GENETIQUE MEDICALE- Anomalies génétiques à l'échelle du gène : mutations et polymorphismes

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1 31/10/2013 ROZALEN William L2 Génétique médicale M. KRAHN 8 pages Anomalies génétiques à l'échelle du gène : mutations et polymorphismes Plan A. Introduction / Rappels B. Microlésions du génome I. Types de lésions II. Mécanismes de survenue des lésions III. Conséquences des lésions IV. Lésions du génome entre microlésions et macrolésions C. Interprétation de données mutationnelles I. La consultation de bases de données II. Interprétation de données mutationnelles A. Introduction / Rappels Le professeur est passé très vite sur cette partie, qui est de toute façon une répétition du cours précédent. La démarche d'analyse s'inscrit dans une stratégie diagnostique. Cette stratégie conduit à la réalisation d'examens qui permettent l identification de variations génomiques de séquence, et l objectif est d'identifier l'effet de ces variations : si elles ont un effet pathogène ou si elles sont de simples polymorphismes. La mutation désigne n importe quel changement intervenu dans la séquence de l ADN, sans préjuger de sa pathogénicité, à l échelle du gène ou du chromosome. On parle aussi de «VARIANTS». Les mutations sont le moteur de l'évolution, la source de la diversité entre individus et sont à l'origine des maladies génétiques monogéniques et des prédispositions (maladies polyfactorielles). Cela dépend de l'effet fonctionnel de la mutation, qui peut : être neutre «améliorer une fonction» : participant à la diversité et l'évolution «altérer une fonction» : ayant alors un effet pathogène. Un polymorphisme est une mutation et peut se situer en région codante ou non codante. Le polymorphisme repose à la fois sur le caractère non pathogène de la variation et la fréquence dans la population (>1% par définition). Les 3 principaux polymorphismes pour l'interprétation et l'utilisation en routine sont : les SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) : polymorphismes de substitution au niveau d'un nucléotide (variation de séquence ponctuelle), très nombreux : on en dénombre plus de 10^7 par génome soit 1 tous les 300 pb. Leur répartition n'est pas homogène : les différentes régions chromosomiques sont plus ou moins riches en SNP. Copy Number Variation (CNV) : variation du nombre d'exemplaires contigus de grands segments génomiques (quelques kb à plusieurs Mb) à locus génomique donné. En effet, à un locus génomique 1/8

2 donné, normalement le gène est présent en 2 copies (une du père, une de la mère) mais on s'est rendu compte que certains segments génomiques peuvent être amplifiés. Par exemple : hériter d'une seule copie du père, mais 2 ou 3 copies de la mère. Les niveaux d'expression de ces gènes pourront alors être différents. Ce mécanisme peut avoir des effets pathogènes. Les polymorphismes de répétition sont des séquences répétées de nombreuses fois. Ce sont des motifs de longueur variable, de quelques pb à plusieurs centaines de pb (en fonction de la taille, on distingue microsatellites, minisatellites, satellites, mégasatellites). Les minisatellites sont les plus importants. Ils sont généralement composés de motifs «CA» (Cytosine-Adénine). La répétition de ce motif «CA» est variable d'un individu à l'autre. Chaque microsatellite a un emplacement unique par individu. Cette grande variabilité des microsatellites fait qu'ils sont utilisés dans le diagnostic indirect, qui via la variabilité des répétitions de microsatellites situés à proximité de gènes permet de suivre la transmission de mutations dans une famille. Les microsatellites permettent l identification des individus dans les enquêtes de police ou les études de paternité. On distingue également d'autres polymorphismes (comme les RFLP...) Les lésions du génome sont classées notamment en fonction de la taille : Les macrolésions à l'échelle du chromosome Les microlésions à l'échelle du gène Les anomalies de taille intermédiaire B. Microlésions du génome I. Types de lésions Les anomalies à l'échelle du gène sont principalement : les substitutions, soit le remplacement d'une base les insertions ou délétions de 1 ou quelques nucléotides les insertions et/ou délétions de quelques dizaines à centaines de nucléotides On peut aussi retrouver à l'échelle du gène des inversions de séquence, ou des amplifications de triplets. Le terme mutation ponctuelle concerne un ou quelques nucléotides. Il est souvent confondu avec la substitution, mais il concerne aussi les insertions ou délétions de un ou quelques nucléotides. Les anomalies à l'échelle du gène peuvent être constitutionnelles : ce sont les anomalies survenues avant la fécondation (de novo ou transmises de génération en génération) ou lors des premières divisions du zygote (de novo). Elles peuvent être responsables de maladies génétiques monogéniques. On peut être confronté à des mutations en mosaïque, où le phénotype est moins sévère. Les anomalies à l'échelle du gène peuvent être acquises : anomalies apparues au cours de la vie et ne touchant qu'un seul ou quelques tissus (de novo). Elles peuvent être à l'origine de la formation de cellules tumorales voire de cancer. II. Mécanismes de survenue des microlésions Les substitutions sont le remplacement d'une base (donc une mutation ponctuelle). Elles représentent 70% des mutations et les causes peuvent être : exogènes physiques ou chimiques (mutagènes) endogènes physiques ou chimiques, anomalies des systèmes de réplication et réparation de l'adn. Ce sont les transitions ou transversions. La transition est la substitution d'une base pyrimidique (C ou T) par une base pyrimidique, ou d'une base purique (A ou G) par une base purique, tandis que la transversion est la substitution d'une base purique par une base pyrimidique et inversement. 2/8

3 Ces mutations peuvent survenir dans des hotspots mutationnels, qui permettent l'étude via des techniques ciblées de ces régions. On voit un alignement de séquences obtenues sous forme de chromatogramme. On note des pics de couleurs différentes. L'alignement par rapport à la séquence de référence permet d'identifier les discordances éventuelles. On note un double pic, qui est une variation de séquence de type hétérozygote. Le séquençage s'effectue après amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) de la région d'intérêt, dans la mesure ou l'adn est généralement prélevé en quantité trop faible. La PCR amplifie exons par exons. L'échantillon d'adn du patient est constitué du patrimoine du père et de la mère. Donc pour un gène donné, il y a théoriquement (hors CNV) une copie du gène donnée par parent. La PCR permet d'amplifier de manière simultanée la région d'intérêt héritée de la mère et celle héritée du père. On obtient un mélange d'amplification et on séquence ce mélange réactionnel. Lorsque la séquence est identique sur les 2 copies, elle est homogène et est comparée à la séquence de référence à la recherche de variation. Si il y a mutation sur une des copies, il y aura une discordance lors du séquençage du mélange réactionnel. Ainsi, on obtiendra un signal superposé, dit de «double pic», caractéristique de la mutation hétérozygote. La variation n'est pas forcément pathogène, cela peut être un polymorphisme de type SNP. Si le père et la mère sont porteurs de la même mutation au même endroit (ce qui détermine le statut homozygote), le mélange réactionnel montrera 2 pics superposés (puisque il y a la même variation) et on aura donc non pas un double pic mais un pic simple. La comparaison à la séquence de référence permettra alors de signer une substitution homozygote. Dans les maladies dominantes, il suffit d'une seule mutation pour être atteint et on a donc le plus souvent affaire à un gène hétérozygote. Dans le cadre des maladies récessives, il faut être porteur de 2 mutations dans le même gène pour être atteint : On identifie alors 2 cas : soit c'est la même mutation (au même endroit) héritée du père et de la mère, appelée mutation homozygote (souvent observée dans les cas de consanguinité), soit l'individu est porteur de 2 mutations différentes (délétères) dans le même gène : cela signe le statut hétérozygote composite. 3/8

4 En plus des substitutions, des insertions et/ou délétions de 1 ou quelques nucléotides peuvent survenir, notamment par mécanisme de «slippage» (au niveau de courtes répétitions) de l'adn Polymérase lors de la réplication. Lors d'une insertion ou délétion, il y a décalage de la séquence, ce qui provoque une superposition de pics : III. Conséquences des lésions En cas de perte de fonction, l'effet délétère est dû à la diminution ou l'abolition de production de la protéine active. En cas de gain de fonction, l'effet délétère est dû à un gain de fonction de la protéine mutée, impliquant l'acquisition d'une nouvelle fonction délétère. Les conséquences fonctionnelles des microlésions (qu'elles concernent une perte ou un gain de fonction) dépendent notamment de la localisation des microlésions, et du type de microlésion. Conséquences des microlésions en fonction de leur localisation : L'information génétique pour la synthèse des protéines («séquence codante») est contenue dans les exons (NB : certains exons sont non-codants). On note l'existence de séquences régulatrices : elles jouent un rôle dans la régulation de la transcription, de la maturation de l'arnm (notamment par l'épissage) de la stabilité de l'arnm, etc.. (NB : les séquences régulatrices peuvent être en région codante ou non-codante.) Ainsi, la séquence codante comporte donc deux niveaux d'information : Elle détermine la séquence en acides aminés de la protéine codée La séquence nucléotidique comporte aussi des séquences régulatrices (notamment impliquées dans l'épissage). Une mutation en séquence régulatrice peut conduire à un épissage aberrant ; par exemple perte de un ou quelques exons qui déstabilisent l'arnm et donc absence de synthèse protéique (très souvent délétère) L'effet délétère peut se situer au niveau protéique ou de l'arnm. La conséquence des substitutions dépend de l'effet induit par la modification du codon concerné : la mutation faux sens : le codon muté code un autre acide aminé la mutation non sens : la mutation conduit à la formation d'un codon stop 4/8

5 la mutation isosémantique : le codon muté code pour le même acide aminé (NB : le code génétique est «dégénéré» : plusieurs codons peuvent coder pour un même acide aminé). La mutation faux sens n'est pas toujours responsable d'un effet pathogène ; la modification d'acide aminé au niveau de la protéine peut être tolérée par la cellule sans conséquence délétère. Elle peut entraîner une perte ou un gain de fonction. L'effet peut être délétère sur l'arnm ou sur la protéine. Exemple : synthèse d'une protéine dont un domaine fonctionnel a été altéré (Altération d'un site catalytique, ou abolition d'un site d'interaction protéique, ou abolition d'une séquence d'adressage, etc.) La mutation non-sens conduit à la formation d'un codon stop. (Cas particulier : un codon stop naturel peut être muté et coder pour un acide aminé. Par exemple : TAG (STOP) est muté en TAT (Tyr), ce qui provoque une extension de la protéine). Ces mutations sont généralement pathogènes, par perte ou gain de fonction. Leur effet est délétère sur l'arnm ou sur la protéine. Exemple : synthèse d'une protéine tronquée, instable ou dégradée. Lorsque la mutation est isosémantique, le codon muté code pour le même acide aminé. Il n'y a aucun effet sur la séquence de la protéine. Cependant, des effets délétères éventuels peuvent apparaître si la mutation survient sur une séquence responsable d'épissage. La conséquence des insertions et/ou délétions de nucléotides dépend de la conséquence sur le cadre de lecture. 2 situations sont possibles : les délétions ou insertions de multiples de 3 nucléotides Il n'y pas de décalage du cadre de lecture, mais perte ou gain d'acides aminés. L'acide aminé de jonction peut éventuellement changer. Le retentissement fonctionnel est variable. Exemple : Insertion de 3 nucléotides (soit un acide aminé) Selon la localisation au niveau de la protéine, l'insertion du nouvel acide aminé peut être «tolérée» ou délétère (par inactivation du domaine fonctionnel etc...) Exemple 2 : Délétion de 6 nucléotides (soit 2 acides aminés) Selon la localisation au niveau de la protéine, la perte des 2 acides aminés peut être «tolérée» ou délétère (par inactivation d'un domaine fonctionnel etc.) NB : la délétion ou insertion peut être à cheval sur plusieurs codons. 5/8

6 Les délétions ou insertions de non-multiples de 3 nucléotides Elles provoquent un décalage du cadre de lecture et très fréquemment la survenue prématurée d'un codon stop. Elles peuvent avoir un retentissement fonctionnel sévère. La survenue prématurée d'un codon stop a donc un effet semblable à l'effet des mutations non-sens : les mutations sont généralement pathogènes, par perte ou gain de fonction et l'effet délétère peut concerner l'arnm ou la protéine. Exemple : synthèse d'une protéine tronquée, instable ou dégradée, etc... Les microlésions en séquence non codante sont moins identifiées et plus difficiles d'interprétation. Elles peuvent être de type substitution ou délétion/insertions. Elles peuvent causer une altération de séquence régulatrice : par effet sur la régulation de la transcription (Promoteur, Enhancers, Silencers...) par altération de la maturation de l'arnm (surtout via l'épissage) par altération de la stabilité de l'arnm et sa destruction L'effet délétère peut se situer au niveau de l'arnm (effet direct quantitatif ou qualitatif) ou au niveau protéique (effet indirect quantitatif ou qualitatif) Mutations de sites d'épissage Le phénomène d'épissage fait intervenir tout un complexe de protéines : le spliceosome, qui coordonne de manière efficace l'élimination des séquences introniques. L'épissage fait intervenir les sites donneur, de branchement et accepteur ainsi que les sites de reconnaissance des facteurs d'épissage. La mutation peut conduire à l'abolition de l'activité des sites canoniques (par exemple inactivation d'un site donneur) et/ou activation de sites cryptiques ou alternatifs d'épissage. Elle peut provoquer la création d'un nouveau site donneur d'épissage, plus actif que le site normal, donc l'épissage se ferait au mauvais endroit et pourrait causer la perte d'un exon. En conséquence, il y aura des effets délétères sur l'épissage normal, tels que : - Délétion partielle ou complète de la séquence d'un exon - Insertions de séquences introniques (Délétion et insertion précédemment évoquées provoquent souvent décalage du cadre de lecture) - Effet délétère sur l'arnm et/ou la protéine codée (NMD (Nonsense Mediated Decay ou dégradation des ARNm non sens), protéine tronquée ou déstabilisée/dégradée). Les lésions de taille intermédiaires touchent un ou plusieurs exons. Certains gènes sont plus sensibles en fonction de leur séquence à la perte de plusieurs exons. Ex : La myopathie de Duchenne, qui est le plus souvent causée par la perte ou le gain d'exons entier sur le gène de la dystrophine. Cela peut entraîner un décalage du cadre de lecture. Un codon stop entraîne un arrêt prématuré de la traduction. 6/8

7 C. Interprétation de données mutationnelles Les différentes techniques d'analyse nous permettent d'identifier des variations de séquence par comparaison à la séquence de référence (que l'on peut obtenir sur des bases de données telles que UCSC Genome Browser ou le serveur Ensembl). Il y a une nomenclature officielle HGVS ( Human Genome Variaton Society ), internationale qui permet de nommer précisément ces variations de séquence, ce qui est primordial. Exemple : «c.3112c>t (p.arg1038x) HTZ» signifie qu'il y a remplacement d'un C par un T en position 3112, ce qui causerait le remplacement d'une arginine par un codon stop en 1038 de la séquence protéique. Autre exemple : «c.965t>c (p.leu322pro) HTZ» On se demande alors si la mutation est délétère ou si c'est simplement une variation de séquence non pathogène. Il y a alors 2 situations : la variation de séquence est connue (permettant la consultation de base de données) Dans ce cas, soit le caractère délétère est confirmé au préalable chez d'autres patients et il s'agit d'une mutation constitutionnelle délétère, soit cette variation de séquence est présente sans effets pathologiques dans la population générale et c'est alors un polymorphisme. La variation de séquence n'est pas connue. La situation est plus complexe ; il faut rassembler de nombreuses informations pour conclure au caractère pathogène. I. La consultation de bases de données Il existe 2 types de database : les bases de données «locus-spécifiques», entretenues par des spécialistes de gènes, et comportent des infos très précises sur les gènes. Le listing est disponible sur le site HGVS. Bases de données «centrales/globales» qui sont des répertoires de séquences et/ou de mutations. Notamment par exemple, Human Gene Mutation Database (HGMD) qui cherche à recueillir toutes les mutations délétères de tous les gènes reconnus pour être pathogènes. Cependant, les informations seront moins précises. On peut citer : HGMD, SNP database, UCSC Genome Browser, Ensembl. Exemples : Le gène de la dysferline est impliqué dans certaines formes de myopathies. Des bases de données répertorient ce gène. Si des mutations ont été décrites, les bases de données donnent des infos sur les autres patients chez qui elle a été identifiée. II. Interprétation de données mutationnelles Certains éléments simples peuvent conclure au caractère pathogène ou non de la variation de séquence non connue au préalable : La nature de la mutation (non-sens, décalage du cadre de lecture, épissage, faux-sens, mutation isosémantique...). Les mutations non-sens ou responsables du décalage du cadre de lecture (faisant apparaître un codon stop prématuré) permettent de prédire un caractère délétère de façon quasi certaine. Cependant, il y a un phénomène de pollution des bases de données par des mutations délétères (hétérozygotes). Étude de la ségrégation de la variation de séquence à l intérieur de la famille. Par exemple : dans une fratrie de 3 individus : 2 sont atteints. Si la mutation est retrouvée chez les 2 atteints et pas sains, on peut conclure à un effet délétère direct, si on la retrouve chez les individus sains et atteints, on ne peut pas réellement conclure. 7/8

8 Recherche de la variation dans une population de témoins sains : par exemple si on découvre une mutation non répertoriée dans les bases de données, si l'individu est issu d'une ethnie particulière ; on peut rechercher la variation dans une population de témoins sains. L'absence de la mutation est en faveur du caractère délétère, la présence de cette mutation indique un polymorphisme probable. Études fonctionnelles: transcriptionnelles (RT-PCR...), protéiques (Western-blot, immunohistochimie), etc. Elles sont plus difficiles (dans le cadre de la routine), parfois plutôt dans le domaine de la recherche. Modélisation bioinformatique. Il existe de plus en plus d'algorithmes de modélisation qui cherchent à prédire l'effet délétère ou non des variations de fréquence. Par exemple, des sites internet où on rentre les séquences normale et mutée pour calculer si il peut y avoir un effet sur l'épissage normal ou l'arnm (dégradation). Il existe des algorithmes qui analysent la conservation du nucléotide impliqué (et de l'acide aminé correspondant) au cours de l'évolution (intéressant surtout pour variants faux sens, mutations isosémantiques, séquences introniques: si le variant est conservé, cela signifie qu'il est important (puisque maintenu par pression évolutive), donc une variation est susceptible d'être délétère. Si l'élément n'est pas conservé, il est moins important et une variation est possible sans effet majeur. La modélisation bioinformatique permet aussi une analyse au niveau de la protéine (domaines fonctionnels, protéine tronquée...) Cette liste n'est bien sûr pas exhaustive. L'identification d'une variation soulève la question de sa pathogénicité. En pratique, on procède à plusieurs étapes : 1- Description précise du variant par la nomenclature HGVS. 2- Vérifier si la variation de séquence a déjà été rapportée : consultation de bases de données locus-spécifiques et données de SNP. La variation est décrite comme mutation délétère ou polymorphisme dans la database, permettant de conclure. 3- Si la variation n'a pas été rapportée au préalable, on analyse le caractère délétère par une démarche d'interprétation (nature de la mutation, cohorte de témoins, étude familiale, modélisation bioinformatique). On pourra alors tenter de conclure sur le caractère délétère ou orienter pour les études complémentaires. Le séquençage à haut débit a des limites. Le séquençage du génome d'un individu permet l'identification de variants nouveaux (jamais décrits dans les bases de données) par génomes qu'il faudra interpréter. Le séquençage d'un exome (la totalité des exons d'un génome) révèle variants, dont 500 variants nouveaux, jamais décrits. Il faudra déterminer lequel est impliqué dans la pathologie du patient. En moyenne, nous sommes tous (individus sains) porteurs de mutations faux-sens, mutations non-sens, mutations synonymes, mutations de site d'épissage et au total environ mutations en séquence codante. Cela cause des problèmes d'interprétation, à cause de la masse d'informations à traiter. Le projet 1000 génomes est aujourd'hui continu par divers projets (dont un projet chinois de séquençage de d'individus). Ces projets révèlent par génome : 2500 variants non synonymes touchant des régions conservées (dont 20 à 40 probablement pathogènes, dont 2 à 5 rares) 150 variants à effet de «perte de fonction» (mutations non sens, décalage du cadre de lecture, sites d'épissage, dont 10 à 20 «rares») 1 à 2 variants décrits au préalable dans des cancers. 8/8