Lab-on-chip: microsystème pour l analyse biologique

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1 Lab-on-chip: microsystème pour l analyse biologique Claude Vauchier 1

2 Domaines d applications et compétences Lab on a Chip In-vivo In vitro Diagnostics Environment Monitoring Life Science Chemistry In vivo & wearable Molecular Imaging µsystems for in vitro diagnostics µsystems for environment monitoring & homeland security µsystems for in vitro pharmacology & chemistry Implanted devices Nanobiopsies Smart textiles Development of probes & instruments for in vivo optical imaging Applications ptical detection Electrochemistry Instrumentation Competencies Biology microtechnologies, microelectronics Chemistry Biochemistry Microfluidics Packaging 2

3 Intérêts des microsystèmes pour la biologie BILGIE MICRELECTRNIQUE Nouveaux outils CHIMIE MICRTECHNLGIE * pas tout le temps * pas une solution miracle pas adapté au dispositif unique de RF *permet de figer des paramètres difficilement maîtrisables en macro Meilleure sensibilité Vitesse de réaction Intégration fonctionnelle * Faible volume d échantillons et de réactifs * peut aider à créer de nouvelles fonctions * autorise la parallèlisation, le multiparamétrique 3

4 Biopuces: applications en génomique, protéomique et cellomique Activité Carte du génome humain Technologie ADN Génomique pharmacogénomique Biotechnologies Diagnostic Environnement. ARNm; ADNc Protéines Protéomique Cellules Cellomique Pharma Cibles thérapeutiques Médicaments Drug design Chimie combinatoire Criblage 4

5 rdre de grandeur des cellules et de leurs constituants Diamètre moyen d'un cellule animale = µm Diamètre d'un globule rouge = 8 µm Diamètre d'une bactérie = 1 à 10 µm (Escherichia coli = 2 µm) Diamètre d'un virus = 15 à quelques centaines de nm Protéine globulaire de 2 à 10 nm Molécule d'adn = 2nm d'épaisseur 5

6 Analyse biologique : les grandes fonctions solide extraction échantillon action mécanique extract. ϕ solide ADN, ARN purification préparation échantillon réaction sur mol. spécifique détection optique électro. liquide protéines amplification mass. spec. vortex, impact cellules culture air détect. cell. 6

7 Principe de la puce à ADN hybridation extraction de l ADN Amplification de l ADN (PCR) ou Détection sur puce à ADN Il n existe pas de PCR pour copier les protéines! 7

8 2 compétences fondamentales Chimie de surface pour les microsystèmes Contrôle & reproductibilité des protocoles de fonctionnalisation de surface Boîte à outil microfluidique Contrôle du déplacement des fluides 8

9 Surface engineering for microsystems Microtechnologies fabrication Surface chemistry Biochip Microfluidics circuit for lab on a chip µarrays substrate Silanisation step (silane grafting + spacer) Functionalisation with biochemical compounds Characterization Liquid phase or Gas phase Spotting or hydrodynamic flow Fluorescence or mass spectrometry 9

10 Micro- & nano systèmes fonctionnels Support solide système fonctionnel robuste ingénierie de surface fonctionnalisation modification de surface (~ Å à nm) & greffage covalent de molécules synthèse organique fonctionnalité molécules de captures ou molécules activables N 3 H Si Si M-TEPP Porphyrins N N N N N M N N 3 N M = Co, Fe, and Mn Au, InP Thiols M-S Solgels, Solgels hybrides (précurseurs silylés) M--C Conducteurs, semi-conducteurs matériaux à surface hydrogénée nanofils Si, nanotubes de carbone, fullerènes Molécules insaturées M-C / Si, Ge-C / C-C Verre, pyrex, quartz, oxydes métalliques, oxydes semi-conducteurs matériaux denses, poreux, microstructurés & nanoparticules Silanes M--C Polymères organiques en bulk («plastiques»), résines (SU8, rdy), etc. H H H Si Si Si DNA_ DNA_ DNA_ NH NH Et Et Si Et NH Si Polymères (fonctionnels, téflon, etc.) M--C Si Si Si 10

11 Process, Covalent Grafting (Glass, Pyrex, Quartz, Si2, Si3N4, IT, ) mm 2 ; 2400 Spots (d = 150 µm) Step = 400 µm Varaiblity Intra chip < 10 % Variability Inter puce < 30 % Exact MMC CY3 Target 10 nm (Saturation) 2MMC MME CY3 Target 1 pm (Low) 12

12 «CEA2» Process, Applications Monoc. Antibody Peptides (Alexa 532 Labelled) Hybridization Area N N N N Si Si Si Si N N Si Si N N N N Si Si Si Si N N Si Si Si Si Si Si 0,5 Immuno-Assay Collaboration with CEA-DSV (SPI Saclay) rapport signal / témoin 3 2,5 2 1,5 1 zoom Si Si Si Si concentration en pm PCR utlets PCR Inlets Digestion of Proteins by Immobilised Trypsin. Trysin is covalently bonded on Si/Si 2 columns. Micro -colonnes CY3 Target 10 nm Grafted fluorescent enzyme CY3 Target 1 pm 13

13 A microfluidics toolbox 3 ways for fluid handling architecture: Monophasic microfluidics Droplets in channel Discrete microfluidics Technology Microfluidics circuits with etched channel. Specific packaging steps (low T C) Microfluidics circuits (glass or PDMS) Microdroplets are actuated on microelectodes pathway Microfluidics Fluid actuation Valve or pump architecture dispensing Mono-phasic Hydrodynamics force electro-osmotic force Thermopneumatic actuation; passive valves; mechanical; Capillaries, wells Di-phasic Hydrodynamics External pump Capillaries diphasic (air/water; oil/water; air/ionic liquid) Electrostatic, SAW No need Integrated tanks 14

14 DIAGNSTIC IN-VITR APPLICATINS 15

15 Le challenge de l intégration Microtechnologies & microfluidiques doivent permettre de miniaturiser et d intégrer toutes les étapes d un protocole d analyse biologique Collecte Collecte de de l échantillon l échantillon (sang, (sang, eau, eau, air, air, biopsie ) biopsie ) Extraction Extraction purification purification Reconnaissance Reconnaissance moléculaire moléculaire Detection Detection Analyse Analyse données données Miniaturisation Fabrication collective, petit volume d échantillon et de réactifs, Reproductibilité, sensibilité Intégration Réactions séquentielles et/ou parallèles Automatisation Système automatisé «point of care» ou borne d analyse 16

16 Collecte PC : fonctions de base à intégrer Préparation échantillon Analyse AIR m 3 10ml à 10µl Liquide en litre Sang en ml ou µl 17

17 Analyses médicales du sang Collecte Centrifugation Concentration Purification, stabilisation Protocole d analyse détection Difficulté d integration : discontinuité disversité de volume d échantillons remplacer la centrifugation 18

18 Point f Care : fonctions de base à intégrer Sang Sang Plasma Globules blancs Globules rouges Diagnostic par Point of care: Deux types de prélèvement adressant différents besoins : Petit volume : 50µl Collecte + fractionnement du sang + stabilisation de la fraction Grand volume : 2ml fractionnement du sang + stabilisation de la fraction 19

19 e-lab on card: diagnostic card & optronic hybridisation detection Hybridisation Hybridisation + + enzymatic enzymatic labelling labelling detection detection Data Data analysis analysis Detection by chemiluminescence: - no more optical scanner scanner - sensibility = fluorescence - APS chip: low cost - toward reader integration APS optosensor Enzymatic labelling, luminescence, Hybridisation from 50 fm to 10 nm, dynamic = 1000 Specific detection 10 pm Plastic card (credit card foramt) 20

20 Concentration module based on magnetic beads Microcomponent for sample concentration volume reduction: from 1 µl to 0.1 µl Fluidic functions: handling magnetic microbeads, filling, Agitation, Anti-diffusion Applications:Fast analysis tools, multichannels and portable Biosensors, Immunosensors DNA chip µtotal Analysis System Agitation by thermo Pneumatic valves FLUX Small chamber 4 Magnet Magnet 0.1µl magnet 10µl 22

21 ENVIRNMENT MNITRING 23

22 Discret microfluidics: EWD on a chip EWD: ElectroWetting n Dielectric Fluid handling by electrowetting Droplet volume : 10nl to 2µl 24

23 Microfluidique en goutte: réacteur mobile Principe: Electrowetting on Dielectric «EWD» V V V capot huile goutte capot huile goutte capot goutte espaceur Couche diélectrique électrodes V = 0 V V = 80 V Surface hydrophobe Surface hydrophile bus stockage 100nl Stockage 100nl Input / output Fonction de base: dispense de gouttes à partir d un réservoir Microprocesseur fluidique Fonctions fluidiques de base: déplacer, mixer des gouttes de qq nl à 2µl 25

24 Balise de détection de pathogènes sur site (PCR en temps réel) Lecteur de fluorescence Démonstrateur intégré pour l analyse génomique basée sur l électromouillage Puce sur PCBoard «RealTimePCR» ou quantitative PCR DNA Extraction FLURESCENT DETECTIN RT PCR n cycles Partie thermique Biosoc Tube goutte ADN humain 4 cycles 20 Réservoir Échantillon ADN (1) (2) Analyse en goutte par RT PCR Zone de détection Poubelle Réservoirs: PCR r2actifs (1 ABI SNP kit per pathogen) Déplacement de la goutte en boucle sur des zones thermiques ( PCR cycles) cyclage thermique: Activation 10 min. à 95 C 40 Cycles 60 min.: 92 C 30, 60 C 30 déplacement dans l huile pendant la PCR Fluorophore FAM 5-10 copies / goutte 1 goutte ( 60 nl) PCR cycles 26

25 Microsystème pour l analyse de métaux lourds dans l eau bjectifs: Surveiller, détecter, alerter Rapidité, fiabilité, aide à la décision Extralab Application: Constellation de capteurs pour le suivi d un réseau d eau capteur Central Microcomposant Si/verre Microcanal diphasique Vue des entrées du composant Piliers stabilisateurs des 2 phases non miscibles Stabilisation physique des interfaces Extraction concentrante Détection par spectrophotomètre portable à fibres optiques Application à la détection de métaux lourds dans l eau objectif: réalisation d un capteur autonome sur site Entrée eau Fibre à analyser optique Source UV-visible Source UV visible (fibre) Phase aqueuse Eau polluée Pb 2+ Pb 2+ Principe de la microextraction concentrante 110µm 110µm 1,5cm Ligne de pilier Stabilisation diphasique Phase organique: boucle d extraction concentrante Phase organique Complexant spécifique du plomb (macrocycle type calixarène) Pb X X S S X X NH HN S S NH NH Complexant du plomb de type Calixarène X = CF3, Ph, PhMe, dansyl cavitands HN S X Me Me NH S X Sortie eau Fibre optique vers détecteur UV visible portable Absorbance / cm -1 0,20 0,15 1 mg.l -1 0,10 2 0,05 3 0,00 4-0,05-0,10-0,15-0,20-0,25-0,30-0,35-0,40-0,45-0,50-0,55-0,60-0,65-0, longueur d'onde / nm Microfluidique diphasique Eau + fluorescéine Débit Q 1 = 1 µl/min Chloroforme Débit Q 2 = 2 µl/min capteur capteur Écoulement diphasique calixarènes 27

26 LIFE SCIENCE APPLICATINS 28

27 De nouveaux outils pour l analyse des protéine par spectrométrie de masse Digestion Digestion protéines protéines separation separation peptides peptides Electrospray Electrospray Mass spec Mass spec détection détection Analyse de Analyse données de données Séparation des peptides sur µcolonne (nano LC chip) 2,8 kv 20 bar Plume électrospray intégrée (ESI) Interface LC ESI Chip avec spectromètre de masse (Trap Thermo MS) Injection de la solution peptidique Biochiplab test espray d 196 (3.893) Cm (40:271) 100 TF MS ES+ 6.13e4 UL072011(0.478) Cm(10:20) TFMSES+ 1.65e4 1,5 µm % injection du mix protéines % UL069418(0.776) Cm(10:20) Microréacteur pour la digestion de protéines (digeste de cytochrome C ; 10pmol/µl; débit: 80nl.min -1 ) TFMSES+ 1.80e4 Structure interne du microréacteur pour l application chromatographie. (phase C18 hydrophobe greffée sur les micropiliers) Spectre de la GFP (Glu- Fibrinopeptide) 5 pmol/µl in ACN/H2/FA débit : 200 nl/min m/z 29

28 LC chip with integrated ESI nozzle MS Fluidic pattern for LC separation 1,5 µm 3 wafers Technology 1mm 800µm 5X50µm 2 slit 5x50 µm 2 30

29 bjectifs: intégration et réponse aux applications spécifiques Intégration d un système d analyse du plasma pour le diagnostic du cancer: Loccandia (EU) Échantillon sang Préparation échantillon sang Mélange de protéines Lab-on-chip & spectromètre de masse Peptide spectrogrammme technologie de l information Diagnostic information BI NAN INF Material flow Information flow En développement : microréacteurs génériques fonctionnalisés selon l application & amélioration des performances avec les nano matériaux Micro concentrateur Nouvelle génération de réacteur avec Nanotube de carbone in-situ 31

30 DNA Chip with in-situ syntheses: YAMATAKE polymer masking step using ink-jet printer colorimetric detection 81 probes per chip marketed in Japan since June 2006 Glass slide format Fabrication process 32

31 Application pour le in-vivo 33

32 util pour le clinicien: PRTL TM Clinical-Biological question Peak intensity (arbitrary units) Global Proteomic Analysis Molecular masses (Da) A B Identification Purification Functional annotation A * * * * * * ** * * * Le concept Nanobiopsie protéomique concept Sampling rod ( 800µm) Guide ( 1mm) Imprint window (2cm) Contact entre l outil et le tissu Collaboration LETI / Inserm U318 (CHU Grenoble) 34

33 W WY WY W WY WY W Y Y WY WY W Y WY WY W Y Y WY WY util pour le clinicien: PRTL TM Technologie LETI: Guide = 1mm Tige de capture = 800µm Microsystème silicium Surface micro structurée => efficacité de la capture de protéines HYDRPHILIC HYDRPHBIC ARMATIC HYDRPHILIC HYDRPHBIC ARMATIC autres... Fonctionnalisation chimique / spatialisation de la tige => specificité Avantages: sensibilité & specificité de capture de protéines, reproductibilité & simplicité du protocole, vitesse 35

34 CNCLUSINS ET PERSPECTIVES 36

35 Perspectives: Exemples d applications des nanotechnologies Capteurs moléculaires Cantilevers arrays fonctionnalisés Détection sur Nanofils 37

36 Perspectives: RADMAP DES LAB N A CHIP PUR LE DIAGNSTICS AU CEA LETI 2015 bjectif pour le futur: Haute sensibilité et spécificité Détection sans marquage Détection ADN et protéines sur des plateformes identiques Détection sans marquage (nanofils.) 2010 Full integration Lab on chip Intégration préparation échantillons (sang, air, eau..) Parallèlisation réactions séquentielles réactifs embarqués PCR temps réel en goutte 2001 Intégration detection APS chimieluminescence Intégration PCR + puce ADN In silicon chip 1999 puce ADN Lecteur bas coût fluorescence 38

37 Les moteurs possibles de la croissance et opportunités Vieillissement de la population: demande croissante des pays industrialisés - Les coûts des soins médicaux demandent des solutions - diagnostic «au lit du malade» PC - drug discovery: trouver de nouveaux médicaments (effet des génériques) - Home «wellness»: marché potentiel? Biodéfense,, biosécurité: - réponse au bioterrorisme - réponse aux impacts des infections: - légionnelle (fort impact sur les populations) - salmonelle (impact économique) - Menace émergente: SRAS, grippe aviaire.. Multidisciplinarité entre science et engeneering: - point clé pour développer de nouveaux concept de biocapteurs - croisement microbiologie, MEMS et microfluidique: fort potentiel mise en œuvre aux USA, Japon et Europe 39

38 Innovation for industry les biopuces, X.Gidrol, S.Baghdoyan, Y.Roupioz; Techniques de l ingénieur, , RE 17-1 puces à ADN, P.Soularue, X.Gidrol; Techniques de l ingénieur, , RE 6-1 Revue spécialisée: Lab on a chip 40

39 You will be welcome to the 7 th Leti Annual Review, 18 and 19 June at Minatec For more information : 41

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