RÉSUMÉ. Mots-clés: méthodes de diagnostic, réaction de polymérisation en chaîne (PCR) optimisation, viroses des animaux de compagnie.

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1 RÉSUMÉ Mots-clés: méthodes de diagnostic, réaction de polymérisation en chaîne (PCR) optimisation, viroses des animaux de compagnie. 1. L'importance de la thèse Actuellement, la pathologie infectieuse/contagieuse des animaux de compagnie n'est plus une inconnue, la recherche médicale actuelle a démontré que la science et la technologie moderne peuvent intervenir avec succès dans l'amélioration du diagnostic, dans la prévention et au combat de ces maladies. Bien que les progrès scientifiques ont alimenté les espoirs d exclure d'agents pathogènes parmis les maladies infectieuses courantes chez les animaux, de nombreux échecs ont montré les limites des méthodes de diagnostic, en particulier dans les premiers stades de l'infection, avec un impact négatif sur l'efficacité des programmes de prévention et / ou leur éradication. La nécessité d'une amélioration des techniques de diagnostic et de la révision des méthodes de l'immunoprophylaxie restent des objectifs pérennes. Le premier objectif de cette étude était de procéder, sur la base de données bibliographiques, à un examen des principales méthodes de laboratoire utilisées pour le diagnostic de la pathologie infectieuse des animaux de compagnie (chat ou chien), visant simultanément à recueillir des informations sur les techniques couramment utilisées dans le diagnostic, ainsi que à l approfondissement des techniques de performance qui permettent un diagnostic sûr et à la fois précoce de l'infection. Des observations recueillies à partir de la littérature, ainsi que ceux dérivés d'un diagnostic obtenu par des méthodes de biologie moléculaire dans certaines maladies infectieuses des chiens et des chats, ont suggéré l'idée d'évaluer dans quelle mesure les méthodes classiques de diagnostic sont conformes aux exigences actuelles. En outre, notre objectif fut d aquerir le savoir, l'optimisation et, si possible, la mise en œuvre des techniques et des méthodes de diagnostic de pointe, base sur la PCR (Polymerase Chain Reaction), qui tente d optimiser l'identification des animaux infectés. Parmi les nombreux viroses des animaux de compagnie, pour cette étude ont été sélectionnés quatre d'entre eux, à savoir l'infection par le virus de l'herpès félin de type 1 (FHV-1), l'infection par le calicivirus félin (FCV), et en ce qui concerne les viroses des chiens, l'infection par le parvovirus canin (CPV-2) et la maladie de Carré (CDV). Pour

2 chacun de ces maladies virales ont été validés les protocoles d'extraction et l'amplification spécifique (pour ADN / ARN des différentes matrices biologiques), pour conduire finalement à des protocoles pratiques et stables qui peuvent être efficacement utilisés dans la surveillance et le diagnostic sensible et spécifique de ceux-ci maladies. Aussi, pour illustrer l'applicabilité pratique de protocoles optimisés, a été sélècté le protocole RT-PCR pour le diagnostic de la maladie de Carré, permettant ainsi de tester un certain nombre d'échantillons biologiques prélevés d'animaux suspecte, asymptomatique ou clinique, pour vérifier la sensibilité et la spécificité de ce test et la possibilité de sa mise en œuvre dans le diagnostic de routine. Comme mentionné précédemment, ces maladies sont fréquemment rencontrées chez les animaux de compagnie, les deux derniers particulièrement agressives, avec une forte morbidité et la mortalité, où un diagnostic précis établi dans un temps relativement court peut sauver de nombreuses vies et prévenir l'apparition d une épidémie. 2. Structure de la thèse La thèse est divisée en deux sections principales. La première partie résume les données recueillies de la littérature sur les caractéristiques spécifiques des infections virales et des méthodes classiques de diagnostic et est divisé en cinq chapitres. La deuxième partie est consacrée à la recherche personnelle et systématisée en 8 chapitres, comprenant les matériaux d'étude, les méthodes de recherche utilisées, les résultats et les conclusions de chaque chapitre et un chapitre général contenant les conclusions et recommandations finales. Partie I - Étude bibliographique CHAPITRE I - est dédié à l infection avec l'herpès-virus félin de type 1 et présente des informations générales sur l'étiologie, la pathogenèse, l'épidémiologie de cette maladie, ainsi que les méthodes de diagnostic (les techniques traditionnelles et les techniques modernes) pour identifier le génome viral. CHAPITRE II présente la calicivirose féline, les données sur l'étiologie, épidémiologie et pathogénie de l infection, des informations sur des questions importantes telles que les animaux porteurs (carrier) et leur rôle dans le contexte épidémiologique de l'infection, la présentation des méthodes de diagnostic sérologique et moléculaire, discutant les avantages et inconvénients des techniques mentionnées. CHAPITRE III dédié a l infection du au parvo-virus canin de type 2, aux concepts généraux sur l'étiologie de l'infection, aux données sur les particularités de l'origine et de l'évolution du parvo-virus (sachant que le virus a été identifié pour la première au chat, puis il

3 a passé au chien, et au cours des dernières années, de nombreux études épidémiologiques indiquent son retour à l'hôte d'origine, le chat). On y resume les données épidémiologiques sur la répartition des différents variantes antigéniques du parvovirus canin, les méthodes utilisées pour diagnostiquer l'infection (méthodes traditionnelles et techniques modernes). CHAPITRE IV - présente les conditions générales concernant la maladie de Carré, l'étiologie et l'épidémiologie, ainsi que les caractéristiques des techniques de diagnostic tels que profil hématologiques et biochimiques, examens radiologiques, investigations au niveau du liquide cérébro-spinal, déterminations immuno-cytologiques, techniques d'immunohistochimie, méthodes sérologiques, isolement virale et aussi la présentation des techniques modernes de diagnostic, respectivement la détection du génome viral. Chapitre V - est un chapitre général consacré à la technique PCR (réaction en chaîne de la polymérase), concernant la présentation des étapes de la réaction, des composants de la réaction, des types de réaction et des méthodes d'analyse et d'interprétation des résultats (électrophorèse sur gel d'agarose et analyse des courbes d amplification), terminologie, etc. Partie II - Recherches personnelles Cette partie débute par la présentation de l'objet et du protocole de la recherche, suivie par huit autres chapitres. Chapitre VI c est un chapitre général qui présente les matériels et méthodes utilisés tout au long de la recherche, examinant, le type d'équipement utilisé, des kits et des réactifs utilisés, les matériaux biologiques nécessaires, les protocoles de préparation des échantillons biologiques, les protocoles d extraction des acides nucléiques, les protocoles et les types d'amorces et des sondes d'hydrolyse nécessaires pour le stade d'amplification, les paramètres de performance évalués pour chaque étape d'optimisation d'un protocole donné. L'optimisation de chaque protocole de PCR, autant dans l'étape d'extraction que dans celle d'amplification, est reprise en détail au chapitres VIII, IX, X, XI, pour chaque maladie virale dans partie. CHAPITRE VII - est un chapitre dédié spécifiquement à la préparation des échantillons destinés a tester par des méthodes de diagnostic moléculaire, en général, et aussi à la présentation des astuces importantes liées aux inhibiteurs de la réaction PCR (identification et caractérisation de ces éléments) et aux méthodes de préparation des échantillons spéciaux (biochimiques, immunologiques, physiques, physiologiques), etc. Chapitre VIII - est dédié à l'optimisation des techniques de biologie moléculaire (la méthode PCR pour le diagnostic de l infection avec l'herpès-virus félin de type 1) et

4 structurée comme suit : un bref aperçu sur les particularités du génome viral, suivi de deux sections principales d'optimisation générale de la méthode : - validation pour l extraction d'adn à partir d'échantillons de tissus mous (organes): présentation des matériels et des méthodes utilisées, du protocole de traitement primaire de l'échantillon des organes, du kit d'extraction à tester, des paramètres de performance évalués et du protocole utilisé pour l'évaluation, la fiche de travail et le profil thermique de la réaction normalisé, et finalement la présentation des résultats et la discussion; - amplification du génome de l'herpèsvirus félin de type 1: matériels et méthodes utilisées, le choix des amorces spécifiques à la région du gène amplifiée, la conception expérimentale, une brève description des deux kits d'amplification utilisés, la fiche de travail et le profil thermique FHV -1 pour chacun des deux kits, résultats, discussion, - conclusions partielles de ce chapitre: validation réussie du protocole d'extraction d'adn à partir d'échantillons d'organes (tissus mous) afin d'optimiser l'amplification spécifique de ADN FHV-1, obtenant ainsi un protocole PCR stable et pratique, qui recommande cette technique pour le diagnostic spécifique et sensible de l'herpèsvirus félin. Chapitre IX - dédié à l'optimisation des techniques de biologie moléculaire (la méthode en temps réel RT-PCR) dans le diagnostic du calicivirus félin et structuré comme suit: un bref aperçu sur les particularités du génome viral, suivi de deux sections principales sur l'optimisation générale de la méthode: - la validation de la méthodologie pour l'extraction de l'arn a partir d'échantillons de tampons oro-pharyngés: présentation des matériels et des méthodes utilisées, du protocole de traitement primaire des échantillons biologiques, du kit d'extraction à tester, des paramètres de performance évalués et du protocole utilisé pour l'évaluation, la fiche de travail et le profil thermique de la réaction normalisé, et finalement la présentation des résultats et la discussion; - l amplification du génome de calicivirus félin: matériels et méthodes utilisées, le choix des amorces spécifiques à la région du gène amplifiée et de la sonde de hydrolyse, la conception expérimentale, la brève description des deux kits d'amplification utilisés, la fiche de travail et le profil thermique pour chacun des deux kits, résultats, discussion

5 - conclusions partielles de ce chapitre: validation réussie du protocole pour extraire l'arn à partir d'échantillons de tampons oro-pharyngés, optimisation de l amplification spécifique de l ARN FCV pour obtenir un protocole en temps réel RT-PCR stable et pratique, ce qui recommande la technique PCR pour le diagnostic spécifique et sensible de la calicivirose féline. Chapitre X - présente l'optimisation des techniques de biologie moléculaire, la méthode PCR en temps réel dans le diagnostic de l'infection par le parvovirus canin 2, structuré comme suit: courte présentation sur les particularités du génome viral, suivi de deux sections principales d'optimisation générale de la méthode: - la validation de la méthodologie pour l'extraction de l'arn par prelevements d'échantillons de matières fecales: présentation des matériels et des méthodes utilisées, du protocole de traitement primaire des échantillons prélevés, du kit d'extraction à tester, des paramètres de performance évalués et du protocole utilisé pour l'évaluation, la fiche de travail et le profil thermique de la réaction normalisé, et finalement la présentation des résultats et la discussion - l'amplification du génome du parvovirus canin de type 1: matériels et méthodes utilisées, le choix des amorces spécifiques à la région du gène amplifiée, la conception expérimentale, la brève description des deux kits d'amplification utilisés, la fiche de travail et le profil thermique CPV-2 pour chacun des deux kits, résultats, discussion; - conclusions partielles de ce chapitre: validation réussie du protocole pour extraire l'arn à partir d'échantillons de matières fecales, optimisation de l amplification spécifique de l ADN CPV-2 pour obtenir un protocole en temps réel RT-PCR stable et pratique, ce qui recommande la technique PCR pour le diagnostic spécifique et sensible de la parvovirose. Chapitre XI - l'optimisation des techniques de biologie moléculaire (la méthode RT- PCR dans le diagnostic de la maladie de Carré), structurée comme suit: une brève introduction sur les particularités du génome viral, suivi de deux sections principales sur l'optimisation générale de la méthode: - la validation de la méthodologie pour l'extraction de l'arn à partir d'échantillons de sang: présentation des matériels et des méthodes utilisées, du protocole de traitement primaire des échantillons prélevés, du kit d'extraction à tester, des paramètres de performance évalués et du protocole utilisé pour l'évaluation, la fiche

6 de travail et le profil thermique de la réaction normalisé, et finalement la présentation des résultats et la discussion - l'amplification du génome viral: matériels et méthodes utilisées, le choix des amorces spécifiques à la région du gène amplifiée, la conception expérimentale, la brève description des deux kits d'amplification utilisés, la fiche de travail et le profil thermique CDV pour chacun des deux kits, résultats, discussion; - conclusions partie de cette section: validation réussie du protocole de l'extraction de l'arn à partir d'échantillons de sang, optimisation de l amplification spécifique de CVD pour obtenir un protocole en temps réel RT-PCR stable et pratique, ce qui recommande la technique PCR pour le diagnostic spécifique et sensible de la maladie de Carré. Chapitre XII - un chapitre qui illustre l'application pratique du protocole optimisé pour le diagnostic de la maladie de Carré par RT-PCR. Ainsi, nous avons testé un grand nombre d'échantillons (différentes matrices biologiques: sang, frottis conjonctivaux, urine, organes) à partir de 50 animaux cliniquement sains ou avec suspicion clinique de la maladie de Carré. L'objectif est donc de mettre en place la sensibilité de la détection par PCR du génome viral de tous les types de matrices biologiques, des animaux asymptomatiques ou de ceux présentant des signes cliniques au moment de l'essai. La détection du virus dans le corps d'abord dans le sang en phase virale (3-6 jours après l'infection) et plus tard (6-9 jours après l'infection) dans divers épithéliums où il est excrété par les sécrétions / excrétions (en échantillons de frottis conjonctivaux, par exemple) est d'une importance particulière pour guider l'approche thérapeutique ultérieure. Elle est également utile dans l'identification des animaux asymptomatiques qui restent sensibles au virus dans une population susceptible. Ils sont également detailés les résultats et les discussions, et les conclusions partielles de ce chapitre, de sorte qu on peut affirmer d avoir reussi l'optimisation et la validation d'un protocole d'extraction d'arn applicable aux quatre types de matrices biologiques (sang, frottis conjonctivaux, urine, organes). Le protocole optimisé pour l'amplification de virus c est avère capable d'identifier un grand nombre d'animaux infectés avec suspicion clinique ou asymptomatiques, ce qui confirme la performance et l'utilité de la technique RT-PCR pour le diagnostic spécifique et sensible de la maladie de Carré et l'utilisation de cette technique comme un outil très pratique pour guider l'approche thérapeutique dans certains stades de l'infection.

7 Chapitre XIII - est un chapitre de conclusions générales visant l'ensemble de l'étude, ou sont soulignés et mis en évidence les aspects les plus importants du sujet étudié. Ont peut conclure: 1) Le diagnostic par des techniques de biologie moléculaire (PCR) est un diagnostic sensible et spécifique très utile en médecine vétérinaire, mais exigeant des installations specifiques (équipements dédiés à la méthode, des kits et des réactifs, un espace spécialement conçu) et personnel spécialisé dans l'exécution de ces opérations; 2) Concernant l'optimisation des techniques d'amplification virale, il existe à l'heure actuelle des informations détaillées dans la littérature sur le type de protocole utilisé (PCR, PCR en temps réel), amorces et de sondes pour des fragments de gènes spécifiques (technologies comme SYBR Green, FRET, MGB ), des combinaisons de kits et réactifs (de type prêt-àutiliser). Celles-ci peuv être ajustés plus tard selon les equipements spécifiques de chaque laboratoire, ou peuvent être recrèés et adaptés individuellement, ce qui a été realisé dans cette étude; 3) L'un des critères pour optimiser un protocole a été l'usage pour lequel il sera dédié : diagnostic rapide (pour des tests individuels ou de dépistage dans une population) nécessitant exploitation en temps réel ou des études épidémiologiques (par exemple, l'identification des souches de CDV circulant dans une zone donnée), ces études étant succédées par le séquençage du génome viral; 4) L'étude a souligné l'importance de facteurs tels que le stade pré-pcr, des techniques d'élimination des inhibiteurs et des procédés pour le traitement des échantillons prélevés, en fonction de la matrice organique, aspects qui peuvent modifier la sensibilité et la spécificité moléculaire de ces maladies; 5) Les échantillons biologiques pour les tests de biologie moléculaire (PCR), recueillies par des méthodes non invasives pour un animale vivant sont les suivants: a) des frottis conjonctivaux, oropharyngée, immergés dans un tampon PBS et envoyés en quelques heures à laboratoire et / ou des organes spécialisés prises post-mortem (dans le cas de la mortalité néonatale) soupçonnant de la rhinotrachéite féline avec étiologie virale (herpès, calicivirus); b) échantillons de matières fecales, indiqués en particulier dans la phase aiguë de la maladie (dans ce cas, les organes internes peuvent être utiles pour la détection de matériel biologique virale, en particulier dans le cas de mort subite du nouveau-né), avec a suspicion clinique de parvovirus.

8 c) maladie de Carré - échantillons de sang pour la validation de la méthode RT-PCR (extraction et amplification) et échantillons de tampons conjonctivaux (recueillies dans des événements respiratoires), des échantillons de sang (phase de virémie), des échantillons d'urine (à la fois dans la phase aiguë et dans la période de récupération), organes (post-mortem) pour la phase de mise en œuvre de la technique RT-PCR; 6) Optimisation d'un protocole classique de type PCR pour le diagnostic du herpèsvirus félin de type 1, traversant les étapes suivantes: a) validation du protocole d'extraction d'adn pour les échantillons des tissus mous (d'organes); b) optimisation de l'amplification spécifique de ADN FHV-1, obtenant ainsi un protocole PCR stable et pratique, qui recommande cette technique pour le diagnostic spécifique et sensible de l'herpèsvirus félin. 7) Pour l'optimisation d'un protocole de type RT-PCR en temps réel dans le diagnostic de la calicivirose féline ont été realisees les suivantes approches: a) la validation avec succès d un protocole d'extraction d'arn à partir d'échantillons de tampons oro-pharyngées; b) l optimisation de l amplification spécifique de l ARN FCV pour obtenir un protocole en temps réel RT-PCR stable et pratique, ce qui recommande la technique PCR pour le diagnostic spécifique et sensible de la calicivirose féline; 8) En optimisant le protocole PCR en temps réel pour le diagnostic de l'infection par le parvovirus canin 2, ont été obtenus les suivants résultats: a) la validation réussie d'un protocole pour l'extraction d'adn à partir d'échantillons matières fecales; b) l optimisation de l amplification spécifique de l ADN CPV- 2 pour obtenir un protocole en temps réel RT-PCR stable et pratique, ce qui recommande la technique PCR pour le diagnostic spécifique et sensible de la parvovirose canine; 9) En optimisant un protocole PCR en temps réel dédié au diagnostic de la maladie Carre, on a obtenu les suivants résultats: a) la validation réussie d'un protocole pour l'extraction d'arn à partir d'échantillons de sang; b) l optimisation de l amplification spécifique de l'arn CDV pour obtenir un protocole en temps réel RT-PCR stable et pratique, ce qui recommande la technique PCR pour le diagnostic spécifique et sensible de la maladie de Carré;

9 10) La mise en oeuvre du test de RT-PCR dans le diagnostic de la maladie de Carré a confirmé: a) Le schéma (pattern) de corrélation de l'infection avec l'âge, connu à partir des observations précédentes: ainsi, la prévalence de l'infection a atteint 100% immédiatement après le déclin des anticorps maternels, mais après l'âge d'un an, la prévalence tend à diminuer à "0" à la suite de la vaccination et / ou l exposition spontanée au virus circulant dans l'échantillon étudié; b) la corrélation de la suspicion de l'infection avec l'âge et l'état immunitaire, comme suit: la plupart des résultats positifs ont été enregistrées chez les animaux de moins de 1 an, non vaccinés ou avec la vaccination incomplète, tandis que dans les autres groupes d'âge on a enregistré seulement des cas isolés d'infection associé à un état immunitaire inconnu ou sans vaccination, ou dû à l'exposition à une souche très virulente; c) pour les animaux cliniquement sains, la détection correcte d une infection subclinique ou encore en état d'incubation ou la détection de l'état de porteur de virus; d) la sensibilité du protocole pour l'identification des animaux qui sont dans la phase aiguë de l'infection, par la discrimination entre les animaux avec infection subclinique par rapport à ceux cliniquement sains, mais porteurs et éliminateurs de virus; Les performances démontrées par les résultats de cette étude - l'efficacité, la rapidité, la sensibilité et la spécificité, montrent que, la RT-PCR est une alternative viable à la gestion de cette maladie. 11) Tous les protocoles optimisés dans le présent document peuvent être aisement mises en œuvre pour établir le diagnostic courant de la herpèsvirose et de la calicivirose au chats ou de la parvovirose et de la maladie de Carré au chien,s et peuvent être également utilisés dans des études épidémiologiques ou des analyses des séquences du génome viral.