La fluorescence des végétaux

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1 La fluorescence des végétaux Définition de la fluorescence La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par l excitation d une molécule, généralement par absorption d un photon. Ce signal optique donne des informations différentes selon les conditions de mesures : température, viscosité, concentration Lorsqu une molécule fluorescente, un fluorophore, absorbe un photon, un électron est transféré vers une orbitale moléculaire d énergie supérieure. La molécule passe de l état fondamental à l état excité, instable, d énergie supérieure. L'énergie accumulée est libérée lors du retour à l'état fondamental de la molécule. Trois voies de libération de cette énergie existent, en plus d'un dégagement de chaleur : un phénomène de fluorescence, mesuré avec le Multiplex, la transmission de l'état d'excitation, la conversion de l'énergie : modification de la structure chimique du pigment ou d'une molécule voisine. Figure 1 : Diagramme énergétique de Jablonski présentant les phénomènes d excitation d un fluorophore et de fluorescence, et leurs temps de vie L efficacité de la fluorescence d une molécule donnée est déterminée par son rendement quantique. Le rendement quantique de fluorescence se définit comme le rapport du nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés. Il peut varier en fonction des conditions environnementales des fluorophores. Toute molécule fluorescente est caractérisée par un spectre d excitation et un spectre d émission : Le spectre d excitation représente l efficacité de certaines longueurs d onde d excitation à provoquer la fluorescence. Il est généralement similaire au spectre d absorption de la molécule Le spectre d émission représente les photons émis après excitation à une longueur d onde. Ces spectres varient en fonction de la structure chimique des molécules fluorescentes et leurs conditions environnementales 1

2 La fluorescence d une feuille Sous lumière UV, les feuilles émettent naturellement une fluorescence dans le visible. Deux types de fluorescences sont observés : Fluorescence rouge ( nm) : résulte de la chlorophylle présente dans les chloroplastes dans le mésophylle Fluorescence bleu-verte ( nm) : provient d une grande quantité de molécules, en particulier des composés phénoliques des parois des cellules Cuticule Epiderme supérieur Parenchyme palissadique Parenchyme spongieux Epiderme inférieur a Figure 2 : Photographies d une coupe transversale de feuille de vigne dans le visible (a) et sous UV (b) b La fluorescence chlorophyllienne La chlorophylle est un pigment photosynthétique présent sous deux formes : la chlorophylle a et la chlorophylle b. La fluorescence rouge provient de ces deux formes, et est nommée fluorescence chlorophyllienne. La chlorophylle b transfère in vivo toute l'énergie lumineuse qu'elle a absorbée à la chlorophylle a. Le rendement quantique de la fluorescence chlorophyllienne varie en fonction de la lumière interceptée par la feuille. En effet, si une feuille adaptée à l obscurité est illuminée, son rendement quantique initialement au niveau minimal F0 augmente jusqu à un niveau maximal Fm puis diminue jusqu à un niveau stationnaire Fs (figure 3). Ce phénomène appelé fluorescence variable est utilisée pour estimer l efficacité de la photosynthèse. Figure 3: Schéma du devenir d un rayon lumineux traversant une feuille 2

3 La fluorescence bleu-verte Figure 3 : Cinétique d induction de la fluorescence variable de la chlorophylle sur une feuille La fluorescence bleue verte provient majoritairement des composés phénoliques, des métabolites secondaires avec des multiples fonctions telles que la protection contre les UV, les agents pathogènes des maladies, un effet dissuasif contre les herbivores, un effet antioxydant et un support structurant des tissus cellulaires. Cette fluorescence est beaucoup plus hétérogène que la fluorescence de la chlorophylle. La localisation diverse des fluorophores dans les différents compartiments cellulaires et tissus contribue à cette variabilité. Trois types de composés phénoliques sont importants pour la fluorescence : les acides hydroxycinnamiques (HCA), des précurseurs des alcools monomères de la lignine. Ils limitent la digestibilité des fourrages les stilbènes, comme le resvératrol, des phytoalexines impliquées dans la défense des feuilles de vigne vis-à-vis des maladies les flavonoïdes dont les flavanones, flavonols, flavanols, flavones. Les anthocyanes font partie des flavonoïdes par leur voie de synthèse, mais ne sont pas des fluorophores. Les flavonoïdes s accumulent majoritairement sous forme glycosides dans les vacuoles de l épiderme ou sous forme méthylée dans les cires de la cuticule Figure 4 : Schéma d une partie de la synthèse des principaux composés phénoliques responsables de la fluorescence bleue verte Le Multiplex 3, un fluorimètre portable UV-Visible L appareil Le principe de fonctionnement du Multiplex est basé sur la mesure de la fluorescence de la chlorophylle. Cette technique fonctionne sur les feuilles et les fruits, en utilisant les UV pour détecter les flavonols (FLAV) ou la lumière du visible pour les anthocyanes (ANTH). 3

4 Le Multiplex est équipé de 6 LED lumineuses excitatrices : 3 LED à 385 nm UV-A (UV), 3 LED dans le Rouge-Bleu-Vert (RGB) à 470 nm (bleu, B), 516 nm (vert, G) et 625 nm (rouge, R). Le Multiplex est également équipé de 3 détecteurs de fluorescence, des photodiodes : jaune (YF), rouge (RF) et proche infrarouge (FRF). Lors d une acquisition, le Multiplex fournit 12 signaux individuels : 4 excitations x 3 émissions. Par exemple, le signal FRF_R (Far Red Fluorescence) correspond à la fluorescence chlorophyllienne mesurée dans l infrarouge sous excitation rouge. Les indices Multiplex Figure 5 : Détail des diodes émettrices et des détecteurs du Multiplex Indices Multiplex FRF_R SFR_R FLAV NBI ANTH FERARI Définition Densité foliaire Chlorophylle ou photosynthèse potentielle Flavonols ou protection potentiel Statut azoté Anthocyanes Cépages concentrés Anthocyanes Cépages peu concentrés Signaux utilisés FRF_R Mesure de la chlorophylle Le chevauchement des spectres d absorption et d émission de la chlorophylle induit une réabsorption de la fluorescence chlorophyllienne par la chlorophylle elle-même. La fluorescence chlorophyllienne dans le rouge est plus réabsorbée que celle émise dans le proche infrarouge. La fluorescence chlorophyllienne mesurée dans le proche infrarouge d une feuille provient donc des couches plus profondes. Le SFR (Simple Fluorescence Ratio) est directement lié à la teneur en chlorophylle de l échantillon. Il correspond au ratio de la fluorescence chlorophyllienne mesurée dans l infrarouge (FRF) (Figure 6) sur la fluorescence chlorophyllienne mesurée dans le rouge (RF) quelle que soit l excitation dans le visible. 4

5 Figure 6 : Spectre d absorption et d émission de la chlorophylle et spectre d absorption des polyphénols de l épiderme sous différentes lumières L effet d écran des flavonols sur la chlorophylle Les flavonols s accumulent dans la cuticule ou dans les vacuoles des cellules épidermiques. Leur localisation est responsable de l effet d écran des flavonols sur la fluorescence chlorophyllienne. Une première longueur d onde de référence non absorbée par les flavonols de l épiderme pénètre jusqu à la chlorophylle (Figure 7) : une quantité de fluorescence rouge de la chlorophylle est ainsi mesurée (FRF_R). Une seconde longueur d onde spécifique aux flavonols dans l UV (385 nm) est ensuite envoyée à travers l épiderme jusqu à la chlorophylle. Une partie est absorbée par les flavonols et le reste génère de la fluorescence rouge chlorophyllienne (FRF_UV). La teneur en flavonols des feuilles est obtenue par comparaison entre les deux quantités de fluorescence mesurées. Excitation rouge Fluorescence chlorophyllienne Excitation UV Fluorescence chlorophyllienne Mésophylle : localisation de la chlorophylle Epiderme supérieur : localisation des flavonols Figure 7 : Coupe transversale d une feuille de tabac excitée dans le rouge et dans l UV Epiderme inférieur : localisation des flavonols L effet d écran des anthocyanes sur la chlorophylle Selon le même principe que l effet d écran des flavonols sur la chlorophylle, la présence d anthocyanes dans les vacuoles des cellules épidermiques modifie l intensité de la fluorescence chlorophyllienne. Une première longueur d onde de référence à 625 nm pénètre jusqu à la chlorophylle. Cette longueur d onde n est pas absorbée par les polyphénols de l épiderme. La quantité de fluorescence rouge de la chlorophylle est alors mesurée (FRF_R). Une seconde longueur d onde verte à 516 nm, spécifique aux anthocyanes permet de les mesurer dans la pellicule. Une partie est absorbée par les anthocyanes et le reste génère de la fluorescence rouge chlorophyllienne (FRF_G). La comparaison des intensités de fluorescence mesurées permet de quantifier les anthocyanes de la pellicule des raisins. 5

6 Références bibliographiques - Ben Ghozlen, N., Cerovic, Z. G., Germain, C., Toutain, S. et Latouche, G. (2010). Sensors, 10, Cartelat, A., Cerovic, Z.G., Goulas, Y., Meyer, S., Lelarge, C., Prioul, J.-L., Barbottin, A., Jeuffroy, M.-H., Gate, P., Agati, G., Moya, I. (2005). Field Crops Res. 91, Cerovic, Z. G., Sanson, G., Morales, F., Tremblay, N. et Moya, I. (1999). Agronomie 19, Cerovic, Z. G., Moise, N., Agati, G., Latouche, G. Ben Ghozlen, N. et Meyer, S. (2008). Journal of food Composition and Analysis 21, Cerovic, Z. G., Goutouly, J-P., Hilbert, G., Destrac-Irvine, A., Martinon, V. et Moise, N. (2009). Fruitic Conception, Chile, Goulas, Y., Cerovic, Z. G., Cartelat, A. et Moya, I. (2004). Applied Optics, 43, Tremblay, N., Zhijie, W. et Cerovic, Z. G. (2012). Agron. Sustain. Dev. 32,