4.0 Électrophorèse capillaire ÉC en solution libre Tampons et additifs: complexation

Transcription

1 ÉC en solution libre Tampons et additifs: complexation Sucre Ovalbumine Borate 1

2 ÉC en solution libre Tampons et additifs: inversion du flux (électro-osmose anodique) 2

3 ÉC en solution libre Tampons et additifs: inversion du flux (électro-osmose anodique) 3

4 ÉC en solution libre Efficacité et résolution Dispersion d un pic : σ 2 total = σ2 dif + σ2 inj + σ2 temp + σ2 ads + σ2 dét + σ2 k + dif: diffusion longitudinal (D m ) inj: longeur de la bande d injection temp: effet joule, gradiant de T vs V ads: intéraction de l analyte avec le capillaire dét: fenêtre de détection (la + petite) k: différence de conductivité entre la zone analyte et le tampon HEPT, H, est un mesure de la dispersion (σ 2 ) d un pic qui traverse une distance L: 2 total H = σ L N, l efficacité d une séparation, est définie par: 2 Ld L N = = d 2 H σ d total A h ½h pic i σ w ½ =2.35σ w=4σ t m,i pic j t m,j t 4

5 ÉC en solution libre En ÉC, la diffusion moléculaire longitudinale est la majeure contribution à σ 2 : σ D = Coefficient de diffusion (cm 2.s -1 ) t m = Temps pour la diffusion (temps de migration, s). Donc, l efficacité est : 2 = 2Dt m N = 2 L ( µ ep + µ d = 2 D t 2D m eo ) V L L d t La résolution entre 2 pics est : N R = 4 µ ep µ ep µ µ ep = µ ep,j - µ ep,i µ ep = la mobilité électrophorétique moyenne N = le nombre de plateaux théoriques + eo 5

6 En pratique, on peut calculer N et R dans le même façon qu en chromatographie : Largeur du pic à la base t N = 5.54 W m 1/2 ÉC en solution libre 2 R ou Largeur du pic à mi-hauteur = t 1 2 m,j t ( W + W ) i m,i j t N = 16 W m base 2 R =1.18 ( t ) m,j tm,i ( W + W ) 1/2, i 1/2, j 6

7 ÉC en solution libre En résumé : Le flux électro-osmotique est influencé par : ph, I et composition ζ V E T η v eo = µ E = eo ε ς E 4 πη Pour améliorer l efficacité et la résolution en ÉC, on peut : Modifier le ph du tampon Charge analyte Flux électro-osmotique Changer le tampon Changer la viscosité N = 2 L ( µ ep + µ d = 2 D t 2D m eo ) V Ld L t R = N 4 µ ep µ ep µ + eo 7

8 ÉC en solution libre Détection en ÉC 8

9 ÉC en solution libre Détection: ÉC vs HPLC Paramètre HPLC ÉC colonne 25 X 0,46 cm 50 cm X 50 µm µ, éluant 1 ml/min µl/min V, injection 10 µl < 1-10 nl t, élution du pic 30 s ~3 s capillaire pour la séparation en ÉC Nécessaire en ÉC - V de détection < 1 nl - L de détection < 1 mm - détecteur < 0,2 s OD ID Longeur de détection efficace l ID = π 4 Pour un capillaire de 50 µm ID, l ~ 39 µm fenêtre de détection ~ 1 mm 9

10 ÉC en solution libre Absorption moléculaire UV-Vis Loi de Beer-Lambert : A I I 0 = log = ε lc A = absorbance I 0 = intensité de lumière incidente I = intensité de lumière transmise ε = absorptivité molaire (L.mol -1.cm -1 ) c = concentration d analyte (mol.l -1 ) l = chemin optique (cm) Modes de détection - Direct - UV-Vis λ fixe - UV-Vis, DAD (ou PDA) λ variable - Indirect I 0 Détecteur (PMT) I analyte tampon l 10

11 Principe: 4.0 Électrophorèse capillaire ÉC en solution libre Absorption moléculaire UV-Vis Détection direct - L analyte absorbe dans l UV-Vis - Le tampon de séparation doit être le plus transparent possible au λ de détection - La ligne de base doit donner un signal constant et nul, A ~ 0 - Lorsque l analyte passe dans la fenêtre de détection, il absorbe la lumière menant à une augmentation de l absorbance SIGNAL I 0 I 11

12 ÉC en solution libre Application: Détection directe des constituants d un comprimé d Aspirine Spectre UV-vis de l acide salicylic acid Spectre UV-vis de la vitamine C 12

13 ÉC en solution libre Dérivation : Réactif d Edman (phénylisothiocyanate) - réactif pour le séquençage de protéines - détection UV (267 nm) Anal. Chem. 64, 1396 (1992) 13

14 ÉC en solution libre Absorption moléculaire UV-Vis Détection indirect Principe: - Si l analyte n absorbe pas dans l UV-Vis - Un produit absorbant dans l UV-Vis est ajouté au tampon de séparation OU un tampon absorbant est utilisé - La ligne de base donne un signal constant non nul A 0 - Lorsque l analyte passe dans la fenêtre de détection, l absorbance diminue SIGNAL 14

15 ÉC en solution libre Application: Analyse d anions par détection indirecte Tampon: acide benzoïque 0.01 M, Tris à ph 8. Détection à 254 nm. Analytes: 1: chlorure; 2: chlorate; 3: fluorure; 4: acétate; 5: propionate; 6: MES. 15

16 4.0 ÉC ÉC en solution libre Application: Analyse de réactions enzymatiques: la conversion de sucres par la ALD et la FBPase. Le tampon contient de l acide sorbic qui absorbe fortement à la longueur d onde de détection (254 nm). En contre partie, les sucres de la réaction ne possèdent aucun chromophore et sont transparent dans l UV. Spectre UV de l acide sorbic ε (254nm) ~ M -1 cm -1 16

17 ÉC en solution libre Détecteur à barrettes de diodes (DAD) 17

18 Détection directe du tryptophane par absorption UV EC RP-HPLC Volume injecté 8,3 nl 20 µl Détection UV (280 nm) LD conc 9 µm 0,85 µm LD masse 75 fmol fmol 4.0 Électrophorèse capillaire ÉC en solution libre Détection: ÉC vs HPLC A = ε lc HPLC ÉC l est de l ordre des mm l est de l ordre des µm À concentrations identiques, l absorbance (i.e., signal) est fois plus faible en ÉC qu en HPLC CH 2 H C COO - + NH 3 H N LD calculé comme S/B=2 ÉC; capillaire: I.D.=50 µm, L T =70 cm, L D =50 cm; tampon: 50 mm phosphate, ph 8, V inj =10 kv, t inj =5 s, V sep =20 kv HPLC; I.D.=4.6 mm, L=10 cm, phase stationnaire: 3 µm ODS-Hypersil; phase mobile: 50 mm acétate d ammonium:meoh (250:30), ph 6, 1.2 ml/min 18

19 ÉC en solution libre Fluorescence Relation B-L pour la fluorescence : I f = 2,3ΦI 0 εcl I f = intensité de fluorescence Φ = rendement de fluorescence I I f (λ ém ) I f Φ = I I 0 I 0 = intensité de lumière incidente ε = absorptivité molaire (L.mol -1.cm -1 ) c = concentration d analyte (mol.l -1 ) l = chemin optique (cm) l Modes de détection - Direct - Indirect I 0 (λ ex ) 19

20 ÉC en solution libre Fluorescence Fluorescence induite par laser Source λ (nm) Puissance d'exitation Lampe W Lasers Kr-F mw He-Cd mw Ar mw 514,5 50 mw He-Ne 543,5 50 mw mw mw Diode mw 20

21 ÉC en solution libre Fluorescence induite par laser 21 Dérivées de fonctions amines pour analyse par fluorescence

22 ÉC en solution libre Application Chlorure de dansyl Détection en fluorescence λ ex : 350 nm λ em : 530 nm 22

23 ÉC en solution libre Séparation des dansyl-acides aminés (DNS-aa) Conditions Capillaire : 75µm i.d. x 100 cm L Tampon : 50 mm phosphate, ph 7 Séparation : 30 kv Détection : 350 nm (excitation); 530 nm (émission) Échantillon A : impureté; B : DNS-ε-lys; C : DNS-αDNS-ε-lys; D : DNS-leu; E : DNS-ser; F : DNS-gly; G et H : impuretés; I : DNS 2 -cys; J : DNS-glu; K : DNS-asp; L : DNS-cysteic acid 1 J.W. Jorgenson and K.D. Lukacs, Capillary Zone electrophoresis, Science. 222 (1983)

24 ÉC en solution libre Spectrométrie de masse (Electrospray, ESI) CHM Migneault 2971 H2006 CHM2971-C9 et 10 H

25 ÉC en solution libre Limite de détection 25

26 Électrophorèse capillaire en milieu micellaire (MEKC) Concept Ajout d un surfactant (agent tensioactif) audessus de sa CMC dans le tampon pour créer une phase «pseudo-stationnaire» dans le capillaire un mécanisme de partage est ajouté au mécanisme électrophorétique. Technique développé pour la séparation des analytes neutres Queue hydrophobe Tête hydrophile 26

27 MEKC La structure d un surfactant est constituée d une partie hydrophobe et d une partie hydrophile CMC : concentration micellaire critique au dessus de laquelle il faut travailler pour avoir formation de structures micellaires N : nombre d agrégation = nombre d unité de surfactants formant la micelle 27

28 MEKC Mécanisme de séparation: espèces neutres Micelle anionique: µ ep µ eo µ app,m Molécule neutre: µ ep = 0 µ app = (f)µ eo + (1-f)µ app,m anode + N N N µ mc N N N N N EOF [ A MC ] K = A + MC A-MC où [ A][ MC ] cathode N 1 N 2 µ app = f µ eof + (1 f ) µ A micelle N 2 plus hydrophobe que N 1 f µ N2 < f N1 app = 1+ 1 µ K[ MC] eof K[ MC] + µ 1+ K[ MC] A micelle 28

29 Application: 4.0 Électrophorèse capillaire MEKC La séparations de petites molécules neutres est possible puisqu elles possèdent chacune différentes affinités (K) avec la micelle. Le sudan III est un analyte très hydrophobe qui ne quitte pas l intérieur de la micelle. Il sert à déterminer le temps de migration moyen d une micelle (t MC ) t MC 29

30 MEKC Mécanisme de séparation: espèces chargées anode + µ mc N + + N + N + N N N EOF cathode [ A MC ] K = A + MC A-MC où [ A][ MC ] µ app f ( 1 = µ eof + µ A ( libre ) + µ A micelle f ) µ app = µ eof K [ MC ] µ A( libre ) K [ MC ] + µ micelle 1+ K [ MC ] 30

31 MEKC Application: Séparation de catéchols neutres et chargés 31

32 MEKC 0.4 Application: Séparation d isomères tyr-l-ala-gly-phe-met 0.3 Signal (mv) tyr-d-ala-gly-phe-met Migration Time (min) (50 mm borate, ph 9.0, 50 mm SDS, 14 kv) 32

33 Électrophorèse capillaire sur gel (CGE) Principe : séparation basé sur la taille des protéines ou oligonucléotides mécanisme de tamisage à travers un gel chimique ou un gel physique (réseau polymérique) application d un revêtement au capillaire pour masquer le flux électro-osmotique Gel chimique Gel physique 33

34 CGE Mécanisme de séparation: oligonucléotides ARN monocaténaire ARN bicaténaire Chaque base possède un charge nette négative provenant du lien PO 4-. Par conséquent, tous les brins, quelle que soit leur longueur auront la même charge sur masse (q/m). Il est impossible de les séparer par CZE. D où l utilité de la CGE. AGCCUACGACC UACGCA UCA q/m = -11/11 q/m = -6/6 q/m = -3/3 34

35 CGE CGE d oligonucléotides de 1k paires de base en utilisant un minimum de réticulation Application (1): séparation d oligonucléotides 35

36 CGE Application (2): séparation d oligonucléotides Capillaire avec revêtement PVA; Tampon : solution polymérique avec ou sans solvant organique; Injection: -10 kv x 7 s Séparation: -25 kv; Détection à 260 nm. 36

37 Mécanisme de séparation: protéines et peptides Contrairement aux oligonucléotides, les peptides et les protéines possèdent des groupements fonctionnels chargés variable (q/m variables) et une structure tertiaire rendant leur analyse par CGE impossible. Il est nécessaire de les dénaturer pour neutraliser les charges variables et développer leur structure compact. CGE Dénaturation de la protéine: Bris des liens S-S et ajout de [sel] Élongation de la séquence polypeptidique: Ajout d un surfactant tel le SDS 37

38 CGE Application : SDS-PAGE de protéines Mise au point d une échelle standard de masse moléculaire α-lactoglobulin (14,2 kda) anhydrase carbonique (29 kda) ovalbumine (45 kda) BSA (66 kda) phosphorylase B (97,4 kda) β-galactosidase (116 kda) myosin (205 kda) 38

39 Principe 4.0 Électrophorèse capillaire Focalisation isoélectrique capillaire (CIEF) 1- Le capillaire est équilibré et rempli avec du NaOH. 2- L ampholyte est introduit (1/3 du volume) 3- Puis l échantillon est injecté (~nl) 4- Puis l ampholyte encore (2/3 du volume) 5- Un V est appliquée avec H 3 PO 4 comme électrolyte d entrée produisant le gradient de ph instantané à travers l ampholyte 6- Au même moment, les analytes se mobilisent dans l ampholyte et deviennent stationnaire lorsqu ils atteignent ph=pi 7- La détection s effectue avec un flux hydrodynamique véhiculant l ensemble vers le détecteur. Ampholytes : composés zwitterioniques polyprotiques ou mélange de composés 39

40 CIEF Application : CIEF du plasma humain normal et du plasma humain affecté par un myélome; cancer des cellules plasmatiques Myélome IgG 40

41 4.0 Électrophorèse capillaire Isotachophorèse capillaire (CITP) Principe (CITP anionique) 1- Le capillaire est équilibré et rempli avec un tampon meneur contenant les ions les plus mobile du système 2- L échantillon est injecté 3- Un deuxième tampon contenant les ions les moins mobile du système est introduit 4- Une V est appliquée produisant la migration des analytes dans un gradient de E 5- La séparation a lieu dû aux différences de mobilité et de conductivité de chaque zone d analyte; le E dissemblable dans ces zone mène à une normalisation de leur v ep 6- La détection s effectue en même temps que la séparation. Modes de séparation sélectifs: anionique ou cationique Électrolyte de terminaison Électrolyte de terminaison électrophorèse à vitesse constante Capillaire non-traîté Échantillon Flux hydrodynamique Injection hydrodynamique Flux hydrodynamique Zones d analytes séparées Champ électrique Électrolyte meneur Électrolyte meneur Électrolyte meneur Électrolyte meneur

42 CITP Application 1 : CITP de de 17 ions métalliques avec détection électrochimique Identification : par la hauteur du signal (h α conductivité) Quantification : la largeur du plateau (L α concentration) h L 42

43 CITP 13 Application2 : CITP de ribonucléotites afin de tester des marqueurs de conductivités pour une identification sélective. Détection UVVis à 260 nm. Identification : temps de migration, ordre de sortie Quantification : hauteur du signal (h) h 43

44 CITP Technique de préconcentration (CITP-CZE) TRAILING LEADING 44

45 CITP Technique de préconcentration (CITP-CZE) Application 1: 45

46 Application 2: 4.0 Électrophorèse capillaire CITP Technique de préconcentration (CITP-CZE) 46

47 Principe: 4.0 Électrophorèse capillaire Électrochromatographie capillaire (CEC) Le capillaire de silice est garni d une phase stationnaire (phase HPLC). Aussi, la phase stationnaire peut être synthétisée (in situ) dans capillaire (monolithe). Ceci donne lieu à des séparation caractérisées par deux mécanismes: électromigration et partition. Les analytes se déplacent avec EOF, µ ep et affinité pour la phase stationnaire greffée. Par conséquent, il devient possible de séparer des analytes neutres Monolithe Capillaire PLOT 47

48 CEC Application 1: Séparation par CEC (phase inverse) de stéroïde (tipredane et structures connexes) 48

49 CEC Application 2: Séparation de peptides par CE-IEC. Deux mécanismes de séparations sont toujours en œuvre. L électromigration permet au analytes de se déplacer dans le capillaire et de se séparer selon leurs propriétés (q/m). L échange ionique permet le second mécanisme où l affinité des molécules pour la phase stationnaire mène à leur rétention différentielle. 49

50 Exercices recommandées Notes de cours WEB Harris 6 ème édition: ÉC : Chapitre 26, p. 674 Problems No. 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 31, 38 50

51 INTRA PROCHAIN COURS 22 FÉVRIER h30-10h20 À apporter: - crayons et efface - une calculatrice non-programmable - une règle millimétrique - votre tête en pleine forme La journée de l intra: - les notes de cours et l aide mémoire sont interdis - déposez le sac d école et le manteau à l avant de la classe - laissez un siège libre entre chaque étudiant 51