Les tests de laboratoire dans les uvéites antérieures aiguës

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1 Les tests de laboratoire dans les uvéites antérieures aiguës Christian Khoury O.D., Ph.D. Utilités des tests Indicateur de maladie systémique Paramètres objectifs Procédures d évaluation reconnues Utiles au DDx Évaluent l efficacité du traitement (suivi thérapeutique du médicament) Apport important dans les justifications médico-légales Les limites normales Dérivées des statistiques Déviations physiologiques Déviations pathologiques Variables âge sexe race Terminologie Exactitude (proche des valeurs réelles) Précision (mesure de reproductibilité) Spécificité aptitude à dépister uniquement les sujets malades, test négatif quand sujet normal Sensibilité aptitude à dépister tous les sujets malades sans exception, positif quand la maladie est présente Sources d erreur Cueillette inadéquate de l échantillon Traitement ou stockage inapproprié de l échantillon Contamination Influence des médicaments (interaction médicamenteuse) Influence d une procédure diagnostique précédente Batterie de tests utilisés de façon routinière Tests hématologiques Biochimie sanguine Analyse sanguine Pression sanguine et ECG (électrocardiogramme) Autres tests 1

2 L hématologie: numération formule sanguine, examen hématologique complet Utilise un compteur Coulter (comptage électronique du nombre de cellules sanguines) Spécimen: prise de sang sang: piqûre au niveau du doigt sang: ponction veineuse biopsie de la moelle osseuse Les cellules blanches Analyse quantitative (numération) Et qualitative (formule) des cellules sanguines (globules rouges, globules blanches et plaquettes) Mesure aussi le taux d hémoglobine et l hématocrite puis calcule les indices Les résultats varient physiologiquement en fonction du sexe, de l âge, grossesse et de l ethnie Le nombre varie avec l âge les granulocytes (4,500-11,000 cellules/mm3) neutrophiles 56% (40-74%) éosinophiles 2,7% (0-8%) basophiles 0,3% (0-1.5%) suite Les leucocytes lymphocytes 34% (19-48%) monocytes 7% (3.4-9%) Ces tests donnent des informations générales sur la présence de plusieurs catégories de maladies (R/O anémie, infection, leucémie) La vitesse de sédimentation des érythrocytes (ESR) ESR: erythrocyte sedimentation rate Sédimentation de sang incoagulable dans un tube gradué Test non spécifique de l inflammation Haute teneur de fibrinogène sanguine en présence d inflammation, les globules rouges se collent ensemble, donc ils sédimentent plus vite 2

3 Varie en fonction de l âge et du sexe Montre la présence d une inflammation (ex: artérite à cellules géantes) Non spécifique pour une maladie Test Westergren: sang + diluent Sédimentation 1 heure dans un tube de 20 cm Normal: 0-20 mm/hr Protéine C-réactive Dans les phases aiguës inflammatoires Concentration augmente rapidement dans les infections et inflammations (sert de marqueur biologique) Synthétisée par le foie Plus sensible que le ESR Marqueur précoce Non-spécifique à une maladie particulière Elle joue un rôle dans le système immunitaire (se fixe aux IgG et active le système complément) Elle augmente proportionnellement à l intensité de l inflammation Elle apparaît 6 h après le début Son taux est maximal après 2 jours Peut baisser en moins de 6 h Les tests immunologiques Les tests immunologiques Recherche d anticorps spécifiques en réponse à certaines infections, ou certaines maladies auto-immunes Typiquement, le sérum est mélangé avec un antigène (commercialement préparé) et on observe si des complexes immuns se forment 3

4 Les tests de syphilis Les tests de Syphilis Association avec le SIDA Typiquement les atteintes oculaires se voient aux stades secondaire et tertiaire (maladie suspectée avec une uvéite récidivante, uvéite bilatérale, neurorétinite et papillite) 4 tests FTA-ABS MHA-TP RPR VDRL Le RPR (Rapid Plasma Reagin) Détecte la présence de Ab pour la cardiolipine et non pas la bactérie Détecte des molécules libérées par des cellules endommagées par la bactérie Donc non-spécifique Test de dépistage et de diagnostic de la syphilis Important pour le suivi de l efficacité du traitement antibiotique Un test positif: indique une infection récente et active les titres augmentent rapidement les titres tombent vite avec un traitement effectif (guérison) test répété chaque 3-4 mois pendant un an négativité indique un traitement efficace RPR: agglutination Le FTA-ABS Fluorescent Treponemal Antibody- Absorbed Test Utilise des Ag bactériens pour détecter les Ab spécifiques au tréponème Positif dès l apparition du chancre Confirme un RPR positif (ou faux négatif) Spécifique et sensible (test de choix) Positif pour la vie (sauf chez 10%) 4

5 VDRL test Venereal Disease Research Laboratory test test sérologique non-tréponémal test remplacé par le test RPR utilisé parfois pour tester les spécimens de liquide céphalorachidien beaucoup de faux positifs MHA-TP L hémaglutination des anticorps du tréponème Hémaglutination des globules rouges animaux (mouton ou poussin) qui ont absorbé des Ag du tréponème Faible sensibilité dans la phase initiale de l infection Test spécifique Une fois positif, le demeure à vie Résultat nécessite 1-2 semaines d attente Plusieurs dilutions sont testées Test quantitatif Alternatif au FTA-ABS 5

6 Autres tests hautement spécifiques ELISA Western blot Amplification génique (PCR) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Dosage immuno-enzymatique sur support solide Dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme (agit comme amplificateur) qui libère un composant coloré Ensuite spectroscopie (analyse colorimétrique) Test sérologique (donc on utilise le sérum du patient) On peut aussi détecter des Ag Plaque de 96 puits Grandes sensibilité et spécificité Test rapide Important: rubéole, herpès, CMV, HIV, toxoplasmose, etc Dans le cas du SIDA utilisé en dépistage le Dx est établi après 2 résultats positifs et confirmation par le Western blot entre autre 6

7 1- Ac de capture 2- échantillon ajouté 3- Ac de détection ajouté 4- Ac secondaire lié à l enzyme 5- substrat ajouté et converti Le Western blot Un transfert de protéines et ensuite la détection et l identification de protéines spécifiques Tracé électrophorétique sur gel de polyacrylamide pour séparer les protéines Les protéines sont transférées depuis le gel sur une membrane en nitrocellulose où elles sont exposées à des Ac ou un Ac spécifique Utilise le sérum du patient Ensuite un Ac secondaire est ajouté, il est lié à une enzyme (peroxydase) Elle convertit un colorant soluble en une forme insoluble, de couleur différente, qui précipite à côté de l enzyme, teintant la membrane de nitrocellulose Démontre la ou les bandes spécifiques au pathogène pour que le test soit positif 7

8 Amplification génique PCR: polymerase chain réaction Permet de copier en grand nombre une séquence d ADN connue Nécessite une quantité infime d ADN Utilise des amorces spécifiques (20-25 nucléotides Enzyme utilisée: polymérase recombinante thermostable Principe Synthèse enzymatique d initiation spécifique avec des polymérases thermostables Propriétés d hybridation et de déshybridation des brins complémentaires d ADN en fonction de la température Répétition de cycles de transition de température Thermocycleur: permet de contrôler l activité enzymatique grâce à des transitions de température répétées de manière cyclique Technique: Dénaturation initiale: chauffage à 95 C pendant min Dénaturation 1 (première étape du cycle): 1 min à 95 C Phase d hybridation (2-60 secondes): permet aux amorces sens et anti-sens (en très grande quantité) de s hybrider à l ADN recherché Phase d élongation (4-120 secondes à 72 C): polymérases de synthétiser Recommence le cycle 8

9 PCR (polymerase chain reaction) amplification génique Test très spécifique Très sensible Très rapide Plus d un milliards de copies en moins d une heure 9

10 ANA (anti-nuclear antibody) Autres tests de laboratoire Recherche d anticorps anti-nucléaires Pour détecter plusieurs maladies autoimmunes Technique d immunofluorescence indirecte Pour le lupus (98%), l hépatite chronique et les maladies auto-immunes Anti-ADN Anticorps à ADN bicaténaire Immunofluorescence indirecte Différencie le lupus d autres maladies des tissus conjonctifs Permet d établir le profil d efficacité thérapeutique Facteur rhumatoïde Ce sont des IgM surtout (IgG et A aussi) dirigés contre le fragment constant de nos propres IgG Forment des complexes immuns Test de latex agglutination DDx et suivi de l arthrite rhumatoïde Sensible, non spécifique Peut être + avec Sjögren, sarcoïdose et le lupus Angiotensin converting enzyme (ACE) Dosage de l enzyme de conversion de l angiotensine ou enzyme de conversion enzyme toujours retrouvée dans le sang importante dans la régulation de la pression artérielle (vasoconstriction) peut être élevée avec certaines maladies comme la sarcoïdose active (80% des cas) n indique pas la présence de la sarcoïdose reflète l activité de la maladie diminue avec les stéroïdes positif chez 5% de la population normale dans le cadre d une sarcoïdose, les cellules T stimulent les monocytes faux positifs: enfants, diabétiques, tuberculose et histoplasmose 10

11 Intradermoréaction à la tuberculine, test de Mantoux Dépistage pour exposition à la tuberculose PPD test (purified protein derivative) hypersensibilité cutanée retardée (cellule T) indique exposition à la bactérie et non pas une infection active induration de 10 mm et plus confirmé par radiographie pulmonaire, etc... Test de Mantoux Réaction positive HLA B27 HLA: système complexe d antigènes présents dans le sang établir compatibilité donneur-receveur important pour greffes et transfusions tests de paternité gènes hérités sur une base autosomique co-dominante plusieurs classes (A,B,C,D,DR) plusieurs sous-classes test sanguin 11

12 HLA B27: les associations avec les spondyloarthropathies (séronégatives) Relation avec le développement de l arthrite avec la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse Prédisposition pour les maladies rhumatoïdes comme la spondylite ankylosante et la maladie de Reiter Le diagnostique des maladies rhumatoïdes se fait par radiographie, manifestations cliniques et tests de laboratoire Le work-up des uvéites Important de bien catégoriser l uvéite: âge race sexe antérieure ou postérieure unilatérale ou bilatérale granulomateuse ou non aiguë ou chronique Une uvéite granulomateuse indique la chronicité une implication oculaire postérieure une étiologie systémique une implication systémique work-up systémique toujours positif Uvéite aiguë moins de 6 semaines pas de work-up nécessaire si première uvéite unilatérale non-granulomateuse et qui répond bien au traitement Un work-up est nécessaire si l uvéite est récidivante bilatérale granulomateuse ne répond pas bien au traitement 12

13 Histoire de cas Drogues IV MTS et partenaires transfusions sanguines on élimine SIDA et syphilis Demander: voyages, lieu de résidence (R/O infections endémiques: la maladie de Lyme, l histoplasmose et la tuberculose) maladies auto-immunes dans la famille signes systémiques qui peuvent causer une manifestation oculaire secondaire Cas clinique Femme blanche, 24 ans Uvéite antérieure aiguë unilatérale OD Mère: arthrite rhumatoïde Revient de voyage en Inde On suspecte quoi? Tests On suspecte Arthrite rhumatoïde Syphilis Lupus Tuberculose HLA B27 + TESTS à faire? CBC (état général de sa santé) ANA (R/O lupus) ESR (R/O conditions inflammatoires) C-protéine (R/O conditions inflammatoires) PPD (R/O tuberculose) RF (R/O arthrite rhumatoïde) RPR (R/O syphilis) HLA B27 13

14 résultats CBC légère anémie ANA négatif ESR élevé C-protéine élevé PPD positif HLA B27 négatif RF négatif RPR négatif DONC? On suspecte une tuberculose Patient référé chez un spécialiste des maladies infectieuses et chez un pneumologue (radiographie pulmonaire et tx) Merci Les bactéries L ulcère bactérien Ulcère bactérien S. aureus, S. pneumoniae, P. aeruginosa infiltrats, réaction CA sécrétions mucopurulentes AV atteinte tests de laboratoire tx : AB 14

15 Kit de prélèvement pour grattage cornéen Étalement de produit de grattage sur une lame pour examen direct Examen direct du produit de grattage cornéen: cocci Gram + Coloration Gram 15

16 Les 3 types d hémolyse Antibiogramme (technique par diffusion sur gélose) La mycologie La mycologie Ils peuvent être microscopiques ou macroscopiques Ils ne sont pas activement mobiles Les fongi microscopiques: levures moisissures dimorphiques Ulcère cornéen causé par Fusarium Aspergillus fumigatus mycelia 16

17 Spécimen pris d une cornée montrant des hyphes non septées Les parasites Acanthamoebe Kystes d Acanthamoebe à l examen direct (coloration MCG, grossissement x100) Kératite, biopsie- aspect postopératoire immédiat- Kystes d amibe sur biopsie cornéenne (coloration HES, grossissement x500) 17

18 Kystes, biopsie cornéenne (coloration HES, x1000) PCR amibes: analyse sur gel d agarose des produits d amplification du grattage cornéen Microscopie confocale de la cornée Kystes Brillants Au stroma 18