effondrés contre lesquels le clinicien ne disposait que de transfusions 60

61 érythrocytaires, avec les inévitables complications infectieuses (risque viral) et les risques d hémochromatose [119]. A l état physiologique, la concentration plasmatique d EPO -de 5 à 25 mui/ml- est régulée par le taux d Hb. En dialyse, la moyenne des concentrations d EPO chez les patients non traités est de l ordre de 20 à 300 mui/ml mais n est pas suffisante pour corriger l anémie. Depuis les premiers essais cliniques en 1986 et la commercialisation en 1989, la rhu-epo est devenue le traitement de référence de l anémie de l IRC [120, 121]. Une morbidité globale diminuée, des capacités physiques améliorées et une qualité de vie augmentée sont les bénéfices démontrés de l administration d EPO, qui permet de corriger les troubles liés à un défaut d oxygénation tissulaire [122] Objectifs du traitement par les ASE Le traitement de l anémie de l IRC vise plusieurs objectifs : Diminuer le recours aux transfusions (diminution du risque viral et d immunisation anti-hla), Combattre les symptômes de l anémie et améliorer la qualité de vie (capacités physiques, intellectuelles, humeur ), Diminuer les complications de l anémie (hypertrophie ventriculaire gauche, troubles endocriniens ). Par ailleurs, certaines études semblent mettre en évidence un rôle néphroprotecteur (ralentissement de la dégradation rénale et effet protecteur endothélial et vasculaire) mais cet effet n est prouvé pour l instant qu in vitro et reste controversé [123]. 61

62 Ce traitement sera à considérer dés que le patient a moins de 11g d Hb/dl [123] Effets secondaires Une trop grande efficacité des ASE, c est-à-dire un taux d Hb trop haut, expose au risque d hypertension artérielle et de thrombose. En hémodialyse, ceci augmente le risque de coagulation des circuits et conduit à une augmentation des besoins en anticoagulants et du risque hémorragique [123]. Les IRC dialysés présentent souvent d autres facteurs de risque cardio-vasculaire (diabète, hypertension artérielle ), la prise en charge doit donc être rigoureuse. Tous ces effets associés au coût important d une prise en charge thérapeutique par rhu- EPO permettent aisément de comprendre qu il est nécessaire d optimiser le traitement par EPO, notamment par le biais d une supplémentation martiale adaptée Résistance à l EPO Même s il est vrai que l introduction de la rhu-epo a radicalement changé le pronostic des patients IRC hémodialysés, la généralisation de son utilisation a mis à jour un certain pourcentage de situation de résistance à l EPO exogène (jusqu à 10% des patients). Cette résistance est plus souvent relative qu absolue, voila pourquoi on parle plutôt de réponse diminuée ("hyporesponsiveness") [124]. Une résistance doit être suspectée quand le patient n atteint pas la cible en hémoglobine alors qu il reçoit plus 300 UI/kg/semaine de rhu-epo ou plus de 1,5 µg/kg/semaine de darbépoétine alfa pendant 4 à 6 semaines[123]. La cause la plus fréquente de résistance à un ASE est la carence en fer. D autres facteurs peuvent être responsables de cette baisse de réponse comme un syndrome inflammatoire persistant (infection, néoplasie ), une hyperparathyroïdie, une 62

63 intoxication aluminique, des carences vitaminiques ou une dialyse insuffisante [125]. 3.2 Supplémentation martiale Une des causes les plus fréquentes de réponse insuffisante aux ASE est le déficit en fer. Selon les recommandations européennes, tous les patients IRC traités par rhu-epo devraient bénéficier d une supplémentation en fer [126]. Les besoins sont plus importants en hémodialyse Risques du traitement martial intraveineux Des réactions de type anaphylactique ont été décrites avec le fer dextran mais sont moins fréquentes avec le Venofer (0,002% de réactions sévères). La surcharge tissulaire, notamment hépatique, en fer était fréquente avant l ère de la rhu-epo même si les complications à type de cirrhoses étaient exceptionnelles en l absence d autres facteurs de risque. Aujourd hui, le problème est plutôt celui de la carence martiale. Le fer libre peut conduire à la formation de radicaux libres de l oxygène et induire une peroxydation lipidique qui pourrait accélérer la maladie athéromateuse. Une augmentation du stress oxydant a été mise en évidence chez les hémodialysés après injection de 100 mg de Venofer mais la signification clinique de ces anomalies demeure controversée. Le fer est un facteur de croissance bactérienne et à haute concentration entraîne une dysfonction des polynucléaires neutrophiles. Les conséquences cliniques sont cependant plus complexes à analyser. En effet, si les patients recevant du fer à forte dose présentent plus d infections, le traitement martial est peut-être plus un marqueur de Co-morbidités qu un véritable facteur de risque d infections [127] Suivi 63

64 Un monitorage régulier de l état du métabolisme du fer des patients IRC est nécessaire. La mesure de la ferritine sérique renseigne sur le stock en fer de l organisme, mais ce paramètre est soumis à de nombreuses causes de variation (inflammation, infection, cytolyse hépatique ). La ferritinémie n évalue pas la carence fonctionnelle qui peut être dépistée par d autres paramètres [123]. 4. Recommandations Différentes recommandations existent pour la définition de l anémie et son traitement chez l IRC hémodialysé ou non. Ces recommandations précisent également le seuil d Hb à atteindre sous traitement, ainsi que celui des autres paramètres du bilan martial (ferritine, CST). Le tableau V résume les objectifs de certaines recommandations. Selon la dernière version des recommandations de NKF-KDOQI de 2007, il est recommandé de ne pas dépasser le taux d Hb à 12 g/dl chez le patient IRC traité par ASE. Ainsi, la fourchette d Hb comprise entre 11 et 12 g/dl semblerait être un bon compromis en termes de bénéfice clinique et de minimisation des risques liés au traitement par ASE [128, 129]. Tableau V: Représente les différents types de recommandation [130] EBPG 2004 AFSSAPS 2005 KDOQI 2006/2007 ERBP 2008 Définition de l anémie Hb < 11,5 F Hb < 13,5 H 70 ans Hb < 12 H > 70 ans Hb < 11 Hb < 12 F Hb < 13,5 H Hb < 12 F Hb <13,5 H 64

65 Hb cible g/dl Hb > 11 Hb > 14, déconseillée (> 12 chez IC) Hb : Hb > 13 (déconseillée chez IC) En générale 11-12, <13 En générale 11-12, < 13 Objectif de traitement CST (%) -Valeur seuil : 20 -Cible : Ferritine (ng/ml) -Valeur seuil : 100 -Cible : CST (%) -Valeur seuil : 20 Ferritine (ng/ml) -Valeur seuil :100 CST (%) -Valeur seuil: 20 Ferritine (ng/ml) -Valeur seuil: 100 non HD 200 HD CST (%) -Valeur seuil: 20 Ferritine(ng/ml) -Valeur seuil : 100 non HD 200 HD H : Homme, F : Femme, HD : Hémodialysé, IC : Insuffisance cardiaque D- Statut martial chez l hémodialysé L exploration du statut martial chez le patient dialysé fait également l objet de recommandations européennes et françaises. Leurs objectifs est d évaluer le statut martial, de corriger les carences en fer sans entrainer de surcharge et d augmenter l efficacité du traitement par ASE. L obtention et le maintien de l Hb cible chez le patient hémodialysé sont conditionnés par une disponibilité suffisante en fer. Celle-ci est définie par un taux de ferritine >100 µg/l et par un CST >20% (ou un % de globules rouges hypochromes < 10% ou un contenu en Hb des réticulocytes >29 pg/cellule) [123]. Les règles de bonnes pratiques médicales (EBPG) recommandent une ferritinémie entre 200 et 500 µg/l et les KDOQI 2007 recommandent un CST >20% et une ferritinémie >200 µg/l chez les hémodialysés [128, 129]. 1. Carence martiale absolue 65

66 Selon les recommandations françaises, une carence martiale est objectivée par un taux de ferritine <100 µg/l et/ou CST < 20 % [123]. 2. Déficit fonctionnel Il est défini par un taux de ferritine >100 µg/l associé à un coefficient de saturation de la transferrine CST < 20%. Chez les patients traités par rhu-epo, l érythropoïèse, stimulée, nécessite des apports médullaires en fer importants pour une synthèse correcte de l Hb. La vitesse de mobilisation du fer depuis les réserves peut devenir insuffisante et engendrer la fabrication d érythrocytes faiblement concentrés en Hb. Il y a appauvrissement en fer du compartiment fonctionnel. Cette situation est appelée carence fonctionnelle en fer [131]. Par ailleurs, au cours de l inflammation, il y a également diminution de la biodisponibilité du fer au niveau médullaire en raison d une séquestration macrophagique. D autres mécanismes entrent en jeu dans la perturbation de l érythropoïèse au cours d un syndrome inflammatoire comme l effet inhibiteur des cytokines sur les précurseurs érythroblastiques [132]. Même si ces deux mécanismes peuvent coexister dans un contexte de déficit fonctionnel, il ne faut pas les confondre car dans l inflammation, la ferritine est artificiellement augmentée alors que dans le déficit fonctionnel, où l apport en fer à la moelle n est pas assez rapide et important pour la synthèse d hémoglobine, la ferritine, même si elle reste dans les valeurs normales ou hautes, voit sa concentration diminuer au cours du temps [119]. 66

67 67

68 Partie pratique 68

69 I- OBJECTIFS 69

70 Les marqueurs biologiques classiques du bilan martial, notamment la ferritine, constituent de piètres indicateurs de déficit fonctionnel en fer chez l IRC dialysé. Cependant, ils peuvent être insuffisants pour dépister un éventuel déficit en fer d origines diverses (traitement par la rhu-epo, syndrome inflammatoire) comme cela a été souligné. La mise en évidence de ce déficit est d un intérêt indéniable pour mieux prescrire la supplémentation en fer évitant ainsi d inefficace et couteuse dose supplémentaire en rhu-epo. Dans le présent travail, menu de façon transversale sur une période d une année (février 2008-janvier 2009) à l HMIMV de rabat, nous avons évalué l intérêt d un nouveau paramètre du bilan martial le Rs-Tf dans une population IRC hémodialysée. Pour cela nous avons ciblé les objectifs suivants : Déterminer un intervalle de référence de la concentration en Rs-Tf chez des sujets en bonne santé (population témoin), conformément aux conditions techniques du laboratoire de biochimie de l HMIMV de Rabat, Etudier la variabilité interindividuelle de cette population témoin en fonction du sexe et de l âge, Valider la concentration de Rs-Tf comme marqueur du statut martial, Evaluer l amplitude du Rs-Tf en cas de carence martiale confirmée, Etudier le rôle du Rs-Tf comme marqueur de déficit fonctionnel en fer, Tf, Etudier l influence de l inflammation sur la concentration sérique du Rs- Enfin, d analyser la pertinence de ce nouveau marqueur comparativement aux marqueurs classiques du bilan martial pour le dépistage de la carence martiale associée à l inflammation au cours de l insuffisance rénale chronique. 70

71 II- MATERIELS ET METHODES 71

72 A- Recrutement des sujets Le recrutement des patients a été fait en deux étapes : 1 ère étape : Recrutement de 102 sujets sains, appariés pour l âge et le sexe avec les malades inclus, au CEMPN (population témoin), 2 ème étape : Recrutement de 82 patients hémodialysés à partir du service de Néphrologie, Dialyse et Transplantation rénale de l HMIMV de Rabat ainsi que d autres centres privés (population malade). Pour chacun des sujets inclus, une fiche d exploitation a été renseignée (voir annexe I). B- Critères d inclusion Les malades inclus sont tous des patients hémodialysés traités ou non par un ASE et/ou du fer intraveineux. Les patients victimes d une hémopathie maligne, d un néoplasie, d une anémie hémolytique, d un déficit fonctionnel en vit B 12 ou acide folique ont était exclus. Dans ces pathologies, il est établi que le taux de Rs-Tf augment indépendamment du statut martial. Aucun des patients n a été transfusé avant les prélèvements. A titre de témoins, nous avons retenu des personnes en bonne santé, ne présentant ni insuffisance rénale chronique, ni anémie, ni syndrome inflammatoire, ni anomalie du métabolisme martial, tirés au sort dans la population du personnel navigant et dont les prélèvements ont été adressés au laboratoire de biochimie et d hématologie pour bilan de contrôle habituel d aptitude. Nous n avions pas besoin d obtenir un consentement éclairé des sujets inclus puisque toutes les analyses réalisées dans le cadre de ce travail ont été 72

73 effectuées sur des prélèvements faisant partie des bilans requis pour le type d exploration demandé. C- Paramètres étudiés En plus des paramètres biochimiques classiques du bilan martial (fer sérique, ferritine, transferrine) dont les limites ont été discutées dans la partie théorique, nous avons mesuré au laboratoire de biochimie de l HMIMV la concentration du Rs-Tf. Nous avons en outre réalisé le dosage d autres paramètres biochimiques, notamment la CRP (protéine de l inflammation à cinétique rapide) et l orosomucoïde (protéine à cinétique lente) en vue de confirmer ou d infirmer la présence d un éventuel état inflammatoire chez les patients inclus. Ont également été étudiés les paramètres hématologiques suivants : le taux d Hb, le VGM, la TCMH, et la CCMH dont l analyse a eu lieu au laboratoire d hématologie du même hôpital. D- Prélèvements sanguins Les prélèvements sanguins ont été effectués à jeun le matin entre 7h et 9h, dans des tubes sans anticoagulant (tubes secs) pour les tests biochimiques et dans des tubes avec anticoagulant EDTA pour les tests hématologiques. Pour les paramètres biochimiques, le sérum a été décanté après centrifugation puis congelé à - 80 C en fractions aliquotes dans des cryotubes jusqu aux dosages qui étaient effectués de façon différée. Pour les paramètres hématologiques, les résultats ont été reportés sur la fiche d exploitation le jour même de la réception des prélèvements. 73

74 E- Analyses biologiques réalisées 1. Tests biochimiques Les paramètres biochimiques étudiés, notamment le fer sérique, la ferritine et la CRP ont été dosés sur un auto-analyseur multiparamétrique de type Dimension RXL de la société Dade Behring (Fig.1). La détermination quantitative du Rs-Tf, de la transferrine et de l orosomucoïde a été effectuée sur l automate BN-Prospec de la même société (Fig. 2). Les réactifs répertoriés dans le tableau I ont été utilisés pour les dosages. Tableau I : Principes analytiques et réactifs utilisés pour le dosage des paramètres biochimiques Paramètre biochimique Méthode de dosage Réactif Fabricant Rs-Tf Immunonéphélémétrie N latex réactif Rs-Tf Dade Behring Fer sérique Méthode IRN Chromophore Ferene Dade Behring Ferritine Immunodosage en phase hétérogène Flex FERR Dade Behring Transferrine Immunonéphélométrie N-Antisérum anti transferrine humaine Dade Behring CRP Immunodosage turbidimétrique utilisant des particules sensibilisées (PETIA) Flex CRP Dade Behring Orosomucoïde Réaction immunochimique N-Antisérum anti Orosomucoïde humaine Dade Behring 74

75 Figure 1 : Automate Dimention RXL de la société Dade Behring (Laboratoire de Biochimie et de toxicologie, HMIMV) Figure 2 : Automate BN-Prospec de la société Dade Behring (Laboratoire de Biochimie et de toxicologie, HMIMV) 75

76 2. Analyses hématologiques L hémogramme a été réalisé avec un compteur automatique d hématologie de type Beckman de la société Coulter (Fig. 3). Figure 3 : Automate Beckman de la société Coulter (Laboratoire d Hématologie, HMIMV) 3. Principes des techniques de dosage, calcul et valeurs usuelles 3.1 Rs-Tf Principe Il s agit d une technique immunonéphélémétrique. Les particules de polystyrène recouvertes d anticorps monoclonaux anti-rs-tf humain s agglutinent lorsqu elles sont mélangées à un échantillon contenant du Rs-Tf. L intensité de la lumière dispersée par le système est proportionnelle à la concentration de la protéine recherchée. L exploitation se fait par rapport à un standard de concentration connue. 76

77 3.1.2 Valeurs usuelles 0,76-1,76 mg/l. 3.2 Fer sérique Principe Il s agit d une technique colorimétrique, utilisant le chromophore FERENE. En milieu acide (ph 4,5), le fer lié à la protéine transferrine est libéré en présence d un agent réducteur, l acide ascorbique. Le produit résultant, Fe ++, forme un complexe bleu avec le 3-(2-pyridyl)-5,6-bis-2-(5-furyl acide sulfonique)-1,2,4-triazine, sel disodique (FERENE ). L absorption du complexe, déterminée à l aide d une méthode en point final bichromatique (600, 700 nm), est proportionnelle à la concentration de fer lié à la transferrine dans le sérum. Fe Transferrine Fe Transferrine 2 Fe Acide ascorbique 2 Fe ++ + Acide déshydroascorbique + 2H + Fe Ferene Complexe Fe ++ - Ferene 3 (λ= 600 nm) Valeurs usuelles µg/dl. 3.3 Ferritine Principe La méthode ferritine (FERR) sur les systèmes de chimie clinique Dimension est un immunodosage enzymatique en une seule étape basée sur le principe du sandwich. 77

78 L échantillon est incubé avec des particules de dioxyde de chrome, recouvertes d anticorps monoclonaux spécifiques de la ferritine, et un réactif conjugué (anticorps monoclonaux marqués à la β-galactosidase et spécifiques d un second site de fixation de la ferritine) pour former un sandwich particule/ferritine/conjugué. Le conjugué non lié et l analyte sont éliminés par séparation magnétique et lavage. Le sandwich lié à la β-galactosidase est combiné avec un substrat chromogénique, le rouge de chlorophénicol β-d-galactopyranoside- (RCPG). L hydrolyse du (RCPG) libère un chromophore (RCP). La concentration de ferritine présente dans l échantillon du patient est directement proportionnelle au taux de changement de couleur dû à la formation de RCP, mesuré à 577/700 nm. Ferritine CrO 2 -Ac- Ferritine- F (ab ) 2 -β-gal + + CrO 2 -Ac CrO 2 -Ac + + F (ab ) 2 -β-galactosidase F (ab ) 2 -β-galactosidase CrO 2 -Ac- Ferritine- F (ab ) 2 -β-gal CrO 2 -Ac- Ferritine- F(ab ) 2 -β-gal + Lavage + CrO 2 -Ac CrO 2 -Ac + (transféré dans une cupule) F (ab ) 2 -β-galactosidase CrO 2 -Ac- Ferritine- F (ab ) 2-β-gal RCPG (n absorbant pas à 577 nm) RCP (absorbe à 577 nm) 78

79 3.3.2 Valeurs usuelles: Femme: ng/ml [ng/ml] Homme: ng/ml [ng/ml] 3.4 Transferrine Principe Il s agit d une technique immunonéphélémétrique. En présence de certains anticorps spécifiques, les protéines présentes dans les fluides corporels chez l homme forment un complexe immun par une réaction immunochimique. Ces complexes dispersent un faisceau lumineux traversant l échantillon. L intensité de la lumière dispersée est proportionnelle à la concentration de la protéine dans l échantillon. Le résultat est évalué par comparaison à un standard de concentration connue Valeurs usuelles 2-3,6 g/l. 3.5 CRP Principe La méthode RCRP est une technique d immunodosage turbidimétrique, utilisant des particules sensibilisées (PETIA). La présence de CRP dans l échantillon provoque l agrégation des particules de latex recouvertes d anticorps anti-crp (AcPR). L augmentation de turbidité due à l agrégation est proportionnelle à la concentration de CRP. Celle-ci est déterminée au moyen d une fonction mathématique. CRP + AcPR Complexe (λ = 340 nm) 79

80 3.5.2 Valeurs usuelles 3mg/l. 3.6 Orosomucoïde Principe C est un dosage immunonéphélémétrique. Dans une réaction immunochimique, les protéines contenues dans le sérum humain forment avec les anticorps spécifiques des complexes immuns sur lesquels est envoyée une lumière. L intensité de la lumière dispersée est fonction de la concentration dans l échantillon de la protéine recherchée. L exploitation se fait par rapport à un standard de concentration connue Valeurs usuelles 0,5-1,2 g/l. 3.7 Paramètres calculés et valeurs usuelles Les paramètres calculés CST, log [ferritine], index du Rs-Tf sont déterminés selon les relations ci-dessous : CTST (mg/l) = Transferrine (g/l) x 1,4 [Labo. de biochimie, HMIMV] CTST (µmol/l) = Transferrine (g/l) x 25 [4] CST (%) = Fer sérique (µg/dl) x 0,72 / Transferrine (g/l) [Labo. de biochimie, HMIMV] CST (%) = Fer sérique (µmol/l) / CTST (µmol/l) [4] Index du Rs-Tf = Rs-Tf /log (ferritine) [4] 80

81 Valeurs usuelles CTST : mg/l [4] CTST : µmol/l [4] CST : % (F) / % (H) [4] Index des Rs-Tf : 0,28-1,22 [4] F- Analyses statistiques et expression des résultats Les résultats ont été saisis à l aide du logiciel Excel version L analyse statistique a été effectuée avec le logiciel SPSS 10. Les variables qualitatives ont été exprimées en pourcentage (%) et celles quantitatives en moyenne ± écarttype. Les comparaisons de ces dernières ont été réalisées par le test ANOVA. Les modèles non paramétriques de Rho de Spearman et le test paramétrique de Pearson ont été utilisés pour l étude des corrélations. Par ailleurs, le pouvoir de discrimination du Rs-Tf par rapport aux autres marqueurs classiques pour le diagnostic de la carence martiale a été étudié par l établissement de la courbe ROC pour chaque paramètre étudié. La signification statistique a été retenue pour une valeur de p < 0,05. 81

82 III- RESULTATS 82

83 A- Description de la population étudiée 1. Répartition des sujets inclus Au cours de la période d étude, 184 sujets ont été inclus (malades : n=82, témoins : n=102). Sur la base des résultats des paramètres biologiques du bilan martial, nous avons subdivisé la population malade en 4 groupes : i) Le groupe 1 compte 28 patients ayant une carence martiale absolue définie par une baisse de la concentration de ferritinémie < 100 ng/ml et/ou CST < 20% [123]. Dans ce groupe, la concentration du Rs-Tf était retrouvée augmentée (2,09± 0,66 mg/l). ii) Le groupe 2 inclut 47 malades présentant un syndrome inflammatoire attesté par une augmentation du taux des marqueurs de l inflammation (CRP > 10 mg/l et/ou Orosomucoïde > 1,2 g/l). Dans ce groupe, la ferritinémie était retrouvée élevée (420 ± 54 ng/ml) associée à un taux sérique de Rs-Tf de 1,83 ± 0,09 mg/l. iii) Le groupe 3 comprend 20 sujets présentant un déficit fonctionnel défini par une baisse du taux de CST au dessous de 20 % et une ferritinémie > 100 ng/ml. Dans ce groupe, la CRP était retrouvée élevée (29,38 ± 8,77 mg/l) associée à un taux sérique de Rs-Tf augmenté (2,24 ± 0,32 mg/l). iv) Le groupe 4 se compose de 26 sujets traités par l association EPO+fer IV, présentant un taux d Hb en dessous de la cible (11-12 g/dl), en dépit d une 83

84 dose administrée d EPO supérieure à 300 UI/kg/semaine pendant plus de 6 semaines. Dans ce groupe, la concentration du Rs-Tf était de 1,84 ± 0,25 mg/l. 2. Caractéristiques démographiques de la population étudiée Les sujets témoins (n = 102) étaient répartis en 48 Femmes et 54 Hommes. Ils avaient un âge compris entre 18 et 70 ans, avec une moyenne de 46,5 ± 16,25 ans (Tableau II). La population malade incluait 43 sujets de sexe masculin et 39 de sexe féminin, soit respectivement 52 % et 48 % (ratio de 0,92 en faveur des hommes). L âge moyen des patients inclus était de 48,40 ± 15,37 ans avec des extrêmes de 15 et 74 ans. Les patients inclus été traités ou non par un ASE et/ou de fer administré par voie intraveineux. Les sujets traités étaient inégaux par rapport au traitement reçu. En effet 26 patients (30%) recevaient un traitement associant Epoétine-β et fer intraveineux, 29 patients (35%) seulement de l Epoétine- β et enfin deux (2,4%) recevaient uniquement du fer. Vingt et cinq patients de la cohorte étudiée (30%) ne recevaient aucun traitement. Les doses moyennes hebdomadaires de l ASE étaient de 5793 UI/kg/semaine quand c est le seul traitement et de 4384 UI/kg/semaine quand le fer y est associé. Les doses de fer intraveineux s échelonnaient de mg/semaine. 84

85 Tableau II : Répartition des sujets inclus selon l âge et le sexe Sexe Age (ans) M F Moyenne ± Ecart-type minimum maximum Malades (n = 82) n = 43 n = 39 48,40 ± 15, Témoins (n = 102) n = 54 n = 48 46,50 ± 16, Caractéristiques biologiques de la population étudiée Les caractéristiques biologiques de la population étudiée sont résumées dans le tableau III. Tableau III : Caractéristiques biologiques des patients hémodialysés inclus Moyenne ± Erreur standard Min Max Valeurs de Référence Ferritine (ng/ml) 372,67 ± 34, Rs-Tf (mg/l) 1,66 ± 0,09 0,35 6,76 0,76-1,76 CST (%) 35,62 ± 2,92 2, Rs-Tf/log [ferritine] 0,71 ± 0,04 0,12 2,29 0,28-1,22 CRP (mg/l) 15,10 ± 3,30 0, ,5-3 Orosomucoïde (g/l) 1,27 ± 0, ,5-1,2 Hb (g/dl) 10,36 ± 0,24 4,7 15,

86 3.1 Taux d Hb Il faut souligner que n=37 patients soit 45% avaient un taux d Hb entre g/dl. Trente et un patients parmi eux recevaient un traitement : 17 associant EPO et fer, 12 à base d EPO seule et 2 à base de fer seul, les 6 restants n étaient pas traités. Un taux d Hb en dessous de 11 g/dl été retrouvé chez 45 patients soit 55%. Vingt six parmi eux étaient traités par l association EPO et fer (n=9) ou par EPO seul (n=17) : c est la catégorie de patients qui n a pas atteint la cible recommandée sous traitement. En revanche, les 19 autres n avaient aucun traitement. Dans notre travail, est conformément aux recommandations KDOQI définissant l anémie par un taux d Hb en dessous de 12 g/dl chez la femme et en dessous de 13 g/dl chez l homme, nous avons relevé n=70 soit 85% de patients anémiques. La prise en charge thérapeutique de l anémie n est recommandée qu en dessous d une valeur seuil de 11 g/dl pour atteindre une cible de 11 à 12 g/dl chez les gens soumis sous ASE. Une supplémentation par le fer est requise lorsque le taux de ferritine est en dessous de 200 ng/ml comme l exige les recommandations internationales [128, 129]. 3.2 Fer sérique Il n a pas été analysé car la plupart des auteurs considèrent qu il ne présente pas d intérêts pour le diagnostic de la carence martiale. Il est sujet de nombreuses variations quotidiennes individuelles, et sa diminution peut être le fait non seulement d une carence en fer mais aussi d une inflammation. 86

87 3.3 Transferrine L augmentation de la transferrine constitue un marqueur de la carence martiale mais sa sensibilité est habituellement faible inférieur à 50%. Nous n allons pas l étudier dans ce travail, on a préféré son coefficient : le CST. Selon les recommandations françaises, un déficit en fer est défini par un CST < 20% et une ferritinémie >100 ng/ml (critères choisis dans la présente étude, car les seuls disponibles), ou une teneur réticulocytaire en Hb < 29 pg/cellule, ou encore un % de globules rouges hypochromes > 10% [123]. La fiabilité du coefficient de saturation est remise en cause dans les études réalisées chez les patients normorénaux. Les critiques portent à la fois sur le dosage de fer sérique et celui de la transferrine et des problèmes qu ils posent et que nous avons déjà cité. 3.4 Ferritine Dans notre étude la valeur moyenne de la ferritine est de 372,67 ng/ml. Son interprétation est rendue difficile par les nombreux facteurs qui l influencent particulièrement le syndrome inflammatoire attesté ici par une valeur de CRP de 15 mg/l et d orosomucoïde de 1,2 g/l. Cela remède en cause la fiabilité de ce paramètre. 3.5 Rs-Tf La valeur moyenne retrouvée dans cette étude est de 1,66 mg/l. 4. Répartition des patients hémodialysés selon l étiologie La répartition des hémodialysés selon l étiologie de l IRC est illustrée par la figure 4. 87

88 D après les résultats obtenus, nous constatons qu en dehors des néphropathies d étiologie indéterminée qui représentent prés de 27% (n=22), la néphropathie diabétique prédomine dans la population étudiée (n=18, 22%), suivie par la néphropathie vasculaire (n =15, 18%), la néphropathie glomérulaire (n=13, 16%), la néphropathie interstitielle chronique (n=4, 4%) et la Polykystose rénale (n=3, 3%). N.D : Néphropathie Diabétique N.G : Néphropathie Glomérulaire P.K : Polykystose N.V : Néphropathie Vasculaire N.I.C : Néphropathie Interstitielle Chronique N.I : Néphropathie Indéterminée Figure 4 : Répartition des hémodialysés selon l étiologie de l IRC B- Aspects biologiques 1. Détermination d un intervalle descriptif de la concentration en Rs-Tf L étude statistique de la population témoin nous a permis de déterminer un intervalle descriptif de la concentration en Rs-Tf selon les conditions techniques du laboratoire de biochimie de l HMIMV à Rabat. 88

89 Les valeurs du taux sérique du Rs-Tf obtenues oscillaient entre 0,59 et 2,40 mg/l avec une valeur moyenne de 1,31 ± 0,185 mg/l d où un intervalle descriptif de 0,94 1,68 mg/l. 2. Etude de la variabilité interindividuelle de la concentration du Rs- Tf en fonction du sexe et de l âge Nous avons étudié les variations de la concentration du Rs-Tf dans le groupe témoin en fonction du sexe et de l âge. 2.1 Variation de la concentration du Rs-Tf en fonction du sexe Les résultats obtenus trouvent une moyenne de 1,32 ± 0,39 mg/l chez les hommes et de 1,30 ± 0,37 mg/l chez le sexe féminin avec respectivement un minimum de 0,60 et 0,66 mg/l et un maximum de 2,40 et 2,11 mg/l. La figure 5 schématise la représentation de la variation du Rs-Tf sérique en fonction du sexe et illustre l absence de cette variation. Figure 5 : Représentation de la variation de la concentration du Rs-Tf en fonction du sexe 89

90 AGE (ans) Récepteur soluble de la transferrine : Intérêt chez l hémodialysé chronique 2.2 Résultat de la variation du taux sérique du Rs-Tf selon l âge La corrélation entre la concentration sérique en Rs-Tf et l âge est retrouvée significative (p= 0,019) et négative (r= -0,29) selon l analyse statistique de Spearman (Fig. 6). Cela signifie qu avec l âge on note une diminution du Rs- Tf Rcarrée = 0,0854,6,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 RSTF(mg/l) Figure 6 : Représentation de la variation de la concentration en Rs-Tf en fonction de l âge 3. Validation du Rs-Tf comme marqueur du statut martial 3.1 Corrélation du Rs-Tf avec les autres paramètres classiques du bilan martial dans la population témoin Dans une population témoin (n=102), nous avons effectué la corrélation du Rs-Tf avec les paramètres du bilan martial (Tableau IV). 90

91 Tableau IV: Corrélation entre le Rs-Tf et les autres paramètres du bilan martial dans la population témoin : Résultats du «r» et du «p» Récepteur Soluble de la Transferrine Paramètres biologiques r P CST (%) -0,295 0,019 Ferritine (ng/ml) 0,115 0,271 Fer sérique (µg/dl) -0,249 0,047 Transferrine (g/l) 0,227 0,029 Index du Rs-Tf 0,723 0,0001 Dans la population témoin, la corrélation du Rs-Tf, étudiée par le test non paramétrique de Rho de Spearman, est retrouvée : Significative (p < 0,05) et faiblement positive avec la Tsf (r = 0,227), mais très nette avec l index du Rs-Tf (r = 0,723). Significative (p < 0,05) mais faiblement négative avec le fer sérique (r = - 0,249), et le CST (r = - 0,295). Non significative (p > 0,05) avec la ferritine. 91

92 3.2 Corrélation du Rs-Tf avec les autres paramètres classiques du bilan martial dans la population malade Afin de vérifier que la concentration sérique du Rs-Tf constitue un bon marqueur du statut martial chez les patients hémodialysés, nous avons déterminé si ce paramètre était corrélé aux marqueurs classiques du bilan martial, à savoir le CST, la ferritine, le fer sérique, la Tsf et l index du Rs-Tf (Tableau V, Figure 7). Dans notre travail, si on considère un seuil de ferritine à 100 ng/ml et d un seuil de Rs-Tf à 1,76 mg/l, l index ou rapport Rs-Tf/Log [ferritine] est évalué à 0,88. Tableau V : Corrélation entre le Rs-Tf et les autres paramètres du bilan martial dans la population malade : Résultats du «r» et du «p» Récepteur Soluble de la Transferrine Paramètres biologiques r P CST (%) -0,28 0,001 Ferritine (ng/ml) -0,15 0,03 Fer sérique (µg/dl) -0,18 0,01 Transferrine (g/l) 0,19 0,01 Index du Rs-Tf 0,8 0,001 92

93 La corrélation du Rs-Tf avec les paramètres classiques du bilan martial, est retrouvée (test non paramétrique de Rho de Spearman) : Significative (p < 0,05) et négative avec le CST (r = - 0,28), la ferritine (r = - 0,15) et le fer sérique (r = - 0,18). Significative (p < 0,05) et positive avec la Tsf (r = 0,19) et l index du Rs-Tf (r = 0,8). Figure 7 : Corrélations entre le Rs-Tf et respectivement, le CST, la ferritine et l Index du Rs-Tf 93

94 4. Validation du Rs-Tf comme marqueur de carence martiale absolue Pour valider le Rs-Tf comme marqueur de la carence martiale absolue, nous avons divisé la cohorte en deux groupes ("carencé" et "non carencé") selon les critéres de l AFSSAPS initialement précisés et comparé les concentartions moyennes du Rs-Tf (Tableau VI) dans les deux groupes : "carencé" (n= 28) et "non carencé" (n= 54). Ensuite nous avons comparé les concentrations moyennes des différents paramètres du bilan martial (Rs-Tf, Ferritine, CST, Index du Rs-Tf) obtenues dans les deux groupes. Les résultats statistiques obtenus sont rapportés dans le tableau VII. Tableau VI : Comparaison de la concentration moyenne en Rs-Tf entre le groupe carencé en fer et le groupe non carencé Rs-Tf (mg/l) Groupe Moyenne Ecarttype Intervalle de confiance à 95 % Borne inférieure Borne supérieure Min Max carencé 2,09 0,66 1,82 2,67 0,87 6,76 non carencé 1,35 0,43 1,23 1,47 0,35 2,26 Non résultats montrent que la concentration moyenne du Rs-Tf du groupe "carencé" est significativement (p < 0,05) plus élevée que celle du groupe "non carencé" avec un intervalle de confiance à 95% compris entre 1,82 et 2,67 mg/l dans le groupe carencé (Fig. 8). 94

95 Figure 8 : Comparaison de la concentration moyenne en Rs-Tf entre le groupe carencés et le groupe non carencés en fer Tableau VII : Comparaison des paramètres biologiques du bilan martial entre le groupe CM + et le groupe CM - Paramètres biologiques CM + (n=28/34.9%) CM - (n= 54/65.9%) P Rs-Tf (mg/l) 2,09± 0,66 1,35 ± 0,43 0,0001 Ferritine (ng/ml) 245,9 ± 234,9 438,4 ± 325, CST (%) 20,6 ± 1,5 43,15 ± 27,8 0,0001 Index du Rs-Tf 1,6±0,5 0,53±0,18 0,0001 CM + : présence de carence martiale ; CM - : absence de carence martiale 95

96 Pour la ferritine, en raison de la large distribution des résultats, ces derniers peuvent être exprimés en médiane en précisant les limites inférieure et supérieure : Ferritine : Médiane = 299,5ng/ml, [ ] Les résultats des différents paramètres du bilan martial entre les deux groupes se révèlent nettement significatifs (p = 0,0001) pour le Rs-Tf, le CST et l Index, significatifs mais à moindre degrés pour la ferritine (p = 0,007). 5. Validation du Rs-Tf comme marqueur du déficit fonctionnel Les critéres de déficit fonctionnel en fer appliqués dans cette étude sont ceux proposés par AFSSAPS, comme cela a été souligné (ferritinémie > 100 ng/ml et CST< 20 %). Nous avons divisé la cohorte étudiée en deux groupes, "déficit fonctionnel" (n=20) et "absence de déficit fonctionnel" (n= 58). Ensuite nous avons comparé les concentrations moyennes des différents paramètres du bilan martial (Rs-Tf, Ferritine, CST, Index du Rs-Tf) obtenues dans les deux groupes. Les résultats statistiques obtenus sont rapportés dans le tableau VIII. 96

97 Tableau VIII : Comparaison des paramètres biologiques du bilan martial entre le groupe déficit fonctionnel et le groupe absence de déficit fonctionnel Paramètres biologiques déficit fonctionnel (n=20) Absence de déficit fonctionnel (n= 58) P Rs-Tf (mg/l) 2,24 ± 0,32 1,56 ± 0,07 0,0001 Ferritine (ng/ml) 372 ± 56,76 379,86 ± 49,46 0,59 CST (%) 15,26 ± 1,23 39,89 ± 3,90 0,0001 Index du Rs-Tf 0,91 ± 0,11 0,66 ± 0,04 0,001 La comparaison des résultats des paramétres du bilan martial (CST, ferritinémie et l index du Rs-Tf) entre le groupe "déficit fonctionnel" et le groupe "absence de déficit fonctionnel" nous a permis de constater que dans le groupe "déficit fonctionnel": Le taux du Rs-Tf est très significativement (p=0.0001) plus augmenté comme l illustre bien la figure 9, L index du Rs-Tf est significativement (p=0.001) plus élevé, Alors que le CST est très significativement (p=0.0001) plus bas. Quant à la ferritinémie, sa valeur ne semble pas varier de façon significative (p>0,05) entre les deux groupes. 97

98 Figure 9 : Comparaison de Rs-Tf, CST, ferritinémie, et l index entre le groupe déficit fonctionnel et le groupe absence de déficit fonctionnel 98

99 6. Influence de l inflammation 6.1 Etude de l influence de l inflammation chez les hémodialysés Nous avons, là aussi subdivisé la population étudiée (n=82) en deux groupes selon l existence ou non d un syndrome inflammatoire (CRP >10 mg/l et/ou Orosomucoïde >1,2 g/l). Nous avons ensuite comparé les moyens des paramètres suivants : Rs-Tf, Ferritine, CST et Index du Rs-Tf (Tableau IX). Tableau IX : Comparaison des paramètres biologiques du bilan martial entre le groupe syndrome inflammatoire + et le groupe syndrome inflammatoire - Paramètres biologiques Syndrome inflammatoire (n=47) Absence de syndrome inflammatoire (n= 35) P Rs-Tf (mg/l) 1,83 ± 0,09 1,48 ± 0,17 0,10 Ferritine (ng/ml) 420 ± 53, ± 31,92 0,04 CST (%) 26 ± 2,22 47 ± 5,50 0,001 Index du Rs-Tf 0,80 ± 0,05 0,62 ± 0,06 0,06 Les résultats de cette étude comparative montrent que la concentration sérique du Rs-Tf ainsi que l index ne sont pas significativement modifiés par l inflammation. En revanche, la ferritinémie se trouve augmentée de façon peu significative (p=0,04) et le CST diminue significativement (p= 0,001) en cas d inflammation associée. 99

100 6.2 Part de l inflammation dans le déficit fonctionnel Nous avons : déterminé le pourcentage de sujets présentant un syndrome inflammatoire parmi ceux ayant un déficit fonctionnel, comparé les concentrations moyennes de CRP et d orosomucoïde entre le groupe "déficit fonctionnel" et le groupe "absence de déficit fonctionnel" (Tableau X). Tableau X : Comparaison des paramètres de l inflammation entre le groupe déficit fonctionnel et le groupe absence de déficit fonctionnel Paramètres biologiques déficit fonctionnel Absence de déficit fonctionnel P CRP (mg/l) 29,38 ± 8,77 11,70 ± 4,67 0,049 Orosomucoïde (g/l) 1,53 ± 0,12 1,19 ± 0,05 0,003 Parmi les 20 sujets présentant un déficit fonctionnel, 15 avaient un syndrome inflammatoire associé. La comparaison des paramètres de l inflammation (CRP, Orosomucoïde) entre les deux groupes montre une augmentation faiblement significative (p=0,049) de la CRP, mais fortement significative (p=0,003) de l orosomucoïde dans le groupe "déficit fonctionnel" (Fig. 10). 100

101 Figure 10 : Comparaison de CRP et Orosomucoïde entre le groupe déficit fonctionnel et le groupe absence de déficit fonctionnel 7. Evaluation du Rs-Tf dans le groupe 4 Sur la base des critères préalablement définis, la population étudiée était scindée en deux groupes : Groupe A, n= 29 : Cible en Hb atteinte, Groupe B, n= 26 : Cible en Hb non atteinte. Nous avons effectué une comparaison des concentrations moyennes de Rs- Tf, CST, Ferritine et l index du Rs-Tf entre les deux groupes 1 et 2 (Tableau XI). 101