Physiologie de la mégacaryopoïèse

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1 Physiologie de la mégacaryopoïèse Les plaquettes sanguines (ou thrombocytes) sont de petits fragments cellulaires anucléés à forte capacité d adhésion aux structures endothéliales et qui ont un rôle essentiel dans l hémostase. Elles proviennent de la fragmentation du cytoplasme de précurseurs médullaires : les mégacaryocytes (MK). La mégacaryopoïèse débute avec une cellule pluripotente, qui se spécialise en progéniteur mégacaryocytaire. Il y a ensuite 3 étapes majeures, en partie imbriquées: prolifération (= amplification du nombre), puis succession d endomitoses ou endoreduplications du noyau sans division cellulaire, et finalement différenciation progressive par maturation cytoplasmique. En fin de maturation, le cytoplasme des MK se fragmente pour donner 2000 à 5000 plaquettes / MK. Les plaquettes sanguines vivent 7 à 10 j dans le sang et leur nombre reste stable chez un même individu (normales = G / litre), suite à un mécanisme de régulation particulier faisant intervenir des cytokines dont la principale est la thrombopoïétine (TPO). 1. Compartiment des progéniteurs = prolifération La prolifération et la différenciation des MK et de leurs progéniteurs se réalise dans la moelle osseuse (MO) Le nombre total de MK est faible: 0,02 0, 05% des cellules nucléées de la MO 1.1. Un progéniteur totipotent (ou hémangioblaste) se différencie en angioblastes puis en précurseurs des cellules endothéliales d une part, et en cellules souches hématopoïétiques d autre part. Une CS hématopoïétique se différencie ensuite en progéniteur lymphoïde d une part et en progéniteur myéloïde d autre part (CFU GEMM = Colony Forming Unit granulocytaire, érythroblastique, mégacaryocytaire et monocytaire) Le stade suivant est la différenciation de la CFU-GEMM en CFU GM d une part et en progéniteur commun érythroblastique-mégacaryocytaire (BFU- E / MK: Burst Forming Unit érythroblastique et mégacaryocytaire) sous l influence de TPO et de SCF (stem cell factor). Ce dernier se différencie à son tour en progéniteurs mégacaryocytaires spécialisés. Le progéniteur mégacaryocytaire précoce BFU-MK est une cellule diploïde, qui donne des colonies d aspect irrégulier in vitro (=bursts). Le progéniteur mégacaryocytaire tardif CFU-MK forme in vitro des colonies de petite taille (15-30 cellules). Les progéniteurs cessent leur prolifération après ce stade Un cycle cellulaire endomitotique débute alors: le noyau entre en phase S, puis M, mais l anaphase et la cytokinèse ne s effectuent pas, et la cellule entre à nouveau en cycle mitotique (les cyclines D3 et E sont impliquées). La ploïdisation augmente, passant progressivement de 2N à 128N, avec un mode à 16N pour plus de la moitié des MK chez le sujet sain. 2. Les divers stades de la différenciation = maturation Alors que les endomitoses se poursuivent une synthèse active débute: les MK immatures ont une taille réduite et un cytoplasme basophile (riche en ARN), et progressivement le noyau augmente de volume alors que les molécules spécialisées s accumulent dans le cytoplasme MAJ sept 2006 Page 1 sur 6

2 qui grandit lui aussi. Le processus aboutit à des cellules géantes (jusqu à 120 µm de diamètre sur frottis, et 60 µm sur biopsie de moelle). La différenciation mégacaryocytaire abouti à des cellules de plus en plus grandes, avec un noyau qui se lobule et un cytoplasme qui acquiert progressivement le contenu et l aspect des plaquettes sanguines MAJ sept 2006 Page 2 sur 6

3 Promégacaryoblastes : cellules transitionnelles issues des CFU-MK Représentent environ 10% de l ensemble des MK Le niveau de ploïdie est faible (2N à 4N): c est à ce stade que les endomitoses débutent Aspect morphologique: petite cellule d apparence lymphoïde. Ces cellules sont identifiables en microscopie électronique car elles contiennent de la peroxydase plaquettaire (PPO), marqueur le plus précoce de la lignée. D autres molécules spécialisées apparaissent progressivement. Mégacaryoblastes : ou MK stade I La ploïdie augmente (4 8 N) et se poursuit, avec début de maturation cytoplasmique Morphologie au MGG: 20 à 30 µm de diamètre, rapport N/C élevé, noyau rond (souvent d aspect bilobé), chromatine fine, cytoplasme très basophile (riche en ARN) sans granulations. Un système de membranes intracytoplasmiques se développe (membranes de démarcation primitives). Des molécules spécialisées sont synthétisées en grande quantité. Mégacaryocyte basophile : ou MK stade II ou promégacaryocyte La ploïdie atteint son apogée à ce stade et la synthèse d ADN cesse (la majorité des MK a une ploïdie = 16N) Morphologie au MGG: grandes cellules (40 80 µm de diamètre) dont le noyau commence à se lobuler et la quantité de cytoplasme augmente (le rapport N/C diminue). Le cytoplasme est de plus en plus abondant, basophile, et quelques granulations alpha et granulations denses apparaissent. Mégacaryocytes granuleux : ou MK stade III Les granulations plaquettaires sont nombreuses et le système de membranes de démarcation délimitant des territoires plaquettaires commence à s organiser Morphologie au MGG: grandes cellules ( µm de diamètre, parfois plus); le rapport N/C diminue; le noyau est multilobé et la chromatine plus dense; le cytoplasme perd une partie de sa basophilie, devenant acidophile et riche en granulations. Mégacaryocytes matures : ou MK stade IV ou plaquettogènes ou thrombocytogènes Les granulations se regroupent en petits paquets dans le cytoplasme, ébauches des futures plaquettes. Morphologie au MGG: le noyau est multilobé, dense, pycnotique, et le cytoplasme variablement abondant (taille totale: µm de diamètre); le cytoplasme a une teinte qui évoque celle des plaquettes. La libération des plaquettes a lieu à ce stade: deux mécanismes sont évoqués : - les MK sont proches des sinusoïdes et émettent de longs prolongements cytoplasmiques (pseudopodes ou proplaquettes) qui traversent la paroi des sinusoïdes et se fragmentent dans la lumière de ces derniers sous la forme de plaquettes. Quelques MK traversent les sinusoïdes et se fragmentent dans la circulation générale et seront arrêtés au niveau des capillaires pulmonaires, - au sein des MK apparaissent des territoires dans lesquels des membranes internes démarquent les futures plaquettes, qui seront libérées ultérieurement par rupture du cytoplasme. Durée totale de la maturation: 8 j Durée de vie des plaquettes: 7 10 j Adaptativité de la mégacaryopoïèse: en cas de thrombopénie la masse totale des MK peut augmenter jusqu à 10 fois, avec augmentation parallèle de la taille nucléaire (augmentation de la ploïdie), de la taille cytoplasmique et du nombre total de MK MAJ sept 2006 Page 3 sur 6

4 NB: l empéripolèse correspond à la traversée d une cellule par une autre sans qu aucune des 2 ne soit altérée : pour les MK la cellule traversante (leucocyte, parfois GR) pénètre par le système membranaire connecté à la surface, chemine dans ce réseau et finit par en sortir (phénomène distinct de la phagocytose) 3. Facteurs de transcription (FT) et mégacaryopoïèse. - Au niveau des progéniteurs précoces, le FT RUNX1/AML1 interagit avec le FT GATA-1 permettant l orientation vers la lignée MK. - Le FT GATA-1 permet la poursuite de l engagement dans la mégacaryopoïèse de 2 manières : * interaction GATA-1 avec ETS, RUNX1 et FOG (friend of GATA) * dérégulation de PU.1 (qui est responsable de la différenciation myéloïde) - Les FT de la famille ets de type Fli-1 permettent la poursuite de la différenciation - Le FT NF-E2 contrôle la maturation terminale, la formation des proplaquettes et leur libération finale. 4. Apparition progressive des marqueurs spécifiques de la lignée. - les techniques de culture in vitro (agar, méthylcellulose, collagène) permettent l identification et la numération des progéniteurs les plus précoces. Ces méthodes sont utiles pour l aide au diagnostic de certaines pathologies plaquettaires (thrombocytémie essentielle). - la microscopie électronique permet d identifier les promégacaryoblastes qui contiennent de la peroxydase plaquettaire (Platelet PerOxidase ou PPO) qui a été le premier marqueur clairement identifié caractérisant les progéniteurs MK précoces. Cette enzyme persiste tout au long de la différenciation et dans les plaquettes sanguines, et correspond à une cyclooxygénase du métabolisme des prostaglandines, localisée dans le réticulum endoplasmique lisse (absente de l appareil de Golgi et des granulations). [l acétylcholinestérase est l équivalent de la PPO pour les rongeurs] - Les techniques de tri cellulaire (FACS) permettent l obtention de populations MK purifiées à partir d échantillons médullaires. Les cytomètres de flux peuvent analyser le contenu en ADN des MK et définir les divers niveaux d hyperploïdie, et rechercher l expression d Ag cytoplasmiques ou/et membranaires grâce à des Ac monoclonaux spécifiques. cellules Ag d immaturité Apparition progressive d Ag plaquettaires BFU-MK CD 34+, CD38-, HLA DR- CD 117+ CFU-MK CD34+, CD38±, HLA DR+, CD 33+ facteur Willebrand (granules précoces) Promégacaryoblaste Mégacaryocytes CD34±, CD33+ PPO+ en ME Gp IIb (CD41a) Gp IIb-IIIa (CD41) Gp Ib (CD42) Gp IV (CD36) MAJ sept 2006 Page 4 sur 6

5 5. Régulation 5.1. Régulation positive La thrombopoïétine (TPO), ou c-mpl ligand. Facteur de croissance le plus important mais non exclusif de la mégacaryopoïèse. Facteur de croissance spécifique de la lignée mégacaryocyto-plaquettaire Glycoprotéine de KDa (gène situé sur chromosome 3q26-3q27), dont le domaine actif N terminal présente une homologie forte (25%) avec l EPO Sites de production : foie (un peu par le rein, le stroma médullaire, les poumons) : la production est constitutive, c est-à-dire non influencée par l existence d une thrombopénie ou d une thrombocytose. Action à tous les niveaux de la mégacaryopoïèse: oriente la différenciation des progéniteurs pluripotents vers la production de BFU-MK, stimule la croissance des progéniteurs primitifs multipotents, favorise la croissance et la différenciation des MK, augmente la production des plaquettes in vivo (effets majeurs des stades CFU-MK au MK stade II) La TPO agit également comme facteur de survie des progéniteurs pluripotents et des progéniteurs érythroïdes (certains progéniteurs érythroïdes expriment CD41 et mpl) Le récepteur de la TPO : Mpl. Présent sur les progéniteurs MK CD34+, les précurseurs MK et les plaquettes: 30 à 200 récepteurs par plaquette Récepteur de type tyrosine kinase, il agit comme le récepteur de l EPO, par dimérisation après contact avec son ligand, puis active le molécules JAK (phosphorylation) puis STAT (dimérisation), mais aussi les voies PI3K et ETS. Régulation de la thrombopoïèse par le couple TPO-MPL: La masse plaquettaire fixe une partie de la TPO (par le mpl des plaquettes). Seule la TPO non liée circulante qui va agir sur les MK: si la masse plaquettaire circulante est forte (thrombocytose) la majorité de la TPO se fixe sur le MPL des plaquettes, puis est internalisée et dégradée, diminuant la quantité de TPO libre pour agir sur les MK. Dans le cas contraire (thrombopénie) peu de TPO se fixe sur les plaquettes et une plus grande quantité est libre pour agir sur les MK (modifications morphologiques des MK avec augmentation du nombre, de la polyploïdisation, de la taille des plaquettes) Il existe diverses anomalies des gènes codant pour la TPO et son récepteur, entraînant diverses maladies (thrombopénies ou thrombocytoses constitutionnelles ou acquises). Les autres cytokines stimulant les MK. L IL 11 a une action parallèle à celle de la TPO (à divers niveaux) IL3, GM CSF et LIF (leukemia inhibitory factor) : agissent positivement sur les progéniteurs MK précoces Le SF agit en orientant les progéniteurs pluripotents vers la mégacaryopoïèse L IL 6 agit essentiellement sur les MK de stades I à IV Diverses autres cytokines sont impliquées, notamment l EPO, qui agit avec la TPO pour orienter les progéniteurs CD34+ vers la mégacaryopoièse et agit sur la maturation des MK; cependant le traitement avec EPO seule n entraîne pas de thrombocytose. MAJ sept 2006 Page 5 sur 6

6 Remarque. Dans les états inflammatoires l IL6 produite par les macrophages induit en outre une augmentation de synthèse de TPO hépatique (parmi les diverses protéines de la phase aiguë de l inflammation). Certaines molécules sont des régulateurs négatifs Produits libérés par les plaquettes elles-mêmes (contenus dans les granules α) : PDGF, TGF β, β-tg (thromboglobuline), PF 4, CTAP III (connective tissue activating peptide III). Ces divers composants inhibent la prolifération et la maturation des progéniteurs, ainsi que la maturation des MK. Le TGF bêta libéré par les MK matures et les plaquettes inhibe à la fois la croissance des progéniteurs MK (CFU MK et promkb), ainsi que la polyploïdisation et la maturation cytoplasmiques des MK ; par contre il stimule les cellules stromales de la MO pour qu elles produisent de la TPO (Blood 1999, 94:1952) Des facteurs de la famille des chémokines ; facteurs qui fixent l héparine et l inhibent D autres molécules sont des inhibiteurs non spécifiques et inhibent également la croissance d autres progéniteurs hématopoïétiques : interférons α et γ, TNF. L IFN alpha inhibe directement les effets de la TPO sur la croissance des MK (Blood 2000, 96 : 2093) 6. Conclusion La mégacaryopoïèse se base sur un mécanisme particulier qui crée des cellules géantes se fragmentant finalement en petits éléments anucléés, les plaquettes. Les différentes molécules utiles aux fonctions plaquettaires apparaissent progressivement au cours de la différenciation. La régulation de production fait intervenir la TPO, son récepteur, et d autres cytokines. Les premiers essais utilisant des molécules recombinantes (rhutpo) dans le traitement des thrombopénies post chimiothérapie ou après greffe de cellules souches se sont révélés peu concluants ; d autres sont en cours, utilisant la TPO ou des peptides de synthèse apparentés ou non à la TPO, mais également des agonistes de c-mpl. Aujourd hui, seule l IL-11 est proposée pour traiter le thrombopénies, mais son efficacité reste limitée. Références utiles - Mégacaryocytopoïèse. G Sébahoun. Hématologie clinique et biologique, Arnette, 1998, pp Plaquettes. G Sébahoun, dans Hématologie clinique et biologique, Arnette, 1998, pp Platelets and megakaryocytes. Wintrobe s clinical hematology. Lee GR et al Eds. Lippincott Williams & Wilkins, pp Deutsch & Tomer. Megakaryocyte development and platelet production. Br J Haematol 2006; 134: Document réalisé par M. Zandecki, V. Gilquin et F. Dubois-Galopin ; revu en sept 2006) MAJ sept 2006 Page 6 sur 6