SV-221 TP-Biochimie Structurale

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1 SV-221 TP-Biochimie Structurale Fascicule de Travaux Pratiques Institut Supérieur de l Education et de la Formation Continue Radhouane Chakroun 1

2 Sommaire SV221 - TP N 1 - Glucides... 3 Dosage de l amidon total de l amylose et de l amylopectine... 3 SV221 - TP N 2 - Glucides... 8 Pouvoir Réducteur des Glucides

3 SV221 - TP N 1 - Glucides Dosage de l amidon total de l amylose et de l amylopectine Généralités L amidon est un polysaccharide de réserve chez les végétaux. C est une macromolécule constituée, en pourcentage variable, de deux polymères du D-Glucose : L'amylose et l'amylopectine. L amylose est constitué essentiellement d unités de D-glucoses unies entre elles par des liaisons de type α(1 4). L amylopectine consiste essentiellement en unités α(1 4)-D-glucosidiques linéaires mais branchée, par des liaisons de type α(1 6)-D-glucosidiques à tous les unités de glucose (Figure 1). L amylopectine contient plus de 106 résidus de D-glucose, la rendant ainsi la macromolécule biologique la plus volumineuse qui existe. La structure primaire de l amylopectine est semblable à celle du glycogène (polysaccharide de réserve chez les animaux) mais le nombre de résidus de D-glucose dans les ramifications est de l ordre de 8 à 12 dans le glycogène. En d autres termes le glycogène est plus ramifié que l amylopectine. Figure 1 - Structures de l amylose et de l amylopectine Principe L iode (I2) interagit avec l amylose et l amylopectine pour donner une coloration respectivement bleue et brune. Les spectres des complexes I 2 -amylose et I 2 -amylopectine sont différents. De ce fait ces complexes ont des longueurs d ondes maximales pour l amylose (λ max = 630 nm) et l amylopectine (λ max = 548 nm) qui sont différentes. En plus l amylose absorbe dans le proche visible tandis que l amylopectine n y absorbe pas (Figure 2). On peut donc utiliser cette différence spectrale pour doser simultanément l amidon total, l amylose et l amylopectine dans un matériel biologique. Dans cette 3

4 manipulation on considérera que l absorbance à 580 nm est liée à la fois à l amylose et à l amylopectine, par contre l absorbance à 720 nm est liée essentiellement à l amylose. Figure 2 - Absorbances de l amidon, de l amylose et de l amylopectine (Jarvis, 1993) Matériel et réactifs Spectrophotomètre UV-Vis Centrifugeuse Bain-marie à 100 C Plaques chauffantes Tubes à centrifuger Tubes à essais 20 ml gradués Fioles jaugées de classe A, capacité 100 ml Becher 250 ml Entonnoir Micropipettes Pipettes graduées Papier ph Eau distillée Réactif de l iode : 0,2g de I 2 dissous dans 100 ml de KI à 2% (m/v) dans HCl 0,1N Solution 1N de KOH Solution 1N de HCl 4

5 Mode opératoire Etalonnage : Dans un bécher 250 ml, disperser 0,5g d amidon dans 20 ml d eau distillée. Y ajouter 80 ml d eau distillée bouillante. Agiter légèrement le mélange et continuer l ébullition pendant 5 min sur une plaque chauffante pour obtenir une solution d amidon limpide. Refroidir le mélange, le transférer dans une fiole jaugée 100 ml et le compléter au trait de jauge avec l eau distillée. Ceci constitue une solution mère d amidon à 5 mg/ml. La courbe d étalonnage est établie selon le tableau cidessous (faire 3 mesures de l absorbance pour chaque tube) : N Tube Solution mère d amidon 5 mg /ml (ml) 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 H 2 O (ml) 4,90 4,89 4,88 4,87 4,86 4,85 4,84 4,83 4,82 4,81 4,80 Réactif I 2 /KI (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Calculer la concentration d amidon en mg/ml DO 1 à 580 nm (3 mesures) DO 2 à 720 nm (3 mesures) Incubation pendant 10 minutes Moyenne DO 1 Moyenne DO 2 Préparation de l échantillon à analyser : Prendre 0.1 g de farine de matériel biologique bien broyé (Ø= 0.5 mm) et y ajouter 5 ml de 1 N KOH. Bien homogénéiser la solution à la température ambiante et la neutraliser ensuite avec 5 ml de 1 N HCl. Bien s assurer que la solution est neutre à l aide d un papier ph. Mettre ensuite le mélange en ébullition au bain-marie pendant 15 min. Réajuster le volume du mélange à 10 ml. Centrifuger le mélange et prendre le surnageant. Filtrer au besoin le surnageant et l utiliser pour le dosage de l amidon. 5

6 Dosage de l amidon dans l échantillon: Préparer les tubes «blanc» et «échantillon» conformément au tableau ci-dessous (faire 3 mesures de l absorbance pour chaque tube) : Réactif / Echantillon BLANC Echantillon : Echantillon : Echantillon (ml) 0 0,05 0,05 H 2 O (ml) 4,90 4,85 4,85 Réactif I 2 /KI(ml) 0,1 0,1 0,1 Incubation pendant 10 minutes Moyenne DO (580 nm) Moyenne DO (720 nm) Résultats : A l aide des mesures réalisées, calculer les proportions d amidon total, d amylose et d amylopectine dans les échantillons. Donner une conclusion. 6

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8 SV221 - TP N 2 - Glucides Pouvoir Réducteur des Glucides Généralités Les glucides ou hydrates de carbone C n (H 2 O) n, sont des composés comportant de nombreux groupements hydroxyles (-OH) responsables de leur caractère très hydrophile. La présence de groupement carbonyle (-C = O), aldéhyde ou cétonique leur confère un caractère réducteur. Dans les formes cycliques des oses, ce sont les fonctions cétalique et hémiacétalique qui confèrent le caractère réducteur à ces glucides. Principe En milieu alcalin et à chaud, les oses et dans certaines conditions les polyholosides peuvent s oxyder et en même temps réduire des substances telles que les sels métalliques. On parle alors de pouvoir réducteur des sucres. Cette propriété, qui est due à la présence de fonction hémiacétalique libre, peut être mise en évidence par exemple grâce au réactif de Fehling qui est une solution alcaline d ions cuivreux de coloration bleue (les ions Cu +2 sont maintenus en solutions grâce au double 8

9 tartrate de Na + et K + ). Si la réaction est positive, on obtient un précipité rouge brique dont la quantité est proportionnelle à celle du sucre réducteur présent. La réaction en milieu basique se passe selon le schéma suivant : Si le sucre n est pas réducteur, la coloration reste bleue. Matériel et réactifs Bain-marie bouillant Agitateur VORTEX Tubes à essais Pipettes propipettes papier indicateur de ph Solution de soude à 10% Acide sulfurique concentré Solutions de glucose, fructose, ribose, saccharose et maltose à 1% Liqueur de Fehling : La liqueur de Fehling est obtenue en mélangeant deux solutions A et B (V:V) dont la composition est la suivante : Solution A : 35 g CuSO 4.5H 2 O + 5 ml H 2 SO 4 concentré + H 2 O compléter à 1L. Solution B : 150 g tartrate de K et Na ml NaOH + H2O compléter à 1L Mode opératoire Préparer 6 tubes à essai : mettez dans chaque tube 1 ml de la solution A puis 1 ml de la solution B. (A+B forment la liqueur de Fehling). Ajoutez au premier tube 2 ml d une solution de glucose, au deuxième 2 ml de la solution de ribose, au troisième 2 ml de la solution de fructose, au quatrième 2 ml de la solution de saccharose, au cinquième 2 ml de solution de maltose et au sixième 2 ml d eau distillée. Agiter pour bien mélanger le contenu des tubes Porter les tubes à ébullition pendant 3 min Observer et noter le résultat obtenu. 9

10 Pouvoir réducteur du produit d hydrolyse chimique du saccharose Mode opératoire Mettre 5 ml de saccharose dans un tube à essai. Ajouter 3 gouttes de H2SO4 concentré (sous la hotte). Agiter et porter à ébullition pendant 2 min. Le saccharose est ainsi hydrolysé. Ajouter 5 gouttes d une solution de soude à 10% jusqu à réaction nettement alcaline (utiliser papier indicateur de ph). Réaliser alors le test suivant : prendre deux tubes et les marquer 1 et 2. Dans le tube 1 mettre 2 ml de la solution de saccharose hydrolysé. Dans le tube 2 mettre 2 ml de la solution de saccharose non hydrolysé. Dans les deux tubes 1 et 2 ajouter 1 ml de la solution A + 1 ml de la solution B. Agiter et porter les deux tubes au bain marie bouillant pendant 3 min. Résultats Observer la coloration obtenue dans chaque tube. Comparer et justifier la différence des résultats obtenus avec les tubes 1, 2, 3, 4, 5 et 6 dans la manip précédente. Comparer et justifier les résultats obtenus avant et après l hydrolyse chimique du saccharose. 10