Master informatique spécialité IMA Cours N 1 Principes de Base de la Microscopie Electronique en Transmission et à balayage cours du 28 septembre 2010

Transcription

1 Master informatique spécialité IMA Cours N 1 Principes de Base de la Microscopie Electronique en Transmission et à balayage cours du 28 septembre 2010 Catherine Vénien-Bryan! Equipe Assemblages macromoléculaires! Institut de minéralogie et de physique des milieux condensés (IMPMC)! CNRS UMR 7590, Universités Paris 6 et Paris 7, IPGP! 140 Rue de Lourmel, Paris! Tél.: ! catherine.venien@impmc.upmc.fr! catherine.venien@bioch.ox.ac.uk! URL: Image - Perception of an object using your eyes (vision). One can sense an object without vision (touch, etc..). Requires visible light. Eye Electron Microscope ;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;<3=>->24;;;;;;;;;;;;;;;;;;;?)0)(@2;@)6!1;;;;;;;;;;;;;;;;A?;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;B>-C; Optical Microscope Microscope - A device with a lens or series of lenses that enlarge (magnify) the appearance of an object. Does not apply to SEM. Resolution is limited to approx. 1/2 the wavelength of illuminating source,-+)*./)&'!''0'"'

2 H*.>+2; I.E)J>2; K-C*3;B; <*30; M2.1>*30; I.E)J>2; K-C*3;B; <*30; M2.1>*30; D-#12.>; N"O*.P*.>0;.3;#>*+200.0;4Q)312>-+R*3;S-F2+;*.;0-30; 2,+)1-R*3T;231>2;>-C*332E231;)3+)4231;21;E-1G>)-.; O>-30E)00)*3; ^)+>*;[.62>; D!-E#;#>*+!2; 0#2+1>*0+*#)2; O*#*6>-#!)2; O*E*6>-#!)2; O>-30E)00)*3; ^)+>*0+*#)2;#!*1*GE)00)*3; _*>+2;-1*E)\.2; _*>+2;E-63GR\.2; `E)00)*3;*#R\.2; D!-E#;#>*+!2; H*342;-1*E)\.2;

3 1#(.2-' "3&"4# 5&-2$%-# 6%72-' 8#29).2+',:+)*./)&' a!*1*30; b99nc99; :2?; 9':µE; 9'9cN9':; dne9/2?; e9ne99µe; 9'eµE; 9'99:; e99nd99/2?; 9'eNe;µE; 9'ed3E; a>*1*30; f'e9 Nb; e9ne99/2?; 9'9eN9'e;µE; ene93e; <*30; e9 Nd; :9/2?N:^2?; e993endµe; d993e; M2.1>*30; 9'ed; 9'9:d2?; eee; eµe; eµend93e; I20;#*)3120; 9Nd;3E; 9'99dN9'f3E; ;:(-9/)&' *%"%(-' <2:9%+%)&' =99>+' ^)+>*0+*#)2;h;1>-30E)00)*3; 9'ed;3E; e'di; 9'fNe93E; e;3e; e9 Nb; e9 Nf;; e9i; end;3e; e9 Nf ;e9 N:; e9i; e;µe; ^)+>*0+*#2;>GZ2,)*3;h;(-002;G32>6)2; e93ene;µe; 9'd;3E; K2+!2>+!2; 9'f3E;23;B; 9'9e3E;23;l; ^)+>*0+*#)2;h;=*>+2;-1*E)\.2; 9'd3E; ^)+>*0+*#)2;*#R\.2; 9'fµE; 9'edµE; ^)+>*0+*#)2;h;+!-E#;#>*+!2; e9nd9;3e; ^)+>*0+*#2;[.62>; :93E; e9 Nf; e9i; ^)+>*0+*#2;h;0#2+1>*;42;E-002;420; )*30;02+*34-)>20; d9;3e; e9 N8 Ne9 No; ei; H*342;-1*E)\.2; :9;3E; e9 Nf; e;-1*e2; H*3420;B;21;E)+>*;B;; :9N:993E; e9 Nc;

4 ;#(-+' 1#"-+' p'p';o!*e0*3; ABDC' m)0+*f2>24;*=;", ABDE' Y.0+!; ABFA' ABFG' ABGC' ABEHI' ABCH' ABCG' A3&)3;r; ]2342>0*3; m.(*+!21;r; 0.6->T; *(02>F-R*3;

5 ;#(-+' 1#"-+' p'p';o!*e0*3; ABDC' m)0+*f2>24;*=;", ABDE' Y.0+!; ABFA' ABFG' ABGC' ABEHI' ABCH' J'K'<*#&9LM+'9)&+(#&('3ENEDO'P'AH IFO' Q).*-N+-9)&R4' ABCG' A3&)3;r; ]2342>0*3; m.(*+!21;r; 0.6->T; *(02>F-R*3; ;#(-+' 1#"-+' p'p';o!*e0*3; ABDC' m)0+*f2>24;*=;", ABDE' Y.0+!; ABFA' ABFG' ABGC' ABEHI' ABCH' ABCG' A3&)3;r; ]2342>0*3; m.(*+!21;r; 0.6->T; *(02>F-R*3;

6 ;#(-+' 1#"-+' p'p';o!*e0*3; ABDC' m)0+*f2>24;*=;", ABDE' Y.0+!; ABFA' ABFG' ABGC' ABEHI' ABCH' ABCG' A3&)3;r; ]2342>0*3; m.(*+!21;r; 0.6->T; *(02>F-R*3;

7 V5W'R-+%$&' 60x! 660x! 6660x! 66000x

8 Observer des proteines en coloration négative! (De Carlo et al.)! u(02>f2>;21;>2+*301>.)>2;; 420;F)>.0;h;#->R>;4Q)E-620; 42;+>C*NE)+>*0+*#)2;; Rotavirus (Yeager Lab Scripps, San Diego)

9 K26->42>;420;+>)01-.,;42;#>*1G)32; 23;E*42;)E-62;21; 23;E*42;4)k>-+R*3; 23;)31G6>-31;420;)3=*>E-R*30; #>*F23-31;4Q-.1>20;E21!*420; Actin decorated with Dictyostelium S1 (Manstein Lab, Heidelberg Image: T. Wendt)

10 lampe filament et;hc01je2; ;201;+*30R1.G;4x.32; HuAKDL; \.); >-4)-R*30W; 4x.32; E2"-31; 42; =-)>2; 42; ft; HC01JE2; 4x)E-62>)2$; D*E()3-)0*3; \.); #>*4.)0231;.32; )E-62; E-63)tG2; 4.; 0#G+)E23'; +*3R231; SeT;.32; uypldo<_; \.); 4.; 0#G+)E23W; 21; \.); =*>E2;.32; )E-62; )312>EG4)-)>20; 4.; 0#G+)E23W; 21; S:T; 42; akupldolak0; \.); 6>*00)00231;.32; #*>R*3; 42; condenseur objectif spécimen image intermédiaire projecteur bt; HC01JE2; 4x23>26)01>2E231$; g.); >-4)-R*30; 23;.32; )E-62; #2>E-32312; 0.>; 0.##*>1; #!*1*6>-#!)\.2;S3G6-R=0T;*.;3.EG>)\.2;S+-EG>-0T'; microscope optique écran image microscope électronique lampe filament A4; I20; *#R\.20; 0*31; =-)120; 42; F2>>2; 21; *31;.32; 4)01-3+2; t,2w; E-63GR\.20; 0*31; +*30R1.G20; 4)01-3+2; 201; 23; 4.; condenseur spécimen D4; L3; 6>*00)002E231; 201; 23; *(P2+R=; E*31G20; 0.>;.3; 4)0\.2; >*1-R=; -.; ; 42; #2.1; -.00); y1>2; E*4)tG; 6>*00)002E231; S4)01-3+2; *(P2+R=; >2012; +*301-31W; 21; +x201; 23; 4)01-3+2; 420; #>*P2+12.>0; \.x*3; =-)1;F->)2>;@2;6>*00)002E231';; objectif image intermédiaire projecteur ;X1YZ'6-+'8-2S)2"#&9-+'RM.&'V5W'R:8-&R-&(' 82%&9%8#*-"-&(' R-' *#' [.#*%(:' R-' +#' *-&/**-' )7\-9/SN' microscope optique écran image microscope électronique

11 lampe filament @-; E)+>*0+*#)2; I-; 6>-342; #>*=*342.>; 42; +!-E#; 4.; ^'L'O'; #2>E21; 42; 3ET'; condenseur spécimen O4; H.>;.3; ^)+>*0+*#2; 0*.>+2; 201; objectif G4; I2; ^'L'O'; =*3+R*332; h; 1>J0;!-.1; F)42; #*.>; #-00-62; 0#G+)E230; 0*31; 0*.F231; 4G0!C4>-1G0; S#-0;4Q*(02>F-R*3;!"#$!$%T'; E4; I2; =-)0+2-.; 4.; ^LO; 4G1>.)1; image intermédiaire projecteur microscope optique écran image microscope électronique

12 <E-62; A3; 0C01JE2; *#R\.2; #>*4.)1;.32; )E-62; 2,-+12; *{; +!-\.2;#*)31; 201; >2#>*4.)1; +*>>2+12E231'; I2;#!G3*EJ32; 42; 4)k>-+R*3; <E-62; I2; #!G3*EJ32; 42; 4)k>-+R*3; #>*F)231; 4.; 1>-P21; @.)NEyE2; +*EE2;.32; H); 201; 0.n0-EE231; +*!G>2312W;*3;F*)1;-##->- @Q*342;4Q*>)6)32W;-.;(*>4;4Q.32;=2312';; L3; +!-\.2; #*)31; 201; >2#>G0231G; #->;.3; 4)0\.2; 42; ND2;4)0\.2;42;4)k.0)*3;201;4.2;-.;#!G3*EJ32;42;R%]2#9/)&; %&R.%('8#2'*-'R%#8J2#$"-'R-'*#'*-&/**-;; ""= longueur d'onde n = 1 indice de réfringence $ = demi-angle d'ouverture d = 1,21. "# n. sin($) N"H*3;4)-EJ1>2;201;)3F2>02E231;#>*#*>R*332@;-.;4)-EJ1>2;42;@Q*.F2>1.>2; 4;$;e%4)-EJ1>2;42;@Q*.F2>1.>2;4*3+;#*.>;-F*)>;.3;4)0\.2;-.00);#2R1;\.2;#*00)(@2; <@;=-.1;.R@)02>;.32;6>-342;*.F2>1.>2; N"I2;0#*1;+231>-@;201;@2;#@.0;)312302;};obi;42;@Q)31230)1G;1*1-@2'N; O $# u v grossissement = v/u I dmin = D/2 diaphragme disque de Airy

13 D>)1J>2; 42; I-; #2R12; 4)01-3+2; 231>2; 42.,; 4)0\.20; 42; [)>C; #*.>; NI2; E-,)E.E; 4.; 4)0\.2; 4Q[)>C; +*)3+)42; #>2E)2>; E)3)E.E; D2"2;4)01-3+2;;4;7;~;m;+*>>20#*34;h;$; ;;;;;;;;;;;;;;;4;7;9W8e;";%;3;0)3S$T; " e99/2? ;7;9W99fc;3E;7;9W9fcv; 3;7;e; 0)3S$T;7;9W9d; "'!'3'AGH'T'^'4 ATD '=&$+(2)"+' #&R'#'(J-)2-/9#*'2-+)*./)&')S'HNHABG'=&$+(2)"+Z' c.('%&'#9(.#*%(u'")+('v5w+'b%**')&*u'j#?-'#&'#9(.#*' 2-+)*./)&'DNO'=&$+(2)"+'#('AHHa-^;

14 y Pf 1 Pf 2 I 1 I 2 x d = %Z O x x y y I20;4G=-.10;420;@23R@@20; $# diaphragme disque de moindre confusion dc = $; ;Cc { %V-2%I V } I " 1 " 2 D+;7;D* ;4Q-(2>>-R*3;42;+!>*E-R+)1G; $"7;42E)N-36@2;4Q*.F2>1.>2; %F%F;7;?->)-R*30;42;1230)*3;4Q-++G@G>-R*3; %<%<;7;?->)-R*30;4Q)31230)1G;42;@-;+-1!*42; <).2'R-+':9J#&/**)&+'"%&9-+d'*e#7-22#/)&' 9J2)"#/[.-'2-+(-'S#%7*-'3R9'fHNA'&"4N' O>*)0;+-.020;)34.)0231;420;F->)-R*30;42;@*36.2.>0;4Q*3420$; N; 420; Z.+1.-R*30; +)>+.)10; 42;!-.12; 1230)*3; S3*>E-@2E231; E*)30; 42; e e9 Nd ; F*@10T'; N;420;F->)-R*30;42;F)12002;420;G@2+1>*30;GE)0;#->;@-;+-1!*42;S f'd;#->r20%e)@@)*3t;; N"420;#2>120;4QG32>6)2;4.20;-.,;+!*+0;)3G@-0R\.20;420;G@2+1>*30;-F2+;@2;0#G+)E23';

15 disque de moindre confusion ds =!. Cs. $ 3 D0;7;D* ;4Q-(2>>-R*3;42;0#!G>)+)1G; $ 7;42E)N-36@2;4Q*.F2>1.>2; $# diaphragme [)30);.3;*(P21;#*3+1.2@;#>*4.)1;.32;0G>)2;42;1>-P2+1*)>20;+*3)\.20';L1;@Q23F2@*##2;42; +20; 4)F2>020; 1>-P2+1*)>20; #*00J42;.3; 4)-EJ1>2; E)3)E.E; \.Q*3; 4)0\.2; 42; E*)34>2;+*3=.0)*3;40'; ^)+>*0+*#)2;G@2+1>*3)\.2;21;G@GE2310;42;+*301>.+R*3; I-;0*.>+2;4QG@2+1>*30W;@2;+-3*3;h;G@2+1>*30' 5"%++%)&'(J-2"%[.-d'(.&$+(-&-; NI2;t@-E231;42;1.3601J32;201;+!-.kG;h;.32;12E#G>-1.>2;F*)0)32;42;:c99ƒD';; NI20;G@2+1>*30;0*31;2,1>-)10;4.;EG1-@;21;=*>E231;.3;3.-62;231*.>-31;@2;t@-E231'; N"IxG@2+1>*42;42;g-J&-*(;201;#*>1G2;h;.3;#*123R2@;3G6-R=;42;\.2@\.20;+231-)320;42;?*@10;#->;>-##*>1;-.; t@-e231w;#*.>;>g.3)>;@20;g@2+1>*30;23;.3;#*)31;t32e231;=*+-@)0gw;@2;+>*00n*f2>'; N";I20;G@2+1>*30;GE)0;#->;@2;t@-E231;*31;420;F)120020;F->)-(@20;E-)0;=-)(@20;S9W:;?T';; N"I20;G@2+1>*30;0*31;230.)12;-++G@G>G0;23;4)>2+R*3;42;@x-3*42;#->;@-;!-.12;1230)*3;S#@.0)2.>0;+231-)320;42; E)@@)2>0;42;F*@10T';

16 5"%++%)&'(J-2"%[.-d'(.&$+(-&-'-('6#cE'3+).29-'8*.+'9)J:2-&(-4; Filament de tungstène Filament de LaB6 T C d'utilisation Energie fournie pour franchir le mur de potentiel (ev) Dispersion en énergie (ev) Pression du vide (mbar) Brillance (A/sr.cm!) (sr :stéradian unité d'angle solide) ,1 Environ 1 < ,5 1 0, à à A32;#*)312;42;E*3*+>)01-@;4Q!2,-(*>.>2;42;I-31!-32;SI-Y8T;-++>*+!G2;h;.3; t@-e231;23;+->(*32;; K2E->\.2;$;#->;>-##*>1;-.;t@-E231;42;1.3601J32W;@2;t@-E231;42;I-Y8;4G@)F>2;.3;Z.,;42;+*.>-31; 23F)>*3;f9;=*)0;0.#G>)2.>;h;#->R>;4x.32;j*32;GE)00)F2;#@.0;>G4.)12';; ^)+>*0+*#)2;G@2+1>*3)\.2;21;G@GE2310;42;+*301>.+R*3; I-;0*.>+2;4QG@2+1>*30W;@2;+-3*3;h;G@2+1>*30' 5"%++%)&'R-'9J#"8; I2;+-3*3;h;GE)00)*3;42;+!-E#;.R@)02;h;3*.F2-.;.32;#*)312;42;1.3601J32W;E-)0;@Q2k21; 42;+!-E#;G@2+1>)\.2;1>J0;)312302;>2F)231;h;+>G2>;.32;0*.>+2;F)>1.2@@2;4QG@2+1>*30;23; 42!*>0;42;+2"2;#*)312';D2;1C#2;42;0*.>+2;1>J0;+*!G>2312;3G+200)12;.3;F)42;1>J0;#*.00G; S12+!3*@*6)2;+!J>2T;E-)0;@-;+*!G>23+2;21;@-;@.E)3*0)1G;4.;=-)0+2-.;0*31;)3+*E#->-(@20';

17 u3420; _23120;4Q *.36; Y#8(.2%&$'%"#$-+' A4" <J)+8J)2-+9-&('+92--&' D4" W%92)$2#8J+3'+%*?-2'J#*%R-'$2#%&+'-"7-RR-R'%&'#&'-".*+%)&4''

18 Y#8(.2%&$'%"#$-+ID' F4'YY;'9#"-2#'3YJ#2$-'Y).8*-R';-?%9-'9#"-2#4' +-#1.>2;.3)10W;2-+!;*=;&!)+!;+*>>20#*340;1*;-; W%92)$2#8J+'?-2+.+'YY;'9#"-2#' N])6!;\.-31.E;2n+)23+C; NI->62;4C3-E)+;>-362; F'9#+h' 6#'S)2"#/)&'R-'*e%"#$-' D4'5*-9(2)&'R%].+:':*#+/[.-"-&(d'R:i-9(:N; Na-0;42;+!-362E231;4QG32>6)2' " NI-;#!-02;+!-362; NH-;1>-P2+1*)>2;201;4GF)G2;42;=- *3;)E#*>1-312;Se9 N: >-4)-3W;9'd * T; F4'5*-9(2)&'R%].+:'%&:*#+/[.-"-&(d'R:i-9(:' N<31G>-+R*3;-F2+;@20;2 N ;@*>0;42;@-;1>-F2>0G2;4.;3.-62;420;*>()1-@20;2 N ;; ND*EE.3)+-R*3;4QG32>6)2;#->;+*@@)0)*3;Se9N:9;2?T';I20;2N;#-00231;4Q.3; 3)F2-.;h;@Q-.1>2;*.;0*31;GP2+1G0; NH-;1>-P2+1*)>2;201;4GF)G2;@G6J>2E231;;Se9 Nb; >-4)-3T; ;6#'82)8)2/)&'R-'9)**%+%)&+':*#+/[.-+'-('%&:*#+/[.-+'R:8-&R'R-'*#'(-&+%)&' Re#99:*:2#/)&'R-+':*-9(2)&+'-('R-'*#'&#(.2-'R-'*e:9J#&/**)&N' H*)1;.3;G+!-3R@@*3;+*30R1.G;4Q.3;t@E;42;+->(*32;42;d9;3E;4QG#-)002.>; )@@.E)3G;#->;.3;=-)0+2-.;4QG@2+1>*30;0*.0;.32;1230)*3;4Q-++G@G>-R*3;42;d9;/?W; ; fbi;420;g@2+1>*30;32;0*31;#-0;4gf)g0w; ; eei;420;g@2+1>*30;0.()00231;.32;4)k.0)*3;g@-0r\.2; ; ddi;420;g@2+1>*30;0.()00231;420;+!*+0;)3g@-0r\.20'; I20;+!*+0;)3G@-0R\.20;4)E)3.231;@*>0\.2;@Q*3;-.6E2312;@-;1230)*3; 4Q-++G@G>-R*3;420;G@2+1>*30;;

19 Y)&(2#+(-'Re#"8*%(.R-' '3:*-9(2)&+'R%].+:+':*#+/[.-"-&(4' m)-#!>-6e2;42;; +*31>-01; K2E->\.20$; Y)&(2#+(-'R-'8J#+-' '5*-9(2)&+'&)&'R%].+:+'-('R%].+:+':*#+/[.-"-&(' 4)k.0G0;*3;-;=*>E-R*3;420;S2#&$-+'R-'`2-+&-*'' @20;:;=-)0+2-.,; ; ; ; g.-34 % 7;-;.3;3*E(>2;;23R2>;42;@W;*3;-.>-;.3;E-,;4Q)31230)1G;21;#*.>;.3;3*E(>2;; ; ; ; )E#-)>;42;"%:;.3;E)3)E.E;4Q)31230)1G;;; l7;4)01-3+2;4.;#@-3;=*+-@; m)kg>23+2;42;e->+!2;4.;-.;#-00-62;h;1>-f2>0;@2;0#g+)e23;

20 Y)&(2#+(-'R-'8J#+-' '5*-9(2)&+'&)&'R%].+:+'-('R%].+:+':*#+/[.-"-&(' I2;+*31>-01;42;#!-02;201;$; -1*E20;\.);4)k.0231; )3F2>0)*3;4.;+*31>-012';,#88-*''9)&(2#+(-'Re#"8*%(.R-'-('9)&(2#+(-'R-'8J#+-h' 3*3;4)k.0G0'; #*.>;42;#2R10;*(P210;-F2+;.3;#2R1;3*E(>2;-1*E)\.2'; 6#'R%].+%)&'%&:*#+/[.-' Nb; >-4)-3T;4*3+;#-00231;1*.0; ) ; ;M 2 ;; [F ;@)G0;h;@-;4)k.0)*3;)3G@-0R\.2;SE)+>*0+*#)2;LLIHW;^LYT; u.;+*ee231;r>2>;#>*t1;42;@-;4)k.0)*3;)3g@-0r\.2; NH.)12;h;+2"2;)312>-+R*3W;@x-1*E2;201;)*3)0G;S.3;G@2+1>*3;201;GP2+1GT';I-;4G02,+)1-R*3;02;=-)1;#->;420;0-.10;G@2+1>*3)\.20; 42;=- *3;h;+2;\.2;@x-1*E2;>21>*.F2;0-;+*3t6.>-R*3;01-(@2';Ix-1*E2;>20R1.2;@xG32>6)2;-+\.)02;0*.0;=*>E2;42;#!*1*3;B; \.-34;.3;G@2+1>*3;42;@Q;*>()1-@2;2,1G>)2.>2;>21*E(2;0.>;;@Q*>()1-@2;42;@QG@2+1>*3;GP2+1G';D2;#!*1*3;B;-;.32;G32>6)2; NIx)312>-+R*3;G@2+1>*3%E-RJ>2;236234>2;4x-.1>20;#!G3*EJ320;\.2;@x*3;.R@)02;23;"%92)#&#*U+-;SLLIHT;*.;23;E)+>*0+*#)2; h;(-@-c-62ˆ^lyt;#*.>;4g12>e)32>;@-;+*e#*0)r*3;*.;@xg1-1;42;0.>=-+2;42;@xg+!-3r@@*3';;