GÉNÉTIQUE TRAVAUX PRATIQUES

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1 Université IBN ZOHR Faculté des Sciences Département de Biologie Filière : Sciences de la Vie Semestre 3 Module de Génétique Microbiologie M12- GÉNÉTIQUE TRAVAUX PRATIQUES Année universitaire :

2 GÉNÉRALITÉS L objectif des travaux pratique de génétique est de vous familiariser avec les matériaux et les méthodes les plus courantes dans ce domaine. Afin de participer à ces séances d une manière rentable et efficace chaque étudiant doit se munir de : - Une blouse blanche ; - Une machine à calculer individuelle ; - Et de tout matériel spécifique à certaines séances réclamé par voie d affichage. De plus, il est absolument nécessaire d être familier avec la manipulation d outils et de techniques dont les plus importantes sont : - Le microscope optique et la loupe binoculaire ; - L ensemencement bactériologique ; - La machine à calculer ; - La rédaction d un compte rendu. Enfin nous vous rappelons : - Qu il est strictement interdit de changer de groupe sans l avis au préalable du responsable ; - Qu il faut arriver à l heure ; - Que toute absence doit être justifiée (voir guide de l Etudiants). I- LE MICROSCOPE PHOTONIQUE a- Conseils généraux : Le microscope optique est un instrument de précision, il est conseillé de : - le manipuler avec soin en évitant les chocs et les mouvements brusques (le porter pour le déplacer et ne jamais le pousser ou le tirer) ; - Eviter de l exposer aux rayons directs du soleil ou à la poussière ; - Ne jamais tourner en sens contraire les deux vis de mis au point ; - Nettoyer les lentilles avec un papier absorbant pour enlever les traces grasses ou les empreintes digitales. b- La mise au point : Il faut toujours : - Vérifier que l objectif dont la valeur numérique est la plus faible (x10) est au dessus de la préparation. - Abaisser la platine à son point le plus bas en tournant la vis macro métrique. - Placer votre préparation sur la platine. - Fermer le diaphragme pour avoir le minimum d intensité lumineuse. - Regarder dans les oculaires, les régler à ces yeux puis remonter la platine à l aide de la vis macro métrique jusqu à apparition d une seule image. - Ajuster l image en tournant la vis micro métrique dans un sens ou dans l autre. c- Le grossissement : - Tourner le revolver à objectifs pour changer de grossissement (x40). - Ajuster l image en tournant uniquement la vis micrométrique. 2

3 d- L éclairage : Un diaphragme à iris est placé sous la platine. Il permet de régler l intensité lumineuse qui éclaire la préparation. Pour faire varier l éclairage, commence par l intensité lumineuse la plus faible (diaphragme fermé). e- Fin de séance - Baisser la platine ; - Retirer la préparation (lame et lamelles à mettre dans un bac à savon) ; - Mettre le petit objectif dans l axe optique ; - Eteindre le microscope et débrancher la prise électrique ; - Mettre la house sur le microscope ; - Nettoyer votre paillasse (tout déchets sur la paillasse et par terre dans la poubelle). II- L ENSEMENCEMENT BACTÉRIOLOGIQUE Le but des méthodes d ensemencement bactériologique est de transférer une culture d organismes microscopiques au milieu neuf. Cependant, il est à rappeler que pour manipuler des cultures pures, des précautions spéciales sont à prendre afin d éviter toute contamination par les micro-organismes environnants. Il est recommandé : - Eviter de parler pendant l ensemencement ; - Laisser les tubes ou les boites de pétri ouvertes le moins longtemps possible ; - Stériliser les instruments avant et après chaque emploi. Pour cela, on passe le goulot des tubes et l anse d ensemencement ou la pince à la flamme ; - Laver les mains très soigneusement en gardant les ongles courts ; - Désinfecter la table de travail avant et après chaque manipulation. III- LE COMPTE RENDU DU TP Au début de chaque séance de TP une question vous sera posée concernant le thème de la séance en cours (cours, TD et TP). Au cours d une séance de travaux pratique, vous êtes appelés à réaliser des manipulations selon un mode préparatoire bien déterminé en vue de répondre à des questions précises. Le compte rendu doit relater clairement le déroulement de la manipulation et conclure à partir des résultats. Sa présentation doit inclure : - 1- Objectif (but) : quelle est la question globale abordée par la manipulation ; - 2- Principe : sur quelle notion fondamentale se base cette question ; - 3- Matériels et méthodes : description détaillée des organismes, des outils et des méthodes utilisés ; - 4- Résultats : présentation la plus claire possible des résultats obtenus sous forme de prose, de schémas annotés, de tableaux ou de graphiques. Le titre explicatif (des titres du genre «tableau des données» n ont aucun sens) doit figurer au dessus du graphe ou tableau. Les lignes et les colonnes des tableaux ainsi que les axes doivent être libellés, sans oublier les unités de mesure surtout sur les graphiques Conclusion : confronter les résultats aux questions formulées dans le but et le principe. Les éléments de la construction d un compte rendu de TP se trouvent dans le polycopié correspondant sous forme d introduction, de description ou de questions. Cependant, il faut éviter de recopier ce document qui ne suit pas nécessairement le plan que nous avions recommandé. Dans la plupart des cas un compte rendu (une feuille réponse) vous sera distribué au début de chaque séance. 3

4 I- INTRODUCTION TP 1 MITOSE ET MÉIOSE Les cellules somatiques d'un organisme pluricellulaire dérivant par divisions successives ou mitose d'une même cellule ou zygote. La mitose est caractérisée par la réplication du matériel génétique ou chromosomes, et sa répartition entre deux noyaux fils identiques. Elle est suivie de la cytokinèse ou la division du cytoplasme qui en résulte deux cellules somatiques filles. Dans une cellule diploïde (2n chromosomes), la taille et la forme d'un couple de chromosomes homologues sont bien déterminées. Chacun de ces homologues porte deux allèles de même position. Au cours de la formation du zygote, deux lots de n chromosomes, l'un d'origine maternelle, l'autre d'origine paternelle ; sont réunis dans un même noyau par l'union des gamètes ou fécondation. Les gamètes sont le résultat de la méiose au cours de laquelle le niveau de ploïdie des cellules germinales est réduit de 2n à n chromosomes. La fécondation, la mitose et la méiose sont les étapes du cycle biologique au cours duquel, il y a perpétuation de l'espèce. II- DESCRIPTION DES NOYAUX EN DIVISION Au cours des divisions cellulaires les chromosomes sont visibles. Les différentes étapes sont caractérisées par la disposition des chromosomes et leur condensation plus ou moins forte. On distingue après coloration au carmin : - L'interphase : noyau granuleux présentant de nombreux points colorés correspondant à la substance chromatique hydrolysée. - La prophase : noyau volumineux teinté de rose. Filaments rouges denses et confus (début) aux chromosomes individualisés (fin). - La métaphase : chromosomes dispersés dans le plan médian de la cellule. En vue polaire on peut les dénombrer. - L'anaphase : deux groupes identiques de chromosomes sont séparés l'un de l'autre. - La télophase : deux lots de chromosomes sont groupés aux pôles de la cellule (début). Parfois, il apparaît une membrane entre les deux cellules filles (fin). Une explication détaillée, des différents stades mitotiques et méiotique, est fournie par les planches du cours. III- ÉTUDE DES CELLULES EN MITOSE. On utilise la pointe de la racine jeune du bulbe de l'oignon Allium cepa. Au préalable, le fragment a été : - fixé dans une solution de 3/4 d'éthanol et 1/4 acide acétique pendant 24H à 4 C. - placé dans une solution de carmin chlorhydrique pour hydrolyser les parois squelettiques, disperser le cytoplasme et colorer les chromosomes. - stocké dans de l'alcool à 70%. - rincer dans l'eau distillée. Ces étapes sont effectuées par le préparateur du laboratoire - prélever les quelques millimètres du bout terminal où la mitose est active. - placer sur une lame dans une goutte de carmin acétique 4

5 - chauffer très légèrement pendant quelques minutes pour renforcer le contraste (Ne pas faire bouillir). - recouvrir avec une lamelle - placer lame et lamelle entre les deux feuilles d'un buvard plié en deux et écraser légèrement du doigt. Plus les cellules sont dispersées, plus l'observation est meilleure. Au grossissement (x10) rechercher la zone où les cellules contiennent des chromosomes plus ou moins condensés. On observe : - des cellules âgées, interphasiques, plus ou moins allongées. - des cellules méristématiques, isodiamétriques, qui présentent des figures de mitose. - passer au grossissement (x40) pour observer des figures de mitose. 1-Observer la présence et la taille du noyau par rapport à la cellule. 2-Pour chaque phase, quel est le nombre de chromatides? 3-Décrire par un schéma clairement annoté le devenir d'un gène porté par un chromosome de l'espèce qui se trouve à l'état hétérozygote, pour chacune des phases. 4-Etude de la planche I : donner le nom de chaque stade mitotique présenté sur cette planche. IV- ÉTUDE DE LA MÉIOSE Chez Lilium regale des inflorescences mâles (étamines) sont recueillies et fixées 5 à 10 jours avant la floraison en vue d'observer les phases de la méiose dans les anthères. Les fleurs les plus basses sur l'inflorescence sont les plus intéressantes. Elles se présentent en paires dont l'une est pédicellée et l'autre sessile, celle-ci étant la plus âgée. - Prélever une fleur et la placer sur une lame. - Retirer les anthères avec des aiguilles en évitant les pressions trop fortes. - Les couper en deux avec la lame de rasoir dans une goutte de carmin acétique, tapoter légèrement avec l'aiguille pour forcer les sporocytes à l'extérieur par la partie ouverte. Eviter de les briser. - Piquer les anthères avec l'aiguille pour les enlever. Eviter les pousser de côté. - recouvrir avec une lamelle. - Chauffer légèrement pendant quelques minutes pour éclairer le cytoplasme et colorer les chromosomes. Eviter l'ébullition. - placer lame et lamelle entre les deux feuilles d'un buvard plié en deux et écraser légèrement du doigt. - Repérer les différents stades au grossissement x Passer au grossissement x40 pour une meilleure observation. Ce protocole expérimental vous est fourni à titre indicatif. L étude des figures de méiose s effectuera sur des préparations microscopiques (lames) ainsi que des planches. Étude de la planche II a- Donner le nom de chaque stade méiotique figurant sur cette planche. b- Quel est le niveau de ploïdie des cellules figurant sur cette planche. c- les stades méiotiques sont caractérisés par la présence des bivalents (les chromosomes se groupent par deux). 1/ Quelles est le nombre de bivalent des stades c, d et e? 2/Quel est le nombre de chromosomes de l espèce étudiée? d- En supposant qu on a une cellule germinale hétérozygote pour deux gènes indépendants avec deux allèles chacun (A/a et B/b). Indiquer les combinaisons possibles de leurs allèles, au cours des différents stades méiotiques (cas de brassage interchromosomique). e- Si les deux gènes sont portés par le même chromosome en position trans schématiser le devenir de ces deux gènes au cours des différents stades de la méiose (avec absence ou présence de C.O. cas de brassage intrachromosomique). 5

6 V- ANALYSES CHROMOSOMIQUES : UNE INTRODUCTION Á LA CYTOGÉNÉTIQUE : A- Diagnostic prénatal Tous les parents espèrent la naissance d un enfant en bonne santé, et la majorité des bébés ne présente pas de problème particulier à la naissance; cependant, environ un enfant sur 170 présente une anomalie chromosomique qui va peser plus ou moins lourdement sur son développement, et un enfant sur 100 présente une maladie génique due a un changement dans un gène 6. Certaines de ces situations peuvent être prévenues par un diagnostic prénatal. 1- Amniocentèse (Liquide amniotique) L amniocentèse permet de réaliser un caryotype, à partir des cellules présentes dans le liquide amniotique et de vérifier les chromosomes de l enfant à naître. Cette analyse est recommandée plus spécialement lorsque les mères ont un risque augmenté par rapport à la population générale d'avoir un enfant avec une anomalie chromosomique. 20 ml de liquide amniotique, prélevé stérilement. 25ml si Fish souhaité. Délai de résultat: 2 jours pour Fish, 8 à 14 jours pour résultat final. Photos: Amniocentèse: du prélèvement au résultat 2- Choriocentèse (Villosités choriales) La choriocentèse 4 permet de réaliser un caryotype, à partir des cellules des villosités choriales (le futur placenta) et de vérifier les chromosomes de l enfant à naître. Cette analyse est particulièrement recommandée lorsqu une perturbation d un gène est à l origine d une maladie connue de la famille, pour laquelle il existe un diagnostic prénatal. 25 mg dans tube contenant du milieu de culture frais, mis à disposition la veille du prélèvement. Délai de résultat: 3 à 6 jours. 3- Analyses Fish Sur liquide amniotique, hybridation fluorescente in situ en interphase, sans culture. Prélèvement de 5 ml supplémentaires de liquide amniotique. Le liquide ne doit pas être rouge ou brun car il pourrait dans ces conditions, contenir du sang maternel. B- Diagnostic post natal Caryotype constitutionnel sur sang veineux. Adultes : 5 ml prélevé sur tube contenant Héparine ou Liquémine. Enfants : 1,5 ml. Délai de résultat: 7 à 14 jours. En cas d urgence, le délai peut être réduit à 3 jours. - Matériel de fausses-couches : Prélèvement stérile à mettre dans un tube contenant sérum physiologique stérile ou milieu de culture. Délai: 14 à 30 jours. 6

7 C- Amniocentèse: du prélèvement au résultat Les principales étapes sont : 1. Le prélèvement 2. Début de la culture 3. La culture cellulaire 4. La récolte et la coloration 5. L analyse des cellules 6. Les résultats 1- Le prélèvement Le prélèvement est réalisé sous contrôle échographique, chez le médecin traitant. Il est ensuite acheminé au laboratoire où il sera enregistré et étiqueté. 2- Début de la culture Les cellules du liquide amniotique sont récupérées par centrifugation puis ensemencées dans des boites de culture qui seront placées dans un incubateur à 37. 7

8 3- La culture cellulaire Les cellules en croissance nécessitent l apport d éléments nutritifs qui sont apportés par le milieu de culture. Ces opérations s effectuent stérilement. 4- La récolte et la coloration Lorsqu il y a suffisamment de colonies, la culture est arrêtée par la colchicine. Les chromosomes sont libérés par choc hypotonique puis colorés par la trypsine puis le Giemsa. 5- L analyse des cellules Les cellules en division des colonies cellulaires sont photographiées. Les chromosomes d une quinzaine de mitoses sont comptés, découpés et classés. 8

9 6-Les résultats Caryotype normal masculin 46,XY Caryotype 46,XY,del(18), délétion partielle du 18 Caryotype 45,XX,der(13;14)translocation Caryotype 45,X, monosomie X Caryotype 47,XY,+21, trisomie 21 Caryotype 47,XYY, 2 chromosomes Y D- Partie pratique : Elle consiste en l analyse de documents et de fiches techniques fournis dans un support informatique portant sur les applications de la cytogénétique. 9

10 TP 2 GÉNÉTIQUE DE LA DROSOPHILE L'étude de la génétique d'une espèce donnée, nécessite une bonne connaissance de l'organisme considéré autant que par sa morphologie, que sa physiologie, ainsi que par son cycle biologique. La mouche du vinaigre Drosophila melanogaster (2n = 8) a été largement étudiée du fait qu'elle présente les avantages suivants : - Le temps d'une génération est court (10 jours à 25 C, voir cycle de reproduction en Fig.1). - Son corps de petite taille permet qu un grand nombre d'individus puisse être contenu dans un espace réduit. L'insecte reste cependant assez grand pour que la reconnaissance des différents caractères soit aisée. - La drosophile se reproduit au laboratoire en nombre suffisamment élevé, ce qui rend les analyses statistiques précises. - Enfin, il existe actuellement un grand nombre de lignées (plus de 1500) très bien caractérisées et répertoriées, rendant ainsi possible toute étude génétique. I- MORPHOLOGIE DE LA DROSOPHILE SAUVAGE Le type sauvage est le type le plus fréquent dans la nature. C'est la référence pour déterminer les nombreuses mutations morphologiques et autres, d'où la nécessité de sa bonne connaissance. 1- Le sexe L'abdomen de la femelle se courbe postérieurement jusqu'à un point. Il présente des bandes noires séparées le long de la face dorsale jusqu'au bout terminal. Le mâle est généralement plus petit. Son abdomen a une terminaison ronde où les bandes sombres fusionnent. Le premier tarsomère de la première paire de pattes présente une structure sombre sous forme de peigne appelé le peigne sexuel (voir Figures 2 et 3). 2- Les yeux sont soit : a- 2 yeux composés de couleur rouge brique (noter la forme). b- 3 cellules dans la partie supérieure de la tête (ocelles). 3- Les antennes Noter la forme et les embranchements. 4- Les soies Sont des organes sensoriels hérités selon un mode constant. Noter la différence de taille entre les soies courtes nombreuses et les soies longues. Localiser les différents types. 5- L'aile - Observer la forme, la longueur, la position au repos et la couleur. - Observer la position des veines longitudinales et les veines transversales. (Fig. 4). - Noter la couleur et la forme des balanciers. 6- Le corps - Observer la forme, la taille et la couleur. 10

11 II- PARTIE EXPÉRIMENTALE 1- Observation du type sauvage. - Des mâles et des femelles sauvages vous seront distribués. - Sous la loupe binoculaire, observer les différents caractères décrits en (I). Familiariser vous avec ces caractères. - Apprenez à bien distinguer le mâle de la femelle, notamment en observant la taille du corps, la couleur de sa partie terminale et la présence ou l'absence du peine sexuel. 2- Observation des mutants Description des mutations : a. Yeux w (white) : Blanc (ocelles incolores) v (vermillon) : Rouge orangé vif (ocelles incolores) bw (brown) : Marron st (scarlett ): Rouge vif bw / st (Brown-rouge vif) : Blanc se. (sepia) : Rouge brunâtre à violet foncé (ocelles : couleur sauvage). b. Ailes vg. (vestigial) : Dimension très réduite cy. (curly) : Extrémité postérieure courbée vers le haut et l'avant. c. Couleur du corps y. (yellow) : Jaune (soies brunes à extrémité jaune). d. Soies sn (singed) : soies frisées ou courbées. - Observer un mâle et une femelle mutants. - Comparer les individus porteurs de ces mutations au type sauvage. - Apprenez à très bien distinguer les différentes lignées en mélangeant et ensuite en séparant les phénotypes. III- RÉALISATION DES CROISEMENTS 1- Obtention de femelles vierges : Les femelles ne sont vierges que pendant un maximal de 6 à 8H après leur éclosion. Pour obtenir des femelles vierges il faut : - A une semaine du jour de culture, surveiller le développement des larves et des pupes (voir cycle de la drosophile en figure 1). - Au moment de la maturation d'un maximum de pupes, vider les tubes tôt le matin en éliminant les mouches. - Sept à huit heures plus tard, les mouches femelles écloses sont toutes vierges. 2- Réalisation des croisements : - Ethériser pendant 1 min au maximum, des mouches contenus dans un tube propre. Une foi que les mouches sont endormies, à l'aide de la loupe binoculaire, séparer les mâles des femelles. A ce stade, le moyen le plus sûr pour distinguer les mâles reste le peigne sexuel. ATTENTION AU MÉLANGE DES SEXES. 11

12 - Mettre les femelles vierges d'une lignée (1) en présence des mâles d'une lignée (2) à raison de 3 femelles et de 3 à 4 mâles dans un tube vide ou réanimation. Quand ils montreront des signes de réveil, les transférer dans un tube de culture (Croisement A). - Le croisement réciproque met en présence des femelles de la lignée (2) en présence de mâles de la lignée (1) (Croisement B). - Marquer sur une étiquette collée au tube : la nature du croisement, la date de réalisation du croisement et le N du groupe et de binôme ou de la personne ayant réalisé le croisement. - Au bout de 7 jours à 23 C on peut observer les larves à la surface du milieu et sur les bords du tube. Eliminer les parents et continuer à conserver le tube dans l'étuve à 23 C. Au bout de 3 semaines de la date de fécondation, on est en mesure d'examiner environ 200 drosophiles issues du croisement. 3- Comptages : - Ethériser pendant 1 min au maximum les mouches par petits groupes pour ne pas être pris de court par des mouches qui se réveillent. - Pour l'examen, séparer d'abord les phénotypes ensuite les sexes d'un croisement. - Compter le nombre de mouches par sexe et par phénotype. N.B. Par manque de temps (nombre de séances de TP insuffisants), cette partie ne sera pas réalisée par les étudiants. IV- INTERPRÉTATION 1- La descendance F1A et F1B (croisements réciproques) - Présentez les croisements réalisés, les résultats obtenus sous forme de tableau par sexe et par phénotype. - En déduire les ratios correspondants. - Quelle (s) indication (s) vous donne la comparaison des résultats obtenus chez les mâles et les femelles. Justifiez votre réponse. - La comparaison des résultats obtenus dans les deux croisements réciproques confirme-t-elle votre conclusion et Pourquoi. - Présentez les résultats de croisements réalisés avec l'autre souche mutante et les comparer avec vos résultats. - Prévoir les ratios mendéliens attendus en F2 pour les deux souches mutantes. 2- La descendance F2A et F2B - Rappelez les croisements de départ et de la F1. - Donnez les résultats obtenus en F2 sous forme de tableau par sexe et par phénotype. - Les résultats confirment-ils vos hypothèses émises en F1. - Déduire le nombre de gènes en présence dans votre croisement? Pourquoi? - Indiquer le génotype et le phénotype des parents, des individus F2, des individus F1. - Présentez les résultats de la F2 des croisements réalisés avec les autres souches mutantes, les comparer avec ceux que vous avait obtenus. - Les gènes en cause sont-ils indépendants ou liés, si oui calculez la distance génétique. - Conclusion : comparez les différentes souches mutantes étudiées, en présentant le déterminisme génétique de chacune des mutations et les cartes factorielles correspondantes. 12

13 Figure 1 : Cycle de vie de D. melanogaster. Figure 2 : Différences morphologiques entre les mâles et les femelles de D. melanogaster. 13

14 Figure 3 : Détail des pattes avant chez le mâle et la femelle. Notez la présence du peigne sexuel au niveau du premier tarse chez le mâle. Figure 4 : Détail de l'aile de la drosophile chez le type sauvage 14

15 TP 3 LA RECOMBINAISON GÉNÉTIQUE CHEZ Sordaria macrospora I- INTRODUCTION Les gènes mutants sont des marqueurs chromosomiques qui permettent de réaliser la carte génétique d'un organisme. Il est donc important de les distinguer du type sauvage. Il existe trois types de mutants : - Morphologiques : affectant les organes végétatifs et reproducteurs. - Biochimiques : affectant les besoins en un élément nutritif particulier pour se développer. - De coloration : sont largement étudiés chez les ascomycètes dont Neurospora crassa ou Sordaria macrospora en vue de comprendre le mécanisme de l'échange génétique. Pour la plupart des champignons, c'est la phase haploïde qui domine le cycle biologique. La phase diploïde se réduit à une période très courte (Fig. 1, voir cycles de Sordaria sp et de Neurospora crassa). Cette situation présente des avantages par rapport aux organismes diploïdes : - Les résultats de la ségrégation étant haploïde, le génotype est directement exprimé par le phénotype. - Les quatre produits de la méiose peuvent être isolés ou groupés en tétrade. - La descendance est très nombreuse. Comme Neurospora crassa, Sordaria macrospora présente le cas le plus favorable pour l'analyse des tétrades : l'orientation spatiale des résultats de la méiose (tétrades) dans les asques ce qui permet d'orienter les deux divisions de la méiose du sommet de l'asque vers sa base. II- DESCRIPTION DE LA FRUCTIFICATION 1- LE PERITHECE Sordaria macrospora est un ascomycète de la classe des pyronomycètes. Il se caractérise par une fructification en forme de ballon (Fig. 2) ou périthèce. Celui-ci s'ouvre à maturité par un canal ou ostiole pour libérer les asques. Le périthèce de Sordaria macrospora (ordre des sphaerialés, famille des sordaréacés) est de couleur sombre. Il se développe en un minimum de 9 jours. Une coupe transversale montre à la base du périthèce la juxtaposition de plusieurs asques à différents stades de maturité. Les asques se développent à tour de rôle, un seul à la fois occupe l'ostiole. 2- LES ASQUES Les asques sont des structures cylindriques. Leurs parois sont fines et se terminent par un anneau apical plus épais. Les ascospores de type sauvage sont de couleur très sombre, les mutants sont blancs ou de couleur claire. 3- LE TYPE D'UNION Sordaria macrospora est homothalique : la fécondation chez un mycélium de même origine. En même temps, il a la capacité de s'hybrider ce qui permet les recombinaisons génétiques. Quand on inocule deux souches différentes sur un milieu de culture une proportion des périthèces peut résulter de mycélium hétérothalique hybride. On peut alors observer dans les asques une combinaison de couleur, de la base au sommet de l'asque, montrant si la ségrégation a eu lieu en méiose I ou en méiose II (Fig. 3). 15

16 III- L'ANALYSE DES TETRADES Une hybridation entre un mutant aux spores sombres (n) et un mutant aux spores claires (c) a été effectuée (voir Fig. 3). Dans le périthèce hybride, la plupart des asques présentent quatre ascospores blancs et quatre ascospores sombres. Les arrangements possibles figurent au tableau 1. Type de ségrégation Phénotype des ascospores (de l Apex vers la base) Asques Pré-réduits : ségrégation en I n n c c première division. II c c n n III n c n c Asques Post-réduits : ségrégation en IV c n c c deuxième division (C.O. entre le gène et V son centromère). n c c n VI c n n c Tableau 1 : Arrangements des Tétrades ordonnées Distance d'un gène au centromère = 1/2 (nombre d'asques post-réduits) X100 Total des asques Distance gène - gène = ½ TT + DNP X 100 (DP> DNP donc gènes liés) TOT des asques IV- PARTIE EXPÉRIMENTALE Ce TP se déroulera comme suit : 1- Réalisation d un croisement : Des croisements entre différentes souches de Sordaria macrospora ont étés réalisés. Le phénotype étudié est la couleur des ascospores. Pour réaliser un croisement, on tracer une ligne au marqueur sur le dos de la boite. Toujours à proximité d une flamme, on a placé le mycélium de chacune des souches à croiser de part et d'autre de cette ligne. Le mycélium qui se développe le long de la zone contenant les deux types du mycélium serait en principe un mycélium hybride susceptible de former des périthèces où il y aurait ségrégation. On a marqué sur le dos de la boite les numéros des lignées ainsi que la date. Et enfin on a Laissé incuber à l'étuve à 25 C pendant au moins 10 Jours. N.B. Cette partie a été réalisée par les enseignants. 2- L observation de l appareil végétatif : - Prélever à l'aide d'une pince fine flambée à proximité d une flamme un bout de mycélium et le placer entre lame et lamelle dans une goutte d'eau distillée et ensuite on écrase entre deux feuilles de papier absorbant. - Observer au microscope au grossissement (x10) puis au (x40). 16

17 3- L observation de l appareil reproducteur : - Prélever à l'aide d'une pince fine flambée à proximité d une flamme quelques périthèces et les placer entre lame et lamelle dans une goutte d'eau distillée et ensuite on écrase délicatement entre deux feuilles de papier absorbant. - Observer au microscope au grossissement (x10) puis au (x40). 4- Analyse du croisement réalisé : - Prélever à l'aide d'une pince fine flambée à proximité d une flamme quelques périthèces hybrides de la ligne médiane, les placer entre lame et lamelle dans une goutte d'eau distillé et ensuite on écrase délicatement (pour ne pas sortir les spores des asques) entre deux feuilles de papier absorbant. - Observer au microscope au grossissement (x10) puis au (x40). - Repérer un périthèce mûre et intact (asques contenant les 8 ascospores), ensuite procéder au comptage (en respectant toujours le même sens ; c est à dire de l apex vers la base des différents types d asques présents (les classer par type de ségrégation). 5- Interprétation des résultats : 1- dresser un tableau de vos résultats. 2- Identifier les génotypes. 3- Les gènes sont-ils liés? 4- Positionner chaque gène par rapport au centromère. 5- Concluez en synthétisant les résultats de vos croisements. Donner la (ou les) cartes factorielle (s) des gènes étudiés. 17

18 Figure 1.a : Appareil de fructification d'un ascomycète Sordaria sp. Figure 1.b : Cycle biologique de Neurospora Crassa 18

19 Figure 2 : Appareil de fructification d'un ascomycète Sordaria sp. a) Schéma d un périthèce avec un asque en cours de maturation ; b) bouquets d'asques d un périthèce mûr éclaté. Pré-Réduction Post-Réduction Figure 3 : Types d'asques. Croisement d'une souche à spores noires et une autre à spores claires 19

20 Nom :. Prénom : Section :. Groupe : Date :... TP 1 MITOSE - MÉIOSE I/ Mitose : a- Question : b- Préparation au microscope : 1- Les cellules d'alium sp possèdent normalement 64 chromosomes. Précisez le nombre de chromosomes présents à chacun des stades de la mitose. Dans vos réponses, comptez les chromatides comme des chromosomes. Nombre de chromosomes Stades Mitotiques Prophase Métaphase Anaphase/ pôle Télophase/ noyau 2- Si une mitose se produit dans une cellule de génotype AABbCc, où toutes les paires de gènes sont sur des paires chromosomiques différentes : Schématiser les phases mitotiques avec les chromosomes et leur gènes correspondants. Quels seront le ou les génotypes des cellules résultantes? 3- Etude de la Planche I : a- Donner le nom de chaque stade mitotique présenté sur la planche I? Photos a b c d e f Nom du Stade b- Quel est le nombre de chromosomes de l'espèce étudiée, et à quel stade on peut le déterminer? 2n = 20

21 II/ Méiose : 1- Etude de la planche II a- Donner le nom de chaque stade méiotique présenté sur la planche II, ainsi que le nombre de bivalents des stades c, d et e. Photos Stade Méiotique Nb. de Lames Stade Méiotique a b c d e bivalents b- Quel est le nombre de chromosomes de l'espèce étudiée? Justifier. 2n =.. 2- a- En supposant qu'on a une cellule germinale hétérozygote pour deux gènes (2 loci) avec 2 allèles chacun (N/n et R/r), portés sur deux chromosomes différents. Schématiser la ségrégation des allèles au cours des différents stades méiotiques? N R b- Si les deux gènes sont portés sur le même chromosome en position cis schématiser le devenir de ces deux gènes au cours des différents stades de la méiose : n r b.1. Absence de C.O. (ou) b.2. Présence de C.O. 21

22 Nom :. Prénom : Section :. Groupe : Date :... TP 2 GÉNÉTIQUE DE LA DROSOPHILE ANALYSE DE LA F1 et de la F2 1- Question : 2- Donner les résultats obtenus en F1 sous forme de tableau, par sexe et par phénotype : Croisement Phénotype N (Mâles) N (Femelles) 3- Donner les ratios phénotypiques correspondants : 4- Que peut-on conclure en comparant les phénotypes des individus mâles et les phénotypes des individus femelles? 5- Quelle information nouvelle est apportée par la comparaison des deux croisements réciproques? 6- Combien de gènes sont mis en cause dans ce croisement? Justifier. 22

23 7- Donner les résultats obtenus en F2 sous forme de tableau, par sexe et par phénotype : Croisement Phénotype N (Mâles) N (Femelles) 8- Donner les ratios phénotypiques de la F2 9- Donner le génotype et le phénotype des parents, de la F1 et de la F2 (sous forme d un tableau de croisement)? Génération Sexe Phénotypes Génotypes Parents F1 Mâles Femelles Mâles Femelles Mâles F2 Femelles 10- Les gènes sont-ils liés? Justifier 23

24 Nom :.. Prénom :.. Section :. Groupe : Date :... TP 3 RECOMBINAISON GÉNÉTIQUE CHEZ Sordaria macrosposra 2- Question : 3- Préparation au microscope : 4- Analyse du croisement C : Compléter le tableau des résultats de ce croisement (Indiquer le phénotype et le génotype des spores). Types d'asques DP DNP TT Paire des Spores 1 I II III IV I II III IV I II III IV V VI VII VIII IX X Nombre d asques Total Types d'asques Paire des Spores TT (suite) I II III IV V VI VII VIII IX X Nombre d asques Total 24

25 Résumer les génotypes des différents phénotypes. Phénotype des spores Génotype Combien de gènes sont en cause dans ce croisement? Justifier. Les gènes sont-ils liés? Si oui calculer les différentes distances (Gène-Gène et Gène- Centromère). Donner la (les) carte(s) factorielle(s) (Echelle : 1 cm = 1 mm) 25