LES CAHIERS DE L IREB N

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1 LES CAHIERS DE L IREB N Institut de Recherches Scientifiques sur les Boissons (Association loi de 1901) 19, avenue Trudaine PARIS Tél. : +33 (0) Fax : +33 (0) courriel : [email protected].

2 Les Cahiers de l Ireb n 19, 2009 Directeur de la publication : Georges de Saint Blanquat

3 AVANT-PROPOS Le 19 ème colloque scientifique de l Ireb s est tenu à Paris les 3 et 4 décembre 2008, accueilli par la société Diagéo, société adhérente à l Ireb. Ce colloque a rassemblé les 41 équipes de recherches subventionnées par l Ireb en 2007 et/ou 2008, équipes qui ont présenté l essentiel de leurs résultats. La caractéristique de ces colloques de l Ireb réside dans le fait que tout le panel scientifique est susceptible d être couvert, des sciences humaines, historiques et sociales aux sciences biologiques, expérimentales et médicales. Le lien de tous ces travaux reposent sur la molécule «alcool» dont la consommation peut entrainer des effets sociaux, psychologiques, physiologiques, pathologiques. Cette revue des «Cahiers de l Ireb» (sous forme électronique pour la 3 ème fois) contient les articles écrits par les auteurs des communications présentées lors de ce colloque ; l ordre de présentation des textes reprend l ordre et l organisation des sessions de travail, à savoir : inflammation, infection alcoolisation précoce histoire vulnérabilité : impacts psycho-sociaux métabolisme et comportement foie sport vulnérabilité : impacts biochimiques la personne Par ailleurs, lors de ce colloque, Alain Ehrenberg (Cesames, Université Paris 5) a présenté une conférence plénière intitulée «Les neurosciences peuvent-elles permettre de comprendre la vie sociale?»

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5 COMITÉ SCIENTIFIQUE DE L IREB (au 1 er janvier 2009) Présidents d Honneur Jacques WEILL Georges de SAINT BLANQUAT Présidente Marie CHOQUET Vice-président Michel HAMON Membres Laure COM-RUELLE Patrice COUZIGOU Patrick COZZONE Philip GORWOOD Véronique NAHOUM-GRAPPE Didier NOURRISSON

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7 SOMMAIRE 1. «INLAMMATION - INFECTION» PHILIPPE PODEVIN, ARNAUD CARPENTIER, CELINE HERNANDEZ, LYNDA AOUDJEHANE, JEAN-FRANÇOIS MERITET, OLIVIER SCATTON, FILOMENA CONTI, YVON CALMUS ET ARIELLE R. ROSENBERG Effet de l éthanol sur la production de particules infectieuses du virus de l hépatite C en culture primaire d hépatocytes humains adultes...15 ROBERTA J. WARD, RACHEL ALLEN, FREDERIC LALLEMAND, FRANÇOIS SCHOL, MATHIEU ANCEAU, PHILIPPE DE WITTE, LAURA DELLA CORTE ET DAVID DEXTER Identification des changements inflammatoires cellulaires provoqués par le «binge drinking»...21 HAIFA HAMDI, AMELIE BIGORGNE, AXEL BALIAN, LAURENCE BOUCHET-DELBOS, INGRID DURAND-GASSELIN, SOPHIE PREVOT, JOCELYNE DELAVEAUCOUPET, SYLVIE NAVEAU, DOMINIQUE EMILIE, GABRIEL PERLEMUTER Glucocorticoid-induced leucine zipper : une protéine clé dans la sensibilisation des monocytes au lipopolysaccharide au cours de l hépatite alcoolique aiguë «ALCOOLISATION PRECOCE» BRUNO GONZALEZ, PAMELA KWETIEU DE LENDEU, FAIZA EL GHAZI, STEPHANE MARRET, VINCENT LAUDENBACH ET SYLVIE JEGOU Effets de l exposition périnatale à l alcool sur le développement de l endothélium vasculaire cérébral...35 RACHID EL FATIMY, ANNE LE MOUEL, RYMA ABANE, LESLIE SCHWENDIMAN, PIERRE GRESSENS ET VALERIE MEZGER Les facteurs de stress HSF (Heat Shock Factors), médiateurs potentiels des effets de l alcool sur la migration neuronale caractéristiques du SAF dans le cortex cérébral...43 ISABELLE BUISSON, JEAN-FRANÇOIS RIOU ET MURIEL UMBHAUER Les effets de l éthanol sur les mouvements de la gastrulation : une cause à la microcéphalie?...49 BEATRICE BOTIA, PASCAL COSETTE, PHILIPPE CHAN, VADIM LE JONCOUR, ANTHONY FALLUEL, THIERRY JOUENNE, HUBERT VAUDRY ET DAVID VAUDRY Caractérisation de protéines dont l expression est régulée par l éthanol dans les neurones en grain du cervelet de rat...57 MURIEL DARNAUDERY, VINCENT VAN WAES, MIHAELA ENACHE, ANNARITA ZUENA, JEROME MAIRESSE, FERDINANDO NICOLETTI, ELISABETH VINNER, MICHEL LHERMITTE ET STEFANIA MACCARI Stress prénatal et mémoire : effets paradoxaux de la consommation chronique d alcool chez le rat...63 Cahiers de l Ireb n 19,

8 JOHAN LE FEL, PIERRE CHAPILLON ET VINCENT ROY Effets d une alcoolisation prénatale sur les capacités d apprentissage et de mémorisation chez le rat DA/Han : comparaison des effets d une alcoolisation aiguë ou chronique au cours des périodes de neurulation et de neurogénèse hippocampique...71 JENNY MOLET, MICHEL HAMON ET LAURENCE LANFUMEY Conséquences comportementales et neurobiologiques de l exposition précoce à l alcool et/ou à un agoniste des récepteurs cannabinoïdes chez des souris consanguines «HISTOIRE» FABIENNE OLMER La soif celtique et l'impérialisme de Rome. L'économie du vin et ses consommations en Gaule au moment de la conquête de César...85 DIDIER NOURRISSON ET JACQUELINE FREYSSINET-DOMINJON L enseignement antialcoolique à l école former les futurs citoyens ( )...89 THIERRY FILLAUT Les jeunes et le boire en Bretagne pendant le second XXème siècle : un défi pour l'historien...95 ARNAUD MORANGE Ethnographie du trafic de «calva» en Basse-Normandie...99 SEBASTIEN LE PAJOLEC ET MYRIAM TSIKOUNAS L'alcool dans les émissions médicales et les fictions à la télévision : convergences et influences (de 1949 à nos jours) «VULNERATIBILITE : IMPACTS PSYCHO-SOCIAUX» HELENE BEAUNIEUX, ANNE-PASCALE LE BERRE, KARINE PINON, FRANÇOIS VABRET, ANNE-LISE PITEL, PHILIPPE ALLAIN, BEATRICE DESGRANGES ET FRANCIS EUSTACHE Etude de la métamémoire dans l alcoolodépendance au moyen de la mesure «Feeling-Of-Knowing» (FOK) en mémoire épisodique OLIVIA BOEUF-CAZOU, LAURE POURCEL ET MARYSE LAPEYRE-MESTRE Impact de la consommation d alcool sur les fonctions cognitives chez des sujets actifs : résultat de l étude VISAT (vieillissement, santé, travail) MARILYN SKINNER, LAURENT MICHEL ET HENRI-JEAN AUBIN La menace d une réaction aversive réduit-elle le craving d alcool? Etude de la réaction à l exposition au stimulus alcool chez des patients alcoolodépendants Cahiers de l Ireb n 19, 2009

9 AUDREY SCHMITT, MELANIE LOUBEYRE, JULIETTE. RICHETIN, NATHALIE DALLE, JEAN-CHRISTOPHE GIGER, MICHAEL DAMBRUN ET PIERRE-MICHEL LLORCA Etude des représentations sociales qu ont les soignants des patients en difficultés avec l alcool au CHU de Clermont-Ferrand «METABOLISME ET COMPORTEMENT» MICHEL DE LORGERIL, PATRICIA SALEN, MARIE-CLAIRE TOUFEKSTIAN, FRANÇOIS LAPORTE ET LES INVESTIGATEURS DU CONSORTIUM EUROPÉEN IMMIDIET DU 5 ÈME PCRD Alcools, polyphénols et acides gras Oméga XAVIER COMBAZ, MYRIAM CAYRE, YANN LE FUR, PATRICK J. COZZONE ET ANGELE VIOLA Effet du scyllo-inositol sur le métabolisme, l osmorégulation et la plasticité cérébrales LEANDRO F. VENDRUSCOLO, ALIOU B. GUEYE, JANAÍNA C.M. VENDRUSCOLO, PIERRE MORMEDE, MURIEL DARNAUDERY ET MARTINE CADOR Prolonged access to sucrose, but not alcohol, during adolescence alters motivation for sweet and alcohol solutions in adult rats HAKIM HOUCHI, VINCENT WARNAULT, CATHERINE VILPOUX, OLIVIER PIERREFICHE, MARTINE DAOUST ET MICKAEL NAASSILA Vulnérabilité à la dépendance à l alcool après une exposition pendant l adolescence : implication des récepteurs A2A de l adénosine et CB1 des endocannabinoïdes «FOIE» MARIE-CHRISTINE BEAUVIEUX, NIZAR SERHAN, PATRICE COUZIGOU, HENRI GIN ET JEAN-LOUIS GALLIS Effets conjoints et/ou séparés de l éthanol et du resvératrol sur les métabolismes hépatiques et cérébraux chez le rat FATIHA DJOUDI, MARIE-THERESE DIMANCHE-BOITREL, MARTINE CHEVANNE, XAVIER TEKPLI, MARY RISSEL, DOMINIQUE LAGADIC-GOSSMANN ET ODILE SERGENT Implication des caractéristiques membranaires dans la toxicité (stress oxydant et mort cellulaire) induite par l'éthanol : influence d'une surcharge en acides gras THI HONG TUOI DO, FRANÇOIS GABORIAU, ROMAIN MOIRAND, CAROLINE LE LAN, ISABELLE CANNIE, LUCIE GOUFFIER, PIERRE BRISSOT ET GERARD LESCOAT Effet de l éthanol sur la prolifération cellulaire dans la lignée d hépatome humain HepARG : mise en évidence d interrelations avec les métabolismes du fer et des polyamines ETIENNE BLANC, BEATRICE LEGRAND, HELENE ROUACH ET MICHELE GARLATTI Le CYP2E1 et l alcool induisent ATF4, un facteur de transcription central de la réponse aux stress dans les cellules hépatocytaires Cahiers de l Ireb n 19,

10 ISABELLE LAROSCHE, BERNARD FROMENTY, PHILIPPE LETTERON, AMAL CHOUMAR, HOLLY VAN REMMEN, CHARLES J. EPSTEIN, ARLAN RICHARDSON, GERARD FELDMANN, DOMINIQUE PESSAYRE ET ABDELLAH MANSOURI L administration chronique d alcool altère l ADN mitochondrial et la fonction mitochondriale chez des souris transgéniques surexprimant la MnSOD LAETITIA KNOCKAERT, BERNARD FROMENTY ET MARIE-ANNE ROBIN Impact de la localisation mitochondriale du cytochrome P4502E1 sur le stress oxydant induit par l'alcool «SPORT» STEPHANE HEAS, DOMINIQUE BODIN, LUC ROBENE, GAELLE SEMPE, FLORIAN LEBRETON, YANNICK LE HENAFF, DAMIEN PHILIPPE ET GUILLAUME ROUTIER Alcools, sports et études universitaires : des relations étroites DELPHINE MAUREL, NATHALIE BOISSEAU, CLAUDE-LAURENT BENHAMOU ET CHRISTELLE JAFFRE Effets combinés d une consommation chronique d alcool et de l exercice physique sur le contenu, la densité minérale osseuse, l architecture osseuse et le remodelage osseux chez le rat «VULNERABILITE : IMPACTS BIOLOGIQUES» YANN LE STRAT, SABAH KELAI, FLORENCE NOBLE, GILLES MAUSSION, JEAN-MARIE MOALIC, MICHEL SIMONNEAU, PHILIP GORWOOD ET NICOLAS RAMOZ Génétique des comportements addictifs : analyse de gènes candidats de l animal à l homme NICOLAS ETIQUE, ISABELLE GRILLIER-VUISSOZ, JULIE LECOMTE ET STEPHANE FLAMENT Effets de l éthanol sur les cellules cancéreuses mammaires : implication d un cross-talk entre récepteur A 2A de l adénosine et récepteur des œstrogènes SANDRINE LAMY, JACQUES BENICHOU, MARC VASSE, JACQUES WEBER, JEAN-PIERRE GOULLE, MARTINE DAOUST, NICOLE HOUDRET, MICHEL LHERMITTE, STEPHANE MARRET ET FLORENCE THIBAUT Etablir la prévalence de la consommation d alcool chez la femme enceinte en Seine-Maritime en utilisant des dosages biologiques couplés à l Addiction Severity Index «LA PERSONNE» PATRICK MARTIN, JACQUES MASSOL, BERNARD LACHAUX, CHARLES SIEGFRIED PERETT ET LE GROUPE ALQOL Création d une échelle de qualité de vie concernant des sujets souffrant d abus ou de dépendance à l alcool Cahiers de l Ireb n 19, 2009

11 LUCIA ROMO, STEPHANIE MILLE, CINDY LEGAUFFRE, SONIA MARQUEZ, SAMANTHA LELEU, ANGELIQUE EXCOFFIER, CAROLINE GERARD ET JEAN ADES Dimensions de personnalité comme prédicteurs de l évolution de l alcoolodépendance. Comparaison de deux instruments d évaluation : l Inventaire de tempérament de Cloninger (TCI) et l Inventaire de cinq grands facteurs de personnalité de Costa et McCrae (NEO PI-R) CHRISTOPHE MOREAU ET CHRISTOPHE PECQUEUR Facteurs sociaux de régulation des consommations : ethnologie des soirées étudiantes en appartement STEPHANE PERRISSOL, YOAN FOSE, VALERIE LE FLOCH, CHLOE LELOIR, DENIS HILTON ET JACQUES PY Apport d une mesure implicite pour étudier la perception des jeunes à l égard des nouvelles boissons alcoolisées et aromatisées HUGUES PENTECOUTEAU ET OMAR ZANNA Les micro-rituels de l abstinence : quand les alcooliques anonymes prennent la parole Cahiers de l Ireb n 19,

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13 1. «INFLAMMATION - INFECTION»

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15 «Inflammation infection» EFFET DE L ETHANOL SUR LA PRODUCTION DE PARTICULES INFECTIEUSES DU VIRUS DE L HEPATITE C EN CULTURE PRIMAIRE D HEPATOCYTES HUMAINS ADULTES PHILIPPE PODEVIN 1, ARNAUD CARPENTIER 1,2, CÉLINE HERNANDEZ 1, LYNDA AOUDJÉHANE 2, JEAN-FRANÇOIS MÉRITET 1,3, OLIVIER SCATTON 4, FILOMÉNA CONTI 2,4, YVON CALMUS 2,4 ET ARIELLE R. ROSENBERG 1,3 1 Equipe «Virologie de l hépatite C», Institut Cochin, INSERM U567 CNRS UMR 8104, 22, rue Méchain, Paris - France 2 UPRES 1833, Groupe Hospitalier Cochin, 27, rue du Faubourg Saint-Jacques, Paris - France 3 Laboratoire de Virologie, Groupe Hospitalier Cochin - Saint Vincent de Paul, 27, rue du Faubourg Saint-Jacques, Paris - France 4 Pôle médico-chirurgical d Hépato-Gastro-Entérologie, Groupe Hospitalier Cochin, 27, rue du Faubourg Saint-Jacques, Paris - France Summary Clinical studies, including one published by our laboratory, have established that excessive alcohol consumption by patients with hepatitis C increases the viral load and aggravates liver disease. Studies in vitro using subgenomic replicons of hepatitis C virus (HCV) in hepatoma-derived cell lines were undertaken to define the mechanisms underlying this frequent co-morbidity, but have given contradictory results. This questions the relevance of the experimental system used, since (i) it does not allow production of infectious viral particles, and (ii) hepatoma-derived cell lines are only a poor reflection of liver physiology in particular, these transformed cells do not retain the metabolic pathways of ethanol. Our group has now developed a novel experimental system that for the first time enables HCV to be propagated in primary culture of human adult hepatocytes. We verified that hepatocytes retain a differentiated phenotype in these culture conditions, including expression of cytochrome P450 2E1. Addition of ethanol to the culture medium was shown to increase the production of infectious viral particles, mimicking the increased viral load observed in HCV-infected patients with excessive alcohol consumption. Our system thus provides a relevant cell culture-based model for studying the mechanisms of aggravation of HCV infection by alcohol. Mots clefs Culture primaire d hépatocytes humains adultes, métabolisme de l éthanol, virus de l hépatite C, infection productive, charge virale INTRODUCTION L infection par le virus de l hépatite C (VHC) et l alcoolisme sont les deux principales causes de maladies chroniques du foie, avec un risque global de cirrhose d environ 20 % (Alter et Seeff, 2000 ; Hines et Wheeler, 2004). Ces deux pathologies sont par ailleurs fréquemment associées. En effet, chez les patients alcoolo-dépendants, l infection par le VHC est 4 à 50 fois plus fréquente que dans la population de référence (pour une revue générale, voir Singal et Anand, 2007). De multiples études épidémiologiques ont également bien montré qu au cours de l hépatite C chronique, une consommation d alcool d au moins 50 g/j augmente la vitesse de progression de la fibrose hépatique, le risque de cirrhose et de carcinome hépatocellulaire, ainsi que le taux de mortalité (Peters et Terrault, 2002). Sur un plan analytique, la consommation d alcool augmente l activité inflammatoire de l hépatite C, ainsi que la charge virale sérique (Pessione et al., 1998) et intra-hépatique (Romero- Gomez et al., 2001). De manière intéressante, notre équipe a récemment montré que cette augmentation de la charge virale dans le foie corrèle avec une augmentation de l expression hépatique Cahiers de l Ireb n 19,

16 de l un des récepteurs cellulaires présomptifs du VHC, le récepteur des lipoprotéines de faible densité (Carriere et al., 2006). Différentes hypothèses ont été avancées pour rendre compte de ces faits cliniques, en particulier une diminution de la réponse lymphocytaire T (Szabo et al., 2001) et une majoration du stress oxydatif (Singal et Anand, 2007). Cependant, en l absence de modèle animal ou cellulaire pertinent pour rendre compte de la co-morbidité hépatite C/alcoolisme, les quelques rares études in vitro publiées sur ce thème ont utilisé le système du réplicon sous-génomique de VHC en lignée d hépatocarcinome Huh-7, mais ont conduit à des résultats contradictoires quant à l effet de l éthanol sur la réplication virale et discordants quant aux mécanismes impliqués (Zhang et al., 2003 ; Plumlee et al., 2005 ; Trujillo- Murillo et al., 2007 ; McCartney et al., 2008). Ces discordances sont probablement imputables au caractère peu physiologique du modèle expérimental utilisé (versant virus : absence de production de particules virales infectieuses ; versant alcool : cellules tumorales en prolifération, avec perte d expression des enzymes du métabolisme oxydatif de l éthanol). Dans ce contexte, le but de notre travail a été de mettre au point un modèle cellulaire pertinent pour étudier l effet de l éthanol sur l infection par le VHC. Ceci a été réalisé par infection in vitro d hépatocytes humains adultes maintenus en culture primaire, donc exprimant des fonctions différenciées. MATERIEL ET METHODES Isolement et culture primaire d hépatocytes humains Les hépatocytes ont été isolés à partir du tissu d aspect normal de pièces opératoires obtenues à l occasion d hépatectomies pour métastases ou tumeurs bénignes chez des sujets séronégatifs pour le VHC. La dissociation a été obtenue par cathétérisme des vaisseaux visibles, et perfusion d une solution d HEPES-EDTA, puis de collagénase à 0,05 % avec un débit de 10 ml/cathéter/min, selon un protocole publié (Aoudjehane et al., 2007). Les hépatocytes ont été purifiés par centrifugation en gradient de Percoll, puis remis en suspension en milieu L-15 de Leibovitz (Invitrogen) additionné de sérum de veau fœtal (10 %) et d insuline (100 unités/l), et enfin ensemencés à raison de 10 6 cellules viables par puits sur des plaques de six puits préalablement recouvertes de collagène de type I (Sigma). A la fin de la période d attachement des cellules, le milieu a été remplacé par du milieu frais contenant de l hydrocortisone (1 µm) et la culture poursuivie à 37 C en présence de 5 % de CO 2. L apoptose et la nécrose des hépatocytes ont été appréciées régulièrement en cytométrie de flux après marquage à l aide d annexine V couplée au FITC et d iodure de propidium (Aoudjehane et al., 2007). Préparation de stocks viraux et infection des hépatocytes humains primaires Des stocks viraux (VHCcc) ont été constitués par concentration de surnageants de culture de cellules Huh (Zhong et al., 2005) transfectées avec l ARN génomique de l isolat JFH1 du VHC (Wakita et al., 2005). Trois jours après ensemencement, les hépatocytes en culture primaire ont été inoculés avec les particules virales VHCcc à une multiplicité d infection de 0,1. Après adsorption, les cellules ont été rincées trois fois avec une solution saline de tampon phosphate, puis cultivées dans du milieu L-15 complet contenant ou non de l éthanol. Quantification des ARNs intracellulaires Les ARNs totaux des culots cellulaires ont été extraits avec le coffret RNeasy R mini kit (Qiagen). Les transcrits de différents gènes spécifiques des hépatocytes ont été quantifiés par transcription inverse suivie de PCR en temps réel (RT-qPCR) à l aide de la technologie du LightCycler R (Roche). Les ARNs du VHC de polarité positive et négative ont été quantifiés par une technique de RT-qPCR spécifique décrite par notre équipe (Carriere et al., 2007). 16 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

17 «Inflammation infection» Titrage des particules virales dans les surnageants de culture La production de particules de VHC dans les surnageants de culture a été mise en évidence par quantification de l ARN viral à l aide d un test standardisé (expression en unités internationales (UI) par ml) utilisé en routine clinique pour le suivi de la charge virale chez les patients atteints d hépatite C (Abbott HCV RealTime R ), et par mesure de l antigène de capside du VHC à l aide d un test de détection immuno-enzymatique (Ortho-Clinical Diagnostics, Tokyo, Japon). L infectiosité des particules virales produites a été estimée par une méthode classique de titrage (Zhong et al., 2005). Brièvement, des cellules Huh sont mises en présence de dilutions croissantes des surnageants à tester, et cultivées pendant 72 heures. Les foyers infectieux sont alors révélés par immunofluorescence et dénombrés. Le titre infectieux est exprimé en unités formant foyer (uff) par ml de surnageant de culture. RESULTATS ET DISCUSSION Caractérisation du modèle cellulaire Viabilité cellulaire En premier lieu, nous nous sommes attachés à vérifier la viabilité des hépatocytes dans nos conditions de culture primaire. Des observations itératives au microscope à contraste de phase ont montré que l intégrité de la monocouche cellulaire était effectivement préservée au cours de la culture (Figure 1A). De plus, le taux d apoptose et de nécrose apprécié en cytométrie de flux restait inférieur à 10 % tout au long de la culture. Figure 1 : maintien de la viabilité cellulaire et de l expression des fonctions hépatocytaires au cours de la culture primaire Les hépatocytes humains isolés d une pièce opératoire ont été maintenus en culture primaire pendant deux semaines. A) Visualisation de la monocouche au microscope à contraste de phase à différents temps de la culture. B) Expression relative des transcrits de gènes spécifiques des hépatocytes. Fonctions différenciées Dans le foie humain, l éthanol est métabolisé par l alcool déshydrogénase cytoplasmique et le cytochrome P450 (CYP) 2E1 microsomal. Compte tenu de la perte d expression des enzymes du Cahiers de l Ireb n 19,

18 métabolisme de l éthanol dans les lignées dérivées d hépatocarcinomes humains, il nous est apparu indispensable de vérifier que les fonctions différenciées propres aux hépatocytes humains étaient en revanche préservées dans nos conditions de culture primaire. De fait, l expression du CYP 2E1 dans les hépatocytes était maintenue tout au long de la culture (Figure 1B). Il en était de même pour les facteurs de transcription C/EBPβ, HNF-1β, HNF-3β et HNF-4, impliqués dans la différenciation morphologique et fonctionnelle des hépatocytes, pour l albumine, un marqueur de la fonction de synthèse du foie, ainsi que pour le CYP 3A4, impliqué dans le métabolisme de la majorité des xénobiotiques. De l ensemble de ces expériences, nous concluons que, dans nos conditions de culture, les hépatocytes humains conservent leur état de différenciation, incluant la capacité à métaboliser l éthanol. Infection productive par le VHC Réplication du génome viral Dans un premier temps, nous avons cherché à mettre en évidence la réplication du génome du VHC dans les hépatocytes humains primaires inoculés avec les particules VHCcc. Comme le montre la figure 2A, des niveaux croissants d ARN viral de polarité positive étaient détectés dans les extraits cellulaires au cours de la culture. De plus, l ARN viral de polarité négative, un intermédiaire de réplication, était également présent dans les hépatocytes, apportant la preuve définitive de l occurrence d une réplication de novo du génome viral. Production de particules virales infectieuses Dans un deuxième temps, nous avons recherché si de nouvelles particules virales (VHCpc) étaient produites par les hépatocytes humains primaires inoculés avec les particules VHCcc. De fait, l ARN viral et l antigène de capside du VHC étaient détectés en quantités croissantes dans les surnageants de culture (Figure 2B). De plus, les particules VHCpc étaient hautement infectieuses, avec des titres atteignant jusqu à 10 5 uff/ml au cours de la deuxième semaine de culture, comme observé dans l expérience représentative montrée en figure 2. Figure 2 : infection productive dans les hépatocytes humains primaires inoculés avec les particules VHCcc Des hépatocytes humains primaires ont été inoculés avec les particules VHCcc, puis les marqueurs d infection virale ont été suivis au cours des deux semaines de culture. A) Réplication intracellulaire du génome viral. Les cellules ont été lysées à différents temps pour quantification des ARNs viraux de polarité positive et négative. B) Production extracellulaire de particules virales. Les surnageants de culture ont été récoltés à différents temps pour quantification de l ARN viral et de l antigène de capside, et titrage de l infectiosité. 18 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

19 «Inflammation infection» Dans les tentatives d infection in vitro d hépatocytes humains adultes en culture primaire rapportées dans la littérature, seule la réplication intracellulaire du génome du VHC avait pu être démontrée, et ce de manière inconstante et faible (Fournier et al., 1998 ; Rumin et al., 1999). Des résultats présentés en figure 2, nous concluons que, dans nos conditions expérimentales, des hépatocytes humains différenciés non seulement peuvent répliquer activement le génome du VHC, mais en outre produisent des titres analysables de nouvelles particules virales infectieuses. Effet de l éthanol sur la production de particules virales infectieuses Compte tenu du caractère volatil de l éthanol et des temps de culture relativement longs, il nous est apparu important de vérifier la persistance de l éthanol dans le milieu de culture auquel il est additionné. En collaboration avec l équipe de Michèle Garlatti et Hélène Rouach (INSERM UMRS747, Paris), nous avons donc mesuré les concentrations d éthanol au cours du temps par une méthode enzymologique couplée à un dosage spectrophotométrique. Ces expériences ont montré qu environ la moitié de la quantité d éthanol est évaporée chaque jour, nécessitant une compensation quotidienne de la perte. Nous avons alors évalué l effet de l éthanol sur la production de particules virales infectieuses dans des conditions maintenant une concentration de 100 mm. Comme le montre la figure 3, les titres infectieux étaient augmentés de deux à cinq fois sous l effet de l éthanol. Il est intéressant de constater que cet incrément est comparable à celui de la charge virale in vivo chez les patients atteints d hépatite C lors d une consommation d alcool d au moins 30 g/j (Carriere et al., 2006). Figure 3 : augmentation de la production de particules virales infectieuses en présence d éthanol Des hépatocytes humains primaires ont été inoculés avec les particules VHCcc, et cultivés en absence ou en présence d éthanol maintenu à une concentration de 100 mm. Les surnageants de culture ont été titrés à différents temps. La figure présente le facteur d augmentation du titre infectieux en présence d éthanol. CONCLUSION Nous avons mis au point un système de culture cellulaire permettant pour la première fois de reproduire le cycle infectieux complet du VHC dans des hépatocytes humains différenciés. L éthanol augmente la production de particules virales infectieuses dans ce modèle in vitro, mimant ainsi l augmentation de la charge virale observée in vivo chez les malades ayant une consommation excessive d alcool. Nous disposons donc désormais d un modèle cellulaire pertinent pour disséquer les mécanismes physiopathologiques de la co-morbidité hépatite C/alcoolisme. Remerciements : nous souhaitons remercier Michèle Garlatti et Hélène Rouach de nous faire partager leur expérience. Cahiers de l Ireb n 19,

20 Références Alter H.J., Seeff L.B. Recovery, persistence, and sequelae in hepatitis C virus infection: a perspective on long-term outcome. Semin Liver Dis 2000, vol. 20, n 1, p Aoudjehane L., Podevin P., Scatton O., Jaffray P., Dusanter-Fourt I., Feldmann G., Massault P.P., Grira L., Bringuier A., Dousset B., Chouzenous S., Soubrane O., Calmus Y., Conti F. Interleukin-4 induces human hepatocyte apoptosis through a Fas-independent pathway. Faseb J 2007, vol. 21, n 7, p Carriere M., Pene V., Breiman A., Conti F., Chouzenoux S., Meurs E., Andrieu M., Jaffray P., Grira L., Soubrane O., Sogni P., Calmus Y., Chaussade S., Rosenberg A.R., Podevin P. A novel, sensitive, and specific RT-PCR technique for quantitation of hepatitis C virus replication. J Med Virol 2007, vol. 79, n 2, p Carriere M., Rosenberg A.R., Conti F., Chouzenoux S., Terris B., Sogni P., Soubrane O., Calmus Y., Podevin P. Low density lipoprotein receptor transcripts correlates with liver hepatitis C virus RNA in patients with alcohol consumption. J Viral Hepat 2006, vol. 13, n 9, p Fournier C., Sureau C., Coste J., Ducos J., Pageaux G., Larrey D., Domergue J., Maurel P. In vitro infection of adult normal human hepatocytes in primary culture by hepatitis C virus. J Gen Virol 1998, vol. 79, n 10, p Hines I.N., Wheeler M.D. Recent advances in alcoholic liver disease III. Role of the innate immune response in alcoholic hepatitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2004, vol. 287, n 2, p. G310-G314. McCartney E.M., Semendric L., Helbig K.J., Hinze S., Jones B., Weinman S.A., Beard M.R. Alcohol metabolism increases the replication of hepatitis C virus and attenuates the antiviral action of interferon. J Infect Dis 2008, vol. 198, n 12, p Pessione F., Degos F., Marcellin P., Duchatelle V., Njapoum C., Martinot-Peignoux M., Degott C., Valla D., Erlinger S., Rueff B. Effect of alcohol consumption on serum hepatitis C virus RNA and histological lesions in chronic hepatitis C. Hepatology 1998, vol. 27, n 6, p Peters M.G., Terrault N.A. Alcohol use and hepatitis C. Hepatology 2002, vol. 36, n 5 Suppl. 1, p. S220- S225. Plumlee C.R., Lazaro C.A., Fausto N., Polyak S.J. Effect of ethanol on innate antiviral pathways and HCV replication in human liver cells. Virol J 2005, vol. 2, p. 89. Romero-Gomez M., Grande L., Nogales M.C., Fernandez M., Chavez M., Castro M. Intrahepatic hepatitis C virus replication is increased in patients with regular alcohol consumption. Dig Liver Dis 2001, vol. 33, n 8, p Rumin S., Berthillon P., Tanaka E., Kiyosawa K., Trabaud M.A., Bizollon T., Gouillat C., Gripon P., Guguen-Guillouzo C., Inchauspe G., Trepo C. Dynamic analysis of hepatitis C virus replication and quasispecies selection in long-term cultures of adult human hepatocytes infected in vitro. J Gen Virol 1999, vol. 80, n 11, p Singal A.K., Anand B.S. Mechanisms of synergy between alcohol and hepatitis C virus. J Clin Gastroenterol 2007, vol. 41, n 8, p Szabo G., Mandrekar P., Dolganiuc A., Catalano D., Kodys K. Reduced alloreactive T-cell activation after alcohol intake is due to impaired monocyte accessory cell function and correlates with elevated IL-10, IL-13, and decreased IFNgamma levels. Alcohol Clin Exp Res 2001, vol. 25, n 12, p Trujillo-Murillo K., Alvarez-Martinez O., Garza-Rodriguez L., Martinez-Rodriguez H., Bosques-Padilla F., Ramos-Jimenez J., Barrera-Saldana H., Rincon-Sanchez A.R., Rivas-Estilla A.M. Additive effect of ethanol and HCV subgenomic replicon expression on COX-2 protein levels and activity. J Viral Hepat 2007, vol. 14, n 9, p Wakita T., Pietschmann T., Kato T., Date T., Miyamoto M., Zhao Z., Murthy K., Habermann A., Krausslich H.G., Mizokami M., Bartenschlager R., Liang T.J. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med 2005, vol. 11, n 7, p Zhang T., Li Y., Lai J.P., Douglas S.D., Metzger D.S., O'Brien C.P., Ho W.Z. Alcohol potentiates hepatitis C virus replicon expression. Hepatology 2003, vol. 38, n 1, p Zhong J., Gastaminza P., Cheng G., Kapadia S., Kato T., Burton D.R., Wieland S.F., Uprichard S.L., Wakita T., Chisari F.V. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 2005, vol. 102, n 26, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

21 «Inflammation infection» IDENTIFICATION DES CHANGEMENTS INFLAMMATOIRES CELLULAIRES PROVOQUES PAR LE «BINGE DRINKING» ROBERTA J. WARD 1, 2, 3, RACHEL ALLEN 3, FREDERIC LALLEMAND 1, FRANÇOIS SCHOL 1, MATHIEU ANCEAU 1, PHILIPPE DE WITTE 1, LAURA DELLA CORTE 2 ET DAVID DEXTER 3 1 Biologie du Comportement, Université Catholique de Louvain, Place Croix du Sud 1, 1348 Louvain-la-Neuve - Belgique 2 Department Preclinical and Clinical Pharmacology, Florence University, Florence - Italie 3 Department of Cellular and Molecular Neuroscience, Imperial College, Londres - Grande-Bretagne Summary In the present studies, the effect of binge drinking on the immune system has been evaluated in alveolar macrophages isolated from binge drinking rats which had received either 2 or 3g/kg ethanol in a 3 week binge drinking regime. A second in vitro study was performed on the immortalized glial cell line, C6, which has been subjected to «binge drinking» for 2 weeks. After binge drinking, both macrophage and glial cells showed an enhanced nitric oxide (NO) release before and after lipopolysaccharide (LPS) stimulation. This NO increase may be related to the increased release of the amino acid glutamate in the extracellular fluid of the hippocampus after the binge drinking procedure in rats. Mots clefs Cellules phagocytaires, microglie, macrophages, binge drinking, neuro-inflammation INTRODUCTION La prise excessive d éthanol, aussi bien de manière chronique qu épisodique, a de nombreux effets néfastes sur les fonctions biochimiques et physiologiques chez l homme. Au niveau du système nerveux central (SNC), l éthanol induit une toxicité via des modifications des systèmes de neurotransmetteurs spécifiques et des nombreuses voies complexes de signalisation (Ward et al., 2009). L éthanol peut aussi affecter négativement le système immunitaire en augmentant la susceptibilité à l infection du consommateur chronique d éthanol (Szabo, 1998 ; Nelson et Kolls, 2002), et ce particulièrement au niveau de la partie supérieure des voies respiratoires (Perlino et Rimland, 1985 ; Jong et al., 1995). Bien que les effets immunosuppresseurs de l abus chronique d éthanol aient été rapportés, ceux-ci n ont pas encore été étudiés chez des individus faisant du «binge drinking», plus particulièrement chez des adolescents. Le «binge drinking» est un sujet interpellant aussi bien la société que les média et le monde politique (Herring et al., 2008) ; il est aussi considéré comme un problème chez les jeunes. Au cours de l adolescence, le cerveau subit un développement qui implique des modifications dans la neurotransmission et la plasticité, associées à des modifications structurelles dans certaines régions cérébrales comme l hippocampe, le cortex préfrontal et les structures limbiques (Dahl, 2004). Une prise accrue d éthanol durant cette étape du développement cérébral pourrait conduire à une multitude de problèmes comme la perte de mémoire et des déficits cognitifs (Andreasson et Kaufmann, 2001 ; Li et al., 2004). L insuffisance des phagocytes mononucléaires (macrophages et microglie) pourrait jouer un rôle significatif dans la pathogenèse des dommages cérébraux induits par l éthanol. Au niveau du SNC, les cellules gliales sont considérées comme un médiateur de la neuro-inflammation en libérant des cytokines inflammatoires ainsi que de l oxyde nitrique (NO) qui pourraient influencer la survie des cellules neuronales. Cahiers de l Ireb n 19,

22 Dans la présente étude, nous avons analysé chez le rat les effets de l abus épisodique d éthanol sur la fonction des macrophages et de la microglie dans un modèle de «binge drinking». De plus, nous avons étudié par microdialyse intracérébrale les effets de ce même régime de «binge drinking» sur la concentration basale de neurotransmetteurs au niveau de l hippocampe, ainsi que les effets aigus d une dose supplémentaire d éthanol sur ces mêmes neurotransmetteurs. Finalement, nous avons développé un modèle de «binge drinking» in vitro sur une lignée de cellules astrocytaires immortalisées (C6) afin de déterminer l action de l éthanol sur la réponse immunologique de ces cellules à un stimulant ex vivo. MATERIELS ET METHODES Modèle animal de «binge drinking» Des rats femelles de la souche Wistar, d un poids moyen de g au début de l expérience, ont été mis en cage plastique standard et maintenus dans un environnement à température (22 C) et éclairage contrôlés (cycle de douze heures de lumière et douze heures d obscurité, la lumière s allumant à huit heures du matin). Les rattes avaient un accès libre à de la nourriture pour rongeurs vendue dans le commerce ainsi qu à de l eau de distribution. Toutes les procédures concernant les animaux ont été réalisées en strict accord avec les recommandations de la CEE (86/609/CEF) ainsi qu avec la loi belge sur les soins et l utilisation des animaux de laboratoire (Moniteur Belge , p. 3437). Les rattes ont reçu par gavage gastrique une dose d éthanol de 2 ou 3 g/kg d éthanol, trois fois par jour sur une période de six heures pendant deux jours consécutifs suivis de cinq jours d abstinence. Cette période de sept jours correspondait à un cycle. Ce cycle a été répété trois fois. Le jour suivant, le dernier jour de gavage du troisième cycle, une opération chirurgicale a été réalisée comme décrit plus loin. Une expérience de microdialyse a ensuite été réalisée le deuxième jour de gavage du quatrième cycle. Trois heures après le début de la microdialyse, les rattes ont reçu par gavage une dose d éthanol de 2 ou 3 g/kg. La microdialyse s est poursuivie pendant encore cinq heures. Procédure chirurgicale La procédure chirurgicale a été réalisée sur les rattes comme décrit précédemment (Lallemand et al., 2006). Les coordonnées pour atteindre la région hippocampale étaient les suivantes par rapport au point Bregma et à la surface de l os du crâne (Paxinos et Watson, 1982) : A/P = -3,8 mm ; L = -4,4 mm ; V =-5,6 mm, à l extrémité de la partie ventrale de la canule guide. La sonde dont l extrémité faisait 2 mm était perfusée à un flux de 2 ml/minute avec une solution de liquide cérébrospinal artificiel comme décrit précédemment (Lallemand et al., 2006). Les échantillons de microdialysat ont été collectés sur des périodes de 30 minutes pendant huit heures. La microdialyse a été réalisée cinq jours après l opération chirurgicale. Les tubes connectés aux sondes de microdialyse étaient maintenus dans des tubes métalliques à spirales pour permettre une liberté de mouvement aux animaux tout en les protégeant des dommages que ces derniers auraient pu leur infliger. Dosage des acides aminés Les concentrations de glutamate, taurine et GABA ont été estimées dans les microdialysats par HPLC combinée à la fluorométrie après dérivatisation par l OPA (ortho-phtaldialdéhyde) (Bianchi et al., 2003). La position des pics de glutamate, de taurine et de GABA dans les microdialysats a été comparée à celle obtenue avec une solution standard contenant ces acides aminés. Extraction et mise en culture des macrophages alvéolaires Les macrophages alvéolaires ont été isolés par lavage des poumons des rats ayant subi un régime de «binge drinking» à l éthanol ainsi que des rats contrôles. Les rats ont été anesthésiés avec du Nembutal, un cathéter a été inséré dans la trachée, et les poumons ont été lavés doucement avec une 22 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

23 «Inflammation infection» solution saline tamponnée avec des phosphates (PBS) à un ph de 7,4. Les macrophages alvéolaires ont été récupérés après centrifugation à 1200 tours par minute durant dix minutes. Les cellules, à une densité de 1 x 10 5 ou 2 x 10 5, ont été mises dans des puits de plaques de culture avec du milieu Dulbecco supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal ainsi que de la pénicilline (100 µg/ml) et de la streptomycine (100 µg/ml). Les cellules ont été laissées ainsi toute la nuit pour permettre leur adhésion à la surface des puits, puis elles ont été rincées et resuspendues dans du milieu de culture. Les cellules ont ensuite été stimulées avec des lipopolysaccharides [(LPS) 2 µg/ml] et incubées 24 heures de plus. Le surnageant des cultures cellulaires a ensuite été récupéré et aliquoté par fractions de 100 µl. Chaque aliquote a été ensuite mélangée à un volume égal de réactif de Greiss (1 % sulphanilamide, 0,1 % naphtalène diamine dihydrochloride et 2,5 % acide phosphorique) afin de déterminer la concentration de nitrite. La densité optique a été mesurée à une longueur d onde de 540 nm après incubation à température ambiante pendant dix minutes. Une série de concentrations de 1 à 50 µm de nitrite de sodium a été utilisée pour établir la courbe de standard. Etudes de la microglie hippocampale activée Les cerveaux des rats contrôles ainsi que ceux des rats ayant subi le «binge drinking» ont rapidement été prélevés puis fixés à l aide de PBS à un ph de 7,4 contenant 4 % de paraformaldéhyde pendant sept jours. Les cerveaux ont ensuite été placés dans du PBS avec du sucrose à 30 % afin de les cryoprotéger. Puis des sections sérielles d une épaisseur de 30 µm ont été prélevées tout le long de l hippocampe à l aide d un cryostat et stockées à -80 C. Une coloration immunohistochimique spécifique de la microglie activée a été appliquée sur chaque 8 ème section incluant l hippocampe, à l aide de la technique standard utilisant l ovidine-biotine immunoperoxydase (ABC). Au moyen d un microscope Nikon Eclipse E800 équipé d une caméra, la microglie hippocampale activée immunopositive pour OX-6 a été visualisée et quantifiée par référence à une section adjacente colorée avec du crésyl violet. Le nombre moyen de cellules microgliales activées par section de 30 µm a ensuite été déterminé pour chaque animal. Etudes sur les cultures de cellules immortalisées Les cellules astrocytaires C6 ont été fournies par la collection européenne de cellules de cultures (ECCC). Ces cellules ont été cultivées dans des flacons stériles en plastique d une surface de 75 cm 2 avec du milieu de culture Ham F12 supplémenté avec du sérum de veau fœtal, de la pénicilline (1 %) et de la streptomycine (1 %). Les cellules ont ensuite été placées dans des puits de plaques de cultures à une densité de 1 x 10 5 avec le même milieu de culture. De l éthanol à une concentration de 25, 50 ou 100 mm a été rajouté pendant 48 heures (binge 1 x). Le surnageant a ensuite été éliminé et les cellules ont été stimulées avec des LPS (2 µg/ml) pendant 24 heures. Le surnageant a finalement été récupéré et son contenu en nitrite déterminé. Dans une autre série de puits, l éthanol a été ajouté en deux occasions, séparées par cinq jours en présence de milieu de culture normal (binge 2 x). Le contenu en nitrite du surnageant récupéré après stimulation par des LPS pendant 24 heures a ensuite été estimé. RESULTATS ET DISCUSSION Concentrations extracellulaires basales de glutamate, taurine et GABA dans l hippocampe Le régime de «binge drinking» avec 2 et 3 g/kg d éthanol a induit une augmentation significative du taux basal de glutamate mais pas de ceux de la taurine ni du GABA (Figure 1). Cette mesure a été effectuée avant l administration par gavage de la dernière dose d éthanol au cours de la microdialyse. L administration de cette dernière dose de 2 ou 3 g/kg d éthanol n a pas modifié de manière significative les concentrations d aucun de ces acides aminés après cinq heures de microdialyse. Il est donc à noter que trois semaines de «binge drinking» ont induit une augmentation de la concentration basale de glutamate au niveau de l hippocampe. Cahiers de l Ireb n 19,

24 Figure 1 : concentrations basales extracellulaires au niveau de l hippocampe de glutamate, taurine et GABA, après trois semaines de «binge drinking». Les résultats représentent la moyenne ± sem. ** représente une différence significative à P < 0,01. Une augmentation de la libération du glutamate a aussi été mise en évidence dans les cerveaux d autres modèles animaux de «binge drinking» (Szumlinski et al., 2007) ainsi que chez des jeunes alcooliques (Lee et al., 2007). Cependant l origine de cet acide aminé excitateur reste à déterminer. En effet, aucune modification de la concentration basale de glutamate n a été observée dans de nombreuses régions cérébrales suite à une période d intoxication chronique à l éthanol par voie pulmonaire (Dahchour et De Witte, 2003 a et b), bien que l alcoolémie ait atteint 2 g/l dans ces conditions expérimentales. Stimulation par des LPS des macrophages pulmonaires isolés de rats ayant subi un régime de «binge drinking» Les macrophages isolés à partir des poumons des rattes ayant subi un «binge drinking» ont montré, avant stimulation avec des LPS, une augmentation significative de la libération de nitrite dans le milieu de culture par rapport au groupe contrôle qui n a pas reçu d éthanol (Figure 2A). 6 5 a) Non-stimulated cells 200,000 cells ** ** Nitrite content (µm) Control 2g/kg 3g/kg Figure 2A : taux basaux de NO (déterminés à l aide des nitrites) dans les macrophages alvéolaires isolés à partir des rattes ayant subi le «binge drinking» avec 2 ou 3 g/kg d éthanol. Les résultats représentent la moyenne + sd. ** représente une signification de P < 0, Cahiers de l Ireb n 19, 2009

25 «Inflammation infection» b) Stimulated cells ,000 cells ** ** Nitrite content (µm) Controls Stim 2g/kg Stim 2g/kg 3g/kg Stim 3g/kg Figure 2B : effets de la stimulation par des LPS sur la libération de NO (déterminée à l aide des nitrites) par les macrophages alvéolaires isolés à partir des rattes ayant subi le «binge drinking» avec 2 ou 3 g/kg d éthanol pendant trois semaines. Les résultats représentent la moyenne + sd. ** représente une signification de P < 0,01. En outre, les deux doses d éthanol ont aussi induit, après stimulation par des LPS (2 µg/ml), une augmentation significative de la libération de nitrite dans le milieu de culture par rapport au groupe contrôle qui n a pas reçu d éthanol (Figure 2B). Identification de la microglie activée au niveau de l hippocampe des rats ayant subi un «binge drinking» Les deux doses d éthanol, 2 et 3 g/kg, ont induit une augmentation significative de l activation de la microglie au niveau de la région hippocampale par comparaison au groupe contrôle n ayant pas reçu d éthanol (Figure 3). Activated microglia *** * 0 VEH 2g/kg 3g/kg Figure 3 : quantification de la microglie activée par coloration de OX-6 au niveau de l hippocampe des cerveaux de rattes (n = 4 dans chaque groupe) ayant subi le «binge drinking» avec 2 ou 3g/kg. Les résultats représentent la moyenne + sd. * représente une signification de P < 0,05 et ** représente une signification de P < 0,01. Cahiers de l Ireb n 19,

26 Modèle de «binge drinking» sur culture cellulaire La figure 4 montre la libération de nitrite, avant et après stimulation par des LPS (2 µg/ml), par les cellules C6 après incubation avec les différentes doses d éthanol, 25, 50 et 100 mm, après une ou deux occasions (respectivement 1 x et 2 x). La plupart des doses d éthanol a induit une augmentation de la libération de nitrite par la cellule C6. La microglie activée produit de nombreux médiateurs de l inflammation ; parmi ceux-ci, l oxyde nitrique (NO) est largement considéré comme un représentant de l activation de l inflammation (Minghetti et Levi, 1998 ; Lee et al., 2004). Lors de nos études précédentes sur les macrophages isolés à partir de rats alcoolisés chroniquement par voie pulmonaire, nous avons clairement montré qu un tel traitement réduisait leur activation (Zhang et al., 1998). Il était dès lors intéressant qu aussi bien le modèle in vivo (au moyen des macrophages alvéolaires) que le modèle in vitro (au moyen des cellules C6) de «binge drinking», étudiés dans la présente étude, montrent une activation accrue de ces cellules. Cette augmentation survenait aussi in vivo (au moyen des cerveaux) au niveau de la microglie de la région hippocampale, comme observé après coloration immunohistochimique. Une explication possible pour l activation de la microglie in vivo serait l augmentation du taux basal en glutamate dans la région hippocampale. Le glutamate est au niveau du SNC le principal neurotransmetteur excitateur. Il est libéré par les vésicules neuronales glutamatergiques dans la fente synaptique via un mécanisme calcium-dépendant. Les récepteurs NMDA présents au niveau postsynaptique des neurones représentent la voie principale de la neurotoxicité au glutamate. De plus, la microglie, lorsqu elle est activée, libère aussi des quantités substantielles de glutamate, ce qui peut contribuer à la neuro-inflammation. Inversement, un des rôles importants de la microglie est de rapidement recapturer le glutamate pour prévenir cette neurotoxicité. Cette dernière fonction pourrait être compromise après que la microglie soit activée. Figure 4 : libération de NO par les cellules gliales C6 (déterminée par les nitrites). Après administration de 100 mm d éthanol à une (1 x) ou deux (2 x) occasions avant et après stimulation par des LPS. Les résultats représentent la moyenne + sd. ** représente une signification de P < 0, Cahiers de l Ireb n 19, 2009

27 «Inflammation infection» CONCLUSION Les présentes études ont montré que le «binge drinking» active les cellules phagocytiques, comme les macrophages alvéolaires, chez les rattes adolescentes. Cet effet est à l opposé de ce que l on observe lors de l abus chronique d éthanol où cette fonction immunitaire est diminuée. De plus, les études in vivo d un modèle de «binge drinking» ont identifié de la microglie activée au niveau de l hippocampe, après un temps relativement court d un tel abus d éthanol, de l ordre de trois semaines. La neuro-inflammation pourrait donc être un facteur important dans le déclin cognitif observé chez les personnes consommant de l éthanol selon un modèle de «binge drinking» et ce particulièrement chez les adolescentes. Références Andreasson K.I., Kaufmann W.E. Role of immediate early gene expression in cortical morphogenesis and plasticity. Results Prob Cell Differ 2001, vol. 39, p Bianchi L., Ballini C., Colivicchi M.A., Della Corte L., Giovannini M.G., Pepeu G. Investigations on aspartate, glutamate and GABA release from ventral hippocampus during repeated exploratory activity in the rat. Neurochem Res 2003, vol. 28, n 3-4, p Dahchour A., De Witte P. Effects of acamprosate on excitatory amino acids during multiple ethanol withdrawal periods. Alcohol Clin Exp Res 2003a, vol. 27, n 3, p Dahchour A., De Witte P. Excitatory and inhibitory amino acid changes during repeated episodes of ethanol withdrawal: an in vivo microdialysis study. Eur J Pharmacol 2003b, vol. 459, n 2-3, p Dahl R.E. Adolescent brain development: a period of vulnerabilities and opportunities. Keynote address. Ann N Y Acad Sci 2004, vol. 1021, p Herring R., Berridge V., Thom B. Binge drinking: an exploration of a confused concept. J Epidemiol Community Health 2008, vol. 62, n o 6, p Jong G.M., Hsiue T.R., Chen C.R., Chang H.Y., Chen C.W. Rapidly fatal outcome of bacteremic Klebsiella pneumoniae pneumonia in alcoholics. Chest 1995, vol. 107, n 1, p Lallemand F., Ward R.J., Dravolina O., De Witte P. Nicotine-induced changes of glutamate and arginine in naive and chronically alcoholized rats: An in vivo microdialysis study. Brain Res 2006, vol. 1111, n 1, p Lee H., Jeong J., Son E., Mosa A., Cho G.J., Choi W.S., Ha J.S., Kim I.K., Lee M.G., Kim C.Y., Suk K. Ethanol selectively modulates inflammatory activation signalling of brain microglia. J Neuroimmunol 2004, vol. 156, n 1-2, p Lee E., Jang D.P., Kim J.J., An S.K., Park S., Kim I.Y., Yoon K.J., Namkoong K. Alteration of brain metabolites in young alcoholics without structural changes. Neuroreport 2007, vol. 18, n 14, p Li R.C., Row B.W., Kheirandish L., Brittian K.R., Gozal E., Guo S.Z., Sachleben L.R. Jr, Gozal D. Nitric oxide synthase and intermittent hypoxia-induced spatial learning deficits in the rat. Neurobiol Dis 2004, vol. 17, n 1, p Minghetti L., Levi G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog Neurobiolog 1998, vol. 54, n 1, p Nelson S., Kolls J.K. Alcohol, host defence and society. Nat Rev Immunol 2002, vol. 2, n 3, p Paxinos G.,Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press, New York, 1982, 256 p. Perlino C.A., Rimland D. Alcoholism, leukopenia, and pneumococcal sepsis. Am Rev Respir Dis 1985, vol. 132, n 4, p Szabo G. Monocytes, alcohol use and altered immunity. Alcohol Clin Exp Res 1998, vol. 22, n 5 Suppl., p 216S-219S. Szumlinski K.K., Diab M.E., Friedman R., Henze L.M., Lominac K.D., Bowers M.S. Accumbens neurochemical adaptations produced by binge-like alcohol consumption. Psychopharmacology (Berl) 2007, vol. 190, n 4, p Ward R.J., Lallemand F., De Witte P. Biochemical and neurotransmitter changes implicated in alcohol induced brain damage in chronic or «binge drinking» alcohol abuse. Alcohol Alcohol 2009, in press. Zhang Y., Crichton R.R., Boelaert J.R., Jorens P.G., Herman A.G., Ward R.J., Lallemand F., de Witte P. Decreased release of nitric oxide by alveolar macrophages after in vivo loading with iron or ethanol. Biochem Pharmacol 1998, vol. 55, n 1, p Cahiers de l Ireb n 19,

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29 «Inflammation infection» GLUCOCORTICOID-INDUCED LEUCINE ZIPPER : UNE PROTEINE CLE DANS LA SENSIBILISATION DES MONOCYTES AU LIPOPOLYSACCHARIDE AU COURS DE L HEPATITE ALCOOLIQUE AIGUE HAIFA HAMDI 1,2, AMELIE BIGORGNE 1,2, AXEL BALIAN 1,3, LAURENCE BOUCHET-DELBOS 1,2, INGRID DURAND-GASSELIN 1,2, SOPHIE PREVOT 2,4, JOCELYNE DELAVEAUCOUPET 5, SYLVIE NAVEAU 1,2,3, DOMINIQUE EMILIE 1,2,6, GABRIEL PERLEMUTER 1,2,3 1 INSERM U764, 32 rue des Carnets, Clamart Cedex - France 2 Université Paris-Sud, Faculté de Médecine Paris Sud, IFR13, 32 rue des Carnets, Clamart Cedex - France 3 AP-HP, Hôpital Antoine Béclère, Service d Hépato-gastroentérologie, 4 AP-HP, Hôpital Antoine Béclère, Service d anatomo-pathologie, 5 AP-HP, Hôpital Antoine Béclère, Service de radiologie, 6 AP-HP, Hôpital Antoine Béclère, Service de Microbiologie-Immunologie Biologique, 157, rue de la Porte de Trivaux, Clamart Cedex - France Summary Glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ), a recently identified protein induced by glucocorticoids (GCs), inhibits the nuclear factor kappab pathway and the activation of monocytes/macrophages by lipopolysaccharides (LPS). This study aimed to elucidate the contribution of GILZ to the pathogenesis of alcoholic hepatitis (AH): we (1) assessed GILZ expression in the livers of patients with AH and (2) treated patients with severe AH with GCs (prednisolone 40mg/day) and studied the effect of GILZ modulation on circulating monocyte function. We quantified GILZ expression in the livers of 42 consecutive alcoholic patients (21 with and 21 without AH). GILZ messenger RNA (mrna) levels were lower in the livers of patients with AH versus those without AH (P < 0.05). We collected circulating monocytes from patients with severe AH before and 48 hours after GC treatment to quantify GILZ expression and cytokine secretion. GC treatment induced significantly higher levels of GILZ mrna than that observed before treatment and impaired LPSinduced tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and regulated upon activation, normal T cellexpressed secretion (RANTES) by these monocytes. We transfected circulating monocytes with GILZ small interfering RNA (sirna), specifically blocking GILZ expression, to demonstrate the role of GILZ in mediating GC effect. GILZ sirna abrogated the effect of GC treatment on LPS-induced TNFalpha and RANTES secretion. Conclusion: Low expression of GILZ may contribute to liver inflammation in AH. GCs enhance GILZ expression, abrogating macrophage sensitivity to LPS and proinflammatory cytokine secretion. These findings may explain the beneficial effect of GC treatment in patients with severe AH. Mots clefs Cytokine, effet bénéfique, glucocorticoïde, hépatite alcoolique, lipopolysaccharide, macrophage, monocyte, protéine, sensibilité RATIONNEL ET BUT DE L ETUDE Les cytokines pro-inflammatoires jouent un rôle majeur dans la physiopathologie de l hépatite alcoolique. Les cytokines sont produites par de nombreuses cellules, en particulier les monocytes et les macrophages, notamment les cellules de Kupffer (macrophages résidents du foie). Le tumor-necrosis factor alpha (TNF-α), les cytokines induites par le TNF- α et les chimiokines sont des médiateurs clés dans l hépatotoxicité de l alcool. Les formes réactives de l oxygène et le lipopolysaccharide (LPS), un composant membranaire des bactéries commensales gram négatives présentes dans le tube digestif, sont deux activateurs majeurs des cellules de Kupffer dans l hépatite alcoolique. En effet, l ingestion Cahiers de l Ireb n 19,

30 d alcool augmente la perméabilité de la barrière intestinale et induit la diffusion de produits bactériens digestifs au niveau de la veine porte. L hépatite alcoolique aiguë sévère entraîne un risque vital puisque la mortalité peut atteindre 50 à 75 % dès le premier mois. Les glucocorticoïdes sont la seule famille de médicaments qui ont montré une efficacité dans l amélioration de la survie à court terme des patients souffrant d une forme sévère d hépatite alcoolique aiguë définie par un score de Maddrey > 32. Les glucocorticoïdes sont antiinflammatoires et immunosuppresseurs. On suppose que leur effet thérapeutique est lié à leur propriété d inhiber les fonctions des macrophages. Ils inhibent, en effet, la production de cytokines, notamment le TNF-α, l interleukine 1, l interleukine 6, et la production de certaines chimiokines, particulièrement RANTES/CCL5 (Normal T cell-express-secretion), et la migration des leucocytes vers les sites de l inflammation. Néanmoins, les mécanismes moléculaires par lesquels les glucocorticoïdes sont efficaces au cours de l hépatite alcoolique aiguë sont peu connus. La protéine glucocorticoïd-induced leucine zipper (GILZ) a été identifiée dans notre laboratoire à partir de la comparaison de banques d ADN de cellules T murines traitées ou non par Dexametauzone. GILZ est produite chez les sujets sains par les cellules de la lignée monocytaire/macrophagique incluant les cellules de Kupffer. GILZ inhibe le Nuclear-Factor-kappaB (NF-κB). GILZ inhibe la réponse des monocytes/macrophages au LPS en diminuant la production de cytokines pro-inflammatoires. GILZ inhibe également l expression de certains toll-like receptors (TLR) qui jouent un rôle dans la reconnaissance de composés microbiens. Nous avons donc émis l hypothèse qu une diminution de la production de GILZ pourrait contribuer à la physiopathologie de l hépatite alcoolique aiguë et que le traitement par glucocorticoïdes pourrait contrecarrer ce déficit. Nous avons donc adopté une double approche pour tester cette hypothèse. Nous avons tout d abord étudié le niveau d expression de GILZ dans le foie de patients ayant une maladie alcoolique ; dans un second temps nous avons traité les patients ayant une hépatite alcoolique aiguë sévère par glucocorticoïdes et étudié les effets de la modulation de l expression de GILZ sur la fonction des monocytes circulants. MATERIELS ET METHODES Les patients étudiés ont tous été hospitalisés dans le service d hépato-gastro-entérologie de l hôpital Antoine Béclère. Il s agissait de patients ayant une consommation d alcool supérieure à 50 g par jour et n ayant pas d autre maladie hépatique. Une ponction biopsie hépatique a été réalisée par voie transjugulaire chez les patients ayant une hépatite alcoolique aiguë sévère (Maddrey > 32 ; n = 23). L effet du traitement par glucocorticoïdes sur les fonctions monocytaires a été testé sur les monocytes circulants de ces patients. Quarante deux patients ayant une maladie alcoolique du foie ont eu une biopsie par voie trans-pariétale pour comparer la production de GILZ entre les patients ayant une consommation alcoolique excessive mais ayant ou n ayant pas d hépatite alcoolique aiguë. La quantification de GILZ a été faite dans le foie par PCR. Les monocytes circulants ont été récupérés chez un même patient avant ou 48 heures après le début du traitement par Prednisolone. Les monocytes circulants ont été purifiés par centrifugation sur gradient de densité. Le niveau d expression de GILZ a été étudié par PCR en temps réel. Une fraction des monocytes a été cultivée et stimulée ou non par LPS. L expression de GILZ a été inhibée dans ces monocytes en les transfectant avec des petits ARN interférants (ARNsi), spécifiques pour le gène GILZ. L étude statistique a été faite par les tests non paramétriques de Mann-Whitney ou de Wilcoxon. RESULTATS Les 42 patients (n = 42) ont eu une biopsie hépatique par voie trans-pariétale. Ils ont été séparés en deux groupes : 21 ayant une maladie alcoolique et 21 n en ayant pas. Le niveau d expression de GILZ était diminué chez les patients ayant une hépatite alcoolique par rapport à ceux n en ayant pas (17753 ± 3839 vs ± unités arbitraires d ARNm normalisées sur la quantité d actine). Ce résultat montre qu un niveau d expression faible du gène GILZ est associé à la présence d une hépatite alcoolique. 30 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

31 «Inflammation infection» Par des études d immunohistochimie, nous avons montré que GILZ était exprimé dans le foie des patients par les cellules de Kupffer. Le traitement par glucocorticoïdes des patients ayant une hépatite alcoolique aiguë sévère augmente l expression de GILZ dans les monocytes circulants. Les monocytes des patients ont été récupérés avant le traitement par glucocorticoïdes puis 48 heures après. Le traitement par glucocorticoïdes entraînait une augmentation du niveau d expression de GILZ : avant traitement, le niveau était de 1700 ± 198 unités arbitraires de GILZ vs 3093 ± 812 après traitement. Le traitement des patients ayant une hépatite alcoolique aiguë sévère par glucocorticoïdes diminue la production de cytokines pro-inflammatoires par les monocytes stimulés par le LPS. L effet bénéfique des glucocorticoïdes en cas d hépatite alcoolique aiguë sévère pourrait dépendre de la diminution de la production de médiateurs pro-inflammatoires en réponse au LPS. Pour tester cette hypothèse, nous avons analysé la sécrétion de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires par les monocytes des patients avant et après traitement par glucocorticoïdes. Les monocytes circulants ont ainsi été purifiés avant et 48 heures après le début du traitement. La sécrétion de TNF-α et de RANTES en réponse au LPS a été étudiée. La sécrétion de TNF-α était diminuée d environ 75 % après traitement par glucocorticoïdes et celle de RANTES de 80 %. Ces résultats montrent qu un traitement de deux jours par glucocorticoïdes diminue de façon importante la capacité des monocytes circulants des patients ayant une hépatite alcoolique aiguë à produire des cytokines et des chimiokines pro-inflammatoires en réponse au LPS. L expression de GILZ désensibilise les monocytes au LPS. Nous avions donc observé d une part une augmentation de l expression de GILZ dans les monocytes circulants après traitement par glucocorticoïdes et d autre part une diminution de la sécrétion de cytokines et de chimiokines proinflammatoires par ces monocytes. Nous avons donc testé l hypothèse que GILZ était directement impliqué dans la diminution de sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Pour tester cette hypothèse, nous avons spécifiquement bloqué l expression de GILZ en transfectant les monocytes par des petits ARN interférants (ARNsi). Nous avons ensuite étudié l effet de l inhibition de la sécrétion de GILZ sur la production de cytokines et de chimiokines par les monocytes isolés chez les patients avant et 48 heures après traitement par glucocorticoïdes. Les résultats ont montré que l inhibition spécifique de GILZ par des ARNsi abolissait l effet des glucocorticoïdes sur la sécrétion de TNF-α et de RANTES, démontrant clairement que l induction de l expression de GILZ par les glucocorticoïdes est l élément clé dans leur effet anti-inflammatoire chez les patients ayant une hépatite alcoolique aiguë. Ainsi, l administration de glucocorticoïdes à des patients ayant une hépatite alcoolique aiguë sévère stimule l expression de GILZ dans les monocytes circulants, ce qui résulte en une diminution de leur sensibilité au LPS et à une diminution de la synthèse de médiateurs pro-inflammatoires. CONCLUSION Un faible niveau d expression de GILZ pourrait contribuer à l inflammation hépatique au cours de la consommation d alcool. Les glucocorticoïdes augmentent l expression de GILZ et abolissent par ce mécanisme la sensibilité des monocytes au LPS et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Ces éléments pourraient expliquer l effet bénéfique des glucocorticoïdes chez les patients ayant une hépatite alcoolique aiguë sévère. Référence Hamdi H., Bigorgne A., Naveau S., Balian A., Bouchet-Delbos L., Cassard-Doulcier A.M., Maillot M.C., Durand-Gasselin I., Prévot S., Delaveaucoupet J., Emilie D., Perlemuter G. Glucocorticoid-induced leucine zipper: A key protein in the sensitization of monocytes to lipopolysaccharide in alcoholic hepatitis. Hepatology 2007, vol. 46, n 6, p Cahiers de l Ireb n 19,

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33 2. «ALCOOLISATION PRECOCE»

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35 «Alcoolisation précoce» EFFETS DE L EXPOSITION PERINATALE A L ALCOOL SUR LE DEVELOPPEMENT DE L ENDOTHELIUM VASCULAIRE CEREBRAL BRUNO GONZALEZ 1, PAMELA KWETIEU DE LENDEU 1, FAIZA EL GHAZI 1, STEPHANE MARRET 1-2, VINCENT LAUDENBACH 1-2 ET SYLVIE JEGOU 1 1 Inserm Avenir-EA4309 Microvascular Endothelium and Neonate Brain Lesions IHURBM, IFR23, Université de Rouen, 22 boulevard Gambetta, 76183, Rouen - France 2 Département de Pédiatrie Réanimation, Hôpital Charles Nicolle, 76031, Rouen cedex - France Summary Vasculogenesis, i.e., in the formation of new blood vessels from endothelial precursor cells, plays a crucial role during brain development. Indeed, vasculogenesis is concomitant with neurogenesis and supplies nervous cells in oxygen and nutriments. Vasculogenesis is under control of growth factors of the vascular endothelial growth factor family (VEGF). The fact that alcohol affects VEGF expression and angiogenesis in adults prompts us to investigate whether prenatal alcohol exposure may alter the brain microvascularization formation in neonates. Exposure of mouse fetuses and pups to different concentrations of alcohol (0.5 to 3 g/kg) from embryonic day 13 to postnatal day 2 induced a dosedependent reduction of the cortical vascular network. This effect of perinatal exposure to alcohol on vascular development was associated with a clear disorganization of the microvessels network. In particular, while in control animals the microvessels preferentially presented a radial orientation, in alcohol-exposed animals the vessels were randomly distributed. In addition, quantitative RT-PCR experiments revealed that perinatal alcohol treatments reduced the cortical expression of VEGF A and its receptor VEGF-R2. Finally, calcimetry experiments performed on cortical organotypic slices from P2 pups indicated that alcohol was able to affect the activity of microvessels and to inhibit the effect of glutamate on cytoplasmic calcium levels. In conclusion, the present data strongly support the idea that perinatal alcohol exposure affects vascular development as well the VEGF system and they suggest that alcohol-induced developmental abnormalities of the brain could be the consequence of vascular defects. Mots clefs Alcool, vasculogenèse, neurodéveloppement, glutamate, VEGF INTRODUCTION La consommation d alcool au cours de la grossesse peut conduire à des altérations du développement cérébral (Guerri, 2002). En particulier, des séquelles neurologiques peuvent se manifester chez des personnes dont l exposition fœtale à l alcool aura été modérée mais régulière (deux verres de bière ou de vin par jour ; Expertise Collective Inserm «Alcool, effets sur la santé», 2001). La vulnérabilité du système nerveux à l alcool est présente tout au long du processus de neurogenèse. Toutefois, la fin du second et le troisième trimestre de la grossesse constituent une période critique de sensibilité du système nerveux à l alcool (Ikonomidou et al., 2000). Au cours de cette période, la neurogenèse est concomitante avec la vasculogenèse (Pryds, 1991). Ce dernier processus, qui consiste en la mise en place de l arborisation vasculaire, est essentiel au bon développement de l encéphale car il assure aux cellules nerveuses un apport en nutriments, en oxygène et en facteurs trophiques. Des résultats récents obtenus chez le primate jeune adulte montrent que la consommation d alcool réduit la capacité des précurseurs endothéliaux à générer de nouveaux vaisseaux (Williams et al., 2008). Toutefois, alors que chez l enfant une altération du système vasculaire cérébral induit des lésions neurologiques Cahiers de l Ireb n 19,

36 comparables à celles décrites lors d une exposition alcoolique prénatale (Volpe, 1997), les effets de l alcoolisation fœtale sur la vasculogenèse cérébrale ont été très peu étudiés. Le vascular endothelial growth factor (VEGF) est un facteur de croissance initialement découvert pour sa capacité à augmenter la perméabilité vasculaire (Senger et al., 1983). La littérature a rapidement rapporté l existence d une famille de protéines regroupant les VEGF A, B, C, D, E ainsi que le placental growth factor (PLGF). Le VEGF exerce une activité biologique majeure sur les cellules vasculaires endothéliales et joue un rôle clé dans la vasculogenèse et l angiogenèse. A titre d exemple, il a été démontré que le VEGF stimule la prolifération des cellules endothéliales et favorise leur survie (Breier, 2000). In vivo, les rôles fondamentaux du VEGF dans l initiation et le contrôle de la vasculogenèse ont été démontrés au cours de l embryogenèse par l inactivation spécifique du gène dont la perte d un seul allèle est létale pour l embryon âgé de 9,5 jours (Bautch et al., 2000). Les animaux invalidés présentent un blocage de la différenciation des cellules endothéliales et une arborisation vasculaire déficiente (Bautch et al., 2000). Des travaux récents réalisés au laboratoire démontrent, chez la souris nouveau-née, que le VEGF périphérique est en mesure de protéger le cerveau contre l apparition de lésions cérébrales d origine excitotoxique (Laudenbach et al., 2007). De plus, le groupe de De la Monte a montré que l exposition prénatale à l alcool altère le processus de placentation chez le Rat (Gundogan et al., 2008), alors que le placenta constitue une source importante de VEGF et de PLGF (Bautch et al., 2000). Par ailleurs, Radek et al. (2008) ont observé que l effet délétère de l alcool sur l angiogenèse périphérique implique une altération de la réponse des cellules endothéliales au VEGF. Compte tenu de ces données, l objectif de notre étude était de caractériser les effets d une alcoolisation périnatale sur la vasculogenèse cérébrale chez le rongeur nouveau-né. En particulier, nous avons recherché l effet de l éthanol sur l expression corticale du VEGF et de ses récepteurs et nous avons étudié l action de l éthanol sur l activité calcique des cellules vasculaires et sur la mise en place du réseau vasculaire cérébral. MATERIELS ET METHODES Injections in vivo d éthanol chez la femelle gestante et post-parturiente Une injection sous-cutanée (s.c.) de solution saline (NaCl 9 ) ou d éthanol à 50 % (0,5 1 ou 3 g/kg) est effectuée chaque matin chez des femelles gestantes Swiss de type NMRI dès le 13 e jour embryonnaire (E13) jusqu au lendemain de la délivrance. Les souriceaux sont sacrifiés au 2 ème jour après la naissance (P2). Une première partie des cerveaux de souriceaux est post-fixée dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % puis congelée. L autre partie est maintenue sur glace, le cortex est rapidement prélevé puis congelé. Visualisation et quantification du réseau vasculaire cérébral par marquage à l isolectine B4- FITC Les cerveaux post-fixés et congelés sont coupés selon un axe rostro-caudal (45 µm) dans un cryostat (Leica Frigocut 2000E) à -19 C. Les coupes sont incubées dans une solution d isolectine B4-FITC afin de visualiser les microvaisseaux et l acquisition du signal fluorescent est réalisée à l aide d un microscope Leica DMI 6000 couplé au logiciel MetaMorph (Roper Scientific). Les surfaces vasculaires sont calculées par seuillage et segmentation après soustraction du bruit de fond. La surface vasculaire est quantifiée par le ratio de l aire segmentée sur l aire totale de la région d intérêt. Pour chaque animal, douze régions d intérêt ont été analysées au niveau cortical. L orientation angulaire des microvaisseaux a également été quantifiée par le logiciel Metamorph dans les mêmes régions d intérêt. La valeur angulaire 0 a été attribuée aux microvaisseaux orientés de façon radiale dans le neocortex. 36 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

37 «Alcoolisation précoce» Quantification de l expression des ARNm de PECAM, VEGF-A, VEGF-R2 par RT-PCR quantitative Les ARN totaux sont extraits à partir des cortex disséqués et congelés à l aide du kit NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel). Les ARNm sont transcrits à l aide du kit Reverse Transcription System (Promega) en présence de Random hexamers. Les ADNc sont amplifiés en présence des amorces sens et antisens spécifiques des gènes d intérêt et du mélange d amplification SYB Green PCR Master MIX (Applied Biosystems) à l aide du détecteur ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). La quantité d ADNc est calculée selon la méthode du 2 - Ct (Applied Biosystems) en choisissant la glycéraldehyde-3-phosphate deshydrogenase (GAPDH) comme gène de référence. Microfluorimétrie calcique sur tranches organotypiques Les tranches organotypiques (épaisseur 200 µm) sont préparées à partir de cerveaux de souriceaux P2 à l aide d un vibratome Leica VT100S et maintenues jusqu à 24 heures dans un milieu de survie sous atmosphère contrôlée contenant 5 % de CO 2 à 37 C. Les microvaisseaux sont repérés après marquage avec l isolectine B4-FITC. L analyse des variations intracellulaires de calcium ([Ca 2+ ] i ) est réalisée à l aide de la sonde fluorescente ratiométrique Fura 2 et sous microscope à fluorescence Leica DMI 6000 équipé d un système d acquisition rapide couplé au logiciel MetaMorph. RESULTATS Effets d une exposition périnatale aiguë à l alcool sur le poids de la mère, des souriceaux et du nombre de petits par portée L administration d éthanol (1 ou 3 g/kg) chez la femelle du stade E13 à P1 n a pas d incidence significative sur la prise de poids des femelles gestantes (Figure 1A). De même, ni le poids des souriceaux à la naissance ni le nombre de petits par portée ne sont significativement modifiés (Figure 1B). A Poids des mères (g) E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 B Poids des petits à P2 (g) Contrôle Ethanol 1 g/kg Ethanol 3 g/kg Figure 1 : effets d une exposition périnatale aiguë à l alcool sur le poids de la mère et des souriceaux et sur le nombre de petits par portée. A) Une administration quotidienne s.c. d alcool (1 ou 3 g/kg) de E13 à E19 n a pas d influence sur le poids des femelles gestantes. B) Une administration quotidienne s.c. d alcool (1 ou 3 g/kg) de E13 à P1 n a pas d influence sur le poids des souriceaux à P2 et sur le nombre d animaux par portée. Chaque valeur correspond à la moyenne ± E.S.M. d au moins quatre déterminations indépendantes. 2 1 Petits par portée Effets d une exposition périnatale aiguë à l alcool sur le développement du réseau microvasculaire cérébral La visualisation des microvaisseaux cérébraux par l isolectine B4-FITC sur des coupes de cerveaux de souriceaux P2 préalablement soumis à une alcoolisation périnatale à l alcool (1 ou 3 g/kg) révèle une altération du réseau vasculaire cortical par rapport aux animaux contrôles (Figure 2A, B). La Cahiers de l Ireb n 19,

38 quantification de la surface vasculaire démontre une réduction significative et dose-dépendante de la densité vasculaire (Figure 2C, p < 0,001). Cette réduction est associée à une diminution significative du nombre de vaisseaux présentant une orientation radiale (0-25 ) au profit du nombre de microvaisseaux possédant une orientation angulaire supérieure à 25 (Figure 2D). L ensemble de ces données indique que des animaux soumis à une alcoolisation périnatale aiguë présentent une réduction et une désorganisation du réseau microvasculaire cérébral. A B C Surface vasculaire/ surface totale (%) *** *** D Distribution des angles (%) * ** [0-25 [ [25-50 [ [50-75 [ [75-90 [ Contrôle Ethanol 0.5 g/kg Ethanol 1 g/kg Ethanol 3 g/kg ** * Figure 2 : effets d une exposition périnatale aiguë à l alcool sur le réseau microvasculaire cérébral. A) Visualisation des microvaisseaux corticaux de souriceaux P2 dont la mère a reçu une injection s.c. quotidienne de NaCl 0,9 % (contrôle). B) Visualisation des microvaisseaux corticaux de souriceaux P2 dont la mère a reçu une injection s.c. quotidienne d éthanol 3 g/kg. Les flèches indiquent des microvaisseaux marqués par l isolectine B4-FITC et orientés radicalement. C) Quantification de la surface vasculaire dans le cortex de souriceaux P2 dont les mères ont reçu une injection quotidienne de NaCl ou d éthanol (0,5, 1 ou 3 g/kg). D) Quantification de l orientation angulaire des microvaisseaux par rapport à la position radiale dans le cortex de souriceaux P2 dont les mères ont reçu une injection quotidienne de NaCl ou d éthanol (0,5, 1 ou 3 g/kg). Chaque valeur correspond à la moyenne ± E.S.M. d au moins cinq individus. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 vs contrôle (test de Kruskal-Wallis). La barre d échelle représente 200 µm. 38 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

39 «Alcoolisation précoce» Effets d une exposition périnatale aiguë à l alcool sur l expression de gènes représentatifs du système vasculaire L exposition périnatale des souriceaux de E13 à P1 induit une diminution significative de l expression du marqueur endothélial PECAM (Figure 3). L alcoolisation maternelle provoque également une inhibition marquée de l expression du facteur pro-angiogénique VEGF A et du récepteur VEGF-R2 qui relaie les effets pro-angiogéniques du VEGF A (Figure 3). L absence d effet significatif de l éthanol sur les taux d ARNm du gène de ménage β 2 -microglobuline montre la spécificité d action de l éthanol sur le système vasculaire (Figure 3). PECAM VEGF A VEGF-R2 β 2 -microglobuline Niveaux en ARNm (% du contrôle) * * * ** * Contrôle Ethanol 1 g/kg Ethanol 3 g/kg Figure 3 : comparaison de l expression des ARNm PECAM, VEGF A, VEGF-R2 et β2-microglobuline dans des cortex de souriceaux P2 dont les mères ont reçu une injection quotidienne de NaCl (contrôle, n = 15) ou d éthanol (1 g/kg, n = 6 ou 3 g/kg, n = 8). Chaque valeur correspond à la moyenne ± E.S.M. *P < 0,05 ; **P < 0,01 vs contrôle (test de Kruskal-Wallis). Effets ex vivo de l éthanol sur les concentrations de calcium intracellulaire dans des cellules vasculaires cérébrales de souris P2 Des études ex vivo ont été initiées sur des tranches organotypiques de cerveaux de souriceaux P2 afin d étudier les mécanismes intracellulaires mis en jeu par l alcool. L administration de glutamate 1 mm (neurotransmetteur excitateur) stimule fortement le flux calcique dans les cellules vasculaires (Figure 4), seul le traitement à l éthanol 50 mm est sans effet sur la mobilisation calcique intracellulaire des cellules vasculaires. En revanche, l administration d éthanol 50 mm abolit la réponse calcique au glutamate (Figure 4). Cahiers de l Ireb n 19,

40 A A D Ethanol 50 mm B C [Ca 2+ ] intracellulaire (340 nm / 380 nm) Temps (min) Glutamate 1 mm Temps (min) Ethanol 50 mm Glutamate 1 mm Temps (min) 10 Figure 4 : effets de l éthanol 50 mm sur la mobilisation calcique intracellulaire de cellules vasculaires dans des tranches organotypiques de cortex de souris P2. A) Visualisation d un microvaisseau cérébral marqué par l isolectine B4-FITC. B) Visualisation de la charge calcique des cellules vasculaires (têtes de flèches) et nerveuses (flèches). C) Superposition des images (A) et (B). D) Effets de l éthanol (50 mm) sur les flux calciques des cellules vasculaires en condition contrôle ou sous l action du glutamate (1 mm). Chaque valeur correspond à la moyenne ± E.S.M. de 14 cellules. La barre d échelle représente 50 µm. DISCUSSION ET PERSPECTIVES En France, le SAF concerne 10 % des enfants exposés à l'alcool in utero. Les 90 % des autres enfants exposés à l alcool in utero ne sont pas détectables par l'examen clinique ni par des examens biologiques de routine. Ils sont pourtant à risque de développer des troubles des apprentissages (retard intellectuel) qui devraient, pour être traités de façon optimale, être détectés le plus tôt possible (Sapin, 2008). La vulnérabilité du système nerveux à l alcool est présente tout au long du processus de neurogenèse et de vasculogenèse. Compte tenu des effets nocifs largement documentés de l alcool sur le système vasculaire cérébral mature (Altura et Altura, 1999) et du rôle essentiel que joue le VEGF dans la formation des microvaisseaux, nous avons recherché les effets de l alcoolisation en période périnatale sur la microvascularisation cérébrale et le système VEGF du souriceau. A terme, ce projet vise à comprendre les effets de l éthanol sur la vasculogenèse et l angiogenèse afin d identifier des marqueurs à valeur pronostique et d améliorer le dépistage des sujets à risque. La quantification de la surface microvasculaire corticale chez les souriceaux issus de mères alcoolisées fait apparaître une diminution importante et significative du réseau pour les doses de 1 g/kg et 3 g/kg. En revanche, pour une dose plus faible (0,5 g/kg), seule une tendance inhibitrice non significative est 40 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

41 «Alcoolisation précoce» mesurée. Nous observons également une modification importante de l orientation angulaire des microvaisseaux. Chez l animal contrôle, les vaisseaux cérébraux, en s alignant le long de la glie radiaire lors du développement cérébral, présentent une distribution radiale par rapport à la surface corticale. Nous observons, chez les animaux soumis à une alcoolisation, que les vaisseaux perdent cette orientation radiale pour adopter une distribution plus aléatoire. Nos résultats sont confortés par l étude de Radek et al. (2007) qui décrit, chez la souris adulte, une perturbation de l angiogenèse et une incapacité des cellules endothéliales à former des ébauches vasculaires après traitement à l éthanol. La vasculogenèse étant sous le contrôle de facteurs pro-angiogéniques, nous avons également étudié l effet de l alcoolisation périnatale sur l expression de plusieurs gènes cibles. Ainsi, nous avons observé une baisse significative de l expression de PECAM, un marqueur des cellules endothéliales, chez les animaux traités avec la plus forte dose d alcool. Cette diminution de l expression de PECAM s accompagne d une réduction significative de l expression du VEGF A et de son récepteur VEGF-R2 dès la dose de 1 g/kg d éthanol. Dans le système nerveux central, VEGF A et VEGF-R2 sont exprimés par les cellules endothéliales microvasculaires et par les neurones (Ogunshola et al., 2002). L expression du VEGF par les neurones du cortex en développement coïncide de façon spatiale et temporelle avec l angiogenèse (Ogunshola et al., 2000). Par ailleurs, la littérature récente montre que VEGF A et VEGF-R2 jouent un rôle déterminant non seulement dans la vasculogenèse et l angiogenèse mais également dans la neurogenèse (Yasuhara et al., 2004). On peut donc faire l hypothèse que l effet délétère de l alcool que nous observons sur le système VEGF puisse avoir une incidence sur le réseau vasculaire et contribuer ainsi à l action délétère de l alcool sur le cerveau en développement (Ikonomidou et al., 2000). Afin d évaluer de façon dynamique l effet de l éthanol sur les microvaisseaux cérébraux, nous avons développé une technique de tranches organotypiques de cortex de souriceaux P2 marquées par l isolectine B4-FITC afin d étudier ex vivo les effets de l alcool sur l activité calcique des cellules vasculaires. Notre étude révèle que l éthanol 50 mm administré seul est sans effet sur la mobilisation calcique intracellulaire des cellules vasculaires. En revanche, l éthanol abolit la réponse calcique induite par le glutamate. Ces résultats suggèrent un effet direct de l éthanol sur la cellule endothéliale et notamment une interaction avec les récepteurs glutamatergiques. En accord avec cette hypothèse, il est établi que, dans le système nerveux central, l alcool exerce un blocage des récepteurs glutamatergiques NMDA (Ikonomidou et al., 2000) et certaines études récentes montrent l expression du récepteur NMDA par les cellules endothéliales vasculaires (Scott et al., 2007). CONCLUSION Nos travaux démontrent qu une exposition périnatale à l alcool engendre une désorganisation sévère du réseau microvasculaire cérébral. Cet effet est corrélé à une répression génique de facteurs proangiogéniques. Dans la suite de cette étude, nous souhaitons i) déterminer l impact de l alcoolisation fœtale sur l expression protéique de ces mêmes facteurs angiogéniques par la technique de western blot sur extraits de microvaisseaux et ii) rechercher par vidéomicroscopie les effets de l alcool sur la croissance vasculaire dans un modèle de tranches organotypiques. Remerciements : ce travail a bénéficié du soutien de l Ireb, de l Inserm, de l Institut Fédératif de Recherches Multidisciplinaires sur les Peptides (IFRMP 23), du Conseil Régional de Haute-Normandie, de l ANR Neuro 2007 (NéoVasc) et de l Université de Rouen. Mlle Faiza El Ghazi bénéficie d une bourse Inserm-Région. Mlle Pamela Kwetieu de Lendeu bénéficie d une bourse de la Fondation Motrice. Références Altura B.M., Altura B.T. Association of alcohol in brain injury, headaches, and stroke with brain tissue and serum levels of lonized magnesium: a review of recent findings and mechanisms of action. Alcohol 1999, vol. 19, n 2, p Bautch V.L., Redick S.D., Scalia A., Harmaty M., Carmeliet P., Rapoport R. Characterization of the vasculogenic block in the absence of vascular endothelial growth factor-a. Blood 2000, vol. 95, n 6, p Cahiers de l Ireb n 19,

42 Breier G. Function of the VEGF/VEGFR receptor system in the vascular system. Semin Thromb Hemost 2000, vol. 26, n 5, p Coll. Alcool : effets sur la santé. INSERM, coll. Expertise collective 2001, 358 p. Guerri C. Neuroanatomical and neurophysiological mechanisms involved in central nervous system dysfunctions induced by prenatal alcohol exposure. Alcohol Clin Exp Res 2002, vol. 22, n 4, p Gundogan F., Elwood G., Longato L., Tong M., Feijoo A., Carlson R.I., Wands J.R., de la Monte S.M. Impaired placentation in fetal alcohol syndrome. Placenta 2008, vol. 29, n 2, p Ikonomidou C., Bittigau P., Ishimaru M.J., Wozniak D.F., Koch C., Genz K., Price M.T., Stefovska V., Horster F., Tenkova T., Dikranian K., Olney J.W. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science 2000, vol. 287, n 5455, p Laudenbach V., Fontaine R. H., Medja F., Carmeliet P., Hicklin D.J., Gallego J., Leroux P., Marret S., Gressens P. Neonatal hypoxic preconditioning involves vascular endothelial growth factor. Neurobiol Dis 2007, vol. 26, n 1, p Ogunshola O.O., Antic A., Donoghue M.J., Fan S.Y., Kim H., Stewart W.B., Madri J.A., Ment L.R.J. Paracrine and autocrine functions of neuronal vascular endothelial growth factor (VEGF) in the central nervous system. J Biol Chem 2002, vol. 277, n 13, p Ogunshola O.O., Stewart W.B., Mihalcik V., Solli T., Madri J.A., Ment L.R. Neuronal VEGF expression correlates with angiogenesis in postnatal developing rat brain. Brain Res Dev Brain Res 2000, vol. 119, n 1, p Pryds O. Control of cerebral circulation in the high-risk neonate. Ann Neurol 1991, vol. 30, n 3, p Radek K.A., Kovacs E.J., DiPietro L.A. Matrix proteolytic activity during wound healing: modulation by acute ethanol exposure. Alcohol Clin Exp Res 2007, vol. 31, n 6, p Radek K.A., Kovacs E.J., Gallo L.R., DiPietro L.A. Acute ethanol exposure disrupts VEGF receptor cell signaling in endothelial cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008, vol. 295, n 1, p. H174-H184. Sapin V. Alcohol and pregnancy: diagnostic aspects and abnormalities in the placental vitamin A pathway. Ann Biol Clin (Paris) 2008, vol. 66, n 5, p Scott G.S., Bowman S.R., Smith T., Flower R.J., Bolton C. Glutamate-stimulated peroxynitrite production in a brain-derived endothelial cell line is dependent on N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor activation. Biochem Pharmacol 2007, vol. 73, n 2, p Senger D.R., Galli S.J., Dvorak A.M., Perruzzi C.A., Harvey V.S., Dvorak H.F. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science 1983, vol. 219, n 4587, p Volpe J.J. Brain injury in the premature infant. Neuropathology, clinical aspects, pathogenesis and prevention. Clin Perinatol 1997, vol. 24, n 3, p Williams J.K., Baptista P.M., Daunais J.B., Szeliga K.T., Friedman D.P., Soker S. The effects of ethanol consumption on vasculogenesis potential in nonhuman primates. Alcohol Clin Exp Res 2008, vol. 32, n 1, p Yasuhara T., Shingo T., Date I. The potential role of vascular endothelial growth factor in the central nervous system. Rev Neurosci 2004, vol. 15, n 4, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

43 «Alcoolisation précoce» LES FACTEURS DE STRESS HSF (HEAT SHOCK FACTORS), MEDIATEURS POTENTIELS DES EFFETS DE L ALCOOL SUR LA MIGRATION NEURONALE CARACTERISTIQUES DU SAF DANS LE CORTEX CEREBRAL RACHID EL FATIMY 1, ANNE LE MOUEL 1, RYMA ABANE 1, LESLIE SCHWENDIMAN 2, PIERRE GRESSENS 2 ET VALERIE MEZGER 1 1 CNRS UMR 8541 «Génétique Moléculaire» et IFR36, Ecole Normale Supérieure, 46 rue d Ulm, Paris - France 2 INSERM U676, Hôpital Robert Debré, Service de Neurologie Pédiatrique, 48, boulevard Sérurier, Paris - France Summary Heat Shock Factors (HSFs) do not only orchestrate the response to environmental stress, but are involved in developmental processes. We demonstrated that HSF2 is involved in normal brain cortical development, by modulating the expression of genes involved in the migration of young neurons in fetal mice: Hsf2 -/- embryonic cortices display radial neuronal migration defects. We are interested by the intriguing role of HSF1 and HSF2 as coordinators between stress and development. On the one hand, alcohol is known to activate HSF1 ex vivo (Li, 1983). On the other hand, it has long been known that chronic alcoholic intoxication (CAI) causes, in the human fetal cortex, neuronal migration defects characteristic of fetal alcohol syndrome (FAS). However, the molecular mechanisms underlying these defects remain elusive (Gressens, 2000). We therefore suspected that HSFs might be involved in the neuronal migration defects characteristic of FAS. We hypothesized that CAI disturbs HSF1/HSF2 activities in fetal cortices. Such alterations could disturb the expression of target genes that contain HSE and are regulated by HSF2 during normal neuronal migration. The mechanisms by which CAI induces a long-term activation of HSF1 as well as the physical and functional interplay between HSF1 and HSF2 in eliciting the migration defects characteristic of FAS are discussed. Mots clefs SAF (ou Syndrome d'alcoolisation fœtale), Heat Shock Factors, cortex embryonnaire, migration neuronale INTRODUCTION Les facteurs HSFs Les facteurs de transcription HSF (Heat Shock Factors) ont été identifiés par leur capacité à répondre à une large variété de stress environnementaux, et à induire une réponse appelée historiquement «réponse au choc thermique». Ces stress, comme le choc thermique, ou l exposition aux métaux lourds, mais aussi diverses situations physiopathologiques comme la fièvre, les lésions neuronales ou le vieillissement, ont en commun de provoquer la dénaturation des protéines cellulaires et de causer leur agrégation cytotoxique. Chez les eucaryotes supérieurs, la réponse au choc thermique est caractérisée par l activation d un facteur HSF, présent dans la cellule à l état latent, qui permet la transactivation des gènes de choc thermique ou Hsp (Heat Shock Proteins). Les gènes Hsp codent pour la plupart des chaperons moléculaires capables d assister la renaturation des polypeptides endommagés par le stress ou bien de les engager dans les voies de dégradation par le protéasome (Åkerfelt et al., 2007). Cahiers de l Ireb n 19,

44 Trois HSF sont présents chez les mammifères : HSF1, HSF2 et HSF4 (Pirkkala et al., 2001). Leurs parties N-terminales partagent un domaine très conservé de liaison à l ADN, qui permet la reconnaissance d un élément de séquence HSE, présent en amont des gènes Hsp. Ce domaine est suivi d un domaine de trimérisation de type leucine zipper. HSF1 est le facteur responsable de la réponse au stress chez les mammifères (McMillan et al., 1998 ; Xiao et al., 1999). Il passe d un état latent et inactif dans la cellule en conditions normales à un état trimérique, nucléaire et capable de lier HSE. Indépendamment de cette transition monomère-trimère et de l acquisition de la capacité à lier l ADN, HSF1 va acquérir des capacités de transactivation. Ces capacités sont gérées par toute une série de modifications post-traductionnelles. Les caractéristiques de la réponse au choc thermique Comme l indique la terminologie de «réponse au choc thermique», l écrasante majorité des études sur l activation de HSF1 a été faite en examinant les effets du choc thermique (HS, Heat Shock). Cette réponse est universelle : à de rares exceptions près, toutes les cellules répondent au choc thermique en activant HSF1 qui induit la transcription des gènes Hsp codant des chaperons moléculaires capables d assister la renaturation des polypeptides dénaturés. L exposition au choc thermique n a aucun effet sur les niveaux de protéine HSF1. On observe uniquement l activation d un HSF1 présent dans la cellule à l état monomérique inactif, latent, qui sous l effet du choc thermique devient trimérique, acquiert la capacité à lier l ADN sur des éléments de séquences très conservés HSE et acquiert également, par toute une série d étapes rapides, des capacités de transactivation. L acquisition des capacités de liaison à l ADN de HSF1 repose sur une désacétylation du facteur (Westerheide et al., 2009). L acquisition de ces capacités transactivatrices repose en particulier sur la phosphorylation induite par le choc thermique de résidus Ser 230 et Thr 141 (Holmberg et al., 2001, 2002 ; Soncin et al., 2003). Une des caractéristiques de l activation de HSF1 par le choc thermique est qu elle est transitoire, même si l on applique à la cellule un choc thermique persistant. Cela est dû à une boucle de rétroaction négative qui implique les Hsp70 et HSP90 capables de désactiver HSF1, mais qui repose aussi sur l hyperphosphorylation de HSF1 lors du choc thermique et la ré-acétylation du facteur (Westerheide et al., 2009). C est le phénomène d atténuation. Des événements de sumoylation sont capables d exercer un pouvoir tampon sur l activité transcriptionnelle du facteur HSF1. En particulier, la sumoylation de HSF1 repose sur la phosphorylation de résidus Ser303/307 et la persistance de cette modification est fonction de la sévérité du stress. Plus le stress est sévère, plus la sumoylation est transitoire (Hietakangas et al., 2003, 2006). Par rapport à cette réponse «historique» au choc thermique, nous verrons que les effets sur HSF1 de l exposition chronique à l alcool présentent des caractéristiques très différentes. Le rôle du facteur HSF2 dans le développement du cortex cérébral Le rôle du facteur HSF2 dans la réponse au stress reste encore énigmatique puisqu il est classiquement connu pour être inactivé par le choc termique. Nous avons montré que HSF2 est abondant et actif pour la liaison à HSE au cours du développement, en conditions normales, au cours de la spermatogenèse, de l ovogenèse et du développement du cerveau. L analyse du phénotype des souris Hsf2 -/- générées au laboratoire a montré que ce facteur est requis pour la méiose chez les deux sexes, avec une action sur la ploïdie et l appariement des chromatides sœurs (Kallio et al., 2002). En ce qui concerne le développement du cerveau, HSF2 influe sur la migration neuronale radiaire qui sous-tend l établissement des couches du cortex en modulant finement l expression de gènes connus pour être impliqués dans la migration neuronale via un contrôle étroit de la dynamique des microtubules (Chang et al., 2006). 44 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

45 «Alcoolisation précoce» La problématique Si un facteur HSF est impliqué dans le développement en conditions normales, quelles en sont les conséquences quand le développement se déroule en conditions de stress? Le syndrome d alcoolisation fœtale (SAF) se caractérise entre autres par des défauts de migration neuronale radiaire, mais les bases moléculaires qui sous-tendent cet effet sont encore mal connues (Gressens, 2000). L exposition courte à l alcool active le facteur de transcription HSF1 dans des cellules ex vivo (Zhong et al., 1998). Nous avons donc fait l hypothèse que les HSF puissent être des médiateurs de ces défauts migratoires. En effet, les facteurs HSF1 et HSF2 ayant la capacité de se lier aux mêmes sites HSE sur l ADN, des perturbations de leur activité par l alcool devraient amener des modifications de l expression des gènes cibles de migration et sous-tendre ainsi les défauts de migration. LES MODIFICATIONS D ACTIVITES DES FACTEURS HSF1 ET HSF2 SOUS L EFFET DE L INTOXICATION CHRONIQUE A L ALCOOL SOUS-TENDENT LES MODIFICATIONS D EXPRESSION DES GENES DE MIGRATION NEURONALE Nous avons analysé par EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay ou gel-retard) les activités HSF de liaison à HSE dans les cortex embryonnaires, après intoxication chronique à l alcool des fœtus de souris in utero. Nous avons montré que l intoxication chronique de fœtus à l alcool (ICA) provoquait une activation de HSF1 pour la liaison à HSE et une perturbation de l activité de HSF2. Nous avons déterminé, par RT-PCR en temps réel, le niveau d expression des gènes normalement cibles de HSF2, impliqués dans la migration neuronale : nous avons montré qu en corrélation avec les perturbations des activités de HSF1 et HSF2, le niveau d expression de ces gènes était modifié. SIGNATURES POST-TRADUCTIONNELLES SPECIFIQUES DE L ALCOOL SUR LE FACTEUR HSF1 OU COMMENT L ALCOOL PROVOQUE UNE ACTIVATION DURABLE DE HSF1 Lors de cette étude, se sont dégagées deux observations qui permettent de supposer une signature particulière de la réponse à l exposition chronique à l alcool vis-à-vis de HSF1 et des caractéristiques de réponses distinctes des cellules souches neurales par rapport aux jeunes neurones corticaux embryonnaires. Un des enjeux de notre étude était de savoir si oui ou non le facteur HSF1 allait être activé par un stress continu à l alcool (ICA), appliqué pendant toute la gestation. Cette question n était pas triviale puisque le choc thermique persistant n est pas capable d activer HSF1 de façon durable. Or, l un de nos résultats les plus importants montre qu effectivement l activité de liaison à l ADN de HSF1 est observée de façon persistante sous l effet de l intoxication chronique à l alcool. Notre but est de comprendre par quel mécanisme et à travers quelles modifications posttraductionnelles l ICA est capable d induire l activation du facteur HSF1 d une manière continue. Grâce à des expériences d immunoprécipitation utilisant des anticorps anti-hsf1 et divers anticorps dirigés contre SUMO-1 ou 2, contre les résidus sérine ou thréonine phosphorylés ou encore contre les résidus lysine acétylés, nous étudions le niveau des modifications post-traductionnelles correspondantes du facteur HSF1 dans les cortex en développement intoxiqués par l alcool de façon chronique ou aiguë (injection péritonéale). Nous utilisons aussi des lignées de cellules en culture pour comparer choc thermique, stress alcoolique aigu ou chronique. Grâce à des expériences utilisant un gène reporter HSE-Luciférase dans des cellules COS ou MEFs, nous estimons quelle est la résultante de ces modifications post-traductionnelles caractéristiques de l alcool sur les capacités transcriptionnelles de HSF1. Cahiers de l Ireb n 19,

46 SIGNATURE TRANSCRIPTIONNELLE INEDITE DE L ALCOOL SUR LE GENE HSF1 Contrairement au dogme établi en ce qui concerne la réponse au choc thermique (HSR), nous avons observé que les niveaux de protéine HSF1 sont augmentés par l intoxication chronique à l alcool. Cette observation constitue une donnée cruciale, à la fois dans le domaine du choc thermique, mais aussi pour comprendre le mécanisme par lequel l alcool peut avoir un effet dans le cerveau en développement lors d une intoxication chronique. Nos résultats montrent que les niveaux élevés de HSF1 sont dus à une augmentation du taux d ARNm Hsf1 dans les cortex en développement soumis à l ICA, sans stabilisation des ARNm Hsf1 sous l effet de l alcool. C est bien la transcription du gène Hsf1 qui est augmentée par l intoxication chronique à l alcool dans les cortex en développement, comme le démontrent des expériences de run-on mesurant le taux d initiation de la transcription sur le gène et des expériences d immunoprécipitation de chromatine (ChIP) estimant le taux d occupation du gène Hsf1 par l ARN polymérase II. Le facteur responsable de cette activation transcriptionnelle est identifié et nous recherchons donc par ChIP, parmi ses sites de liaison à potentiels présents dans le gène Hsf1, quels sont les sites réellement liés par ce facteur de façon inductible par l alcool. Nous étudions aussi la voie de signalisation par laquelle l alcool provoque l activation de ce facteur et par là l activation de la transcription du gène Hsf1 (notons qu il ne peut y avoir d activation du gène Hsf1 par HSF1 lui-même puisque le gène Hsf1 ne contient pas de sites HSE). MISE EN EVIDENCE D UNE INTERACTION SPÉCIFIQUE DE L ALCOOL AVEC HSF1 ET HSF2 Dans le cortex en développement, c est le facteur HSF2 qui est constitutivement actif et régule la migration neuronale radiaire dans des conditions normales. En ce qui concerne la réponse au stress, le rôle de HSF2 reste obscur. En effet, il est clairement inactivé par le choc thermique. Pourtant il semble influencer l activité de HSF1 en réponse à divers stress (He et al., 2003 ; Loison et al., 2006 ; Östling et al., 2007). Le rôle de HSF2 dans la réponse au stress passe vraisemblablement par des interactions physiques et fonctionnelles avec HSF1. A cet égard encore, la réponse à l alcool est exemplaire. En particulier, nous nous attendions à une inactivation brutale de HSF2 lors de l exposition à l alcool, comme c est le cas lors du choc thermique. Nous avons constaté, au contraire, qu on conservait une activité HSF2, mais présente dans des complexes avec HSF1. On observe avant stress, sur des extraits de cortex embryonnaires, des complexes HSE par EMSA qui sont dus uniquement à HSF2, ainsi que le montre un retard supplémentaire de migration (supershift) en présence d anticorps anti-hsf2, mais pas d anti-hsf1. Après choc thermique, les complexes ne contiennent plus de HSF2, mais uniquement du HSF1. Dans le cas d une ICA ou d une exposition aiguë à l alcool, on observe la formation d un complexe HSF- HSE qui est déplacé entièrement par l anticorps HSF1, mais aussi par l anticorps HSF2, et qui présente une migration différente des complexes HSF1-HSE ou HSF2-HSE classiques. De plus, grâce aux souris Hsf2 -/-, nous avons montré que HSF2 est requis dans le cortex prénatal pour que HSF1 soit capable de lier HSE en ICA. En absence de HSF2, l alcool n active pas le facteur HSF1. L alcool fait donc intervenir des interactions physiques et fonctionnelles inédites entre les HSF et révèle pour la première fois un rôle crucial de HSF2 pour l activité de HSF1. Les facteurs HSF1 et HSF2 possédant des domaines d oligomérisation très semblables, il a été depuis longtemps supposé que ces facteurs devaient pouvoir former non seulement des homotrimères, mais également des hétérotrimères. Cependant, ils n ont jamais pu être mis en évidence. Leur mise en évidence est rendue complexe par le fait que les homotrimères HSF1 sont capables d interagir entre eux (Clos et al., 1990 ; Xiao et al., 1991) pour former des structures de type hexamère, rendant difficile la distinction entre hétérocomplexes (assemblage d un homotrimère HSF1 et d un homotrimère HSF2) et hétérotrimères stricts. 46 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

47 «Alcoolisation précoce» Cependant, l existence d hétérotrimères est importante car elle permettrait un niveau de subtilité supérieure dans la régulation des gènes cibles : par la modulation de l affinité pour certains gènes cibles - et pas par d autres - en fonction des variations fines de la séquence HSE ou de sa position dans le gène ; par la modulation de l activité transcriptionnelle, etc. Dans notre cas, l alcool induit la formation de complexes à migration caractéristique, différente de ce qui est observé dans le choc thermique, et entièrement déplacés par l anticorps anti-hsf2 ou anti- HSF1. Ceci milite pour l existence de tels hétérotrimères. Nous entreprenons donc de les caractériser par diverses techniques biochimiques et d imagerie : par gradient de sucrose ou gelfiltration en conditions non-dénaturantes en utilisant des cellules ou cortex fœtaux après ICA, couplé avec une analyse de la composition des trimères dans les fractions en Western blot ; par pontage EGS entre HSF1 et HSF2, qui ne permet le pontage qu entre résidus proches de 16 Å et analyse par Western blot ; par analyse Scatchard de l affinité de liaison à l ADN de ce complexe qui devrait être intermédiaire entre celui de HSF1 et celui de HSF2 (plus faible) ; enfin, par FACS/FRET, en utilisant des constructions HSF1-YFP et HSF2-CFP établies au laboratoire. ROLES RESPECTIFS DE HSF1 ET HSF2 DANS LE SAF Il est admis que la réponse au stress par synthèse de chaperons moléculaires est bénéfique à la cellule. Dans le cas du SAF, il est néanmoins permis de se demander si les taux de HSF1 ou HSF2 dans le cerveau en développement pourraient constituer une base de sensibilité à l alcool. Est-il bénéfique ou non d activer HSF1 puisque cette activation, certes permet la synthèse de chaperons moléculaires capables de prendre en charge certains dommages occasionnés par l alcool, mais engendre aussi une perturbation de l expression des gènes de migration neuronale? Quel impact ont la présence et la persistance de HSF2 dans les cortex soumis à l ICA? Il est donc important de déterminer si la présence ou l absence de HSF1 (ou HSF2) constitue une base de sensibilité particulière au SAF. Chez la souris en effet, on observe une variation étonnante du taux de HSF1 dans le cortex entre souches distinctes. Afin de démêler l importance relative des facteurs HSF1 et HSF2 dans le SAF, nous étudions donc dans les cortex embryonnaires l impact de l absence de HSF1 ou HSF2 sur les défauts de migration induits par l alcool par analyse histologique d embryons Hsf1 -/- ou Hsf2 -/-. Nous estimons également l impact de la perte d un facteur HSF sur la localisation subcellulaire du HSF restant après exposition à l alcool, in vivo et ex vivo sur des lignées cellulaires en culture Hsf1 -/- ou Hsf2 -/-, ou encore par ARNi contre HSF1 ou HSF2. Nous tentons de déterminer par ChIP si l occupation des sites HSE sur les gènes cibles contrôlant la migration neuronale avant et après alcool et les gènes Hsp est modifiée par l absence d un des deux HSFs. Enfin, nous examinons les conséquences de cette occupation ou perte totale d occupation sur l expression des gènes cibles par RT-PCR en temps réel dans les Hsf1 -/- ou Hsf2 -/- ou ex vivo par ARNi sur cellules. Les souris Hsf2 -/- ont été produites au laboratoire (Kallio et al., 2002 ; Chang et al., 2006). Les souris Hsf1 - sont utilisées en collaboration avec le laboratoire d Elisabeth Christians (Xiao et al., 1999 ; Christians et al., 2000). Ces études récentes sur l alcool révèlent que les facteurs HSFs sont vraisemblablement des médiateurs de certains effets du SAF concernant la migration neuronale radiaire. Elles révèlent également des mécanismes de dysrégulation insoupçonnés des HSFs par l alcool par des voies transcriptionnelles et post-traductionnelles. Enfin, elles mettent en lumière un pan encore mal connu de l importance des interactions entre HSFs : celui de la dépendance de HSF2 vis-à-vis de HSF1 pour son activation par l alcool. Cette dépendance passe sans doute par la formation d hétérotrimères HSF1/HSF2, dont la mise en évidence est pertinente pour notre compréhension du SAF. Les niveaux de HSF1 et HSF2 constituent donc peut-être une base de sensibilité au SAF qui peut être estimée par l emploi de modèles animaux chez lesquels les gènes Hsf1 et Hsf2 ont été inactivés. Références Åkerfelt M., Trouillet D., Mezger V., Sistonen L. Heat shock factors at a crossroad between stress and development. Ann N Y Acad Sci 2007, vol. 1113, p Cahiers de l Ireb n 19,

48 Chang Y., Ostling P., Akerfelt M., Trouillet D., Rallu M., Gitton Y., El Fatimy R., Fardeau V., Le Crom S., Morange M., Sistonen L., Mezger V. Role of heat-shock factor 2 in cerebral cortex formation and as a regulator of p35 expression. Genes Dev 2006, vol. 20, n 7, p Clos J., Westwood J.T., Becker P.B., Wilson S., Lambert K., Wu C. Molecular cloning and expression of a hexameric Drosophila heat shock factor subject to negative regulation. Cell 1990, vol. 63, n 5, p Christians E., Davis A.A., Thomas S.D., Benjamin I.J. Maternal effect of Hsf1 on reproductive success. Nature 2000, vol. 407, n 6805, p Gressens P. Mechanisms and disturbances of neuronal migration. Pediatr Res 2000, vol. 48, n 6, p He H., Soncin F., Grammatikakis N., Li Y., Siganou A., Gong J., Brown S.A., Kingston R.E., Calderwood S.K. Elevated expression of heat shock factor (HSF) 2A stimulates HSF1-induced transcription during stress. J Biol Chem 2003, vol. 278, n 37, p Hietakangas V., Ahlskog J.K., Jakobsson A.M., Hellesuo M., Sahlberg N.M., Holmberg C.I., Mikhailov A., Palvimo J.J., Pirkkala L., Sistonen L. Phosphorylation of serine 303 is a prerequisite for the stress-inducible SUMO modification of heat shock factor 1. Mol Cell Biol 2003, vol. 23, n 8, p Hietakangas V., Anckar J., Blomster H.A., Fujimoto M., Palvimo J.J., Nakai A., Sistonen L. PDSM, a motif for phosphorylation-dependent SUMO modification. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, vol. 103, n 1, p Holmberg C.I., Hietakangas V., Mikhailov A., Rantanen J.O., Kallio M., Meinander A., Hellman J., Morrice N., MacKintosh C., Morimoto R.I., Eriksson J., Sistonen L. Phosphorylation of serine 230 promotes inducible transcriptional activity of heat shock factor 1. EMBO J 2001, vol. 20, n 14, p Holmberg C.I., Tran S.E., Eriksson J.E., Sistonen L. Multisite phosphorylation provides sophisticated regulation of transcription factors. Trends Biochem Sci 2002, vol. 27, n 12, p Kallio M., Chang Y., Manuel M., Alastalo T.P., Rallu M., Gitton Y., Pirkkala L., Loones M.T., Paslaru L., Larney S., Hiard S., Morange M., Sistonen L., Mezger V. Brain abnormalities, defective meiotic chromosome synapsis and female subfertility in HSF2 null mice. EMBO J 2002, vol. 21, n 11, p Li G.C. Induction of thermotolerance and enhanced heat shock protein synthesis in Chinese hamster fibroblasts by sodium arsenite and by ethanol. J Cell Physiol 1983, vol. 115, n 2, p Loison F., Debure L., Nizard P., le Goff P., Michel D., le Dréan Y. Up-regulation of the clusterin gene after proteotoxic stress: implication of HSF1-HSF2 heterocomplexes. Biochem J 2006, vol. 395, n 1, p McMillan D.R., Xiao X., Shao L., Graves K., Benjamin I.J. Targeted disruption of heat shock transcription factor 1 abolishes thermotolerance and protection against heat-inducible apoptosis. J Biol Chem 1998, vol. 273, n 13, p Östling P., Björk J.K., Roos-Mattjus P., Mezger V., Sistonen L. Heat shock factor 2 (HSF2) contributes to inducible expression of hsp genes through interplay with HSF1. J Biol Chem 2007, vol. 282, n 10, p Pirkkala L., Nykänen P., Sistonen L. Roles of the heat shock transcription factors in regulation of the heat shock response and beyond. FASEB J 2001, vol. 15, n 7, p Soncin F., Zhang X., Chu B., Wang X., Asea A., Ann Stevenson M., Sacks D.B., Calderwood S.K. Transcriptional activity and DNA binding of heat shock factor-1 involve phosphorylation on threonine 142 by CK2. Biochem Biophys Res Commun 2003, vol. 303, n 2, p Westerheide S.D., Anckar J., Stevens S.M. Jr, Sistonen L., Morimoto R.I. Stress-inducible regulation of heat shock factor 1 by the deacetylase SIRT1. Science 2009, vol. 323, n 5917, p Xiao H., Perisic O., Lis J.T. Cooperative binding of Drosophila heat shock factor to arrays of a conserved 5 bp unit. Cell 1991, vol. 64, n 3, p Xiao X., Zuo X., Davis A.A., McMillan D.R., Curry B.B., Richardson J.A., Benjamin I.J. HSF1 is required for extra-embryonic development, postnatal growth and protection during inflammatory responses in mice. EMBO J 1999, vol. 18, n 21, p Zhong M., Orosz A., Wu C. Direct sensing of heat and oxidation by Drosophila Heat Shock Transcription Factor. Mol Cell 1998, vol. 2, n 1, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

49 «Alcoolisation précoce» LES EFFETS DE L ETHANOL SUR LES MOUVEMENTS DE LA GASTRULATION : UNE CAUSE A LA MICROCEPHALIE? ISABELLE BUISSON, JEAN-FRANÇOIS RIOU ET MURIEL UMBHAUER Université Pierre et Marie Curie, UMR CNRS 7622, 9, quai Saint-Bernard, case 24, Paris - France Summary Alcohol consumption during pregnancy can cause congenital malformations leading to the fetal alcohol syndrome (FAS). Abnormalities observed at birth result from defects occurring during the early steps of embryonic development. Amphibian embryos from Xenopus lævis are very accessible to experimentation at early stages of development, and are thus used to analyze processes affected by teratogenic doses of ethanol. Ethanol treatment at stages of gastrulation results in an abnormal development of the brain reminiscent of FAS, with a characteristic reduction of anterior-most structures of the brain. Specification of ectoderm to form anterior brain is taking place during gastrulation. It is dependent on signals emitted from the underlying mesoderm that cause anterior dorsal ectoderm to adopt an anterior neural fate. Here we show that ethanol treatment does not significantly interfere with the emission of inductive signals from dorsal mesoderm. Rather, it appears to perturb the normal sequence of morphogenetic movements which, in turn, results in the perturbation of inductive interactions between anterior dorsal mesoderm and ectoderm. Mots clefs Ethanol, syndrome d alcoolisation fœtale, cerveau, développement, gastrulation, Xénope INTRODUCTION La consommation d alcool pendant la grossesse peut entraîner l apparition de malformations congénitales chez le nouveau-né formant le Syndrome d Alcoolisation Fœtale (SAF). Ce syndrome se caractérise par des anomalies morphologiques et anatomiques telles que la microcéphalie et une dysmorphogenèse faciale, associées à des retards mentaux. L essentiel de ces manifestations liées à l alcoolisation maternelle résulte d une atteinte du système nerveux central. Si les effets de l alcool varient en fonction de la concentration d alcool à laquelle l individu est soumis ainsi qu en fonction de la période et de la durée d exposition, il est établi que les malformations cérébrales sévères observées à la naissance résultent de perturbations des premières étapes du développement embryonnaire. Plusieurs systèmes modèles animaux ont été élaborés pour analyser les processus de développement affectés par des doses tératogènes d éthanol et élucider les mécanismes moléculaires mis en jeu. Les rongeurs, génétiquement proches de l homme, sont largement utilisés mais ils présentent l inconvénient d un manque d accessibilité aux premiers stades embryonnaires du fait de leur développement intra-utérin. L embryon d amphibien, Xenopus laevis, est utilisé pour analyser les étapes précoces du développement embryonnaire affectées par des doses tératogènes d éthanol. Le traitement à l éthanol d embryons de Xénope pendant la gastrulation provoque des malformations caractéristiques du SAF qui incluent un axe antéro-postérieur raccourci, une microcéphalie et une microphtalmie (Ahlgren et al., 2002 ; Buisson et al., 2006 ; Nakatsuji, 1983 ; Yelin et al., 2005, 2007). Les mécanismes cellulaires et moléculaires qui concourent à la mise en place de la plaque neurale, à l origine du système nerveux central, ainsi qu à sa régionalisation le long de l axe antéro-postérieur, sont bien connus chez le Xénope (De Robertis et Kuroda, 2004). Au cours de la gastrulation, le mésoderme dorsal émet des signaux, reçus par l ectoderme sus-jacent, qui répond en adoptant une destinée neurale. Ces signaux comprennent les facteurs de croissance IGF (Insulin Growth Factor) (Pera et al., 2001) ainsi que des facteurs sécrétés tels que noggin et chordin, inhibiteurs de la voie de signalisation BMP, ou encore cerberus, inhibiteur des voies BMP, Wnt et nodal. Il est clairement Cahiers de l Ireb n 19,

50 établi qu une altération de l émission de ces signaux provoque des défauts de formation du système nerveux central. MATERIELS ET METHODES Obtention des embryons de Xénope, traitement à l éthanol et microdissection Les œufs de Xenopus laevis sont obtenus à partir de femelles stimulées avec 500 UI d hormone HCG (Human Chorionic Gonadotropin, Sigma) injectées dans les sacs lymphatiques dorsaux. La fécondation est réalisée in vitro à l aide de fragments de testicules dilacérés. Vingt minutes après la fécondation, les embryons sont dégangués dans une solution de cystéine 2 % (ph 7,8), puis lavés dans du MBS 0,1X (Modified Barth Solution, NaCl 88 mm, KCl 1 mm, CaCl 2 0,41 mm, Ca(NO 3 ) 0,33 mm, MgSO 4 0,82 mm, NaHCO 3 2,4 mm, HEPES 10 mm, ph 7,4). Les embryons sont incubés à partir du stade 9 en présence d éthanol à 2,5 % (vol/vol) dilué dans du MBS 0,1X. Les zones marginales dorsales sont découpées sur des embryons au stade 10 et sont recombinées avec une calotte animale ectodermique isolée au même stade. Les recombinaisons sont cultivées dans du MBS 1X en présence d éthanol à 2,5 % jusqu à l équivalent du stade bourgeon caudal 26. Les stades embryonnaires sont déterminés en référence à la table établie par Nieuwkoop et Faber (1967). RT-PCR Les ARNm totaux sont extraits à partir de dix recombinaisons ou de deux embryons. La lyse s effectue sur la glace dans 20 µl d une solution de guanidium thiocyonate 4 M additionnée de β-mercaptoéthanol 0,1 M, de citrate de sodium 25 mm ph 7,0 et de 0,5 % Sarkosyl. 400µl de Trizol (Invitrogen) sont ajoutés. Le tout est homogénéisé puis incubé cinq minutes à température ambiante, avant d ajouter 20 % de chloroforme. Après centrifugation à rcf (15 minutes), la phase aqueuse est récupérée et les acides nucléiques précipités par un vol. d isopropanol à 20 C pendant une heure. Le culot obtenu après centrifugation à rcf (30 minutes) est lavé à l éthanol 70 % puis repris dans 10 µl d H 2 O. Les résidus d ADN génomique sont digérés par traitement à la DNase I pendant 20 minutes à 37 C. L intégrité et la présence des ARN sont contrôlées sur gel d agarose 1 %-TAE en présence de bromure d éthidium. Les ADNc sont synthétisés à partir des ARN totaux en utilisant des hexanucléotides aléatoires comme amorces et la trancriptase inverse (Gibco BRL). Les oligonucléotides utilisés pour la PCR sont : N-CAM sens : 5 CACAGTTCCACCAAATGC3, antisens 5 GGAATCAACGGTACAGA3 ; Sox2 sens : 5 AACTCCATGAGCAGCTCGCAG3, antisens 5 GAGGCACTCTGATAGTGTTGC3 ; En-2 sens : 5 TTCATCAGGTCCGAGATC3, antisens 5 TCCTTTGAAGTGGTCGCG3 ; Krox-20 sens 5 AACCGCCCCAGTAAGACC3, antisens 5 GTGTCAGCCTGTCCTGTTAG3 ; Pax6 sens 5 CCCACAAGTCCATCTGTA3, antisens 5 CTGCTGAACATCCAACTG3 ; Otx2 sens 5 GGATGGATTTGTTGCACCAGT3, antisens 5 CACTCTCCGAGCTCACTTCTC3 ; ODC sens 5 GTCAATGATGGAGTGTATGGATC3, antisens 5 TCCATTCCGCTCTCCTGAGCAC3. Les produits de PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d agarose 1,5 %-TBE en présence de bromure d éthidium. Western blot Les protéines sont extraites à partir de cinq embryons lysés dans 100 µl de tampon de lyse (NaCl 50 mm, NaF 50 mm, EDTA 5 mm, NP40 0,5 %, PMSF 2 mm, leupeptin 10 µg/ml, Na 3 VO 4 1 mm, Tris-HCL 10 mm, ph 7,5). Elles sont séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10 % en conditions dénaturantes. Après transfert sur une membrane de nitrocellulose, une immunodétection est réalisée avec un anticorps primaire anti-phospho Akt (Ser 473) (Cell Signaling, 9271S) et un anticorps secondaire couplé à la peroxydase. L activité de la peroxydase est révélée par chimioluminescence (PerkinElmer). 50 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

51 «Alcoolisation précoce» La membrane est lavée dans une solution SDS 2 %, Tris-HCl 65 mm, ph 6,8, β-mercaptoéthanol 0,7 %, puis traitée à nouveau en immunodétection avec un anticorps anti-akt (Cell Signaling, 9272). RESULTATS ET DISCUSSION L éthanol ne modifie pas significativement les signaux inducteurs neuraux émis par le mésoderme dorsal Pendant la gastrulation, le mésoderme dorsal émet des signaux qui induisent l ectoderme à former le neuroderme, à l origine du système nerveux central. Il est possible d analyser les capacités inductrices du mésoderme dorsal ex vivo, en recombinant la zone marginale dorsale d un embryon au stade jeune gastrula avec une calotte animale ectodermique. Dans ces recombinaisons, la calotte animale ectodermique est induite en neuroderme et exprime des gènes marqueurs du tissu neural tels que N-CAM et Sox2 ainsi que des gènes spécifiques du cerveau (Pax-6, Otx-2 pour le cerveau antérieur, En-2 pour l isthme et Krox-20 pour le rhombencéphale). Le traitement à l éthanol 2,5 % de ces recombinaisons ne modifie pas significativement l expression de ces gènes (Figure 1A). A B Figure 1 : analyse de l effet de l éthanol sur l expression des marqueurs neuraux dans l ectoderme neuralisé. A) Neuralisation par recombinaison de la calotte animale (CA) avec la zone marginale dorsale (ZMD). La ZMD est prélevée sur des embryons au stade jeune gastrula (stade 10) et est recombinée avec une calotte animale ectodermique. Les recombinaisons sont cultivées en présence ou en absence d éthanol 2,5 %. B) Neuralisation par inhibition des signaux BMP. Les embryons sont injectés ( xar1) ou non (Te) au stade 4 cellules avec des ARNm codant xar1. Au stade blastula âgée (stade 9), les calottes animales sont disséquées et mises en culture en présence ou absence d éthanol 2,5 %. Dans tous les cas, l expression des marqueurs neuraux est analysée par RT-PCR semi-quantitative à l équivalent du stade bourgeon caudal (stade 26). RT- : témoin sans transcription reverse ; ODC est un contrôle de charge. Cahiers de l Ireb n 19,

52 Les signaux inducteurs émis par le mésoderme dorsal comprennent des facteurs sécrétés tels que chordin et noggin, inhibiteurs de la signalisation BMP-4, et il est possible d induire in vitro du neuroderme en inhibant la signalisation BMP-4 dans des calottes animales ectodermiques. Cette inhibition peut être obtenue en exprimant une forme dominante-négative du récepteur BMP/activine ( xar1). Des calottes animales disséquées au stade blastula âgée sur des embryons préalablement injectés avec des ARNm codant xar1 expriment les marqueurs neuraux antérieurs Otx-2, Pax-6, En- 2 et Krox-20. L incubation des explants en présence de 2,5 % d éthanol n affecte pas significativement l expression des différents marqueurs analysés (Figure 1B). Ces résultats indiquent que l éthanol ne modifie pas de manière significative les signaux inducteurs neuraux émis par le mésoderme dorsal. Les défauts de développement du cerveau antérieur ne résultent donc pas d une altération directe de l émission de ces signaux. L éthanol perturbe la gastrulation en provoquant un ralentissement des mouvements morphogénétiques Les signaux inducteurs neuraux du mésoderme dorsal sont, au moins en partie, émis pendant la phase de gastrulation. Cette phase de développement est caractérisée par des mouvements cellulaires, étroitement coordonnés et contrôlés, qui conduisent les cellules à changer de position les unes par rapport aux autres et permettent ainsi l établissement de nouvelles interactions cellulaires. En particulier, le mésoderme dorsal s invagine et migre vers la région antérieure. Il entre alors en contact avec l ectoderme sus-jacent qui répond aux signaux émis en adoptant une destinée neurale antérieure. La perturbation de ces mouvements peut provoquer des anomalies de la formation des structures cérébrales. Nous avons analysé en détail l effet d un traitement à l éthanol sur les mouvements de la gastrulation. Un des signes morphologiques quantifiables de l avancement de la gastrulation est la diminution de la taille du bouchon vitellin qui résulte de la fermeture progressive du blastopore. Des photographies d embryons traités ou non par l éthanol ont été prises toutes les deux heures et le diamètre du bouchon vitellin a été mesuré. L éthanol affecte la vitesse de fermeture du blastopore. Quatre heures après le traitement à l éthanol, le diamètre moyen du bouchon vitellin des embryons traités est significativement plus grand que celui des embryons témoins (Figure 2). Cette différence est maintenue pendant toute la gastrulation. Le blastopore des embryons traités à l éthanol se ferme mais cette fermeture est observée avec un délai d environ quatre heures par rapport aux contrôles. Ces résultats montrent clairement que l éthanol perturbe la gastrulation en provoquant un ralentissement des mouvements morphogénétiques. 52 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

53 «Alcoolisation précoce» Figure 2 : effet de l éthanol sur les mouvements de la gastrulation Des lots d embryons sont incubés ou non en présence d éthanol 2,5 % à partir du stade blastula âgée (stade 9). Toutes les deux heures, des photographies sont prises et le diamètre du bouchon vitellin est mesuré pour chaque embryon. Les photographies illustrent la morphologie des embryons, le trait rouge indique le diamètre du blastopore. L histogramme synthétise les résultats obtenus sur un total de 20 embryons traités et 20 embryons témoins. L effet perturbateur de l éthanol sur la gastrulation ne dépend pas de la phosphatase PTEN Il existe une coordination étroite entre les mouvements de la gastrulation et le cycle cellulaire. La durée du cycle cellulaire s allonge pendant la gastrulation et les cellules mésodermiques axiales arrêtent de se diviser après leur involution à l intérieur de l embryon (Saka et Smith, 2001). L inhibition de la prolifération cellulaire est nécessaire au bon déroulement de la gastrulation et une augmentation de la prolifération perturbe les mouvements morphogénétiques (Murakami et al., 2004). Récemment, il a été montré, par des approches de gain et de perte de fonction, que la phosphatase PTEN (tumor suppressor phosphatase and tensin homolog) jouait un rôle crucial dans les mouvements de la gastrulation à travers son action sur le contrôle de la durée du cycle cellulaire (Ueno et al., 2006). PTEN est une phosphatidylinositol-3 (PI3)- phosphatase qui fonctionne en tant que régulateur négatif de la voie PI3-Kinase. L expression ectopique de la forme sauvage, ainsi que de formes mutées Cahiers de l Ireb n 19,

54 constitutivement actives ou dominantes négatives, ralentit la progression de la gastrulation. Ce phénotype étant très similaire à celui observé chez les embryons traités à l éthanol (Figure 2), nous avons testé l implication de PTEN en tant qu effecteur de l éthanol dans le ralentissement de la gastrulation. L expression de PTEN au cours de la gastrulation a été analysée par RT-PCR dans des embryons traités à l éthanol 2,5 % et comparée à celle des embryons témoins (non montré). Aucune différence significative d expression n a été mise en évidence. Le traitement à l éthanol ne modifie donc pas l expression de PTEN dans l embryon pendant la gastrulation. L activité de la protéine PTEN a également été évaluée en analysant le niveau de phosphorylation de la protéine Akt (Figure 3). PTEN inactive la voie PI3-Kinase en déphosphorylant la PIP3, ce qui conduit à la déphosphorylation de Akt. L expression de Akt et de sa forme phosphorylée a été analysée par western blot à l aide d anticorps spécifiques, à différents temps, dans des embryons traités ou non à l éthanol. Les résultats ne révèlent aucune différence significative dans les niveaux d expression d Akt et de sa forme phosphorylée entre les embryons traités et les témoins. Ces résultats indiquent que l éthanol ne modifie ni l expression, ni l activité de la protéine PTEN, excluant un rôle majeur de cette phosphatase dans le ralentissement de la gastrulation. Figure 3 : effet de l éthanol sur l expression et l activité de la protéine PTEN Des lots d embryons sont incubés ou non (témoin) en présence d éthanol 2,5 % à partir du stade blastula âgée (stade 9). Toutes les deux heures, des embryons sont prélevés pour une analyse en western blot de la protéine Akt et de sa forme phosphorylée (pakt). CONCLUSION Nos résultats montrent que des doses tératogènes d éthanol ne modifient pas de manière significative les signaux émis par le mésoderme dorsal responsables de la détermination du neuroderme antérieur à l origine du cerveau. En revanche, l éthanol perturbe le déroulement des mouvements de la gastrulation, interférant ainsi de manière indirecte sur les interactions inductrices. Références Ahlgren S.C., Thakur V., Bronner-Fraser M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proc Natl Acad Sci U S A 2002, vol. 99, n 16, p Buisson I., Riou J.F., Umbhauer M. Effets de doses tératogènes d'alcool sur le développement du cerveau. Cahiers de l'ireb 2006, n 18, p De Robertis E.M., Kuroda H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol 2004, vol. 20, p Murakami M.S., Moody S.A., Daar I.O., Morrison D.K. Morphogenesis during Xenopus gastrulation requires Wee1-mediated inhibition of cell proliferation. Development 2004, vol. 131, n 3, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

55 «Alcoolisation précoce» Nakatsuji N. Craniofacial malformation in Xenopus laevis tadpoles caused by the exposure of early embryos to ethanol. Teratology 1983, vol. 28, n 2, p Pera E.M., Wessely O., Li S.Y., De Robertis E.M. Neural and head induction by insulin-like growth factor signals. Dev Cell 2001, vol. 1, n 5, p Saka Y., Smith J.C. Spatial and temporal patterns of cell division during early Xenopus embryogenesis. Dev Biol 2001, vol. 229, n 2, p Ueno S., Kono R., Iwao Y. PTEN is required for the normal progression of gastrulation by repressing cell proliferation after MBT in Xenopus embryos. Dev Biol 2006, vol. 297, n 1, p Yelin R., Kot H., Yelin D., Fainsod A. Early molecular effects of ethanol during vertebrate embryogenesis. Differentiation 2007, vol. 75, n 5, p Yelin R., Schyr R.B., Kot H., Zins S., Frumkin A., Pillemer G., Fainsod A. Ethanol exposure affects gene expression in the embryonic organizer and reduces retinoic acid levels. Dev Biol 2005, vol. 279, n 1, p Cahiers de l Ireb n 19,

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57 «Alcoolisation précoce» CARACTERISATION DE PROTEINES DONT L EXPRESSION EST REGULEE PAR L ETHANOL DANS LES NEURONES EN GRAIN DU CERVELET DE RAT BEATRICE BOTIA 1,4, PASCAL COSETTE 2,3, PHILIPPE CHAN 2, VADIM LE JONCOUR 1,4, ANTHONY FALLUEL 1,4, THIERRY JOUENNE 2,3, HUBERT VAUDRY 1,4 ET DAVID VAUDRY 1,4 1 INSERM U413-EA 4310, DC2N, Université de Rouen, place Emile Blondel, Mont-Saint-Aignan - France 2 Plate-forme de Protéomique de l IFRMP23, Université de Rouen, place Emile Blondel, Mont-Saint-Aignan - France 3 FRE 3101 CNRS, Université de Rouen, place Emile Blondel, Mont-Saint-Aignan - France 4 Laboratoire International Associé Samuel de Champlain, 531 boulevard des Prairies, Laval, Québec, H7V 1B7 - Canada Summary Alcohol exerts toxic effects on neuronal survival and differentiation but so far, only part of the mechanisms has been characterized. To identify new proteins regulated by ethanol, we have investigated, by proteomic analysis, the effects of ethanol on protein expression in cultured cerebellar granule neurons. This work led to the characterization of 14 proteins regulated by alcohol, among which 5 could be identified. Three of these proteins which were up-regulated correspond to α2 and ß2 proteasome sub-units and two proteins which were down-regulated code for calmodulin and phosphatidylethanolamine binding protein (PEBP). The aim of the project will now be to identify the 9 other proteins regulated by alcohol, to characterise the mechanisms involved in their regulation and to investigate their putative functional implication. Mots Clefs Ethanol, neurones en grain, protéomique INTRODUCTION Une exposition à l alcool, même ponctuelle, au cours de la maturation du cerveau peut engendrer chez l enfant un Syndrome d Alcoolisation Fœtale (SAF) qui se traduit, entre autres, par des retards de croissance, des malformations cranio-faciales et une atrophie du cerveau. Or, d après l enquête nationale périnatale (Blondel et al., 2000), 3,9 % des femmes admettent consommer au moins un verre d alcool par jour pendant leur grossesse. Le SAF représente la première cause non génétique de déficit mental (Sampson et al., 1997). In vivo, l administration de 5 g/kg d éthanol à des ratons diminue d environ 25 % le poids du cervelet (Ikonomidou et al., 2000). In vitro, l incubation des cellules en grain de cervelet de rat pendant 24 heures avec de l éthanol engendre une diminution de 25 % de leur nombre, une réduction d environ 50 % de la longueur de leurs neurites et une augmentation de 2,5 fois du nombre de cellules dépourvues de prolongements (Vaudry et al., 2002). Il a été mis en évidence que l effet toxique de l éthanol implique, entre autres, l activation de la caspase-3 (Vaudry et al., 2002), l induction de la peroxiredoxine 2 (Botia et al., 2008) et l ouverture de canaux potassiques (Mei et al., 2004). L exposition à l alcool provoque aussi une diminution de l expression du Brain- Derived Neurotrophic Factor (Ohrtman et al., 2006), de la Cyclin-Dependent Kinase 2 (Li et al., 2002) et des Cyclines A et D (Li et al., 2002). Néanmoins, si quelques protéines impliquées dans les effets de l éthanol sur la survie et la différenciation des cellules en grain ont été caractérisées, un grand nombre reste à identifier. L objectif du présent travail était donc de mettre en évidence de nouvelles protéines dont l expression est affectée par l alcool au niveau des cellules en grain du cervelet en culture pour pouvoir ensuite rechercher leur possible implication dans les effets neurotoxiques de l éthanol. Cahiers de l Ireb n 19,

58 RESULTATS ET DISCUSSION Caractérisation de protéines dont l expression est affectée par l éthanol dans les cellules en grain du cervelet La première partie du travail a consisté à identifier, par électrophorèse bidimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse, des protéines dont l expression est modifiée par l éthanol (200 mm) dans les cellules en grain de cervelet de ratons âgés de huit jours (Figure 1). La comparaison des cartes protéomiques issues d échantillons témoins et celles issues d échantillons traités à l éthanol a permis de caractériser 14 protéines dont l expression est modifiée dans les cellules en grain après six heures de traitement (Figure 2). Parmi ces protéines, nous avons identifié les sous-unités α2 et ß2 du protéasome dont l expression est induite (Figures 3 et 5) ainsi que la calmoduline et la phosphatidylethanolamine binding protein (PEBP) qui sont quant à elles réprimées (Figures 4 et 5). Culture de neurones en grain Contrôle Ethanol (6h) Extraction des protéines Séparation des protéines en fonction du point isoélectrique (pi) Séparation des protéines en fonction du poids moléculaire (PM) Coloration des gels bidimensionnels pi PM Analyse informatique et caractérisation de protéines régulées Identification des protéines régulées par spectrométrie de masse Figure 1 : stratégie protéomique adoptée pour l identification de protéines dont l expression est modifiée par l éthanol dans les cellules en grain de cervelet de rat. 58 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

59 «Alcoolisation précoce» pi Mm MM Figure 2 : carte protéomique, obtenue à partir de cellules en grain du cervelet en culture, sur laquelle sont annotées les 14 protéines dont l expression est régulée par l éthanol. Les numéros en gras correspondent aux protéines identifiées à ce jour (PM : poids moléculaire ; pi : point isoélectrique). Moyenne des intensités des spots (% du contrôle) Contrôle Ethanol N des spots Figure 3 : quantification de l expression des protéines dont l expression est induite après six heures de traitement en présence d éthanol (200 mm) dans les cellules en grain du cervelet en culture. Moyenne des intensités des spots (% du contrôle) N des spots Contrôle Ethanol Figure 4 : quantification de l expression des protéines dont l expression est réprimée après six heures de traitement en présence d éthanol (200 mm) dans les cellules en grain du cervelet en culture. Cahiers de l Ireb n 19,

60 Spots Nom de la protéine PM expérimental PM théorique pi expérimental pi théorique Correspondance exp/th (%) 1 Sous unité α2 du protéasome ,95 32% 4 Sous unité α2 du protéasome ,2 8,39 8% 10 Sous unité β2 du protéasome ,9 6,96 19% 12 Calmoduline ,5 4,09 36% 14 Phosphatidylethanolamine ,4 5,48 43% binding protein Figure 5 : caractéristiques expérimentales et/ou théoriques des protéines identifiées dont l expression est modifiée par l éthanol. (PM : poids moléculaire, : la protéine a une masse moléculaire comprise entre et ; pi : point isoélectrique). Analyse des résultats obtenus Le protéasome est un complexe, composé de multiples sous-unités α et β, fortement impliqué dans le contrôle de la dégradation des protéines telles que les cyclines. Une étude in vitro dans les cellules en grain de cervelet de rat, en conditions apoptotiques, a révélé que l inhibition des fonctions du protéasome prévient l activation de la caspase-3 et le clivage de la protéine Tau (Canu et al., 2000). De plus, il a été observé, au cours de l apoptose, que des inhibiteurs du protéasome comme le MG132 empêchent la sortie du cytochrome C hors de la mitochondrie, bloquant ainsi la mort neuronale (Bobba et al., 2002). La présence de deux isoformes de la sous-unité α2 sur nos gels, ayant la même masse moléculaire mais des points isoelectriques (pi) légèrement différents, suggère que cette protéine peut aussi faire l objet de modifications post-traductionnelles. A l appui de cette hypothèse, une modification du pi de la sous-unité α7 a déjà été observée dans des extraits de foie de rat ayant reçu un régime alcoolisé pendant 30 jours, modification qui correspond à une hyperphosphorylation de la protéine (Bardag-Gorce et al., 2004). La calmoduline peut fixer le calcium et ainsi jouer un rôle clef dans les voies de signalisation calciques intracellulaires. Le complexe calcium-calmoduline, une fois activé, est un substrat de la CAM-kinase II, qui est fortement exprimée dans les cellules en grain du cervelet et impliquée dans l expression du BDNF (Takeuchi et al., 2000). Une étude sur les cellules en grain de cervelet de rat révèle que la neuritogenèse et la survie neuronale sont médiées par la CAM-kinase II (Borodinsky et al., 2002). Ainsi, dans notre modèle d étude, l effet neurotoxique de l éthanol sur la survie cellulaire et la croissance neuritique passe probablement par l inhibition de l expression de la calmoduline, ce qui pourrait entraîner, entre autres, une altération de l activité de la CAM-kinase II et de l expression du BDNF. La phosphatidylethanolamine binding protein (PEBP) est connue pour avoir une forte affinité pour la phosphatidyléthanolamine, constituant des membranes cellulaires. De nombreuses fonctions lui ont été attribuées telles que le transport des lipides et la participation aux voies de signalisation intracellulaires. Récemment, un nouveau membre fonctionnel de cette famille, le hpebp4, a été découvert dans la majorité des tissus humains. Le hpebp4, en inhibant la voie des MAP kinases et l externalisation de la phosphatidyléthanolamine, peut protéger les cellules de l apoptose induite par le tumor necrosis factor α (Wang et al., 2004). Notre étude suggère que la neurotoxicité induite par l alcool pourrait être associée à une diminution de l activité neuroprotectrice de cette protéine. Afin de continuer ce travail, nous allons essayer d identifier par spectrométrie de masse les neuf autres protéines régulées par l alcool. Ensuite, il sera intéressant de compléter les résultats obtenus par une étude par Western Blot afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la dysrégulation de ces protéines par l alcool et nous rechercherons à l aide d ARN d interférence l implication des protéines d intérêt dans le contrôle de la survie et/ou de la différenciation des neurones en grain en culture. 60 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

61 «Alcoolisation précoce» CONCLUSION Des travaux récents suggèrent que la période de vulnérabilité du cerveau vis-à-vis d une exposition à l alcool coïncide avec la phase de synaptogenèse pendant laquelle s établissent les connexions entre les neurones et leurs cellules cibles. Compte tenu des effets délétères de l alcoolisme maternel sur le développement du système nerveux central du fœtus et de l enfant, la compréhension des dysrégulations de l expression protéique impliquées dans la neurotoxicité de l'éthanol est indispensable pour identifier des cibles moléculaires sur lesquelles il sera possible d agir afin de prévenir la mort neuronale. L étude réalisée à partir de cellules en grain du cervelet en culture a mis en évidence 14 protéines dont l expression est affectée par l alcool. L analyse de la littérature suggère que certaines de ces protéines pourraient être impliquées dans la toxicité de l éthanol et constituent donc des cibles thérapeutiques potentielles pour bloquer les effets délétères de l alcool. Remerciements : ce travail a bénéficié du soutien de l IREB, de l Inserm, de la Plate-Forme de Protéomique de l IFRMP23, de la Région Haute-Normandie, du programme Interreg IVA (AdMiN) du CRIHAN et de l ANR JCJC. Béatrice Botia. a été boursière de la FRM. Références Bardag-Gorce F., Venkatesh R., Li J., French B.A., French S.W. Hyperphosphorylation of rat liver proteasome subunits: the effects of ethanol and okadaic acid are compared. Life Sci 2004, vol. 75, n 5, p Blondel B., Norton J., Du Mazaubrun C., Breart G. Enquête nationale périnatale Inserm 2000, 140 p. Bobba A., Canu N., Atlante A., Petragallo V., Calissano P., Marra E. Proteasome inhibitors prevent cytochrome c release during apoptosis but not in excitotoxic death of cerebellar granule neurons. FEBS Lett 2002, vol. 515, n 1-3, p Borodinsky L.N., Coso O.A., Fiszman M.L. Contribution of Ca 2+ calmodulin-dependent protein kinase II and mitogen-activated protein kinase kinase to neural activity-induced neurite outgrowth and survival of cerebellar granule cells. J Neurochem 2002, vol. 80, n 6, p Botia B., Seyer D., Ravni A., Bénard M., Falluel-Morel A., Cosette P., Jouenne T., Fournier A., Vaudry H., Gonzalez B.J., Vaudry D. The peroxiredoxin 2 is involved in the control of caspase-3 activity by PACAP in cerebellar granule neurons. J Mol Neurosci 2008, vol. 36, n 1-3, p Canu N., Barbato C., Ciotti M.T., Serafino A., Dus L., Calissano P. Proteasome involvement and accumulation of ubiquitinated proteins in cerebellar granule neurons undergoing apoptosis. J Neurosci 2000, vol. 20, n 2, p Ikonomidou C., Bittigau P., Ishimaru M.J., Wozniak D.F., Koch C., Genz K., Price M.T., Stefovska V., Horster F., Tenkova T., Dikranian K., Olney J.W. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science 2000, vol. 287, n 5455, p Li Z., Miller M.W., Luo J. Effects of prenatal exposure to ethanol on the cyclin-dependent kinase system in the developing rat cerebellum. Dev Brain Res 2002, vol. 139, n 2, p Mei Y.A., Vaudry D., Basille M., Castel H., Fournier A., Vaudry H. PACAP inhibits delayed rectifier potassium current via a camp/pka transduction pathway: evidence for the involvement of I k in the antiapoptotic action of PACAP. Eur J Neurosci 2004, vol. 19, n 6, p Ohrtman J.D., Stancik E.K., Lovinger D.M., Davis M.I. Ethanol inhibits brain-derived neurotrophic factor stimulation of extracellular signal-regulated/mitogen-activated protein kinase in cerebellar granule cells. Alcohol 2006, vol. 39, n 1, p Sampson P.D., Streissguth A.P., Bookstein F.L., Little R.E., Clarren S.K., Dehaene P., Hanson J.W, Graham J.M. Jr. Incidence of fetal alcohol syndrome and prevalence of alcohol-related neurodevelopmental disorder. Teratology 1997, vol. 56, n 5, p Takeuchi Y., Yamamoto H., Miyakawa T., Miyamoto E. Increase of brain-derived neurotrophic factor gene expression in NG cells by the nuclear isoforms of Ca ++ /calmodulin-dependent protein kinase 2. J Neurochem 2000, vol. 74, n 5, p Vaudry D., Rousselle C., Basille M., Falluel-Morel A., Pamantung T.F., Fontaine M., Fournier A., Vaudry H., Gonzalez B.J. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide protects rat cerebellar granule neurons against ethanol-induced apoptotic cell death. Proc Natl Acad Sci USA 2002, vol. 99, n 9, p Wang X., Li N., Liu B., Sun H., Chen T., Li H., Qiu J., Zhang L., Wan T., Cao X. A novel human phosphatidylethanolamine-binding protein resists tumor necrosis factor α-induced apoptosis by inhibiting mitogen-activated protein kinase pathway activation and phosphatidylethanolamine externalisation. J Bio Chem 2004, vol. 279, n 44, p Cahiers de l Ireb n 19,

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63 «Alcoolisation précoce» STRESS PRENATAL ET MEMOIRE : EFFETS PARADOXAUX DE LA CONSOMMATION CHRONIQUE D ALCOOL CHEZ LE RAT MURIEL DARNAUDERY 1, VINCENT VAN WAES 1, MIHAELA ENACHE 1, ANNARITA ZUENA 1,2, JEROME MAIRESSE 1,2, FERDINANDO NICOLETTI 2,3, ELISABETH VINNER 4, MICHEL LHERMITTE 4 ET STEFANIA MACCARI 1,2 1 Laboratoire Neurostress EA 4347, Université de Lille 1, Villeneuve d'ascq - France 2 Department of Human Physio & Pharmacology, Sapienza University of Roma, Roma - Italie 3 Neuromed (I.R.C.C.S.), Venafro - Italie 4 Laboratoire de Toxicologie et Génopathie, UPRES EA 2679, Université de Lille 2 et l hôpital Calmette, Lille Cedex - France Summary Although it is generally believed that chronic ethanol consumption impairs learning and memory, results obtained in experimental animals are not univocal, and there are conditions in which ethanol paradoxically improves cognitive functions. In the present work, we investigated the effects of prenatal stress and of chronic ethanol exposure during adulthood on spatial memory in rats. Rats were subjected to a prenatal stress delivered as a 3 daily 45-min sessions of restraint stress to the mothers during the last 10 days of pregnancy. After 7 months of ethanol exposure (ethanol 10%, oral intake), memory performances were evaluated in a spatial discrimination test in control and prenatally stressed male rats. Then, the oxidative damages and the expression of metabotropic glutamate (mglu) receptors were assessed in their hippocampus. Chronic ethanol exposure resulted in a reduced performance in a spatial recognition task in control animals. Unexpectedly, however, the same treatment attenuated spatial memory deficits in rats that had been subjected to prenatal stress. This paradigm of ethanol administration did not produce detectable signs of oxidative damage in the hippocampus in either unstressed or stressed rats. Interestingly, ethanol intake resulted in differential effects on the expression of mglu receptor subtypes implicated in mechanisms of learning and memory. In control rats, ethanol intake reduced mglu2/3 and mglu5 receptor levels in the hippocampus; in prenatally stressed rats, which exhibited a constitutive reduction in the levels of these mglu receptor subtypes, ethanol increased the expression of mglu1a receptors but did not change the expression of mglu2/3 or mglu5 receptors. Our findings support the idea that stress-related events occurring before birth have long-lasting effects on brain and behavior, and suggest that the impact of ethanol on cognition is not only dose- and time-dependent, but also critically influenced by early life experiences. Mots clefs Stress maternel, reconnaissance spatiale, alcool, péroxydation lipidique, glutamate INTRODUCTION L alcoolisme est associé à des troubles cognitifs sévères, en particulier mnésiques (Fama et al., 2004 ; Oscar-Berman et al., 2004). Cependant, les études expérimentales conduites sur l impact de la consommation chronique d alcool ont donné des résultats très disparates. Ainsi, chez l animal, certains auteurs ont décrit des perturbations mnésiques, une absence d atteintes, voire des améliorations mnésiques après une alcoolisation chronique (Fadda et al., 1999 ; Farr et al., 2005 ; Krazem et al., 2003a, b ; Robles et Sabria 2008), conduisant à l hypothèse de phénotypes de vulnérabilité. Chez le rat, un stress chronique de contention chez la mère lors de la gestation provoque de profondes altérations physiologiques et comportementales chez la descendance (Darnaudery et Maccari 2008). Ainsi, les rats stressés en période prénatale ont une diminution de la neurogenèse hippocampique Cahiers de l Ireb n 19,

64 (Lemaire et al., 2000), associée à une réduction des quantités de récepteurs métabotropiques au glutamate (mglu2/3 et mglu5) dans l hippocampe (Zuena et al., 2008). Ces animaux présentent aussi une exacerbation des troubles mnésiques au cours du vieillissement (Darnaudery et al., 2006 ; Vallee et al., 1999). Enfin, le stress prénatal induit une plus grande vulnérabilité à plusieurs drogues d abus, incluant l alcool (Darnaudery et al., 2007 ; Deminiere et al., 1992 ; Kippin et al., 2007). Récemment, nous avons démontré que les rats stressés prénatalement présentaient une réponse différentielle suite à une administration aiguë d alcool caractérisée, entre autres, par une activation moindre de l axe corticotrope (Enache et al., 2007 ; Van Waes et al., 2006). En revanche, les effets de l alcoolisation chronique chez les rats stressés in utero sont inconnus. Dans ce travail, nous avons examiné si des facteurs environnementaux précoces pouvaient influencer l impact d une alcoolisation chronique sur les performances mnésiques. Les conséquences de l alcoolisation chronique (éthanol 10 % pendant neuf mois) ont été étudiées sur les capacités de reconnaissance spatiale chez des rats ayant subi un stress prénatal. Parallèlement, nous avons quantifié le stress oxydatif et l expression des récepteurs métabotropiques au glutamate (types I et II) dans l hippocampe, comme mécanismes neurobiologiques potentiels sous-tendant les effets comportementaux observés. MATERIELS ET METHODES Stress prénatal Des femelles Sprague-Dawley gestantes étaient soumises à un stress de contention de 45 minutes sous lumière vive trois fois par jour pendant les dix derniers jours de la gestation (Figure 1). Après la naissance, les mères et leurs petits n étaient plus dérangés jusqu au sevrage (J21). Les femelles témoins n étaient dérangées, ni lors de la gestation, ni après. Au moment du sevrage, la descendance mâle était placée en cage individuelle jusqu à la fin de l étude. Les animaux avaient accès à des biberons remplis d eau jusqu à l âge de 28 jours. Exposition à l éthanol Pendant une première période, les animaux étaient progressivement habitués en condition de libre choix (eau versus alcool 10 %) pendant dix jours (Figure 1). A partir de l âge de 38 jours post-natals et jusqu à la fin de l expérience, les animaux étaient soumis à un traitement forcé à l éthanol durant lequel la seule boisson disponible dans les biberons était de l éthanol (10 %). Des animaux jamais exposés à l éthanol étaient également utilisés comme témoins. Epreuve de reconnaissance spatiale spontanée Les rats âgés de 8-9 mois ont été testés dans une épreuve de reconnaissance spontanée dans un labyrinthe en Y (Dellu et al., 1992). L épreuve se déroulait en deux essais séparés par un intervalle de six heures ou 24 heures. Lors du premier essai, l animal explorait librement deux bras du labyrinthe pendant 10 minutes, après quoi il était replacé dans sa cage pendant six heures ou 24 heures (intervalle de rétention). Lors du deuxième essai, le rat était replacé dans le labyrinthe et pouvait explorer les trois bras (deux bras familiers et un bras nouveau). Le pourcentage de temps passé dans le bras nouveau par rapport aux autres bras servait d index de reconnaissance (une exploration supérieure à 33 % indiquait une reconnaissance). Mesures neurobiologiques Les animaux ont été sacrifiés un mois après la dernière épreuve comportementale, l hippocampe rapidement disséqué et stocké à -80 C pour les mesures biochimiques. 64 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

65 «Alcoolisation précoce» Stress oxydatif Les niveaux hippocampiques de malondialdehyde (MDA), un métabolite de la péroxydation lipidique, marqueur de stress oxydatif, ont été quantifiés à l aide d un test colorimétrique NWK-MDA01 (Northwest Life Science Specialties, Vancouver, Canada). La lecture des échantillons a été réalisée avec un spectrophotomètre à une longueur d onde de 532 nm. Récepteurs métabotropiques glutamatergiques de type I et II Les récepteurs de type I (mglu1a et mglu5) et de type II (mglu2/3) ont été quantifiés dans l hippocampe des animaux par western blot. Les anticorps utilisés étaient l anti-mglu1a (1 : 500), l anti-mglu5 (1 : 1000) et l anti-mglu2/3 (1 : 250) (Upstate Biotechnology, Guyancourt, France). La protéine de référence était l actine (anti-actin IgG, 1 : 1000; Sigma Aldrich, Lyon, France). M è re gestante Choix Consommation forcée 3 X 45 min/jour EAU ETHANOL 10% Descendance mâle STRESS J - 21 J - 10 J0 J21 J28 J38 9 mois 10 mois Gestation Tâche de reconnaissance spatiale Labyrinthe en Y P éroxydation lipidique (Dosage du MDA) Dosage colorimétrique Dosage des ré cepteurs m é tbotropiquesau glutamate Western blot Figure 1 : résumé du design expérimental général de l étude. Statistiques Les données ont été analysées à l aide d une ANOVA, suivie de comparaisons planifiées pour l étude des effets spécifiques. Les quantités de récepteurs mglu ont été comparées entre les groupes «témoins» et «stress prénatal» et par un test t de Student. Toutes les données sont présentées sous la forme de la moyenne ± SEM. Le seuil de significativité était fixé à p 0,05. RESULTATS Consommation lors de l alcoolisation chronique Durant toute l expérience, les animaux témoins et stressés prénatalement consommaient des quantités d alcool identiques (témoins : 4,96 ± 0,34 g/kg par jour; stress prénatal : 5,03 ± 0,18 g/kg par jour). Cahiers de l Ireb n 19,

66 Temps passé dans le bras nouveau (%) * Eau Alcoolisation chronique * 33% = hasard 0 Témoin Stress Prénatal Figure 2 : impact de l alcoolisation chronique (10 %) sur les performances en reconnaissance spatiale dans le Y chez des animaux témoins et exposés à un stress prénatal. N = 6-7 par groupes, * p < 0,05 vs. 33 %. L alcoolisation chronique perturbe la mémoire spatiale des rats témoins, mais atténue les déficits cognitifs induits par le stress prénatal Comme illustré sur la figure 2, après six heures de rétention, les animaux témoins, jamais exposés à l alcool (Témoins Eau), discriminaient correctement les bras familiers du bras nouveau (p < 0,05 vs 33 %). En revanche, les animaux stressés (Stress prénatal Eau) exploraient les trois bras de façon aléatoire (p = 0,76 vs 33 %). Les performances de reconnaissance spatiale étaient différemment affectées par l alcool en fonction des groupes (groupe x traitement, F(1,23) = 11,80, p < 0,01). Les analyses post-hoc ont révélé que les performances des animaux témoins non alcoolisés étaient supérieures à celle des témoins alcoolisés et à celle des stressés non alcoolisés (Témoins Eau vs Témoins Alcoolisés, p < 0,01 ; Témoins Eau vs Stress prénatal Eau, p < 0,01), mais identiques à celles des rats stressés exposés à l alcool. Après 24 heures de rétention, tous les animaux présentaient une absence de reconnaissance spatiale (données non présentées). L ensemble de ces résultats suggère que l exposition chronique à l alcool a des effets opposés sur la mémoire des animaux témoins et des animaux soumis à un stress prénatal. L alcoolisation chronique a un impact différentiel sur les récepteurs métabotropiques hippocampiques des animaux témoins et des animaux exposés à un stress prénatal Les analyses des quantités de MDA hippocampiques révèlent que l alcoolisation chronique n induisait pas de péroxydation lipidique chez les témoins comme dans le groupe exposé au stress prénatal. Nous avons ensuite quantifié le nombre de récepteurs métabotropiques au glutatmate dans l hippocampe. Nos résultats (Table 1) démontrent que le stress prénatal diminue le nombre de récepteurs mglu1a (t = 2,31, d.f. = 11, p < 0,05), mglu5 (t = 2,99, d.f. = 11, p < 0,05) et mglu2/3 (t = 2,18, d.f. = 11, p < 0,05) dans l hippocampe des rats âgés de dix mois. 66 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

67 «Alcoolisation précoce» Témoins Stress prénatal mglur1a 100 ± 3,17 90,70 ± 2,56 * mglur5 100 ± 5,14 77,58 ± 5,36 * mglur 2/3 100 ± 3,57 88,78 ± 3,65 * Table 1 : quantités de récepteurs mglu (exprimés en % du groupe témoin) dans l hippocampe chez les animaux âgés de dix mois et jamais exposés à l alcool. N = 6-7 par groupes, * p < 0,05 témoins versus stress prénatal. Comme l illustre la figure 3, l alcoolisation chronique a eu un impact différent sur les quantités de récepteurs métabotropiques au glutamate dans le groupe témoin et le groupe «stress prénatal». L alcool augmente les récepteurs mglur1a (Figure 3A) chez les stressés (Stress prénatal Eau versus Stress prénatal Alcool, p < 0,05), mais n affecte pas les quantités de ces récepteurs chez les témoins (p = 0,54). Les quantités de mglur5 (Figure 3B) et de mglur2/3 (Figure 3C) des animaux témoins ont été fortement réduites par l alcoolisation chronique (p < 0,05), alors que cet effet n est pas présent chez les stressés (n.s.). A B C mglur1a / Actin (DO) 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,0 Témoins # Stress Prénatal - mglur1 - Actin mglur5 / Actin (DO) 3,0 2,5 2,0 1,5 0,0 # Témoins Stress Prénatal - mglur5 - Actin mglur2/3 / Actin (DO) 0,6 0,5 0,4 0,0 # Témoins Stress Prénatal - mglur2/3 - Actin Eau Alcoolisation chronique Figure 3 : impact de l alcoolisation chronique (10 %) sur les quantités de récepteurs métabotropiques au glutamate dans l hippocampe des animaux témoins et exposés à un stress prénatal. A, récepteurs mglur1a, B, récepteurs mglur5 et C, récepteurs mglur2/3, n = 6-7 par groupe, # p < 0,05. DISCUSSION ET CONCLUSION Dans cette étude nous avons montré que la consommation chronique d alcool à une concentration de 10 % induisait des perturbations de mémoire spatiale chez les animaux témoins dans une tâche mettant en jeu l hippocampe. De manière surprenante, cette même exposition atténuait les perturbations mnésiques observées à l âge de dix mois chez des rats ayant subi un stress prénatal. Parallèlement, nous avons observé que l alcool modulait différemment chez les témoins et chez les stressés les quantités de récepteurs métabotropiques au glutamate dans l hippocampe, zone connue pour son rôle essentiel dans les processus de plasticité cérébrale et de mémorisation. Notre étude indique que le stress prénatal produit des déficits de mémoire spatiale chez des rats âgés de dix mois. De nombreux processus tels qu une diminution de la neurogenèse hippocampique (Lemaire et al., 2000), une Cahiers de l Ireb n 19,

68 activation anormale de la voie de la protéine kinase C (Wu et al., 2007) pourraient expliquer les déficits observés. Nous montrons ici, que la baisse des récepteurs mglur1 et mglur5 impliqués dans les processus de potentialisation à long terme et dans la rétention mnésique dans des épreuves hippocampo-dépendantes (Lu et al., 1997 ; Riedel et al., 1996 ; Steckler et al., 2005) pourrait aussi participer aux déficits mnésiques produits par le stress prénatal. De façon paradoxale, les troubles de mémoire observés chez les stressés sont atténués par l alcoolisation chronique. Ainsi, l exposition chronique à des doses d alcool délétères chez les sujets témoins pourrait avoir un impact positif chez des sujets déficitaires. Ces résultats sont en accord avec des travaux précédents montrant que l exposition à l alcool (12 %) pendant plusieurs mois atténue les altérations mnésiques normalement observées chez des souris âgées (Krazem et al., 2003a). Un travail récent a par ailleurs démontré que des doses modérées d alcool amélioraient la mémoire et augmentaient les récepteurs au NMDA dans l hippocampe (Kalev-Zylinska et During 2007). Notre travail suggère que les récepteurs métabotropiques au glutamate pourraient également jouer un rôle dans ce processus. En conclusion, notre étude montre que les effets de l alcool sur les processus cognitifs ne sont pas seulement dépendants de la dose ou de la durée d exposition, mais varient aussi en fonction de facteurs de vulnérabilité individuels, qui peuvent trouver leur origine lors de la période périnatale. Références Darnaudery M., Louvart H., Defrance L., Leonhardt M., Morley-Fletcher S., Gruber S.H., Galietta G., Mathe A.A., Maccari S. Impact of an intense stress on ethanol consumption in female rats characterized by their pre-stress preference: Modulation by prenatal stress. Brain Res 2007, vol. 1131, n 1, p Darnaudery M., Maccari S. Epigenetic programming of the stress response in male and female rats by prenatal restraint stress. Brain Res Rev 2008, vol. 57, n 2, p Darnaudery M., Perez-Martin M., Belizaire G., Maccari S., Garcia-Segura L.M. Insulin-like growth factor 1 reduces age-related disorders induced by prenatal stress in female rats. Neurobiol Aging 2006, vol. 27, n 1, p Dellu F., Mayo W., Cherkaoui J., Le Moal M., Simon H. A two-trial memory task with automated recording: study in young and aged rats. Brain Res 1992, vol. 588, n 1, p Deminiere J.M., Piazza P.V., Guegan G., Abrous N., Maccari S., Le Moal M., Simon H. Increased locomotor response to novelty and propensity to intravenous amphetamine self-administration in adult offspring of stressed mothers. Brain Res 1992, vol. 586, n 1, p Enache M., Van Waes V., Vinner E., Lhermitte M., Maccari S., Darnaudery M. Impact of an acute exposure to ethanol on the oxidative stress status in the hippocampus of prenatal restraint stress adolescent male rats. Brain Res 2007, vol. 1191C, p Fadda F., Cocco S., Stancampiano R., Rossetti Z.L. Long-term voluntary ethanol consumption affects neither spatial nor passive avoidance learning, nor hippocampal acetylcholine release in alcohol-preferring rats. Behav Brain Res 1999, vol. 103, n 1, p Fama R., Marsh L., Sullivan E.V. Dissociation of remote and anterograde memory impairment and neural correlates in alcoholic Korsakoff syndrome. J Int Neuropsychol Soc 2004, vol. 10, n 3, p Farr S.A., Scherrer J.F., Banks W.A., Flood J.F., Morley J.E. Chronic ethanol consumption impairs learning and memory after cessation of ethanol. Alcohol Clin Exp Res 2005, vol. 29, n 6, p Kalev-Zylinska M.L., During M.J. Paradoxical facilitatory effect of low-dose alcohol consumption on memory mediated by NMDA receptors. J Neurosci 2007, vol. 27, n 39, p Kippin T.E., Szumlinski K.K., Kapasova Z., Rezner B., See R.E. Prenatal stress enhances responsiveness to cocaine. Neuropsychopharmacology 2007, vol. 33, n 4, p Krazem A., Marighetto A., Higueret P., Jaffard R. Age-dependent effects of moderate chronic ethanol administration on different forms of memory expression in mice. Behav Brain Res 2003a, vol. 147, n 1-2, p Krazem A., Mons N., Higueret P., Jaffard R. Chronic ethanol consumption restores the age-related decrease in neurogranin mrna level in the hippocampus of mice. Neurosci Lett 2003b, vol. 338, n 1, p Lemaire V., Koehl M., Le Moal M., Abrous D.N. Prenatal stress produces learning deficits associated with an inhibition of neurogenesis in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U.S.A 2000, vol. 97, n 20, p Lu Y.M., Jia Z., Janus C., Henderson J.T., Gerlai R., Wojtowicz J.M., Roder J.C. Mice lacking metabotropic glutamate receptor 5 show impaired learning and reduced CA1 long-term potentiation (LTP) but normal CA3 LTP. J Neurosci 1997, vol. 17, n 13, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

69 «Alcoolisation précoce» Oscar-Berman M., Kirkley S.M., Gansler D.A., Couture A. Comparisons of Korsakoff and non-korsakoff alcoholics on neuropsychological tests of prefrontal brain functioning. Alcohol Clin Exp Res 2004, vol. 28, n 4, p Riedel G., Wetzel W., Reymann K.G. Comparing the role of metabotropic glutamate receptors in long-term potentiation and in learning and memory. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 1996, vol. 20, n 5, p Robles N., Sabria J. Effects of moderate chronic ethanol consumption on hippocampal nicotinic receptors and associative learning. Neurobiol Learn Mem 2008, vol. 89, n 4, p Steckler T., Oliveira A.F., Van D.C., Van C.H., Mateus A.M., Langlois X., Lesage A.S., Prickaerts J. Metabotropic glutamate receptor 1 blockade impairs acquisition and retention in a spatial Water maze task. Behav Brain Res 2005, vol. 164, n 1, p Vallee M., Maccari S., Dellu F., Simon H., Le Moal M., Mayo W. Long-term effects of prenatal stress and postnatal handling on age-related glucocorticoid secretion and cognitive performance: a longitudinal study in the rat. Eur J Neurosci 1999, vol. 11, n 8, p Van Waes V., Enache M., Dutriez I., Lesage J., Morley-Fletcher S., Vinner E., Lhermitte M., Vieau D., Maccari S., Darnaudery M. Hypo-response of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis after an ethanol challenge in prenatally stressed adolescent male rats. Eur J Neurosci 2006, vol. 24, n 4, p Wu J., Song T.B., Li Y.J., He K.S., Ge L., Wang L.R. Prenatal restraint stress impairs learning and memory and hippocampal PKCbeta1 expression and translocation in offspring rats. Brain Res 2007, vol. 1141, p Zuena A.R., Mairesse J., Casolini P., Cinque C., Alema G.S., Morley-Fletcher S., Chiodi V., Spagnoli L.G., Gradini R., Catalani A., Nicoletti F., Maccari S. Prenatal restraint stress generates two distinct behavioral and neurochemical profiles in male and female rats. PLoS ONE 2008, vol. 3, n 5, p. e2170. Cahiers de l Ireb n 19,

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71 «Alcoolisation précoce» EFFETS D UNE ALCOOLISATION PRENATALE SUR LES CAPACITES D APPRENTISSAGE ET DE MEMORISATION CHEZ LE RAT DA/HAN : COMPARAISON DES EFFETS D UNE ALCOOLISATION AIGUE OU CHRONIQUE AU COURS DES PERIODES DE NEURULATION ET DE NEUROGENESE HIPPOCAMPIQUE JOHAN LE FEL, PIERRE CHAPILLON ET VINCENT ROY UPRES PSY-NCA, EA 4306, Faculté des Sciences, Université de Rouen, Mont Saint Aignan - France Summary It is well known that prenatal exposure to alcohol can severely impair the developing brain and consequently lead to behavioural problems. However, the most vulnerable stages of the development are not fully described and a debate still exists between the effects of chronic versus acute exposure. Our study aimed at comparing the consequences on learning capacities and memory in rats of a chronic versus an acute prenatal exposure to alcohol. The study also aimed at comparing these effects at two different stages of the brain s development: neurulation, as an early stage, and hippocampal neurogenesis, as a late stage. Our results first showed that prenatal exposure to alcohol affects development (i.e. weight gain) in pups; mainly in pups exposed chronically to alcohol on both stages of development, but also in pups exposed acutely during the late pregnancy. In addition, our results also demonstrated that chronic exposure during neurulation can affect spatial learning capacities at adult age. No difference was obtained for other learning or memory processes but a correlation indicates that pups exposed acutely during neurulation could be impaired as a function of the amount of alcohol ingested by their dam. These behavioural results will be completed by some physiological and neurological studies. Mots clefs Alcoolisation prénatale, alcoolisation chronique/aiguë, modèle animal, rat, apprentissage, mémoire INTRODUCTION L alcool représente une forme de pollution intra-utérine des plus nocives (Barnes et Walker, 1981 ; Marret et al., 2005 ; Riley et McGee, 2005), notamment parcequ il traverse facilement la barrière placentaire et se retrouve ainsi en contact avec l organisme en développement et particulièrement son système nerveux. Selon la quantité d alcool absorbée, le stade de grossesse, les capacités métaboliques de la mère et selon la sensibilité individuelle du fœtus, les effets de l exposition prénatale à l alcool sur le développement seront plus ou moins prononcés (INSERM, 2001). Ces effets pour les plus graves conduiront au développement d un «syndrome d alcoolisation fœtale» (SAF), qui associe des anomalies physiques comme un retard de croissance et une dysmorphie craniofaciale à des troubles neurocomportementaux tels qu un retard mental à long terme (Jones et Smith, 1973). Bien que les effets d une alcoolisation prénatale soient globalement connus, nous ignorons encore précisément les doses qui produisent des malformations, les périodes critiques de la gestation ainsi que les effets de consommation chronique ou aiguë. De plus, s il est vrai que 82 % des Français estiment que consommer de l alcool pendant la grossesse peut entraîner des risques pour l enfant, 40 % d entre eux pensent que ces risques n apparaissent qu avec une consommation quotidienne (INPES, 2006). Afin d apporter de plus amples informations sur l importance du type d alcoolisation (aiguë ou chronique) et sur l existence de périodes critiques au cours du développement, nous avons utilisé un modèle d alcoolisation prénatale chez l animal. Notre but était de préciser les conséquences comportementales, sur le plan des apprentissages et de la mémoire, d une alcoolisation fœtale de type Cahiers de l Ireb n 19,

72 chronique par rapport à une alcoolisation de type aiguë, mais aussi de comparer les effets de ces alcoolisations sur deux périodes du développement, l une précoce (période de neurulation) et l autre tardive (période de neurogenèse hippocampique). Nous souhaitions ainsi répondre aux idées reçues mises en avant par l INPES (2006) selon lesquelles l alcool n a d effets néfastes que s il est consommé de manière chronique ou bien très tôt lors du développement fœtal. MATERIEL ET METHODES Animaux Les animaux utilisés sont des rats de la lignée DA/Han. Celle-ci a été choisie pour sa sensibilité marquée aux stimulations périnatales (Chapillon et al., 2002), ce qui pouvait laisser envisager des effets de l alcoolisation prénatale. En pratique, des femelles ont été mises en reproduction et leur J0 de gestation déterminé par la technique des frottis vaginaux. Les femelles ont ensuite été réparties pseudo aléatoirement dans les conditions témoin et alcoolisation aiguë ou chronique. Pour chaque condition d alcoolisation, nous avons ciblé une période de développement précoce, correspondant à la phase de neurulation, et une période de développement plus tardive, correspondant à la phase de neurogenèse hippocampique. De cette façon, nous avons constitué cinq groupes expérimentaux, composés de cinq à sept femelles et pour lesquels nous avons obtenus de 27 à 47 petits (sexe ratio proche de 50 %). Procédure d alcoolisation La procédure d alcoolisation consiste à remplacer le biberon d une femelle gestante par un biberon d eau alcoolisée à une concentration de 6,6 % (éthanol absolu > 99 %, Fisher Scientific France). Cette procédure ne permet pas de contrôler exactement la quantité d alcool ingérée mais évite les effets d un stress en cas d injection IP ou de gavage. Le biberon d alcool est placé pendant 24 heures au 10 ème ou au 16 ème jour de gestation pour les femelles de la condition alcoolisation aiguë précoce (groupe 10A) et tardive (groupe 16A). Pour les femelles de la condition alcoolisation chronique, le biberon est placé de façon continue du 8 ème jour au 12 ème jour de gestation (groupe 8C) ou bien du 14 ème au 18 ème jour de gestation (groupe 14C). Un relevé des consommations est effectué toutes les 24 heures et nous avons ainsi pu évaluer la consommation moyenne de liquide des mères à 20 ml sur 24 heures, ce qui correspond à une ingestion quotidienne d alcool d environ 8 g/kg. Expérience 1 Dans notre première expérience, nous avons mesuré les effets des différents types d alcoolisation prénatale sur les capacités d apprentissage spatial et de mémorisation des animaux dans la piscine de Morris (1984). Ce dispositif permet d évaluer, chez les rongeurs, les capacités à gérer de l information spatiale et à la mémoriser. En pratique, l animal est placé dans un bassin circulaire rempli d eau et doit s aider d indices visuels distaux pour retrouver une plate-forme qui permet d échapper au contact de l eau. Différentes procédures permettent ainsi d évaluer les capacités d apprentissage, le rappel en mémoire, la plasticité des apprentissages et la mémoire de travail. Les animaux des différents groupes ont été soumis à un protocole expérimental permettant d évaluer ces différentes compétences à partir de l âge de 45 jours (± 2). Au préalable à cette évaluation comportementale, nous avons mesuré dans chacun des groupes le nombre de petits par portée, la mortalité avant sevrage et l évolution pondérale des jeunes (au 1 er, 12 ème et 23 ème jours postnatals). Expérience 2 : test de conditionnement positif L expérience 1 ayant montré des effets modérés de l alcoolisation prénatale (cf. infra), nous avons décidé de tester les capacités d apprentissage de rats alcoolisés prénatalement à un âge plus précoce ; ceci de façon à tester d éventuels effets d une compensation par l âge. Nous avons pour cela testé les capacités d apprentissage de jeunes ratons (au 11 ème et 14 ème jours postnatals) dans un test de 72 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

73 «Alcoolisation précoce» conditionnement positif. Le protocole utilisé est adapté de Bouslama et al. (2005 et 2007) et permet de mesurer la réalisation d un apprentissage associatif entre un stimulus olfactif (odeur de menthe ou de citron) et un renforcement positif (caresses au pinceau). RESULTATS ET DISCUSSION Nous n avons pas observé d effet de l alcoolisation sur la taille des portées et la mortalité des petits avant le sevrage. Cependant, nous avons pu confirmer que l alcool était néfaste pour le développement pondéral des petits (Table 1). En effet, les résultats statistiques nous indiquent que les animaux des groupes 8C, 16A et 14C sont globalement moins lourds que les animaux témoins (F 4,193 = 6,68 ; p < 0,001, post-hoc : p au moins < 0,05). De plus, une interaction entre l âge de pesée et le facteur groupe (F 8,386 = 5,31 ; p < 0,001) nous indique que ces différences sont surtout liées à la mesure effectuée au 23 ème jour. A cet âge, les animaux issus de mères alcoolisées de façon chronique (8C et 14C) sont significativement moins lourds que les témoins (p < 0,001) de même que les animaux issus de mères alcoolisées de façon aiguë et tardivement (groupe 16A, p < 0,01). Jour 1 Jour 12 Jour 23 Témoins (n = 36) 6,54 ± 0,18 16,93 ± 0,35 36,18± 0,55 10A (n = 45) 5,89 ± 0,12 16,77 ± 0,29 35,82± 0,63 8C (n = 43) 5,86 ± 0,11 15,90 ± 0,18 32,18± 0,50 *** 16A (n = 47) 5,47 ± 0,10 16,39 ± 0,22 33,74± 0,64 ** 14C (n = 27) 5,25 ± 0,18 16,10 ± 0,14 33,30± 1,22 *** Table 1 : poids moyen (± sem) chez les rats témoins, issus de femelles alcoolisées de façon aiguë (10A et 16A) ou de façon chronique (8C et 14C). ** p < 0,01 et *** p < 0,001 en comparaison au groupe Témoin. Cet effet de l alcool sur le poids des petits est tout à fait compatible avec les effets observés dans le cas du SAF. Cependant, dans le cas du SAF, les effets de l alcool sont observés dès la naissance. Une différence dans le timing de développement entre l espèce humaine et l espèce rat pourrait expliquer en partie ce résultat (Clancy et al., 2001). De plus, d après les données obtenues il est probable qu avec des effectifs plus conséquents et une moindre variabilité, nous aurions mis en évidence des effets significatifs de l alcool sur le poids de la descendance dès le premier jour postnatal. Quoi qu il en soit, notre modèle semble donc pertinent puisqu il affecte le développement des petits et met en évidence qu une alcoolisation aiguë, même si elle semble avoir des effets moins prononcés qu une alcoolisation chronique, peut affecter de façon significative le développement pondéral. L alcoolisation prénatale a également eu des répercussions, assez limitées toutefois, sur le comportement des animaux à l âge adulte (Figure 1). Le seul effet observé dans le test de la piscine de Morris concerne les animaux du groupe 8C qui sont globalement moins performants que les animaux du groupe témoin et des autres groupes expérimentaux lors de la tâche d apprentissage (F 4,191 = 6,04 ; p < 0,001 post-hoc : p au moins < 0,05). De plus, l analyse d un effet d interaction nous indique que ce résultat est principalement lié aux premiers jours d apprentissage (résultats non montrés), le groupe 8C rejoignant la performance des autres groupes en fin d apprentissage. Les autres paramètres mesurés en piscine de Morris (performance au probe test, latences en phase de rappel et durant la tâche de mémoire de travail) ne montrent pas de différences significatives entre les groupes. Ce résultat montre à première vue, pour notre modèle, que seule une alcoolisation chronique durant une période précoce du développement prénatal peut affecter le devenir comportemental de la progéniture. Il est certainement à mettre en rapport avec la dose très modérées de notre alcoolisation. En effet, d autres études réalisées avec des alcoolisations prénatales modérée ont également conduit à observer des effets comportementaux très limités (Dursun et al., 2006). Cependant, il est aussi à moduler puisque nous savons qu un facteur de risque des troubles liés à l alcoolisation fœtale est la quantité d alcool ingérée par la mère durant la grossesse (Rostand et al., 1990). En effet, le risque de développer des troubles associés à l alcoolisation fœtale n est pas uniforme, tous les enfants de mères Cahiers de l Ireb n 19,

74 ayant consommé de l alcool pendant la grossesse n étant pas forcément atteints de SAF (Kaminski et Larroque, 2005). Par conséquent, nous avons également analysé nos données par le biais de corrélations entre le taux d alcool ingéré par les mères des différents groupes et les performances des portées aux différentes tâches en piscine de Morris. Comme le montre la figure 2, les mères du groupe 10A qui ont consommé le plus d alcool sont également celles dont les petits sont les moins performants au jour 4 de la phase d apprentissage. Ce résultat est à prendre avec précaution puisque nous n avons pas mis en évidence d autres corrélations significatives au sein de ce groupe, ni au sein des autres groupes, mais il semble cependant montrer de nouveau qu une alcoolisation prénatale, même aiguë, peut avoir des effets sur le devenir comportemental des petits. De plus, il montre de nouveau une atteinte des petits dont la mère est alcoolisée de façon précoce. Cette période apparaîtrait ainsi comme plus sensible aux effets de l alcool en vue de provoquer des répercussions sur le plan comportemental. La période tardive apparaît elle plutôt comme importante dans le développement pondéral des petits. Un complément à cette analyse consistera prochainement à étudier le profil individuel des petits, de façon à observer si la proportion de petits «peu performants» n est pas supérieure chez les mères ayant consommé le plus d alcool Apprentissage en piscine de Morris (latences en secondes) Témoin - T Aiguë précoce - 10A Chronique précoce - 8C Aiguë tardif - 16A Chronique tardif - 14C Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4 Figure 1 : latence moyenne (± sem) lors de la phase d apprentissage en piscine de Morris chez des rats issus de femelles témoins (T), alcoolisées de façon aiguë (10A et 16A) ou bien chronique (8C et 14C). Le groupe 8C est moins performant que les autres groupes (p < 0,05), essentiellement en début d apprentissage. Figure 2 : latence moyenne des portées du groupe 10A (n = 8) au 4 ème d apprentissage en piscine de Morris en fonction de l alcool consommé par la mère. Corrélation de Pearson : r² = 0,56 ; p < 0, Cahiers de l Ireb n 19, 2009

75 «Alcoolisation précoce» Enfin, les résultats obtenus dans l expérience 2 pour la tâche de conditionnement positif ne montrent pas de différences significatives liées à l alcoolisation prénatale. Ces résultats n ont été obtenus que pour un nombre très faible de portées (n = 2) et de petits (n compris entre 6 et 17) mais ne laissent apparaître aucune différence au niveau des capacités d apprentissage associatif entre les conditions. Ils permettent de penser que les résultats assez modérés obtenus dans l expérience 1 ne sont pas liés à une compensation avec l âge qui pallierait les méfaits de l alcool mais cela n est pas à exclure cependant puisque l on considère ici deux types d apprentissage très différents, la difficulté étant l impossibilité pratique de tester des capacités d apprentissage complexe chez de tout jeunes animaux. CONCLUSION Notre modèle d alcoolisation prénatale chez le rat et la comparaison de différents modes d alcoolisation (chronique ou aiguë) à deux périodes clefs du développement cérébral (neurulation et neurogenèse hippocampique) nous ont permis de montrer plusieurs résultats intéressants. Tout d abord, l alcoolisation fœtale provoque des troubles du développement pondéral. Ce résultat est observé sur les petits de femelles alcoolisées de façon chronique, mais également sur ceux de femelles alcoolisées de façon ponctuelle au 16 ème jour de la gestation. Ce résultat met en évidence une sensibilité particulière de la période la plus tardive de la gestation pour le développement pondéral de la progéniture. Il met aussi et surtout en évidence qu une prise d alcool aiguë peut conduire à ce type de trouble. Nos données confortent ainsi les préconisations de l INPES (2006) et contestent les idées reçues selon lesquelles une consommation occasionnelle ne présente pas de risque pour le fœtus. Notre modèle a aussi permis de confirmer que l alcoolisation fœtale à dose modérée pouvait conduire à des troubles des apprentissages. Même si cela n apparaît que de façon assez ponctuelle dans notre travail, ce résultat est visible pour une alcoolisation chronique durant la phase de formation du tube neural et il semblerait également qu une alcoolisation aiguë pendant cette phase de développement neural puisse être délétère en fonction de la quantité d alcool consommé par la mère. Au regard de cette étude, il sera désormais intéressant d observer les effets d alcoolisation plus prononcées, ceci afin d accentuer et de confirmer les effets que nous avons observés. De plus, dans le cadre de futures collaborations, nous chercherons à mettre en lien les troubles comportementaux observés et d éventuels dommages de l alcool au niveau cérébral. En particulier, nous chercherons à étudier la relation entre la consommation spontanée des mères, le taux d alcoolémie auquel sont exposés les petits et la proportion de petits affectés par des troubles du comportement. Références Barnes D.E., Walker D.W. Prenatal ethanol exposure permanently reduces the number of pyramidal neurons in rat hippocampus. Brain Res 1981, vol. 227, n 3, p Bouslama M., Durand E., Chauviere L., Van den Bergh O., Gallego J. Olfactory classical conditioning in newborn mice. Behav Brain Res 2005, vol. 161, n 1, p Bouslama M., Renaud J., Olivier P., Fontaine R.H., Matrot B., Gressens P., Gallego J. Melatonin prevents learning disorders in brain-lesioned newborn mice. Neuroscience 2007, vol. 150, n 3, p Chapillon P., Patin V., Roy V., Vincent A., Caston J. Effects of pre- and postnatal stimulation on developmental, emotional, and cognitive aspects in rodents: A review. Developmental Psychobiology 2002, vol. 41, n 4, p Clancy B., Darlington R.B., Finlay B.L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience 2001, vol. 105, n 1, p Dursun I., Jakubowska-Dogru E., Uzbay T. Effects of prenatal exposure to alcohol on activity, anxiety, motor coordination, and memory in young adult Wistar rats. Pharmacol Biochem Behav 2006, vol. 85, n 2, p INPES. Zéro alcool pendant la grossesse. INPES, Paris 2006, 6 p. Jones K.L., Smith D.W. Recognition of the fetal alcohol syndrome in early infancy. Lancet 1973, vol. 2, n 7836, p Cahiers de l Ireb n 19,

76 INSERM. Alcool : effets sur la santé. Inserm, coll. Expertise collective 2001, 358 p. Kaminski M., Larroque B. Consommation d'alcool et conséquences pour le fœtus: données épidémiologiques depuis la découverte du syndrome d'alcoolisme fœtal. In, Périnatale. S. f. d. m. (Ed.), 35ème journées nationales de médecine périnatale, Tours 2005, p Marret S., Brossard V., Adde-Michel C., Leroux P., Laudenbach V. Conséquences cérébrales fœtales de l'alcoolisme maternel. In, Périnatale. S. f. d. m. (Ed.), 35ème journées nationales de médecine périnatale, Tours 2005, p Riley E.P., McGee C.L. Fetal alcohol spectrum disorders: an overview with emphasis on changes in brain and behavior. Exp Biol Med (Maywood) 2005, vol. 230, n 5, p Rostand A., Kaminski M., Lelong N., Dehaene P., Delestret I., Klein-Bertrand C., Querleu D., Crepin G. Alcohol use in pregnancy, craniofacial features, and fetal growth. J Epidemiol Community Health 1990, vol. 44, n 4, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

77 «Alcoolisation précoce» CONSEQUENCES COMPORTEMENTALES ET NEUROBIOLOGIQUES DE L EXPOSITION PRECOCE A L ALCOOL ET/OU A UN AGONISTE DES RECEPTEURS CANNABINOIDES CHEZ DES SOURIS CONSANGUINES JENNY MOLET, MICHEL HAMON ET LAURENCE LANFUMEY INSERM U677, Faculté de Médecine UPMC, Site Pitié-Salpêtrière, 91, boulevard de l Hôpital, Paris Cedex 13 - France Summary The effects of early exposure to ethanol and/or cannabinoid (CB) receptor agonist on alcohol preference at adult age were examined in two mouse strains (C57BL/6J and DBA/2J), with marked differences in native alcohol preference. Mice were subjected to a daily intragastric ingestion of various doses of ethanol (0; 1; 1.5 or 2 x 2.5 g/kg) for 5 or 15 days starting on postnatal day (PND) 28. In addition, other groups of mice were treated with the CB receptor agonist WIN 55,212-2 (2 x 0.5 mg/kg/day s.c.) with or without ethanol ingestion (2 x 2.5 g/kg/day) during 5 days (PND 28-32). When 8-10 week-old, animals were subjected to a progressive ethanol intake procedure in a free choice paradigm to assess whether exposure to alcohol and/or CB receptor agonist during adolescent period could modify spontaneous alcohol intake at adult age. In alcohol-preferring C57BL/6J mice, early ethanol exposure (1 g/kg for 5 days) significantly decreased (-32 ± 9%) spontaneous alcohol consumption at adulthood. In contrast, early treatment with WIN 55,212-2 increased (+37.0 ± 3.5%) their spontaneous alcohol intake. In DBA/2J mice, which show no preference for alcohol, the latter treatment had no effect whereas early ethanol exposure increased their spontaneous alcohol consumption at adulthood (between +34 ± 15% and +96 ± 10%). Because brain serotoninergic neurotransmission is known to play a key role in alcohol preference/dependence, we investigated whether 5-HT 1A receptors, which are critically involved in serotonin (5-HT)-mediated behavioural controls, were affected by early ethanol exposure. Direct measurement of the functional coupling between 5-HT 1A receptors and G proteins showed an increase in the hippocampus of C57BL/6J and DBA/2J mice and in the dorsal raphe nucleus of DBA/2J mice that ingested ethanol at adolescence. These results suggested that early ethanol and/or cannabis consumption can affect ethanol preference at adulthood and that such induced modulations of alcohol intake are under genetic control. The critical influence of gene-environment interactions on alcohol preference/avoidance at adult age may depend -in part- on serotoninergic mechanisms. Mots clefs Exposition précoce, alcool, cannabinoïde, sérotonine, adolescence, souris INTRODUCTION L alcool et le cannabis sont deux des substances d abus les plus consommées chez les adolescents, et cette polyconsommation constitue un problème de santé publique avec le risque de développer une addiction et diverses complications psychologiques et sociales. Plusieurs études cliniques ont souligné l existence de relations entre l exposition précoce à l alcool et la dépendance à l âge adulte (Grant et Dawson, 1998), ainsi que l importance des interactions gèneenvironnement à des périodes critiques du développement dans la vulnérabilité à diverses psychopathologies. Par ailleurs, les effets à long terme d une consommation précoce d alcool et/ou de cannabis sont en réalité plutôt mal connus. Cahiers de l Ireb n 19,

78 La dépendance à l alcool implique de nombreux systèmes de neurotransmetteurs centraux (Johnson, 2004). Parmi eux, le système sérotoninergique (5-HT), principalement régulé par les récepteurs 5-HT 1A localisés au niveau du raphé et des régions corticales et limbiques (Hensler, 2003), et le système cannabinoïde (CB) (Onaivi, 2008) semblent jouer un rôle clef dans les mécanismes centraux contrôlant la préférence pour l alcool (LeMarquand et al., 1994 ; Kelaï et al., 2006). De plus, il a été démontré que la neurotransmission sérotoninergique subissait d importants remodelages au cours de l adolescence avant sa maturation complète chez l adulte, et que ce processus pouvait être altéré par l alcool (Crews et al., 2007). L objectif de notre étude était de modéliser, chez la souris, l exposition précoce à l alcool ou au cannabis, afin : d en évaluer les conséquences comportementales (appétence pour l alcool) de rechercher d éventuelles modifications concomitantes des récepteurs 5-HT 1A centraux à l âge adulte. Deux lignées consanguines de souris, les C57BL/6J et les DBA/2J, présentant respectivement une appétence pour l alcool et, au contraire, une aversion, ont été utilisées dans nos études. MATERIELS ET METHODES Animaux et traitements Des souris mâles C57BL/6J et DBA/2J ont été soumises à une ingestion quotidenne d éthanol per os (solution aqueuse à 16 % d éthanol), à des doses variées (0 ; 1,0 ; 2,5 ; 2 x 2,5 g/kg) pendant cinq ou quinze jours à partir du 28 ème jour postnatal (PN 28). D autres souris ont été traitées avec un agoniste des récepteurs cannabinoïdes, le WIN 55,212-2 (2 x 0,5 mg/kg/j, par voie sous-cutanée, s.c.), avec ou sans ingestion d éthanol (2 x 2,5 g/kg) durant cinq jours à partir du PN 28. A l âge de dix semaines, c'est-à-dire chez les jeunes adultes, quatre à cinq semaines après ces traitements, les animaux ont à nouveau accès à l alcool, mais dans un protocole de libre choix cette fois, permettant d évaluer leur appétence pour le produit. A cette fin, on dispose dans les cages un biberon d eau et trois biberons d éthanol (dont la concentration est augmentée progressivement de 3 à 10 % en huit jours) en libre accès pendant 21 jours (Crabbe et al., 1996 ; Yoneyama et al., 2008). La consommation d éthanol ainsi que l alcoolo-préférence sont déterminées par la mesure tous les deux jours des quantités d alcool (pur, en g/kg), d eau, et de liquide ingérées. La croissance pondérale des animaux a été suivie par pesée quotidienne. Mesures neurobiologiques A l issue de la procédure de prise d alcool en libre choix, le cerveau des souris a été prélevé afin d évaluer le degré de couplage des récepteurs 5-HT 1A avec leurs protéines G. A cette fin, des coupes coronales de 20 µm d épaisseur ont été prélevées au niveau de l hippocampe (antériorité entre -1,06 mm et -2,54 mm par rapport au bregma) et du noyau raphé dorsal (NRD) (antériorité entre -3,88 mm et -4,96 mm par rapport au bregma). La quantification de la liaison spécifique de [ 35 S]GTP-γ-S induite par la stimulation des récepteurs 5-HT 1A (Fabre et al., 2000) a été effectuée selon le protocole suivant : après pré-incubation à température ambiante dans un tampon HEPES 50 mm, ph = 7,5, contenant 100 mm de NaCl, 3 mm de MgCl 2, 0,2 mm d EGTA et 0,2 mm de dithiothréitol, les lames gélatinées sur lesquelles ont été disposées les coupes de cerveaux sont immergées dans le même tampon, fraîchement préparé, auquel on a ajouté 2 mm de GDP et 10 µm de DPCPX [antagoniste des récepteurs de l adénosine, afin de diminuer le radiomarquage «non spécifique» (Laitinen et Jokinen 1998)]. Le [ 35 S]GTP-γ-S (1000 Ci/mmol ; 0,05 nm) a ensuite été ajouté à ce milieu en absence (condition «basale») ou en présence d une gamme de concentrations croissantes (10 nm, 100 nm, 1 µm, 10 µm) de 5- carboxamidotryptamine (5-CT), un agoniste des récepteurs 5-HT 1A (condition de «stimulation»). La liaison «non spécifique» est évaluée sur des coupes adjacentes traitées dans les mêmes conditions, sauf que du WAY (10 µm), un antagoniste sélectif des récepteurs 5-HT 1A, est également ajouté au milieu d incubation. Au bout de 60 minutes à 30 C, les coupes sont lavées dans un tampon HEPES (50 mm, ph 7,5) à 4 C, séchées et mises au contact d un film sensible pour en obtenir des 78 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

79 «Alcoolisation précoce» images autoradiographiques. La quantification du marquage est réalisée à l aide d un analyseur d images (Samba). La courbe «concentration-réponse» du pourcentage de stimulation de la liaison de [ 35 S]GTP-γ-S en fonction de la concentration de 5-CT permet de définir la concentration de l agoniste produisant 50 % (CE 50 ) de l effet. RESULTATS ET DISCUSSION Conséquences d une prise précoce d alcool sur la consommation spontanée d alcool à l âge adulte Chez les souris C57BL/6J, «alcoolo-préférantes», l administration précoce d éthanol n induit de modification significative de la consommation spontanée d alcool à l âge adulte qu à la dose de 1 g/kg pendant cinq jours (PN 28 à PN 32). Dans ce cas, la consommation d alcool est significativement diminuée (-32,1 ± 8,8 %) par rapport à celle des souris C57BL/6J témoins (ayant reçu de l eau de PN 28 à PN 32) (Tableau 1). Au contraire, les souris DBA/2J, «non alcoolo-préférantes», augmentent significativement leur consommation spontanée d alcool lorsqu elles ont reçu de l éthanol pendant la période «adolescente». Cette augmentation varie de +34 % à +96 % selon la dose d éthanol et la durée d administration entre PN 28 et PN 42 (Tableau 1). Aucune modification de la croissance pondérale ni des consommations d eau et de liquides n a été observée chez les deux lignées de souris lors de ces protocoles expérimentaux (résultats non montrés). Lignée H2O EtOH 1 g/kg (5 j) PN 28 PN 32 EtOH 1 g/kg (15 j) PN 28 PN 42 EtOH 2,5 g/kg (5 j) PN 28 PN 32 EtTOH 2 x 2,5 g/kg (5 j) PN 28 PN 32 C57BL/6J 100,0 ± 6,4 67,9 ± 8,8 * 125,9 ± 4,9 76,4 ± 9,1 77,9 ± 9,5 DBA/2J 100,0 ± 13,3 133,8 ± 15,1 173,2 ± 24,4 * 195,6 ± 17,8 ** 195,6 ± 10,2 ** * p < 0,05; ** p < 0,01 (test de Dunnett) Tableau 1 : variations de la consommation volontaire d éthanol de souris adultes ayant ingéré pendant la période «adolescente» différentes doses d alcool, exprimée en pourcentage (± E.S.M., n = 8-25) de la consommation de souris n ayant eu que de l eau au cours de cette même période. Conséquences de l administration précoce d un agoniste des récepteurs cannabinoïdes sur la consommation spontanée d alcool à l âge adulte Interactions avec l ingestion d éthanol au cours de la même période Chez les souris C57BL/6J, l administration répétée de WIN 55,212-2 à l adolescence entraîne une augmentation significative de la consommation volontaire d alcool à l âge adulte (Tableau 2). Curieusement, cet effet disparaît lorsqu on fait ingérer de l éthanol au cours de la même période (PN 28 - PN 32) chez les souris adolescentes (Tableau 2). Chez les souris DBA/2J, l administration précoce de WIN 55,212-2 n a aucune conséquence sur la consommation spontanée d alcool à l âge adulte. De plus, ce traitement ne modifie pas significativement l augmentation de l appétence pour l éthanol induite par l ingestion d alcool pendant l adolescence (PN 28 - PN 32) (Tableau 2). Aucune modification de la croissance pondérale ni des consommations d eau et de liquides n a été observée chez les deux lignées de souris lors de ces protocoles expérimentaux (résultats non montrés). Cahiers de l Ireb n 19,

80 Lignée H2O + saline H2O + WIN 2 x 0,5 mg/kg EtOH 2 x 2,5 g/kg (5 j) + saline EtOH 2 x 2,5 g/kg (5 j) + WIN 2 x 0,5 mg/kg C57BL/6J 100,0 ± 10,4 136,7 ± 3,5 * 111,3 ± 11,38 90,0 ± 8,1 DBA/2J 100,0 ± 13,8 96,6 ± 8,9 160,6 ± 20,2 * 155,6 ± 14,9 * * p < 0,05 (test de Bonferroni) Tableau 2 : variations de la consommation volontaire d éthanol chez des souris adultes ayant reçu l agoniste cannabinoïde WIN 55,212-2 seul ou en association avec l ingestion d éthanol au cours de l adolescence (PN 28 - PN 32). Les résultats sont exprimés en pourcentage (± E.S.M., n = 8) par rapport aux souris témoins (H2O + saline). Etat fonctionnel des récepteurs 5-HT 1A chez les souris ayant ingéré de l éthanol au cours de l adolescence. Mesure de la liaison de [ 35 S]GTP-γ-S induite par la stimulation des récepteurs 5-HT 1A Chez les souris DBA/2J, l ingestion d éthanol à l adolescence (2 x 2,5 g/kg/5 j), suivie d une prise d alcool en libre choix à l âge adulte, augmente significativement la liaison du [ 35 S]GTP-γ-S induite par la stimulation des récepteurs 5-HT 1A dans l hippocampe (F[1,36] = 13,44 ; p = 0,0008) et dans le NRD (F[1,40] = 22,2 ; p < 0,0001) quand on la compare à celle mesurée chez les souris n ayant ingéré que de l eau à «l adolescence» (Figure 1, C-D). Chez les souris C57BL/6J, l ingestion d éthanol à la dose de 1 g/kg durant cinq jours pendant la période «adolescente» accroît significativement la puissance de l agoniste 5-HT 1A, la 5-CT, à augmenter la liaison de [ 35 S]GTP-γ-S dans l hippocampe (F[1,24] = 9,635 ; p = 0,0048). De fait, aucun effet de l ingestion précoce d éthanol n est observé dans le NRD (Figure 1,E-F). A Hippocampe Basale Stimulation Non spécifique 5 CT B NRD Basale Stimulation Non spécifique 5-CT 80 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

81 «Alcoolisation précoce» C Hippocampe D NRD Liaison du [ 35 S] GTP-γ-S (% de stimulation) EtOH 2 x 2,5 g/kg H2O log [5-CT] M EtOH 2 x 2,5 g/kg log [5-CT] M * H2O ** E Hippocampe F NRD Liaison du [ 35 S] GTP-γ-S (% de stimulation) EtOH 1 g/kg H2O log [5-CT] M log [5-CT] M EtOH 1g/kg H2O Figure 1 : liaison de [ 35 S]GTP-γ-S induite par la stimulation des récepteurs 5-HT 1A. A-B : Autoradiogrammes représentatifs des sections de cerveau (20 µm d épaisseur) au niveau de l hippocampe (A) et du noyau raphé dorsal (NRD ; B) ; «basale» : section sans stimulation des récepteurs 5-HT 1A ; «stimulation» : section exposée à la 5-CT ; «non spécifique» : section exposée à la fois à la 5-CT et au WAY C-D : Courbes «concentration-réponse» de la liaison de [ 35 S]GTP-γ-S induite par la 5-CT dans l hippocampe (C) et dans le NRD (D) de souris DBA/2J ayant ingéré de l éthanol (2 x 2,5 g/kg/j pendant 5 j : PN28 - PN32) à l adolescence. E-F : Courbes «concentration-réponse» de la liaison de [ 35 S]GTP-γ-S induite par la 5-CT dans l hippocampe (E) et dans le NRD (F) de souris C57BL/6J ayant ingéré de l éthanol (1 g/kg/j pendant 5 j : PN28 - PN32) à l adolescence. * p < 0,05 ; ** p < 0,01 (test de Bonferroni) CONCLUSION Nos résultats montrent que, chez la souris, une consommation précoce d éthanol et/ou d un agoniste cannabinoïde peut affecter l appétence pour l alcool à l âge adulte. Les différences de consommation entre les souris des lignées C57BL/6J et DBA/2J indiquent que les modifications induites par la prise précoce d alcool sont sous contrôle génétique. Suite à l ingestion précoce d éthanol, la réduction de la prise volontaire d alcool chez les souris C57BL/6J pourrait être en relation avec un accroissement de la neurotransmission sérotoninergique via Cahiers de l Ireb n 19,

82 un couplage fonctionnel renforcé entre les hétérorécepteurs 5-HT 1A et leurs protéines G (dans l hippocampe). De fait, une corrélation négative a déjà été rapportée chez la souris entre le niveau d activation des hétérorécepteurs 5-HT 1A et l appétence pour l éthanol (Kelaï et al., 2006). Au contraire, l augmentation de consommation d alcool chez les souris DBA/2J ayant ingéré de l éthanol à l adolescence pourrait, quant à elle, être en relation avec l hypersensibilité des autorécepteurs 5-HT 1A mise en évidence par la mesure de la liaison 5-HT 1A -dépendant de [ 35 S]GTP-γ-S dans le NRD. De fait, une telle hypersensibilité entraîne une augmentation du rétrocontrôle inhibiteur exercé par la sérotonine elle-même sur le tonus sérotoninergique central, ce qui conduit en particulier à une diminution du degré d activation des hétérorécepteurs 5-HT 1A postsynaptiques (Renoir et al., 2008). Ces résultats sont en accord avec des données obtenues précédemment au laboratoire qui montraient une corrélation négative entre le niveau d activation des hétérorécepteurs 5-HT 1A et l appétence pour l éthanol (Kelaï et al., 2006). Dans leur ensemble, nos résultats permettent de conclure que des interactions gène-environnement lors d une période critique du développement jouent probablement un rôle clef dans l établissement des différences inter-individuelles concernant l alcoolo-préférence, voire l alcoolo-dépendance, à l âge adulte chez la souris. L implication de modifications fonctionnelles affectant la neurotransmission sérotoninergique dans ces différences interindividuelles est une hypothèse qui devra faire l objet d études complémentaires en vue d une éventuelle validation. Remerciements : ces travaux ont été financés par l INSERM, l IREB ( ) et la MILDT (APE07005DSA). Références Crabbe J.C., Phillips T.J., Feller D.J., Hen R., Wenger C.D., Lessov C.N., Schafer G.L. Elevated alcohol consumption in null mutant mice lacking 5-HT 1B serotonin receptors. Nat Genet 1996, vol. 14, n 1, p Crews F., He J., Hodge C. Adolescent cortical development: a critical period of vulnerability for addiction. Pharmacol Biochem Behav 2007, vol. 86, n 2, p Fabre V., Beaufour C., Evrard A., Rioux A., Hanoun N., Lesch K.P., Murphy D., Lanfumey L., Hamon M., Martres M.P. Altered expression and functions of serotonin 5-HT 1A and 5-HT 1B receptors in knock-out mice lacking the 5-HT transporter. Eur J Neurosci 2000, vol. 12, n 7, p Grant B.F., Dawson D.A. Age of onset of drug use and its association with DSM-IV drug abuse and dependence: results from the National Longitudinal Alcohol Epidemiologic Survey. J Subst Abuse 1998, vol. 10, n 2 p Hensler J.G. Regulation of 5-HT 1A receptor function in brain following agonist or antidepressant administration. Life Sci 2003, vol. 72, n)15, p Johnson B.A. Role of the serotonergic system in the neurobiology of alcoholism: implications for treatment. CNS Drugs 2004, vol. 18, n 15, p Kelaï S., Hanoun N., Aufrère G., Beaugé F., Hamon M., Lanfumey L. Cannabinoid-serotonin interactions in alcohol-preferring vs. alcohol-avoiding mice. J Neurochem 2006, vol. 99, n 1, p Laitinen J.T., Jokinen M. Guanosine 5 -(gamma-[ 35 S]thio)triphosphate autoradiography allows selective detection of histamine H3 receptor-dependent G protein activation in rat brain tissue sections. J Neurochem 1998, vol. 71, n 2, p LeMarquand D., Pihl R.O., Benkelfat C. Serotonin and alcohol intake, abuse and dependence: findings of animal studies. Biol Psychiatry 1994, vol. 36, n 6, p Onaivi E.S. An endocannabinoid hypothesis of drug reward and drug addiction. Ann N Y Acad Sci 2008, vol. 1139, p Renoir T., Païzanis E., El Yacoubi M., Saurini F., Hanoun N., Melfort M., Lesch K.P., Hamon M., Lanfumey L. Differential long-term effects of MDMA on the serotoninergic system and hippocampal cell proliferation in 5-HTT knock-out vs. wild-type mice. Int J Neuropsychopharmacol 2008, vol. 11, n 8, p Yoneyama N., Crabbe J.C., Ford M.M., Murillo A., Finn D.A. Voluntary ethanol consumption in 22 inbred mouse strains. Alcohol 2008, vol. 42, n 3, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

83 3. «HISTOIRE»

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85 «Histoire» LA SOIF CELTIQUE ET L'IMPERIALISME DE ROME. L'ECONOMIE DU VIN ET SES CONSOMMATIONS EN GAULE AU MOMENT DE LA CONQUETE DE CESAR FABIENNE OLMER CNRS UMR 5140 Archéologie des Sociétés Méditerranéennes, 390 avenue de Pérols, Lattes - France Les boissons alcoolisées, soit le vin, la bière, l hydromel, pour les plus ordinaires mais aussi d autres plus élaborées comme la soma (qui est de l hydromel mêlé à du malt) ou le kykeon (à base de vin, mêlé à de l orge, du miel et du fromage râpé), existent depuis des millénaires et les sociétés anciennes les consommaient sous diverses formes. Ainsi dans l Egypte ancienne, la production de bière dérivant de la fabrication du pain (toutefois assez forte en alcool) était quotidienne et familiale tandis que certains vins étaient réservés à Pharaon, pour des raisons religieuses. Globalement dans l Antiquité, si la consommation de boissons alcoolisées est autorisée dans le cadre familial ou domestique, l enivrement doit se plier à des règles religieuses. Il n est pas digne d être ivre et l ivresse isolée est prohibée, même à Rome. L ivresse est le plus souvent rattachée aux pratiques rituelles. C est pour cela que la manière de boire des Gaulois (c est-à-dire dans l excès) est remarquée, et est restée inscrite dans les mémoires. Le Gaulois, à travers l image d Epinal, est souvent ridiculisé, braillard, prompt à se battre et le plus souvent ivre. Les sources latines et grecques ont largement contribué à véhiculer cette vision peu glorieuse de l ennemi intime de Rome. Nous verrons ce qu il en était vraiment. Ce qui nous intéresse ici, c est ce qui se passe en Méditerranée occidentale tout particulièrement en Gaule durant la deuxième moitié du I er millénaire avant J.-C. et à la toute fin de la période, aux alentours du changement d ère. En effet, on observe, plus ou moins à l époque de César, un phénomène tout à fait remarquable qui consiste en un changement de mode de la consommation d alcool : on passe d un phénomène rituel et/ou réservé à l aristocratie -ou bien qui se doit de passer par les auspices de l aristocratie- à un phénomène privé/domestique et donc à une démocratisation des consommations, et ceci en quelques dizaines d années, motivée par des raisons économiques. L Italie toute puissante, en recherche de terres à conquérir, doit absolument écouler ses productions de vin. On remarquera que le vocabulaire employé pour ce thème est très proche de celui qui participe à notre société du XXI ème siècle : protectionnisme, impérialisme, monopole, corruption, standardisation, crise Cette période est en effet un moment où les conséquences du développement effréné du commerce seront très importantes et toucheront même aux structures fondamentales des sociétés antiques. Durant très longtemps les boissons alcoolisées sont restées dans le domaine des plus puissants et de l aristocratie. L enivrement, lui est réservé aux dieux. Les consommations de produits alcoolisés sont sans doute réalisées collectivement dans un premier temps. C est en tout cas ce que nous renseignent certaines figurations retrouvées sur des vases, à Chypre ou en Mésopotamie, qui mettent en scène des individus qui boivent ensemble. Il peut s agir d individus du clergé ou bien d un groupe d individus autour de son souverain, roi ou reine ; c est dans tous les cas un acte communautaire. Certaines sociétés traditionnelles africaines ont gardé ces coutumes et ainsi les Luo continuent, dans certaines circonstances et dans le cadre politique, de consommer des boissons alcoolisées en groupe. Les sociétés de la Gaule du VI ème siècle avant J.-C. qui sont fondées sur des petites principautés très puissantes, ont probablement procédé de cette manière. Tout le monde connaît le vase de Vix en Bourgogne, un cratère en bronze qui compte une capacité de 1200 litres. Ce vase est le plus grand que le monde grec ait jamais produit. Et il n a pas été retrouvé dans le domaine grec mais dans une de ces petites principautés qu était le site de Vix à côté de Châtillon-sur-Seine. Les dernières interprétations Cahiers de l Ireb n 19,

86 laissent à penser que cette société princière était dirigée par une femme qui avait le statut de pythie, comme celle de Delphes ou de Cumes. Son rayonnement devait être immense, peut-être à l échelle même de la Méditerranée. Ce vase lui aurait été offert comme cadeau diplomatique par un Grec ou un Carthaginois, sans doute un chef de guerre pour la remercier de ces «visions». Ce qui semble assez évident en revanche, c est que ce vase, qui était un véritable choix (il a sans doute fait l objet d une commande auprès des bronziers et aura été fabriqué exprès pour sa destinataire), devait être mis en scène pour en consommer son contenu quel qu il fût, bière, hydromel ou vin. Il devait réunir une partie de la société au sein d un programme festif et collectif particulier. Le vin est à l époque produit en Méditerranée et revêt un caractère luxueux indéniable. On retrouve très peu de vestiges de vin d Etrurie, de Sicile ou de Marseille, les plus fréquents des vins qui arrivaient jusque dans ces principautés. On en déduit qu ils étaient consommés par l élite sociale. A la fin de l exercice de ces principautés qui périclitent, à la fin V ème siècle avant J.-C., on observe un arrêt des importations de vin. Mais les boissons alcoolisées traditionnelles (bière, hydromel) sont toujours d actualité. On les perçoit à travers les vases à boire qui font toujours partie des répertoires des vaisseliers, et témoignent souvent d un certain luxe. Les plus humbles ne boivent sans doute jamais de boissons alcoolisées. Il faut attendre le II ème siècle avant notre ère pour voir réapparaître le vin. Il s agit cette fois du vin de la péninsule italique qui en produit des quantités phénoménales. Certains chercheurs vont même jusqu à penser que la politique expansionniste de l Italie républicaine, qui à cette période conquiert des terres «à tour de bras», est motivée principalement pour trouver des débouchés pour exporter le vin. C est toute l aristocratie italienne qui produit du vin, ses généraux en sont issus et trouvent donc des solutions à cette immense production en annexant l Espagne, la Grèce puis la Gaule méridionale. Le vin est distribué en amphores et celles-ci sont importées très brutalement, en force, en masse, par dizaines de millions. Mais là encore on observe des mutations. Tout d abord, elles sont consommées dans le cadre de banquets politiques. Ces banquets sont sans doute organisés autour de l aristocratie. Les sources historiques nous parlent de banquets extraordinaires, qui donnent lieu à des distributions de vins phénoménales et ostentatoires. Ainsi Poséidonios d'apamée (Athénée, Deipnosophistes IV 37, 1-19) nous livre ce qu il aurait vu en Gaule. Cette scène met en lumière un roi Arverne, Luernos : «Luernos, pour gagner la faveur de la multitude, se faisait transporter sur un char à travers les campagnes, et jetait de l or et de l argent aux myriades de Celtes qui le suivaient. Il faisait enclore un espace de douze stades carrés, sur lequel il faisait remplir des cuves avec des boissons d un grand prix, et préparer de telles quantités de victuailles que, plusieurs jours durant, il était permis à ceux qui voulaient entrer dans l enceinte de goûter aux mets qu'on avait préparés et qui étaient à disposition sans interruption». En ce qui concerne d autres cas, Poséidonios toujours, donne d autres détails : «On étend du foin et l'on sert sur des tables de bois peu élevées au-dessus du sol. Pour nourriture, des pains en petit nombre et beaucoup de viandes bouillies et rôties sur des charbons ou à la broche. On porte ces mets à la bouche proprement, mais à la manière des lions, en prenant des deux mains des membres entiers et en mordant dedans... On mange aussi du poisson chez les riverains des fleuves et des deux mers... L'huile n'est pas en usage : elle est rare et, faute d'habitude, on la trouve désagréable. Ceux qui servent font circuler la boisson dans des vases de terre ou d'argent ; les plats sont du même genre, quelques-uns en cuivre ou en bois ou en osier tressé. Les riches boivent du vin d'italie ou de Marseille, pur... Chez les autres, c'est la bière de froment préparée avec du miel ; le peuple boit la bière toute simple» (Histoires, XXIII d après Athénée). Le site archéologique de Corent en Auvergne semble apporter tous les éléments décrits voici plus de 2000 ans : un vaste sanctuaire, des amphores par centaines de milliers, des restes d animaux cuits et consommés, notamment des moutons, des cuves en bois pour les consommations communautaires des boissons, plus particulièrement du vin mais peut-être pas exclusivement, un atelier monétaire pour des distributions Ce témoignage montre combien le rituel accompagnait les consommations de boissons et de nourriture dans le sanctuaire. C est assez fidèle à ce qu aurait vu Poséidonios, et ces réunions pourtant certainement hautement spirituelles ou politiques sont à la base du folklore du Gaulois ivre et braillard. Il est vrai que l ivresse devait être de mise durant ces cérémonies. Toutefois cette «exception» prend tout son sens car désormais on consomme également des boissons alcoolisées en dehors des cadres politiques ou religieux. Une grande partie de la population a désormais le droit de consommer du vin, ce qui se développe de manière vertigineuse dans le cadre domestique. Le vin perd ses vertus religieuses et on ne s enivre plus collectivement. On boit 86 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

87 «Histoire» modérément dans le cadre familial, peut-être à l occasion de cérémonies privées. Cela participe au grand bouleversement de la société gauloise qui accompagne la Romanisation. Les Gaulois voient leur économie se tourner vers une agriculture intensive et l artisanat se développer de manière spectaculaire, notamment l artisanat du métal. S en suit le développement économique de très grandes villes (les oppida) qui parsèment la Gaule et rendent chaque peuple autonome, puissant et économiquement indépendant. Une des conséquences de ce phénomène de mutation sociétale et économique, se traduit par l essor du commerce avec la Méditerranée. En effet, l ouverture aux marchands Italiens, Grecs ou Ibères est facilitée par la conquête du sud de la France en De très nombreuses marchandises sont ainsi proposées et les Gaulois échangent denrées agricoles et produits manufacturés contre de nombreuses autres marchandises, comme de la vaisselle fine et des produits alimentaires au rang desquels le vin prend une place toute particulière. Mais ne croyons pas que les Gaulois subissaient cette vaste entreprise économique, car ils y participaient sans doute très activement. Nous verrons deux exemples. Le premier est la figure emblématique de Vercingétorix. Durant longtemps on n a vu dans ce chef gaulois vaincu par César à Alésia, qu un aristocrate aux prises avec les affres de la politique romaine. Pourtant, c est un personnage bien plus complexe qui apparaît lorsque l on se penche sur son cas. Il a peut-être été élevé à Rome, comme cela se faisait pour la noblesse, lui permettant d acquérir une vue d ensemble des mentalités romaines (mais aussi de stratégie militaire, ce qui est avéré) ; il avait des ambitions royales, ce qui était plutôt mal vu à l heure où les Gaulois avaient plutôt opté pour des élections annuelles à la manière des Romains et leurs consuls en binôme ; son père avait été tué par ses pairs alors qu il prétendait lui aussi devenir roi des Arvernes suite à Luern ; enfin il devait avoir des accointances avec le commerce du vin. Cela fait sourire de voir un Arverne faire du commerce du vin mais avec Vercingétorix nous sommes loin du bougnat de la gare de Lyon. Il devait en fait gérer tout un pan du commerce du vin italien au niveau de la Gaule du centre-est, générant des revenus phénoménaux, à même de couvrir ses ambitions personnelles. Ses monnaies en témoignent : elles montrent sur l avers son portrait à la manière de Philippe II de Macédoine et au revers, sous un cheval, on observe une amphore, symbole de sa fortune. Un autre personnage célèbre dans l Antiquité est Dumnorix. C est un chef Eduen, opposé à César. On dit de lui qu il aurait influencé ses clients, en les corrompant, pour obtenir la perception des taxes douanières de toutes les marchandises passant par la Saône et par la Loire ; là encore il devait s agir de sommes très conséquentes propres à lui assurer un avenir politique. Son frère, Diviciacos, druide et vergobret (l équivalent de consul des Eduens) était lui, au contraire, un partisan de Rome. C est lui qui a plaidé devant le Sénat, à Rome, pour une intervention de l armée romaine en -62. Il logeait chez Marcus Tullius Cicéron, dans sa villa sur le Palatin, ce qui montre à quel point ces personnages avaient une existence et une reconnaissance cosmopolite ; ils étaient reçus au plus haut de l état. Ces exemples nous montrent que l aristocratie gauloise était certainement très impliquée dans les mutations de la société et que la conquête césarienne de l année -52 et la Romanisation qui s en est suivie n a fait qu entériner un phénomène sérieusement abordé plusieurs décennies auparavant. Je conduis à Alès (Gard) une fouille archéologique sur l oppidum de l Ermitage depuis C est en cela que l Ireb m a soutenu concrètement dans le cadre de ma recherche. Ce site était connu depuis les années 50 mais très ponctuellement. Il s avère que les nouvelles recherches ont mis en lumière le statut jusque là inconnu de ce site très particulier. Il s agit probablement d un emporion plutôt qu un site d habitat traditionnel. Un emporion est un lieu de commerce, un lieu d échange qui voit les transactions entre diverses populations ; c est donc un lieu de contacts. Fort à propos, ce site est localisé à la frontière entre le monde Romain et le monde Gaulois avant la conquête de César. Denrées et marchands de tout bord et de toute origine fréquentaient l oppidum de l Ermitage pour réaliser des transactions ; s y côtoyaient des Romains, des Marseillais et des Gaulois. S en est suivie une acculturation très rapide à certains usages, notamment dans le domaine de l architecture. Ce sont les décors développés dans la petite ville qui sont le plus marquants. En effet, si les habitants de l oppidum de l Ermitage ont vécu dans des maisons traditionnelles, petites et plutôt archaïsantes puisque partiellement creusées dans le roc, ils les ont parées d enduits peints et de mosaïques tout à fait exceptionnels. C est la première fois que l on trouve ce type de décors dans un contexte apparemment aussi «modeste». Cela exprime une romanisation très forte, générée par la fréquentation de marchands romains et l enrichissement des Gaulois. Une romanisation un peu «m astu-vu» assez particulière, due au statut du site qui réunissait des individus de toute origine. Les Cahiers de l Ireb n 19,

88 Gaulois d Alès ne voulant pas rester en marge des nouvelles sociétés ont fait preuve d un opportunisme un peu ostentatoire. Tout cela pour vendre du vin. Car ce site est sans doute une des portes de l arrivée du vin italien en Gaule. D ailleurs, sur l oppidum de l Ermitage tout le monde en buvait C est donc une évolution des consommations de boissons alcoolisées qu il est possible d observer. D abord collectives et réservées aux dieux, ces consommations passent à un moment donné des mains de l aristocratie à celle de l ensemble de la population. Les consommations changent de nature : de religieuses et/ou politiques, les consommations deviennent familiales plus ou moins quotidiennes, mais sans doute générées par les profits de l agriculture et de l artisanat et donc de l enrichissement général de toute la population. Ces mutations sont à mettre au compte de la Romanisation, qui à travers celle des élites diffuse de nouvelles habitudes alimentaires au sein de toute la population gauloise. 88 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

89 «Histoire» L ENSEIGNEMENT ANTIALCOOLIQUE A L ECOLE FORMER LES FUTURS CITOYENS ( ) DIDIER NOURRISSON ET JACQUELINE FREYSSINET-DOMINJON Laboratoire ISOR, Université Paris 1 Panthéon-Sorbonne, 17 Rue de la Sorbonne, Paris Cedex 05 - France Summary This study is based, first, on a corpus of 148 school handbooks of hygiene, domestic economy, natural sciences and reading skills, for primary and higher primary classes, used throughout the period of reference ( ), and, secondly, on a corpus of 21 filmstrips mainly sponsored or made by antialcohol associations since the 1930 s. It analyses the lasting call to pupils invited to participate in the anti-alcoholic fight, as children in their current families as well as future adults -especially future wives and mothers- in their future families. It stresses the innovation brought in the 1950 s by filmstrips which show not so much the alcoholic s violence and insanity but rather the risks taken at work and on the road and advocate sport as a means of prevention against excessive drinking. Mots clefs Antialcoolisme, école, manuels scolaires, films fixes INTRODUCTION «Mes enfants que font à l école vos dévoués instituteurs? - Ils vous enseignent un grand nombre de sciences : ils font de vous des jeunes gens instruits. Mieux encore : ils s appliquent à vous rendre honnêtes et vertueux. Or la sobriété est une grande vertu. Sans elle, les individus, les nations périssent» 1. Face à l alcool, l école remplit traditionnellement une double tâche. En premier lieu, elle se charge d instruire la jeune génération sur les divers types de boissons alcooliques, leurs modes de fabrication et les risques de leur usage abusif. Au delà de cette «vulgate alcool» et sous des formes qui évoluent dans le temps, l institution scolaire revendique une fonction d éducation morale et de contribution à la formation civique des futurs citoyens. En cela, elle se charge d une véritable «mission antialcoolique» qu elle assume par la parole du maître appuyée sur les outils pédagogiques mis à sa disposition, depuis les tableaux muraux jusqu à la télévision 2. Dans cet objectif, les élèves sont l objet d une interpellation directe durant toute la période de référence ( ). Après les années 1940, les stratégies utilisées s enrichissent de nouvelles propositions de prévention dans une bataille qui est toujours d actualité. 1 F. Mane, P. Pugnière, 40 leçons sur l hygiène, l antialcoolisme, l épargne et la mutualité, Paris, Gedalge et Cie, Notre étude porte d une part sur un corpus de 148 manuels d hygiène, d économie domestique, de sciences naturelles et de lecture destinés aux élèves du primaire et du primaire supérieur, en usage durant toute la période de référence ( ), d autre part sur un corpus de 21 films fixes (ou photogrammes), le plus souvent sponsorisés ou réalisés par des associations antialcooliques à partir des années Voir D. Nourrisson et J. Freyssinet- Dominjon, L école face à l alcool. Un siècle d enseignement antialcoolique ( ) à paraître aux Presses Universitaires de Saint Etienne en Cahiers de l Ireb n 19,

90 UNE DURABLE INTERPELLATION DES ELEVES Les élèves sont interpellés sous deux angles. D abord comme enfants, destinataires naturels du discours pédagogique et de la mise en garde contre les dangers de l alcool. En second lieu, en tant que futures ménagères, les jeunes filles sont plus spécialement invitées à préparer leur participation à la lutte contre l alcoolisme. Notons d emblée l existence d un point commun entre ces deux populations ciblées par le message antialcoolique, celui d être désignées à la fois comme victimes de l alcoolisme et comme possibles sauveteurs de l alcoolique. L adresse aux enfants Avant d être invités à s associer au combat antialcoolique, les enfants sont avertis de tous les dangers qui les guettent ou accablent déjà un certain nombre d entre eux 3. L enfant victime De la fin du XIX ème siècle aux deux tiers du XX ème, l inventaire de la totalité des effets négatifs de l alcoolisme du père sur la santé de l enfant fait apparaître plus de constantes que de variantes. Parmi les constantes, d abord la fragilité des descendants de l alcoolique dès leur naissance : ils sont moins résistants que les autres, chétifs, faibles, rabougris, malingres, rachitiques, atrophiés, débiles. S ajoute une prédisposition à toutes les formes de tuberculose, à l épilepsie, aux convulsions, à la paralysie infantile et aux maladies nerveuses jusqu à la folie. Dans cette avalanche de périls annoncés, quelques auteurs apportent un complément original. En 1921, le rédacteur du Cours abrégé d histoire naturelle et d hygiène renforce la description calamiteuse. En effet, non seulement l alcoolisme est héréditaire, mais «ses effets retentissent jusqu à la quatrième génération en s aggravant toujours» 4. Deux manuels plus récents ajoutent au catalogue déjà lourd des risques encourus par les descendants d alcooliques celui de la surdi-mutité : «beaucoup de muets et de sourd muets sont des enfants d alcooliques» 5. En résumé, atteint de tares profondes, physiques et morales, ils sont appelés à une vie de maladie et de dégradation, avec d autant plus de probabilités qu ils sont eux mêmes attirés presque inexorablement vers la consommation abusive d alcool. Digne d un film d horreur, la photographie de face et de profil d un enfant «taré» de l hôpital Saint-Louis présentée dans un film fixe de 1952 vise à provoquer dégoût et répulsion. Outre les «tares» qu il reçoit en héritage, l enfant (comme la mère) est une victime au quotidien des excès de l homme qui boit. Les membres de la famille de l alcoolique sont «sous-alimentés parce que la misère s installe au foyer du fait qu il dépense inconsidérément sa paye et qu il trouve difficilement du travail» 6. A la maison, les disputes, les mauvais propos, les coups réduisent les membres de la famille à la plus misérable condition. La paye de l alcoolique est dépensée au cabaret : «d où la misère ; femme et enfants sont voués à la mendicité, au vagabondage, les plus sûres voies d accès au vol et au déshonneur». En fin de course, le père à l hôpital ou à l asile d aliénés, la mère usée par un travail sans relâche et «les malheureux enfants tombent à la charge de l Assistance publique» 7. 3 Par ailleurs, les enfants doivent être instruits des normes du boire adaptées à leur âge. Celles-ci évoluent au cours du siècle de référence. Jusqu aux années 1940, la majorité des auteurs de manuels plaident pour l abstinence totale jusqu à l âge de 7 ans et l usage de l eau rougie de 7 à 15 ans. Pour certains, à titre de complément alimentaire ou de médication, l alcool «convient chez les vieillards et chez les enfants». Les recommandations sont plus strictes après les années cinquante dans les manuels comme dans les livrets d accompagnement des films fixes destinés aux commentaires du maître au moment de leur projection sur écran. 4 V. Boulet, Cours abrégé d histoire naturelle et d hygiène, brevet élémentaire, Hachette, R. Guillaume, La Vie familiale et ménagère, CEP, Bourrelier, De même, Marcel Obrieux, Hygiène, Enseignement technique, Hachette, Marcel Obrieux, Hygiène, Hachette, E. Aubert et A. Lapresté, Cours élémentaire d hygiène, André Guédon, Cahiers de l Ireb n 19, 2009

91 «Histoire» L enfant sauveur L éducation scolaire à la sobriété ne concerne pas seulement l enfant d aujourd hui et l adulte qu il deviendra. Dès son jeune âge, l élève est invité à contribuer à sa façon au sauvetage de son père en péril. Obéissant et aimable, il entretient chez ce dernier le désir de rentrer du travail directement à la maison sans faire étape au cabaret. Pour illustrer cette recommandation, manuels et films offrent une iconographie édifiante de l accueil de l ouvrier par des enfants empressés et affectueux. L enfant obtient de bons résultats à l école, remporte prix et récompenses pour faire la fierté de ses parents. Savant en herbe, il pense à lire, le soir, à haute voix, quelques pages de ses livres d école qui contiennent des récits intéressants et instructifs pour le profit de toute la famille, et le maintien du père au foyer. S il adhère à une ligue scolaire d enfants tempérants -association en vogue au début du XX ème siècle- il sera aux yeux du père buveur excessif un exemple vivant de la vertu de tempérance. Former les futures femmes Les auteurs de manuels d économie domestique -discipline spécifiquement destinée aux fillespartagent une haute idée de leur responsabilité morale et sociale. En 1948, dans la dixième édition de son manuel La femme au foyer, Madame Foulon-Lefranc explique que son but est «non seulement d apprendre et de faire apprendre, mais encore de faire aimer à la femme son travail dans la maison et son rôle dans la famille et la Société» 8. Moins soucieux que les rédacteurs de manuels de morale, de lecture ou d hygiène de mettre en évidence les risques courus par les épouses de maris alcooliques, violents ou fous, ces auteurs préfèrent présenter des images de la femme idéale dans ses rapports à l alcool. Les recommandations évoluent et s enrichissent dans la durée. Caviste, liquoriste, sommelière? La préoccupation première des manuels les plus anciens est de former la future maîtresse de maison à une bonne gestion des boissons alcooliques dans son propre foyer : fabrication, conservation, service à table, etc. Tante Aurore consacre de longs développements de son ouvrage Le Ménage au processus de fabrication de l alcool, avant de fournir les recettes des liqueurs de ménage, eau-de-noix, eau de coings, ratafia de cerises 9. La bonne distribution des vins occupe une place importante dans le chapitre de La future ménagère consacré à l ordonnancement d un grand repas 10. Certes, les excès de boissons alcooliques doivent être déplorés. Encore convient-il de dénoncer les boissons dangereuses au cas par cas. Si le gin, alcool anglais, est une liqueur abrutissante, qui cause tremblements et folie, le rhum -ou eau-de-vie de sucre- est présenté comme une liqueur tonique. De façon significative, l auteur de ce manuel ancien n éprouve pas le besoin de tirer des conclusions générales sur les manquements épisodiques ou chroniques à la sobriété. Une fée du logis, combattante de la cause antialcoolique Le nouveau mot d ordre des programmes et circulaires du ministère de l instruction publique de la toute fin du XIX ème déclarant la guerre à l alcool se répercute dans les manuels d économie 8 Mme Foulon-Lefranc, La femme au foyer, La femme dans la famille, Hygiène Enseignement ménager Conduite à tenir en cas d accidents Puériculture Le jardin et la basse-cour La politesse et l éducation 10 ème édition, Paris, Les Editions de l Ecole, Henri Fabre J., Le Ménage, Delagrave, Wirth E., La Future ménagère, Hachette, Le même thème est repris dans un manuel du début du siècle (Mlle Masson, La Petite ménagère, E. Vitte, 1905) où une fillette met la table et précise : «Pour le vin, papa s en est chargé ; il aime mieux avoir une bouteille de Bordeaux ou de Bourgogne, prise dans une maison sûre, que trois bouteilles d affreux liquide acheté au hasard». Cahiers de l Ireb n 19,

92 domestique pour de nombreuses années. Une nouvelle image de la femme idéale se profile : courageuse, active et vaillante, toujours la première levée, elle sait que «laisser par paresse le mari partir à jeûn au travail, c est d abord n avoir aucun souci de son bien-être. De plus c est l exposer à contracter une habitude funeste qu on déplore plus tard bien amèrement» 11. Ménagère irréprochable, véritable fée du logis, la femme se voit assigner une responsabilité plus élevée et d ordre national. De l harmonie familiale sous la houlette de l épouse dépend la vigueur d une nation «puisqu il dépend de la femme française de décupler les forces vives du pays en établissant au sein de la famille la santé, la paix, la joie» 12. Une thérapeute Dans les années 1940 enfin, il est reconnu à la femme une fonction directement thérapeutique. Avec beaucoup de courage, de douceur et de patience il est possible de guérir un alcoolique. Celui-ci n a que rarement la force de se guérir lui-même et après s être gardée elle-même d un vice abject et criminel, «c est à la femme, la mère... de suppléer à sa volonté chancelante». Pour ce faire, cette dernière connaît les manières d agir : «jamais de remontrances à un homme ivre, et quand il a retrouvé son bon sens, il ne faut pas lui faire de scènes, de reproches mais le raisonner doucement, éveiller sa bonne volonté, son désir de guérir». Au besoin, «un docteur l éclaire avec plus d autorité sur les dangers qu il court et fait courir aux siens». Mais il ne faut jamais «lui faire prendre à son insu de drogue menteuse promettant la guérison» 13. Cependant, une rupture s opère à partir des années Les auteurs de manuels d économie domestique (discipline vouée à disparaître) mais aussi d économie familiale et sociale ou de sciences naturelles n ont plus de telles préoccupations d ordre moral et thérapeutique. Le rôle privilégié de la femme n est plus nécessairement mis en vedette. C est sur les dangers que cette dernière court pour son propre compte et pour celui des enfants qu elle porte que les auteurs insisteront. DES PROPOSITIONS NOUVELLES DANS LES FILMS FIXES Avec leurs vues projetées en continu sur l écran, les film fixes prennent désormais le relais de cet enseignement «ménager civique». La notice d accompagnement d un film de 1957 expose le «rôle de la femme dans la lutte antialcoolique». «Généralement c est l homme qui boit. Le malheur est encore plus grand pour la famille quand la femme se laisse aller à la boisson. Souvent l homme boit parce qu il s évade de la maison parce qu il fuit un foyer peu agréable ; mais aussi chaque fois que la mère de famille rendra confortable l atmosphère familiale, elle luttera contre l alcoolisme. Le goût avec lequel l intérieur est arrangé, le calme sont des qualités qui retiendront l homme au foyer. Le rôle de la femme sera plus nuancé en contribuant à maintenir la paix entre les divers membres de la famille, en trouvant à son mari des occupations agréables, en l intéressant habilement à la vie du foyer. Tout cela est facile dans les conditions normales où le mari ne s est pas laissé aller à boire. Quand il s agit de guérir un alcoolique, le travail est infiniment plus délicat. La psychologie du buveur est très particulière, car il faut tenir compte de son agressivité, de sa jalousie, de son jugement faussé, de sa passion, de ses colères. Là, le rôle de la femme est parfois dramatique, d autant plus que toute maladresse peut mettre en danger sa vie ou celle de ses enfants» 14. Mais la contribution à la lutte antialcoolique de ces images projetées sur écran et commentées par l enseignant ne se limite pas au discours traditionnel. Elle promeut de nouveaux thèmes, développe de nouvelles argumentations 11 M. Murique, Economie domestique et hygiène, Delalain, Boutier Mme M., L Education ménagère, cours supérieur et cours complémentaire, Hachette, Foulon-Lefranc Mme, La Femme au foyer, Les Editions de l Ecole, Commission scolaire du Comité national de défense contre l alcoolisme, Alcool et alcoolisme, film n 2, par G.C. Chavannes, J. Humbert, A. Poissant, Cahiers de l Ireb n 19, 2009

93 «Histoire» Attention aux accidents! Les films fixes des années leur âge d or- font une place notable au discours de prévention des accidents provoqués par les excès du boire. La mise en scène iconique du travailleur pris de boisson se renouvelle. Les effets malheureux de ses abus ne sont plus représentés au cabaret, dans la rue ou en famille, mais d abord sur son lieu de travail, le chantier ou l atelier. C est l ouvrier du bâtiment qui bascule par dessus la barrière d un échafaudage sans lâcher la bouteille qu il tient à la main. Dans une autre dessin projeté, un menuisier debout, fait face au spectateur en brandissant un flacon de vin de sa main gauche. Il ne pourrait pas le faire de sa main droite dégoulinante de sang qu il vient de la trancher d un coup de scie électrique. Son commentaire explique la situation tragique : «Sans mon litre de rouge, pas moyen de travailler» 15. Loin de toute ironie déplacée, la vue suivante apporte un commentaire chiffré sur la question : sur 100 travailleurs, 80 sont sobres et 20 sont alcooliques. Ces derniers provoquent 50 % des accidents ce qui revient à dire que «statistiquement, l accident frappe quatre fois plus le travailleur alcoolique» 16. Le conducteur d une automobile court les mêmes risques s il roule en état d ivresse. En témoigne la photographie d une voiture accidentée, réduite à un tas de ferraille quasi-informe. Quelques mots donnent la morale de l histoire : «Il avait bu... de l alcool» 17. La relation de l alcool avec l insécurité routière devient un ressort systématique de la production de films fixes sur le thème de l alcoolisme. La notion d alcoolémie fait son apparition. L accidentologie automobile supplante bientôt les accidents du travail provoquant une vision effrayante et durable de la circulation mécanique. Elle s oppose en cela à la vue positive des activités sportives. Faites du sport Plus de la moitié des films fixes analysés parlent de sport. La règle est simple : «les vrais sportifs ne prennent pas d alcool». La bouteille est bannie de toutes les pratiques sportives, individuelles ou collectives, tant il est attesté que l endurance, l agilité, la vitesse, la force, la précision sont diminuées par l absorption d alcool. Ainsi, le coureur cycliste ne met pas du vin ou une quelconque boisson alcoolisée dans ses bidons. Il sait bien que l alcool coupe les jambes. Plus généralement, l alcool diminue le rendement musculaire de 5 à 15 %. Dans une compétition où il s agit d arriver quelques secondes avant un concurrent sur un parcours d une ou deux heures, il serait ridicule d être handicapé au point de mettre 10 ou 20 minutes de plus que si l on était en forme. Ainsi, le sport prend alors une place privilégiée dans l arsenal antialcoolique. L enfant devra modeler son comportement sur celui des vrais champions en s abstenant de boire avant et pendant la compétition. Même après le match, alors qu il se rend au café, siège traditionnel des clubs, il lui est demandé de commander du sans-alcool. Le dernier mot doit rester à l éducation. Certes, l alcoolisme comme fléau social tarde à rendre les armes, ce que reconnaît ouvertement le professeur Robert Debré, président du Haut Comité d Etude et d Information sur l Alcoolisme, s adressant aux enseignants au début de l année Pourtant, ce dernier tient à déclarer avec force son espoir dans une véritable éducation antialcoolique et la confiance qu il accorde à la «formation du caractère» plutôt qu à une «crainte de la maladie». Qu en penser aujourd hui? On aimerait mettre sur le compte de l éducation et de la formation du caractère la sensible diminution de la consommation d alcool en France depuis quelques décennies. Mais alors, comment expliquer les comportements désastreux de jeunes, souvent sobres les cinq premiers jours de la semaine et pratiquants réguliers de «beuveries express» le samedi ou le dimanche soir? 15 Commission scolaire du Comité national de défense contre l alcoolisme, Les réflexes, l alcool et les accidents, par J. Humbert et L. Faurobert. 16 Commission scolaire du Comité national de défense contre l alcoolisme, Luttons l action sociale, film n 5, par G.C. Chavannes, J. Humbert, A. Poissant. 17 Commission scolaire du Comité national de défense contre l alcoolisme, Luttons l action sociale, film n 5, par G.C. Chavannes, J. Humbert, A. Poissant. Cahiers de l Ireb n 19,

94 Références Choppin A. Manuels scolaires : histoire et actualités. Hachette, Paris 1992, 224p. Freyssinet-Dominjon J., Wagner A.C. L'Alcool en fête. Manières de boire de la nouvelle jeunesse étudiante. L Harmattan, Paris 2004, 273 p. Nourrisson D. Le Buveur du XIXe siècle. Albin Michel, Paris 1990, 327 p. Nourrisson D. (dir.). Education à la santé XIXe-XXe siècle. Rennes, Ecole National de Santé Publique, 2002, 158 p. Nourrisson D. Enseigner par le film fixe. Spirale, revue du département des sciences de l éducation de l université Lille 3, numéro spécial sur l image dans l enseignement Cahiers de l Ireb n 19, 2009

95 «Histoire» LES JEUNES ET LE BOIRE EN BRETAGNE PENDANT LE SECOND XX EME SIECLE : UN DEFI POUR L'HISTORIEN THIERRY FILLAUT Centre de recherches Historiques de l Ouest (CERHIO), - UMR 6258, Université de Bretagne Sud, 4 rue Jean Zay, BP 92116, Lorient Cedex - France Summary Since thirty years, the drunkenness has been frequently observed on the teenagers and the young people in Brittany. However, no retrospective study on this subject exists. This research tries to fill this lack and doesn t speak only about the drunkenness. Its purpose is to describe the various drinking habits of the young Bretons during the second half of the twentieth century. But the informations are discontinuous and partial. Therefore it is necessary to diversify the sources and the approach modes. Mots clefs Jeunes, Bretagne, histoire, boire, ivresse INTRODUCTION Toutes les études récentes confirment qu en matière d usages d alcool, les jeunes Bretons se démarquent nettement de la moyenne. Ainsi, selon l Atlas régional des consommations d alcool 2005 publié par l INPES et l OFDT, c est en Bretagne qu à 17 ans, les jeunes déclarent les plus hauts niveaux d ivresse de la métropole avec un rapport de l ordre de 1,8 pour les ivresses répétées et de 2,4 pour les ivresses régulières (23 % en Bretagne contre 9,7 % en moyenne en France). L initiation à l ivresse est également plus précoce et le sex-ratio plus faible. De tels chiffres questionnent évidemment l ensemble des acteurs publics et associatifs du fait des problèmes que ces comportements peuvent engendrer (troubles à l ordre public, accidents de la circulation ). Pour les expliquer et pour mieux adapter les politiques locales de prévention aux besoins, diverses hypothèses sont émises ou revisitées (transformation des modes de vie, régulation des adultes, convivialité et/ou mal-être ) qui toutes nécessitent finalement de «redonner de l épaisseur historique» (CIRDD Bretagne, 2007) aux regards portés sur l alcoolisation des jeunes en Bretagne. De fait, dès la fin des années 1970, diverses études ont pointé l importance de l ivresse chez les jeunes Bretons, par exemple l étude de Françoise Davidson et Marie Choquet sur Les jeunes et les drogues permises et interdites (1980), tandis que certains auteurs, par exemple Jean Daumer, s interrogeaient sur le sens des rituels observés localement comme celui de la piste, «une sorte de phénomène d ivrognerie de groupe» (Daumer, 1987) courant dans la région. Or, jusqu à présent, aucune étude rétrospective n a été menée sur le boire des jeunes dans une région confrontée depuis des lustres à l alcoolisme et dans laquelle l ivresse semble davantage banalisée qu ailleurs. Pour l historien, répondre à cette demande sociale relève donc d un double défi : d une part, se situer dans une logique de démarche appliquée qui n est pas si fréquente dans la discipline ; d autre part, porter un regard large, et si possible novateur, sur un sujet des plus complexes. C est l objectif de cette étude, actuellement dans sa phase de repérage, de recueil et d exploitation de l information, que de décrire les manières de boire des jeunes Bretons et de retracer leur évolution au cours de la seconde moitié du XX ème siècle. Son but, modeste mais nécessaire, est d établir les faits et d opposer «un discours documenté, rationnel et critique» à des représentations et à des «constructions sociales qui sont la conscience commune» (Bédarida, 1996). Cahiers de l Ireb n 19,

96 MATERIEL ET METHODES Méthodes Cette étude se propose de situer l environnement général du boire des jeunes en Bretagne (offre et demande) et plus précisément leurs usages des boissons et comment ils évoluent. Elle combine à la fois une approche diachronique dont l objectif est de repérer les permanences et mutations de ce boire sur le temps long du second XX ème siècle (des années 1950 à 2000) et une approche synchronique qui, par le moyen de «coupes transversales» reposant sur des items de même nature (caractéristiques de la jeunesse, moments et lieux du boire, offre de boissons, pratiques d ivresse, actions de prévention), cherche à décrire la situation propre à telle ou telle génération et à repérer les écarts observables entre celles-ci. Pour l approche synchronique, quatre périodes ont été retenues, distantes les unes des autres d une quinzaine d années : le milieu des années 1950 ; la fin des années 1960 ; le milieu des années 1980 ; le seuil des années Chacune de ces périodes correspond à des temps forts : le renouveau des regards sur l alcoolisme et l émergence d un antialcoolisme d État symbolisé par la création du Haut Comité d Étude et d Information sur l Alcoolisme en 1954 ; l essor des travaux sur la jeunesse et, entre autres, sur son attitude vis-à-vis des drogues licites et illicites dans les années 1970 ; l essor d une alcoologie régionale et de diverses théories ethno-psychiatriques visant à expliquer la place particulière de l alcoolisme en Bretagne (matricentrisme, perte de la langue, acculturation ) au milieu des années 1980 ; et enfin, le développement des priorités et programmes régionaux de santé qui accordent une large place aux conduites addictives à la fin des années Sources Les sources exploitables sont variées. On pensera tout naturellement et au premier chef aux sources écrites de première ou de seconde main (sources administratives, ouvrages, articles ). Ont d abord été recensés les ouvrages et articles généraux et spécialisés (revues médicales) sur le sujet ainsi que les travaux et mémoires académiques (du rapport de stage de travailleur social à la thèse de médecine ou de sciences humaines et sociales en passant par les mémoires de maîtrise ou mémoires spécialisés en alcoologie). Un dépouillement de la série W des archives départementales (archives administratives postérieures à 1940), où sont conservés les documents produits par les services départementaux et régionaux (cabinets des préfets, conseils généraux, DDASS et DRASS ) et de la même série des archives communales (documents produits par les services communaux) est en cours. Un dépouillement, par sondage de la presse locale, quotidienne (Ouest-France, Le Télégramme) ou mensuelle (Armor-Magazine) est prévu. L étude passe également par l exploitation de l information économique régionale (étude du marché des boissons notamment). Bien évidemment, dans une société où l image et l audiovisuel occupent une place de plus en plus importante, l écrit ne peut être la seule source à exploiter. Des documentaires, des reportages mais aussi des films privés peuvent donner à voir et à comprendre les manières de boire des jeunes et leur évolution : divers documents ont ainsi pu être repérés à la Cinémathèque de Bretagne. Enfin, un recueil de témoignages est envisagé, bien que plus complexe à réaliser car il conviendrait de pouvoir multiplier les entretiens pour pouvoir disposer, sur un tel sujet, d un matériau assez conséquent pour pouvoir être significatif. RESULTATS ET DISCUSSION Cette étude, envisagée sur deux années, n en est encore à ce jour qu au stade du repérage, du recueil et des premiers traitements de l information collectée. 96 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

97 «Histoire» L ivresse des jeunes, l arbre qui cache la forêt? Aborder la question des jeunes et du boire en Bretagne pendant le second XX ème siècle, c est prendre d emblée un risque : celui de se focaliser sur ce qui, aujourd hui, retient l attention des pouvoirs publics et des médias, à savoir la fréquence des comportements d ivresse. Manifestement, l approche historique de ce comportement mérite une attention particulière. Deux raisons justifient cette attention. D une part, l ivresse est davantage banalisée en Bretagne que dans le reste du pays et ce ne sont pas seulement les jeunes mais aussi les adultes qui apparaissent plus sujets à de tels déportements ; l approche sur plusieurs générations peut permettre de préciser l évolution dans le temps de ces comportements. D autre part, à plus d un trait, l ivresse des jeunes de la fin du XX ème siècle rappelle certaines pratiques en vigueur au XIX ème siècle dans la région : or un tel rapprochement n a de sens que dans la mesure où l on peut faire un lien historique entre les comportements d hier et ceux d aujourd hui. Néanmoins, sans nier son importance, le phénomène n en est pas moins ponctuel : il constitue, pour une majorité de jeunes, un phénomène paroxystique qui rompt un quotidien où la sobriété est la règle. Désormais, la consommation des boissons non alcooliques constitue le quotidien de la plupart d entre eux. Or, cela n était nullement le cas au sortir du second conflit mondial quand la Bretagne avait le triste privilège d être la région française où l on mourait le plus par alcoolisme et cirrhose. Tout comme l ivresse des jeunes n était pas alors dissociée -ni dissociable malheureusement dans bien des sources- de celles des adultes sous le regard desquels elle s organisait. De fait, l étude historique du boire des jeunes en Bretagne ne peut se réduire à l histoire de l ivresse, voire même du seul usage des boissons alcooliques. Il est en effet important de saisir dans toutes ses composantes aussi bien le boire quotidien que le boire exceptionnel, les usages du boire chez soi et hors de chez soi. Plusieurs aspects méritent ainsi que l on y porte une attention particulière, par exemple le rôle des bars qui occupent une place majeure dans la convivialité juvénile mais aussi celui des buvettes dans les enceinte sportives (cf. la guerre des buvettes à la fin des années 1970) ou à l occasion de certaines manifestations culturelles ou festives (exemple des festou-noz), l essor d un marché régional des boissons (colas et bières locales) ou encore sur la matérialité et l impact des campagnes de prévention, et notamment celles de promotion des boissons de remplacement de la fin des années 1950 et début des années 1960, sur les manières de boire des jeunes dans les décennies suivantes. Mais aborder le boire dans ses multiples dimensions est chose complexe car ce qui retient l attention et laisse trace, c est davantage l exceptionnel que le quotidien. Une information discontinue et partielle Les premiers dépouillements réalisés mettent en évidence une difficulté majeure de l étude rétrospective des manières de boire chez les jeunes. Très diverses et dispersées, les sources ont pour principal défaut leur discontinuité. Jusqu aux années 1970, les données collectées concernent essentiellement l enfance : c est elle qui retient l attention dans un contexte où l alcoolisation régulière et principalement alimentaire est la norme ; les motivations sont évidentes : il s agit de dissuader les enfants d adopter trop tôt de telles habitudes en les informant des dangers de l alcool pour la santé et en leur proposant de nouveaux usages (promotion de boissons de remplacements, lait et jus de fruits par exemple). À partir des années 1970, s opère un basculement vers l adolescence et les jeunes adultes. En Bretagne, les études spécifiques à la jeunesse demeurent toutefois marginales jusqu aux années 1990, et ce, malgré le foisonnement de travaux sur l alcoolisme (travaux sur les populations hospitalisées, travaux d ethnopsyschiatrie). L importance des ivresses au volant explique pour une part cette évolution. L information est par ailleurs partielle. La plupart des travaux portant sur le sujet traitent du risque alcool et, de ce fait, ne donnent qu une vision partielle, sinon partiale, de la réalité du boire des jeunes dans la région. Les approches sont aussi plus souvent quantitatives que qualitatives. Cahiers de l Ireb n 19,

98 Un usage quotidien en baisse, des excès périodiques en hausse : des tendances à préciser Les premiers éléments réunis confirment la double tendance de l évolution du boire observée chez les jeunes dans la seconde moitié du XX ème siècle : baisse de l usage quotidien de boissons alcooliques d une part, tendance à la hausse des excès périodiques d autre part. De fait, au fil des décennies, l âge des consommations régulières recule. A en croire certains auteurs, ce mouvement aurait débuté assez tôt. Ainsi, dès la fin des années 1950 chez les marins, «les jeunes boivent moins» et en particulier «moins de vin, d apéritifs et d alcool», fait «partout et unanimement signalé par des personnes à même de l observer directement» (d Hugues et Lavenir, 1959). Mais de tels témoignages ne peuvent masquer la réalité, à savoir que les boissons alcooliques sont alors encore très tôt servies quotidiennement aux enfants, notamment dans les campagnes. C est plutôt dans les années 1960 que ce mouvement se profile alors que, sous l effet de l urbanisation et de la tertiarisation de la société bretonne, les pratiques alimentaires perdent de leur singularité, quand bien même des traits originaux, liés à l importance de l autoconsommation, se maintiennent. La baisse de l alcoolisation quotidienne chez les jeunes s accompagne également d un choix de boissons différent de celui de leurs aînés. Cidre et vin reculent au profit de la bière. Pour ce qui concerne l ivresse, c est un phénomène souvent difficile à repérer avant les années 1980, faute d études détaillées sur les manières de boire de la jeunesse, une jeunesse qui, dans les années 1950 et 1960, rejoint tôt le monde du travail et donc celui des adultes. En l état actuel de l étude, il est donc difficile d apprécier à sa juste valeur le mouvement même si, entre les années 1970 et 2000, les excès périodiques sont à la hausse. Par ailleurs, on assiste à un glissement du phénomène, d un acte encadré -au moins partiellement- par les adultes à un acte circonscrit entre pairs. L approche générationnelle devrait permettre d affiner ces évolutions. CONCLUSION Étudier les jeunes et le boire dans le cadre d une région comme la Bretagne au cours de la seconde moitié du XX ème siècle est un défi pour l historien. Un tel sujet se heurte en effet à un important problème de recueil de données (informations très ponctuelles avant les années 1970 concernant l alcoolisation des jeunes ; prégnance des enquêtes épidémiologiques et de certaines thématiques comme l ivresse ou les accidents de la circulation par exemple). Pour l envisager, il faut diversifier les sources (littérature grise, archives, presse, audiovisuel, témoins ) et les angles d attaques (approche économique et culturelle autant que socio-sanitaire). C est le seul moyen de saisir l acte de boire dans ses multiples dimensions et pas uniquement sous l angle du risque alcool auquel il est trop souvent réduit. Références Citations dans le texte : Bédarida F. L histoire entre science et mémoire? Sciences humaines 1996, n 59, p CIRDD Bretagne, Groupe de travail «L alcoolisation des jeunes en Bretagne», Compte-rendu de réunion, 29 mai 2007 [non diffusé]. Daumer J. Perte de la langue et réponse acculturative : le cas de la piste des Bretons. Les Cahiers du Droit 1987, p Davidson F., Choquet M. Les jeunes et les drogues permises et interdites. Les lycéens, le tabac, l alcool, les médicaments psychotropes et les drogues illicites. Éditions INSERM 1980, 90 p. D Hugues P., Lavenir H. La lutte contre l alcoolisme chez les jeunes marins-pécheurs bretons. Rapport présenté au Haut Comité d Étude et d Information sur l Alcoolisme. Dactylographié 1959, 70 p. Sur le contexte historique du boire en Bretagne, se reporter à : Broudic J.-Y. Suicide et alcoolisme en Bretagne au XXème siècle. Sociologie histoire psychanalyse. Éditions Apogée 2008, 237 p. Fillaut T. Les Bretons et l'alcool (XIXe-XXe siècle). Éditions de l ENSP 1991, 352 p. 98 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

99 «Histoire» ETHNOGRAPHIE DU TRAFIC DE «CALVA» EN BASSE-NORMANDIE ARNAUD MORANGE Centre de Recherche sur les Risques et les Vulnérabilités (CERREV), EA 3918, Université de Caen-Basse-Normandie, Esplanade de la Paix, Caen Cedex - France Summary Ethnography of the «calva» smuggling in Basse-Normandie : In the Basse-Normandie french region, the smuggling of cider brandy (named : the calvados or calva), was sometimes the talk of the town, when some local bootleggers were sued. Some of the incredible stories of these heroes of the calva smuggling main period are known, others much less. Starting from an investigation on the field, we proceeded to gather «slices of memo» which form, in the visited lands, a part of the collective identity. Mots clefs Alcool de cidre, calvados, contrebande, ethnologie rurale INTRODUCTION La contrebande d alcool de cidre en Basse-Normandie -le calvados- a donné lieu à quelques aventures rocambolesques dignes de scénarii de films d Henri Verneuil : faux corbillards traversant les barrages de la maréchaussée, fosses sceptiques remplies du précieux liquide, ou encore incendies volontaires de DS Citroën dégageant une forte odeur d eau-de-vie... Mais le transport et la vente de «calva» non déclaré aux services de l État constituant un délit sévèrement puni, les récits de ces aventures savoureuses, plus ou moins mythifiées, sont le plus souvent restés confidentiels et se transmettent essentiellement oralement. La période actuelle est propice au recueil de données qualitatives sur ce thème pour plusieurs raisons. La première tient aux évolutions récentes des modes de consommation de calvados. Cette boisson, ainsi que nous l avions observé dans une précédente étude de l Ireb (Morange, 2005), est de moins en moins consommée en milieu rural et sa fabrication revient de plus en plus à quelques industriels qui assurent la promotion du produit à l exportation. On peut ajouter à ces changements ceux intervenus dans le monde agricole : réduction du nombre d exploitations et baisse de la production cidrière. Par ailleurs, la période durant laquelle quelques trafiquants notoires devenus de véritables figures mythiques ayant alimenté l actualité de leurs «exploits» rocambolesques, a pris fin durant les années Le calvados fait donc moins l objet de trafics ; ce qui permet un meilleur accès aux informations sur le sujet. Nous nous sommes donc rendus sur les lieux de production -et de dissimulation- de la «goutte» afin de collecter quelques «tranches de vie locale» concernant cette mémoire toujours vive du trafic de calva. METHODE Technique d enquête L approche est socio-anthropologique en ce sens qu elle fait appel à la démarche éprouvée de l ethnologie, tout en intégrant la dimension critique et analytique de la sociologie (Dupont, 2007). La technique d enquête retenue à titre principal est celle de l entretien approfondi -dit semi-directif- sur le terrain même de la recherche. Cette technique classique en sociologie qualitative propose de stimuler la mémoire des interviewés, de leur laisser à loisir le plaisir de l évocation de l objet, quitte à conduire à une certaine volubilité du discours. L analyse du riche contenu de ces entretiens constituait l ultime étape avant sa mise en perspective théorique. Cahiers de l Ireb n 19,

100 Objectifs L objectif était de recueillir de longs témoignages d acteurs locaux afin de fixer par écrit des récits qui, par la nature même de l activité illicite, n étaient transmis que de manière diffuse et uniquement orale. Si la rigueur scientifique a présidé au protocole de cette enquête et a conditionné sa réalisation, son objet même lui donne un caractère parfois drolatique qui n obère en rien les graves questions de santé publique qui se sont posées dans nos régions relativement à la consommation parfois très excessive de calvados 1. Au delà du travail de collecte des récits, il s agissait aussi de saisir la fonction symbolique, sur un territoire donné, de ce que nous pouvons nommer les «petites mythologies du trafic de calva». Echantillonnage et terrain Des réseaux tant personnels qu institutionnels ont été mobilisés afin de mettre en confiance les interviewés. Une trentaine de personnes ont été visitées et entendues. Outre quelques personnalités qui se livraient à un trafic important par le passé, nous avons principalement eu affaire à des témoins directs de faits remarquables concernant le trafic et à des ruraux qui, du fait de leur activité agricole, faisaient (font?) distiller des quantités de cidre dépassant le cadre légal. Quelques récits peuvent concerner le département de l Orne ou, plus largement, la région que l on a singulièrement nommée localement le «triangle d or» (entre les villes de Domfront, Flers et Mayenne). La majorité des entretiens a cependant été réalisée dans le département de la Manche, parfois dans celui du Calvados (dans le Pays d Auge plus précisément). RESULTATS ET DISCUSSION Préalables Nous entendons ici comme «résultats» le cœur même de l étude, à savoir les récits relatifs au trafic et à ses aléas cocasses. Le croisement de ces récits ainsi que leur mise en perspective théorique est un prolongement de ce qui constitue déjà, en tant que tel, l objectif recherché. Le terme de calvados, utilisé pour qualifier l alcool de cidre des campagnes normandes, vient paradoxalement de la ville. Les cafetiers parisiens, au XIX ème siècle, avaient en effet pris coutume de nommer ainsi l alcool qui provenait du Pays d Auge et qu ils proposaient aux citadins. Ce terme ne fut donc que peu utilisé en Basse-Normandie -et moins encore dans l Orne et dans la Manche...-, au profit de celui de «goutte» («faire de la goutte»). Le verbe bouillir sert de référent pour qualifier l opération de distillation (on parle aussi de la «bouille»), tandis que le producteur de cidre qui le transforme en calvados, tout comme le professionnel ambulant qui assure cette transformation, se nomment «bouilleurs», plus précisément «bouilleurs de cru». Le lieu d installation de l alambic ambulant nommé aussi «bouillotte» est «l atelier public» (depuis une loi définissant ces lieux officiels, mieux contrôlables par les services de l État que les cours de ferme) (Lepelley, 1977). Ainsi, de manière assez discrète verbalement, tel ou tel va parfois «travailler à l atelier...» Et l activité est très développée dès le XIX ème siècle, ainsi que l atteste ce voyageur : «Á certaines époques de l année, les alambics grands ou petits circulent du nord au sud dans tout le département [de la Manche]. Partout on les rencontre, sur les routes nationales comme dans les chemins vicinaux, transportés d un village à l autre, et parcourant toutes les fermes» (Billy et Drouin, 1987). Plus 1 Témoignage sur ce point : - «Dans l Orne, les gens étaient tous anéantis par l alcool, tous brûlés par l alcool! Moins dans le Pays d Auge, mais aussi dans la plaine de Caen (...) Dans certains coins, quand on faisait les foins à la main, ça consommait des quantités énormes de cidre et de calva. Même les gamins étaient déjà alcoolos ; certains qui en avaient eu dans le biberon ne marchaient pas : problèmes cérébraux, ça les fauchait! Il y avait des gens alcooliques qui mettaient au monde des enfants alcooliques! C était terrible!». 100 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

101 «Histoire» récemment, dans la seconde partie du XX ème siècle : «On avait droit à 100 litres de cidre à bouillir, mais on en mettait 5600 litres. On bouillait toujours plus qui n fallait. C est tout le monde qui faisait ça car quand il y avait une corvée [agricole], il fallait quand même du calva... Á cette époque y avait pas de pinard! Cidre, café et calva, c était que ça! L apéritif, c est arrivé plus tard» 2. Introduction historique Le trafic de calvados résulte des quantités de liquide distillé en dehors des droits octroyés par l État aux producteurs, ces droits étant variables dans l histoire. En fait, producteurs de goutte et législateurs successifs ont engagé une passe d armes qui remonte au XVI ème siècle. Le conflit s appuie en particulier sur le traitement inégal réservé aux eaux-de-vie de cidre par rapport aux eaux-de-vie de vin soutenues par les grands marchands du Sud-Ouest. Une ordonnance royale de 1713 interdit ainsi l exportation de l alcool de cidre au-delà des frontières de la région de production et il faudra attendre 1942 pour que le calvados obtienne sa classification en AOC. Durant les XIX ème et XX ème siècles, souvent au gré du calendrier électoral, les droits à bouillir sont alternativement rendus et supprimés (rétablissement des droits à bouillir en 1875, confisqués par l État en 1903, puis supprimés de fait au titre de la réquisition des alcools non classés en AOC durant la Première Guerre mondiale ; droits rendus seulement en En 1953, diverses mesures visent à la réduction de la production et abolissent l hérédité du privilège. Actuellement, à la condition de s acquitter de quelques euros par litre, les derniers détenteurs de droits peuvent faire distiller l équivalent de dix litres d alcool pur, soit une quinzaine de litres de calvados). Les intérêts contradictoires des paysans et de l État vont traverser l histoire de la fabrication du calvados et engendrer une production parallèle que le service fiscal des contributions indirectes n aura de cesse de découvrir et de réprimer. Les «indirects», terme utilisé pour désigner les agents de l État de ce service, sont aussi affublés du nom de «rats de cave» du fait de leur mandat légal de vérification des stocks de calvados chez les bouilleurs. Le trafic entraîne dès lors une multitude d aventures mobilisant l ingéniosité des fraudeurs pour ce qui touche au transport et à la revente du produit. Sélection de récits 3 Gorges ou les risques du métier de douanier Á Gorges, village de la Manche, dans les années : «Les douanes avaient décrété qu il y avait trop de calva de fait. C était des tonneaux entiers, ça durait trois semaines à l atelier public (qui existe toujours). Donc, les douanes de Lessay décident d aller piquer les gars qui faisaient dix fois ce qui était autorisé. Le receveur-buraliste d ici était d accord pour 10 litres d alcool pur (le cadre de la loi), mais les gars en faisait 300 litres, y avait le commerce! Et ce receveur avait raconté ça aux douanes et qu à tel moment il y aura la cuisson du cidre. Alors, ils se sont amenés avec la 4 chevaux, mais toute l équipe des gars du coin les a reçus! Et parmi eux, y avait des durs! Ils n avaient pas peur, alors quan t les douanes sont arrivées Pfff! Tout l monde à poil [les douaniers]! Et hop à la baille dans l lavoir! Et la 4 CV dans la mare! Après, les douaniers sont r partis à pied à Lessay (quatorze kilomètres). Alors renforts, les CRS, là ça rigolait plus! Mais pendant c temps là, les gars sont allés boire un coup au café. Le fameux buraliste-receveur qui avait dénoncé les gars devait rendre des comptes! Ça a commencé à être des palabres, puis un CRS est entré dans l café et des coups de feu sont partis. Mon frère qui rentrait de l école a évité de peu une balle, y aurait pu avoir l drame! Mais c est l buraliste qu est mort d une crise cardiaque. Trois jours après il a eu droit aux funérailles officielles. Mon père qui r venait d faire du cid à Gonfreville s est dit, en entendant les coups d feu : «mais c est quand même pas la guerre?», et il est allé faire sonner l tocsin. Ça f sait impression! Et en fin de compte, quequ s-uns ont fait un peu d prison. Mais ça a laissé des traces : après, pendant 2 Témoignage recueilli par nos soins. 3 L ensemble des récits collectés fera l objet d une présentation ultérieure plus complète au moyen d un support différent. 4 L orthographe choisie dans les transcriptions vise à préserver le caractère phonétique de l énoncé. Cahiers de l Ireb n 19,

102 vingt ans, on a été tranquille pour l calva! Et puis y avait toujours dix gars qu étaient là à aider au bouilleur, au cas où... [...]. Après, Gorges avait la réputation de gens assez tendus Fallait pas remettre les pieds où qu y fallait pas! Y a pas très longtemps, quand un jeune du village s était retranché dans sa maison, l capitaine de gendarmerie de Coutances avait dit : «attention, j vais prendre des m sures parce que Gorges est pas une commune comme les autres!»». Jacques ou l enfance héroïque par nécessité Pendant les années qui ont suivi la Deuxième Guerre mondiale, Jacques, qui vivait près de Flers (département de l Orne) accompagnait régulièrement son père (fermier) et un ami (mécanicien) lors de la collecte et de la vente de calvados non déclaré : Une consommation et un trafic par nécessité «Frauder, on le faisait pas par plaisir mais vraiment par nécessité. Toutes les bêtes de mes parents avaient été tuées durant la nuit du débarquement et c était impossible d en racheter ; fallait gagner de l argent! Le calva c était pour ça. Mais on pouvait pas vendre très cher parce que les gars étaient pas bien riches [...]. Nous, on le faisait pas de manière industrielle, c était pour survivre. On faisait peut-être litres par an! Mais on avait de la concurrence : un voisin par exemple, qui ne sortait que deux fois par an mais pour litres à chaque fois! Il était pas repéré car il avait un petit camion citerne Renault qui servait pour la livraison d essence. Lui, il l a fait longtemps [...]. Á Caen, les gars qu étaient dans les bistrots, ils avaient les joues creuses, ils n avaient pas d argent pour manger, alors c était café-goutte», «café-goutte»! Et ces bistrots, il fallait bien qu ils soient alimentés par quelqu un, alors on allait voir les paysans de la Mayenne. Ils avaient des grands mulots de bourrée (fagots) mais l intérieur était creux. On stockait beaucoup dans les granges, entre les bottes de paille, c était un vrai gruyère Chez nous, on avait un ouvrier agricole qui venait nous demander : «patron, où est-ce que je peux prendre de la paille parce qu à chaque fois que je tire une botte y a un barriquot de goutte derrière» [...]. Les paysans nous attendaient pour charger mais on pouvait passer la nuit, la voiture planquée sous la paille, parce que les indirects surveillaient. Parfois, on les laissait se fatiguer plusieurs jours, ça nous faisait marrer. Et queq fois on y allait franchement, on passait en force en criant : «tire-toi ou j te passe dessus!»». Les James Bond du bocage «On avait commencé avec une 5 CV trèfle. Avec cette voiture, il fallait d abord fermer les portières avant de charger, sinon tu pouvais plus les fermer après Il y avait un double plancher. Après, on a eu un corbillard. Lui, il a toujours bien passé partout, avec les cercueils remplis de bidons et le grand drap noir dessus pour la mise en scène (rires). Mais on a dû arrêter parce qu au bout d un moment, les gens trouvaient qu il y avait un peu trop de morts dans le coin [...]. Après, on a eu une Pakcard V- 12. Là, il y avait du volume parce qu il fallait quand même que ça vaille le coup! On se partageait ça à trois. On a eu aussi une traction ; la traction c était bien parce que tout le plafond c était un réservoir. Mais les tractions, il y avait des barres de torsion à l arrière, alors quand on chargeait un peu trop ou qu on allait trop vite, on cassait parfois une barre. Et là c était embêtant parce qu après il fallait rouler tout doux On avait aussi des jerricanes de calva, mais il fallait pas se gourer parce que ça sentait tellement la goutte dans les bagnoles qu on transportait aussi de l essence pour que l odeur passe par dessus celle de la goutte! [...]. C était un boulot dangereux mais quand tu sors de la guerre, t as plus bien peur! Avec les indirects c était vraiment au chat et à la souris, mais à partir du moment où ils ont mis les herses on pouvait rien faire sauf faire demi-tour et essayer de passer par ailleurs mais ils te la mettaient (la herse) souvent juste à la sortie d un virage Alors une fois que t es pris, t es pris, et ils appellent les indirects et t es foutu! [...]. Nous, c est à Flers qu on s est fait prendre et y a pas eu d arrangements possibles rien du tout! C est là qu on a vu qu on était plus dans le coup parce que les gendarmes commençaient à pouvoir s appeler (par radio). Tandis que nous, les paysans qui avaient vu la herse en fer ne pouvaient pas nous prévenir. Là, on s est dit que ça ne pouvait plus durer car la maréchaussée était devenue plus moderne que nous. Et puis La vase» [le mécanicien de l équipe 102 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

103 «Histoire» dont c était le surnom] s est pris quand même cinq ans de tôle! [...]. On a arrêté d un seul coup. Par ici, ça bricolait encore, mais nous, on avait plus besoin de ça». La construction d un système symbolique Dans son analyse du système sorcellaire dans le bocage, Jeanne Favret-Saada avait montré comment la sorcellerie se déployait dans un univers objectivé par l intrusion d un «annonciateur» ; annonciateur qui n était autre qu elle-même en sa qualité d ethnologue (Favret-Saada, 1977). A partir de ses observations, l auteur développait une série d analyses et de concepts qu il nous semble pertinent de mobiliser à propos de notre objet. Nous les mettrons en évidence en puisant dans les nombreux témoignages recueillis auprès de fraudeurs plus «modestes» que les personnages emblématiques d un trafic plus important et organisé. Un trafiquant introuvable Comme l envoûteur, le trafiquant reste toujours introuvable : c est toujours un autre, un voisin, une connaissance à l autre bout du village, elle-même réputée pour ses activités illicites passées (ou présentes) : «Lui, là-bas, c est un gars à voir... Il peut vous donner pas mal de... d astuces et de gens... Il est bien connu...» ; «Allez donc voir L., dans le bas du village ; lui, il pourra vous en parler». Solidarité territoriale oblige, le vrai trafic est à chercher au-delà des frontières du canton ou même de la région : «Ici, c était seulement local, c était quand même plus calme que du côté d Domfront Eux c était des sérieux!» ; «Il y en a c était vraiment des trafiquants, tandis qu ici y a pas eu ça» ; «Dans le Mortanais, du côté de Barenton, par là c était quelque chose! D ailleurs, dans not coin, quand les gens sont saouls, on dit qu il sont «barentonnés!»» ; «Ici c était des petits trafics ; la Bretagne était pire! Ils faisaient des gros trafics, c était des tonneaux de calva qui passaient à la place de tonneaux de cidre...». Si le trafiquant reste toujours invisible localement, il tombe néanmoins quelquefois aux mains des contrôleurs car ayant fait l objet d une «vendaison» de la part d un voisin malintentionné, par jalousie, par méchanceté ou pour régler des comptes très anciens (voisin malintentionné pareil à celui que l on peut soupçonner de jeter des sorts) : «Ça marchait par dénonciation : ils téléphonaient...» ; «Le père de ma femme avait une mauvaise voisine qui l avait dénoncé» ; «Á la maison, on se méfiait que ça ne se sache pas. Nous on n a jamais eu d ennuis mais y en a qu en ont eu... Mais tout ça, c est tabou, comme les histoires de sorcellerie par ici. On ne sait jamais trop les fins de l histoire...». La méfiance est donc de rigueur même si, en tout état de cause, on n a rien à se reprocher puisque, pour sa part, on n a jamais «vraiment» trafiqué... On n en fait plus, ou plus trop... D ailleurs, on n en a jamais vraiment fait... La consommation de calvados a progressivement et nettement diminué en Basse-Normandie depuis une trentaine d années et le trafic a suivi cette courbe descendante. Toutefois, à en croire les témoignages recueillis, il semble bien que le changement des usages n ait pas été accompagné d une baisse totalement proportionnelle de la production illicite : «Dans toutes les fermes, y a de la réserve... Par contre, la vente ça se calme!». La distillation illégale, quoique plus marginale, existe toujours, ne serait-ce que pour permettre la transmission générationnelle de quelques bouteilles d un nectar fortement associé au terroir d origine. Au travers de la passation aux descendants, c est d abord d une transmission symbolique qu il s agit, une part d histoire familiale préservée ; le calva devient alors la forme cristallisée d un enracinement dont la philosophe Simone Weill écrivait qu il constituait «le besoin le plus important et le plus méconnu de l âme humaine», soutenu par «une collectivité qui conserve vivants certains trésors du passé et certains pressentiments d avenir» (Weill, 1949). «Y en a pu d bu, du tout! Alors que j voyais, chez mon père, tous les jours y avait la goutte qui v nait sur la table : et allez une rincette! et une aut et vas-y! Mais maintenant y en a pu. Quand on m en d mande, comme quand ma fille et mon gendre viennent, je la mets jamais sur la table, pour la raison Cahiers de l Ireb n 19,

104 qu on conduit et qu on a vraiment pas droit à beaucoup : trois verres..., mais celui qu aime ça il en prendrait bien quat e des fois...» «Quand j me suis installé, j ai dit que je ne bouillerai pas parce que j veux pas voir les flics débarquer comme ça chez moi... : «où qu sont les barriques?», prendre les m sures et tout... Et j mens suis arrêté là. D ailleurs, nous on en a jamais fait, ou si peu...». Un peu plus loin durant l entretien : «Il faut pas laisser ça dans les fûts! Je me rappelle qu une fois j en avais fait une barrique de 70 litres mais quand j ai regardé dedans plus tard, y avait pu rien! Le bois avait tout pris! C est pour ça qu il faut la mettre en bonbonne après quelques années». «On gagnait suffisamment, alors le trafic on voulait pas le faire, on avait notre petite consommation personnelle, mais ça c était différent [...]. On avait droit à 10 litres d alcool pur, bon... donc on n en f sait peut-être une petite barrique de 70 litres pour avoir 30 litres pour l année sur la table, puis pour en donner de temps en temps à un copain qu en avait pas». Le précieux liquide possède aussi la faculté de rester peu visible aux yeux d autorités locales bien insérées dans le territoire : «Les gendarmes on les connaît mais la douane... ; même les flics ont parfois eu chaud quand ils ramenaient un peu de calva vers Cherbourg pour Pierre ou Paul...» ; «C était pas les gendarmes qui nous gaulaient, eux, ils s en buvaient aussi, et ils avaient des copains - c était les douanes! Ah les douanes! Ils étaient intraitab! Tandis que les gendarmes nous disaient : vous nous avez pas vu, dégagez au plus vite! Ils étaient correc! Mais ça se fait pu...». Discours ambivalent et place du chercheur A l instar de l enquête de Jeanne Favret-Saada, on relève toujours deux registres de la parole chez un même interviewé : le discours officiel : «Oui, c est vrai, il y en a qui croient [aux sorts]», ou, versus calva : «Je sais que y en a qui en font», puis, le discours qui dévoile des réalités : «Moi, je suis pris [ensorcelé]», et pour notre objet : «J ai vu en faire y a pas longtemps le gars [le bouilleur] me disait vous revenez dans une demie heure. Faut l enlever rapidement!». Une certaine malice de l esprit paysan s exprime pleinement autour de l interdit contourné. On reste toujours plus ou moins méfiant et dissimulateur mais on est également fier d évoquer les aventures passées et sa capacité à déjouer l autorité de la ville représentée par ses agents contrôleurs : «Quand je faisais le marché de Coutances, je vendais des petits cochons, alors je mettais les bouteilles de calva dans la cage, sous la paille. Et les gars de Coutances venaient au marché des petits cochons... Ceux qui achetaient c était des copains de Coutances. Pour vendre aux cafés, c était plus délicat, mais ça passait... Il y en a qui se faisait prendre bêtement mais ceux qui avaient un peu de génie ils y arrivaient toujours». En dépit de la vantardise dont font preuve quelques-uns, nos interlocuteurs sont vite rattrapés par une méfiance atavique qui préside aux relations en milieu rural, surtout à l égard des étrangers -des horsains- : «Je sais pas si les gens ici en faisaient. Moi j étais pas d là. En 65, j arrivais de Quettreville [dans un proche canton], alors les gens se méfiaient, je les connaissaient pas beaucoup» ; méfiance qui s applique bien évidemment au chercheur de passage : «Et comment vous avez eu mon adresse là, par le fait?» ; «Moi, j ai connu une histoire sur Trelly, du côté des Hauts-Vents, mais c est pas à moi d vous la donner. Et puis vous enregistrez, je ne veux rien dire là, mais y a eu des suites... Si vous allez voir S., il pourra vous raconter ; je vais vous dire l adresse quand vous aurez éteint votre truc là... [le dictaphone]». Le chercheur joue le rôle de l annonciateur qui structure le passé du trafic, objective les réseaux et identifie ses acteurs. Il est donc par nature potentiellement dangereux, d autant plus qu il vient de la ville, à l exemple des services fiscaux, et que le souvenir des «vendaisons» n est pas si éloigné. On lui assigne donc certaines limites qu il se doit d épouser tout en cherchant sans cesse à les repousser au moyen des stratégies propres à la technique de l entretien. Elles s appuieront ici sur la prise de conscience par les fraudeurs de la nécessité de transmettre un patrimoine oral qui risquerait sinon de disparaître avec ses dépositaires vieillissants. 104 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

105 «Histoire» Du mythe à l identité locale L analyse des discours met en évidence une construction mythologique faite d épopées, de héros, de frontières troubles entre ce qui se dit -et se transmet- et la réalité ; phénomènes d euphémisation ou d amplification reconnus parfois par les intéressés eux-mêmes : «Madame M., attention car elle raconte plus d histoires que d vérités!» ; «Á l arrivée des rats de cave ils ont balancé le calva dans la mare et il paraît que les canards étaient saouls... mais est-ce que c est vrai ça...?». Le mythe repose cependant sur des réalités tangibles popularisées par un Bobosse -flibustier du bocage- ou un Dédé la riflette, véritable «James bond de la goutte» qui disposait dans sa voiture d un système de largage d huile sur la chaussée en cas de poursuite... Ces personnages légendaires dont les aventures rocambolesques ont été rapportées par les médias 5 agissent comme des figures de proue d un imaginaire collectif qui se déploie d autant mieux qu à des échelles plus modestes tout un chacun a soit participé directement au trafic, soit pu l observer autour de lui. L élaboration de cette mythologie participe de la construction identitaire de la vie paysanne normande. Dans un contexte de désertification des campagnes, la réaffirmation d une identité collective propre passe par la préservation et la réactivation de faits structurants comme l histoire cocasse du trafic de calva. Cette fonction sociale et symbolique est particulièrement opérante dans la mesure où le produit est en quelque sorte un «concentré» des lieux et de la vie des hommes, du paysage (les pommiers qui serviront à la production) jusqu à un certain art de vivre («il a bien vécu!», dit-on pour qualifier celui qui a abusé de la boisson) 6. Pourtant, on peut considérer que le calvados et tout ce qui y a trait relèvent véritablement d un fait social total (Mauss, 1950). CONCLUSION Au-delà du folklore local, la posture plus socio-anthropologique adoptée ici engage à penser le trafic de calvados comme un fait social total, en ce sens qu il recouvre un ensemble assez large de pratiques collectives au sein d un même territoire : préservation de techniques, de savoir-faire, d un système langagier riche, activation des solidarités face à l adversité du pouvoir représenté par les «indirects», système d échanges tant symboliques qu économiques, transmission générationnelle, réaffirmation d une identité locale, production d une histoire, et même, d une mythologie. Cette enquête ouvre alors à une meilleure compréhension de la sociabilité en milieu rural normand tout en contribuant à la préservation d un patrimoine fondé, en l espèce, sur la mémoire orale. Cela est d autant plus important que, selon les personnes rencontrées, nous serions parvenus à «la fin d une époque», bien que : «La dernière fois qu j ai bouilli c était y a trois ans. J étais en retraite mais j avais mon tonneau. Le calva c est fini mais y a toujours la presse qui passe pour le cidre et ensuite l alambic : il en reste quelques-uns. Les jeunes pourront toujours se débrouiller, y aura toujours moyen de...». Références Citations dans le texte Billy J., Drouin C. Le Grand Livre des calvados. Charles Corlet, Condé-sur-Noireau 1987, 216 p. Dupont Y. Dictionnaire des risques. Armand Colin, Paris 2007, 421 p. Favret-Saada J. Les Mots, la mort, les sorts : la sorcellerie dans le bocage. Gallimard, Paris 1977, 332 p. Lepelley R. Le Vocabulaire de l eau-de-vie de cidre ou calvados dans le français régional de Normandie. Travaux de linguistique et de littérature 1977, Tome 15.1, 383 p. Mauger R. Bobosse : le flibustier du bocage, film documentaire. France 3 Normandie 1993, 45 minutes. 5 Outre les gazettes spécialisées dans l évocation spectaculaire des faits divers, on relèvera l excellent documentaire de Rémy Mauger portant sur la vie d Honoré Bossières, dit Bobosse : Bobosse, le flibustier du Bocage, France 3 Normandie, 45mns, «Entre chaque plat, on faisait un trou, le trou Normand, avec un verre d eau-de-vie qui jetait du feu dans les corps et de la folie dans les têtes» ; Guy de Maupassant dans Le conte de la Bécasse. Cahiers de l Ireb n 19,

106 Mauss M. Sociologie et anthropologie. P.U.F., Paris 1950, 544 p. Morange A. L Article R.6 de la licence IV du code des débits de boissons et la sécurité routière. Points de vue et pratiques des cafetiers concernant l ivresse des consommateurs et ses conséquences possibles sur la voie publique. Etude de cas en milieu rural dans le département du Calvados. IREB 2005, 584 p. Weill S. L Enracinement. Gallimard, Paris 1949, 249 p. Pour en savoir plus : Annales de Normandie. Manger et Boire. Congrès des Sociétés historiques et archéologiques de Normandie 1999, vol. 4, 280 p. Coll. Sorcellerie, bocage et modernité. Cahiers du L.A.S.A. 1987, n 7, 133p. Collin J. Notre trou normand. Edition de la lieutenance, Honfleur 2003, 138 p. Deries L. L Alcool et l alcoolisme dans la Manche. Ed. inconnue 1901, pagination inconnue. Gancel H., Le Gall J. Bouilleurs de cru et rats de cave. Ed. Ouest-France, Rennes 2002, 218 p. Lanöe F. Petites Histoires et grands secrets des boissons en Normandie. Ed. Charles Corlet, Condé-sur- Noireau 1997, 176 p. Leavitt J. (Dir.). Le Mythe aujourd hui. Anthropologie et sociétés 2005, vol. 29, n 2, p Lemarchand F. (Dir.). Vivre dans le bocage normand au XXe siècle. Témoignages d un siècle. Université inter-âges de Basse-Normandie, Presses Universitaires de Caen 2003, 432 p. Targat G. Le Calvados. Editions Ouest-France, Rennes 2002, pagination inconnue. Tievant C. Almanach de la mémoire et des coutumes en Normandie. Hachette, Paris 1982, 365 p. 106 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

107 «Histoire» L'ALCOOL DANS LES EMISSIONS MEDICALES ET LES FICTIONS A LA TELEVISION : CONVERGENCES ET INFLUENCES (DE 1949 A NOS JOURS) SEBASTIEN LE PAJOLEC ET MYRIAM TSIKOUNAS Équipe ISOR/CRH du XIX e siècle, Université Paris 1 Panthéon-Sorbonne, 17, rue de la Sorbonne, Paris cedex 05 - France Summary This third year of research focused on the analysis of medical programs on French TV and the comparison with the corpus of fiction programs previously studied. In the first place, these medical and fiction programs have in common the varied character these sources provide for the researcher : the variations in formats and genres typical of the «fictions of alcohol» can be compared with the heterogeneity of medical programs (types of reporting, talk-shows with alcohol or alcohol related subjects, autonomous program or talk-show following a fiction broadcasted just before). Despite the specificities of both corpus studied, one can see similarities in their discursive and formal evolutions. Thus, one notes a progressive focus on women s and young people s alcoholization in medical programs as well as in fictions; similarly, one notes in all the different sources for the last twenty years, the growing importance given to accidentology (in the words of experts as well as in fictions). Finally, the development of pathos and the increase of words in medical programs, since the beginning of the 1980 s, are also found in the psychologizing of the theme of alcoholism (dramatizing of everyday life or staging the subjectivity of alcoholic characters and their family circle). The transformations undergone by the French television (privatization of existing channels, creation of new ones, competition increased by the importance given to audience ratings) have determined for a large part this evolution in the representations of alcohol on television. Nevertheless, if the changes observed in medical and fiction programs seem to coincide, they are not always synchronous. It appears that most of the time, the evolutions of the first ones come first, which tends to prove that scriptwriters get their inspiration from medical programs, while simplifying the information for their fictions. Mots clefs Alcool, alcoolisme, alcoologue, centre de cure, CHA, émission médicale, fiction télévisuelle, télévision INTRODUCTION La première année de recherche, dont les résultats ont été publiés dans Les Cahiers de l Ireb (n 18, 2007), avait été l'occasion d'établir le corpus de notre objet après avoir cartographié les fonds audio et vidéo de l INAthèque de France. Nous avions exposé la méthodologie que nécessitait l'appréhension des fictions. L'an dernier, nous avons présenté nos résultats concernant les émissions radiophoniques -très difficilement accessibles- et les programmes de divertissement. Cette troisième année a été dévolue à l'analyse des émissions télévisées médicales et à leur comparaison avec le corpus de fictions, déterminé précédemment, et pour lesquelles nous avons en 2008 tenté de retrouver les conditions de production. En dépit de leurs spécificités narratives et de leurs points de vue divergents, les deux corpus étudiés connaissent des évolutions similaires. Les mutations du paysage audiovisuel français (privatisation de chaînes, apparition de nouveaux canaux, concurrence accrue par l'importance accordée à l'audience) déterminent pour une large part ces transformations intervenues au début des années Cahiers de l Ireb n 19,

108 DES SOURCES DISPARATES ET LACUNAIRES Hétérogénéité des supports En premier lieu, ce qui rapproche les fictions et les programmes médicaux, c'est le caractère disparate que ces sources offrent au chercheur. Entre mai 1958 (date de la première production dévolue à l alcool sauvegardée) et décembre 2007, les émissions médicales télévisuelles proposent une grande variété de formats. La durée d'un programme peut ainsi aller de trois minutes (C est la vie) à plus de quatre-vingt dix (Les Médicales). Les fictions offrent la même diversité, variant de treize minutes (Le Temps des copains) à quatre-vingt dix (les téléfilms, les épisodes de séries à héros récurrent comme Navarro). Le statut même des émissions de santé et des fictions ne présente pas de caractère constant. L alcoolisme peut être abordé dans des productions composées de plusieurs sujets, connexes (le quartmonde, les drogues, l accidentologie ) ou différents (Santé à la Une, Cinq colonnes, La Marche du siècle). Mais il peut aussi être traité dans un seul dossier ou dans un ensemble de reportages consacrés à différents portraits de malades ou à plusieurs lieux de soins. La question peut enfin être débattue sur un plateau, durant toute la plage horaire, ou après une fiction, film ou téléfilm qui illustre le thème (Les Dossiers de l'écran). De fait, faute de définition stable, nous avons choisi de recenser toutes les émissions dans lesquelles la parole est donnée, plus ou moins longuement, à un expert médical : médecin généraliste, médecin du travail, médecin psychiatre ou psychanalyste, gastro-entérologue, pharmacologue De la même manière, les fictions offrent un panorama très hétérogène dans lequel il faut distinguer les spécificités génériques (drame psychologique, comédie, fictions policière, sentimentale ou de terroir...) et les registres narratifs (téléfilm, feuilleton, série à héros récurrent). Spécificités génériques L'hétérogénéité des supports implique des cahiers des charges spécifiques D un bout à l autre de la période observée, les émissions médicales qui traitent de l alcoolisme s apparentent à des émissions de conseil : Pierre Desgraupes (Les Médicales), comme Noël Mamère (C est la vie), et plus tard Martine Allain-Régnault (Le Journal de la santé), proposent systématiquement aux téléspectateurs concernés par ce «fléau» d écrire à l émission qui communiquera les adresses des différents groupements d anciens buveurs, une liste des centres de cure Aux conseils pratiques, signe d'un lien privilégié entre la télévision et son public, les téléfilms et les feuilletons opposent des récits édifiants fonctionnant sur une dramaturgie mélodramatique, des histoires dans lesquelles les téléspectateurs peuvent se reconnaître. Mais ces fictions proposent moins des modèles d identification que des figures repoussoir. Les scénaristes, qui n ont pas suivi de cursus médicaux mais juridiques ou littéraires, évitent toute approche trop scientifique, lui préférant l'émotionnel et le spectaculaire. Il s'agit de divertir par les moyens de la fiction. À l'inverse, durant les quarante ans de télévision étudiés, les émissions de santé affichent constamment le souci maniaque des chiffres, la volonté de tout quantifier. Chaque émission, indifféremment de l année, de l heure et de la chaîne de diffusion, s ouvre sur un rappel du nombre de buveurs excessifs et, parmi eux, d alcoolodépendants, du nombre que représentent les malades alcooliques parmi l ensemble des malades hospitalisés, du coût de l alcool sur la Sécurité sociale, des bénéfices et des pertes pour l État Ce qui ajoute de la crédibilité aux programmes médicaux (les conseils, les informations scientifiquement validées) ne serait que surcharge dans une fiction et la rendrait inefficace. Limites de la recension La recherche sur l alcool à la télévision se caractérise par la difficulté à constituer un corpus. Si les bases de données de l INA fournissent des renseignements sur les magazines de société qui traitent de l alcoolisme, la situation est bien différente pour la fiction. Les notices des téléfilms et des épisodes de 108 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

109 «Histoire» série s avèrent souvent très succinctes et n évoquent que rarement l alcoolisme. Le visionnage de plusieurs séries et feuilletons a mis en évidence la présence de la thématique recherchée alors même que les bases de l'ina ne les mentionnaient pas. Pour tenter de combler ces lacunes, nous nous sommes concentrés sur les programmes diffusés en prime time des trois chaînes hertziennes les plus anciennes. Concernant les émissions médicales, la recension ne pose aucun problème. Par contre, il faut échantillonner. L objectif étant de regarder attentivement des programmes de très grande consommation 1, nous avons écarté les fonds régionaux, dont les émissions ont été conçues pour des publics limités. N'ont été retenus que les programmes diffusés sur les chaînes hertziennes. Par contre, le choix initial de ne recenser que des émissions programmées en access prime time et en prime time s est avéré peu judicieux. En effet, dès leur origine, les émissions médicales dévolues à l alcool sont ciblées en termes d âge, de sexe et de milieu socioprofessionnel. L après-midi, elles s adressent aux femmes (Français si vous parliez, FR3, Aujourd hui Madame, A2, Le Magazine de la santé, FR3, Savoir plus santé, A2). De fait, ces programmes s intéressent tout particulièrement à la buveuse et à l alcoolisme des jeunes. Le soir, jusqu à la fin des années 1960, c est-à-dire jusqu au moment où la majorité des Français -compte tenu de la couverture du réseau- mais aussi du prix d un téléviseur équipé des deux chaînes -ne peut encore regarder qu une chaîne- les émissions de la Une visent les familles modestes, se concentrant sur l alcoolisme ouvrier. Inversement, les émissions de la deux 2, faites de dialogues savants entre un journaliste spécialisé en santé publique et un médecin visent davantage les publics jeunes, citadins et aisés qui sont ceux de la deuxième chaîne. Malheureusement, l INA est loin de posséder une copie de toutes les émissions médicales consacrées à l alcool qui ont été recensées à partir des bases de données ainsi que des magazines de radio-télévision Télérama et Télé 7 jours. Certaines, qui ne sont pas encore numérisées, ne sont pas consultables car elle se trouvent sur des supports aujourd hui obsolètes : deux pouces, trois quart de pouce D autres, réalisées en direct avant l avènement du kinescope 3, n ont tout simplement laissé aucune trace. Surtout, en 1982, TF1 est privatisé et les archives de la chaîne, qui cessent d être déposées à l INA, ne sont plus systématiquement sauvegardées. Tel quel, le corpus rassemble 112 émissions échelonnées entre 1958 et LES DISCOURS SUR L'ALCOOL A TRAVERS LES DEUX CORPUS L'alcoolisme au temps de l'ortf : les mêmes buveurs mais montrés différemment Au départ du corpus et jusqu'aux années 1980, les équipes de télévision se déplacent pour filmer longuement et en direct un service hospitalier : visiter les malades, assister à une opération, interroger, sans lui couper la parole, un chef de service qui explique durant plusieurs minutes le fonctionnement du foie 4. La télévision se rend aussi dans les locaux des Alcooliques Anonymes, puis, à partir des années 1970, des associations confessionnelles : successivement La Croix bleue et La Croix d or. Jusqu en 1975, les émissions de plateau sont rares, limitées au débat des Dossiers de l écran et à Aujourd hui madame. Les producteurs prennent soin d inviter toutes les parties : anciens buveurs -généralement membres d un groupement-, médecins, représentants du Comité National de Défense Contre l Alcoolisme (CNDCA) et du Haut Comité d Information et de Lutte contre l Alcoolisme (HCIA). La technique n est pas encore très au point. Les gastro-entérologues déplorent que les téléspectateurs ne puissent voir en couleur les photos de foie malade et les schémas de trajets du sang, qu ils ont 1 Succès en termes d audience (Jusqu en décembre 1974, sondages d opinion quotidiens - Sondages quotidiens, opinions, Centre des archives contemporaines de Fontainebleau, fonds ORTF, versement n ; ultérieurement mesures d audience quotidienne Médiamétrie). 2 La deux commence à émettre en mars Appareil muni d un miroir, consistant à filmer directement l émission en direct sur un écran de télévision. Le kinescope se généralise à la fin des années Pour la collection Les Médicales, le producteur et présentateur Pierre Desgraupes, vêtu d une blouse blanche, parcourt durant près d une heure le service de gastroentérologie de l hôpital Tenon (L Alcoolisme, ennemi public numéro 1, 07/05/1958) et de l hôpital Saint-Antoine (La Cirrhose alcoolique, 13/07/1967). Cahiers de l Ireb n 19,

110 confectionnés tout exprès et sur lesquels la caméra, empesée 5, a bien du mal à aller faire un gros plan. Les experts médicaux, qui sont tous des hommes de plus de quarante ans, sont peu à l aise devant la caméra et se comportent devant elle comme devant un groupe d étudiants. Ils parlent lentement, répètent les phrases au moyen de synonymes. Ils répondent longuement à chaque question posée par le journaliste. Les émissions sont non seulement rébarbatives mais difficiles à supporter : le public voit en très gros plans des incisions de la peau, l introduction d un trocard, un ventre déformé par l acite, le tissu d un foie ravagé par l alcool Ainsi, tant que la télévision est un monopole, l Office de Radio Télévision Française, et tant que n existent qu une ou deux chaînes nationales, les producteurs imposent aux téléspectateurs des émissions crues, ardues, mais informatives et émaillées de conseils. Durant cette «période ORTF», la fiction, contrairement aux émissions médicales, incite les téléspectateurs à boire, non pas à l excès mais continûment, des alcools fabriqués en France 6. Jusqu au mitan des années soixante-dix, le décor obligé des feuilletons et séries est le café : les camionneurs qui empruntent inlassablement l axe PLM s arrêtent souvent pour trinquer au vin rouge ou blanc dans des «routiers» implantés sur la nationale 7. La caméra reste fixement braquée sur les cafés-épiceries situés le long des canaux. Les étudiants, mal logés dans la capitale, ne cessent de se donner rendezvous au bistrot. Toutes les affaires se règlent encore dans les estaminets, tenus par le maire dans les villages. Et, dans ces établissements, excepté en début de matinée, à l heure du café-crème et des croissants, tout le monde, y compris les lycéens, consomme des boissons alcoolisées : bocks de bière pour les plus jeunes et pour les femmes, ballons de vin pour les aînés. Au début de la période, à une époque où la télévision s assignait pour but de faire en sorte que les Français découvrent sur l écran d autres régions et d autres professions les réalisateurs montrent continuellement le vignoble, les vendanges et évoquent la distillation clandestine. Le médecin (Cécilia Médecin de campagne) explique en souriant à un brigadier que «la région pullule de distilleries clandestines» mais que «on n arrive pas à les prendre sur le fait car la population est du côté des distillateurs». Les fictions de l'ortf présentent des consommateurs offrant quasiment les mêmes caractéristiques que ceux qualifiés par les experts invités dans les émissions médicales de «buveurs excessifs» : hommes buvant quotidiennement trop de vin, femmes et jeunes s alcoolisant de plus en plus à la bière. La télévision construit un alcoolisme stéréotypé qui cible principalement les catégories sociales défavorisées et les régions viticoles. Mais là où les programmes de santé promeuvent dans leurs discours l idée de sanction, de punition (le buveur ne peut se «relever» que s il a été préalablement puni ou menacé de l être, les cures sont des échecs jusqu à la sanction qui peut être de différentes natures 7 ), les fictions adoptent un point de vue opposé, faisant des alcooliques des victimes (Régis, Les Cinq dernières minutes) voire des devins (La Vigne à Saint-Romain). La fiction prend le contre-pied des magazines de santé publique en dédouanant les personnages d'alcooliques et en privilégiant une vision conviviale de la boisson. Le tournant formel des années 1980 À partir du début des années 1980, les caractéristiques formelles des émissions médicales et des fictions changent. Pour les premières, les émissions de plateau dominent désormais. Ce sont à présent les praticiens qui se déplacent à Buttes Chaumont pour y tenir à plusieurs reprises le même discours, à l occasion de la sortie d un ouvrage, d un livre blanc ou d une expertise INSERM. Sur ces plateaux, ces médecins, 5 Avant l avènement de la vidéo, au mitan des années soixante, la télévision ne connaît que deux types de caméra : la caméra Éclair Caméflex 16 millimètres, légère mais muette, le son devant être enregistré en parallèle ; la caméra sonore Tonala, la seule qui autorise des interviews lors d un reportage. Mais, une fois installée, cet appareil pesant plus de 90 kilos ne pouvait plus bouger. 6 Au terme d une consultation attentive, à l INA et au Centre des Archives Contemporaines de Fontainebleau, des archives des chefs décorateurs et des producteurs, nous pouvons affirmer que plus de la moitié des fictions télévisuelles que nous avons recensées durant la période ORTF, sont, non seulement patronnées par des marques d alcool mais soutenues par un département du ministère de l Agriculture, lequel impose, généralement, de localiser l action dans une région viticole. 7 Son fils le prive de voir ses petits-enfants, les services sociaux le menacent de perdre la garde de son enfant, sa femme demande le divorce, elle porte plainte au commissariat pour coups et blessures, le buveur doit payer une forte amende ou passe en correctionnelle suite à une conduite en état d ivresse 110 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

111 «Histoire» désormais qualifiés d alcoologues, ne rencontrent plus seulement des malades, des anciens buveurs et des confrères issus d autres spécialités, mais Paul puis Patrick Ricard et des représentants de l ANIVIT. L émission, comme l indique parfois son titre, se termine avec de L Huile sur le feu et l explication cède le pas à une bataille de chiffres contradictoires. Hors plateau, vraisemblablement par crainte du zapping -puisque la télécommande fait son apparition dans les années quatre-vingt- les reportages sont de plus en plus brefs, excédant rarement une minute. Comme ils ne sont plus jamais réalisés en direct, les propos des «alcoologues», déjà très simplifiés, sont encore recoupés au montage. On n assiste plus à aucune cure, à aucune opération du foie, à aucune visite de malades alcooliques. Les images sont aseptisées : le praticien n est plus interrogé que dans son bureau ou dans le parc verdoyant de son hôpital ou de son centre de cure. Les malades s ébrouent eux aussi dans la verdure ou discutent dans un bar sans alcool. Après l éclatement de l ORTF, à la fin de l année 1974, puis avec la démultiplication des chaînes, l invention du magnétoscope de salon et de la télécommande, les émissions médicales qui sont diffusées à des heures de grande écoute sont conçues en fonction des annonceurs et de destinataires nomades et infidèles qu il faut réussir à retenir coûte que coûte. Les sujets sont traités de façon beaucoup plus superficielle. En outre, les médecins interrogés ne sont plus nécessairement les experts les plus réputés, comme c était le cas sous l ORTF, mais simplement les personnes les plus médiatiques : celles qui s expriment le mieux et avec vélocité, celles qui réussissent à imposer une image forte, facilement identifiable par le téléspectateur, pour un détail vestimentaire -Claude Got et son éternel chandail- ou discursif, Philippe Batel est en empathie avec ses malades puisqu il s affirme, comme eux, allergique à l alcool. Depuis les années 1980, apparaissent aussi les «bons témoins», qui savent, mieux que le simple quidam jadis invité par l ORTF, parler de leur alcoolisme, tel Hervé Chabalier, directeur de la CAPA et président d une commission de réflexion sur l alcoolisme. Parallèlement, les animateurs ne sont plus forcément ceux qui ont reçu une double formation de journaliste et de médecin, comme Martine Allain-Régnault 8, mais ceux qui sont capables de tenir un rythme trépident, sans temps mort, de couper la parole des «buveurs d eau» jugés ennuyeux et trop longs dans leurs réponses, d extorquer du sensationnel, notamment les pires confidences des anciens buveurs ou de leur famille, pour parler autrement, de maintenir la curiosité ou la simple attention des téléspectateurs. Un peu paradoxalement donc, la concurrence entre les chaînes favorise moins la diversité que l'uniformité de la production de l'information médicale. Elle pèse sur le choix des sujets, leur hiérarchisation, la sélection des invités et des personnes interrogées pour en parler. Pour le corps médical, l'espace médiatique devient de plus en plus un espace stratégique pour se donner non seulement une légitimité mais une spécificité. Ce développement du pathos et cette multiplication des paroles se retrouvent dans la fiction. Jusqu'au milieu des années 1980, les scénaristes adoptaient des points de vue extérieurs pour faire découvrir aux téléspectateurs des univers sociaux. Dorénavant, avec l irruption des reality-show et ensuite de la télé-réalité, les œuvres audiovisuelles insistent davantage sur l expérience subjective. Le public doit ressentir les dilemmes que vivent les alcooliques : arrêter, continuer ou recommencer à boire (Joséphine ange gardien, PJ). La narration et la mise en scène insistent sur la psychologisation dans la représentation de l'alcoolisme. Les fictions fonctionnent donc, sur ce point, comme des prolongements des autres programmes (émissions de santé, magazines de société). Convergences et divergences thématiques entre les deux corpus depuis les années 1980 On observe d'abord des points communs aux deux corpus dans les évolutions des portraits de buveurs. Jusqu'au milieu des années soixante-dix, l'alcoolisme ouvrier occupait une place centrale à la télévision. Lors des trois dernières décennies, cette figure a connu un net reflux et se retrouve désormais noyée dans une sociologie de l'alcoolique beaucoup plus développée, à l'intérieur de laquelle les classes moyennes et la bourgeoisie jouent un rôle important. De la même manière, depuis les années 1980, on constate des similitudes entre les émissions de santé et les fictions concernant l'émergence (ou le passage au premier plan) de nouveaux thèmes, tels que l'alcoolisation des jeunes et l accidentologie. Au cours de l année 1978, une nouvelle catégorie de buveurs entre en scène dans les 8 Licenciée es sciences biologiques, ayant effectué des recherches sur l alcoolisation des rats, responsable de la rubrique santé au Monde avant de devenir présentatrice de television. Cahiers de l Ireb n 19,

112 programmes médicaux : les jeunes, qui ne sont pas encore alcoolo-dépendants mais boivent différemment de leurs aînés : des alcools forts et de la bière, irrégulièrement, à la scandinave, en fin de semaine, à la recherche d une ivresse rapide. La fiction multipliera elle aussi ce type de séquences (Pause Café, Commissaire Moulin, PJ et Navarro et autres séries à héros récurrent). La consommation juvénile d'alcool est ici mise sur le même plan que celle de la drogue. D'autres discours qui émergent dans les années 1980 et 1990 paraissent semblables sur les deux supports. Ainsi le buveur est-il désormais très souvent représenté sous les traits du chauffard, du délinquant routier. On assiste également, dès les lendemains de la Guerre du Golfe de 1991, à la montée en puissance à l'écran d un alcoolisme propre aux nouvelles précarités : alcoolisme et quart-monde, alcoolisme et chômage... Mais, sur d'autres points, les convergences ne sont qu'apparentes. Si l'alcoolisme féminin est présent dans les deux corpus, en y regardant plus attentivement, on s'aperçoit que les émissions de santé ont depuis toujours privilégié ce thème alors que la fiction continue tout au long de la période de surreprésenter l'alcoolisation des hommes. À partir des années 1970, les femmes sont elles-mêmes buveuses. Dans les émissions médicales, la caméra s attarde sur des femmes issues de milieux défavorisés, hospitalisées pour cirrhoses dues à des consommations excessives de vin et de bière, les journalistes interrogent des bourgeoises, souvent mères célibataires, assises au comptoir, vidant à grands traits bocks de bière et verres de whisky, et les médecins commencent à se focaliser sur la différence entre boires masculin et féminin. À l inverse, si l'évocation des femmes alcooliques est spectaculaire dans des téléfilms qui lui sont spécifiquement consacrés (La Grande fille), c'est justement parce que le phénomène est jugé comme étant encore insuffisamment reconnu. Le cas des femmes est révélateur du rapport qui s'installe entre les magazines de santé d'une part et les fictions d'autre part. Les secondes traduisent avec retard dans leurs scénarios les histoires racontées dans les premières. Les scénaristes s'inspirent largement des émissions de santé, tout en n'hésitant pas à en simplifier les discours pour satisfaire aux exigences du récit. Enfin, les caractéristiques de chaque support débouchent sur des différences nettes dans les discours délivrés aux publics. C'est particulièrement frappant dans le cas des séries policières, très nombreuses à la télévision à partir de la fin des années Décliné sous tous les grades et toutes les missions, le policier occupe une place centrale dans les séries et les feuilletons. Il n est donc pas étonnant que le «flic» alcoolique apparaisse comme le stéréotype audiovisuel dominant. De Plus belle la vie (Léo Castelli) à PJ (Commissaire Meurteaux), en passant par Boulevard du palais (Commissaire Rovère), chaque série a son policier qui se débat avec l alcoolisme. Ce personnage n'apparaît pas dans les mêmes proportions, et loin de là, dans les émissions médicales (une émission seulement 9 ). À l'inverse, le discours médical qui constitue le cœur des programmes de santé, même modifié et dénaturé dans sa présentation formelle à partir des années 1980, est le plus souvent évacué des séries et téléfilms car jugé peu conforme aux besoins dramaturgiques de la fiction. CONCLUSION Pendant la période de l'ortf, les discours sur l'alcool proposés par les deux corpus s'avèrent nettement distincts, quand l'un martèle la souffrance et l inévitable sanction qui se rattachent à l'alcoolisme, l'autre en montre une vision édulcorée et presque souriante. Depuis le début des années 1980, les frontières entre les deux supports sont devenues poreuses ; on aboutit à un mélange des genres dans lequel sourdent encore, certes, des différences ponctuelles (la place de l'alcoolisation féminine, le stéréotype du policier alcoolique), mais qui met surtout en évidence un rapprochement, voire une interpénétration évidents. L'évolution formelle des émissions médicales conduit à la starisation de ses intervenants au premier rang desquels les médecins, en même temps que la fiction joue sur la banalisation et la psychologisation des personnages d'alcoolique, devenus des monsieurs tout-le-monde. 9 «Paroles de flics», Envoyé spécial, 2 mars 2000, A Cahiers de l Ireb n 19, 2009

113 4. «VULNERABILITE : IMPACTS PSYCHO-SOCIAUX»

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115 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» ETUDE DE LA METAMEMOIRE DANS L ALCOOLODEPENDANCE AU MOYEN DE LA MESURE «FEELING-OF-KNOWING» (FOK) EN MEMOIRE EPISODIQUE HELENE BEAUNIEUX 1, ANNE-PASCALE LE BERRE 1, KARINE PINON 2, FRANÇOIS VABRET 1, ANNE-LISE PITEL 1,3, PHILIPPE ALLAIN 2, BEATRICE DESGRANGES 1 ET FRANCIS EUSTACHE 1 1 INSERM-U923-EPHE UCBN «Neuropsychologie Cognitive et Neuroanatomie Fonctionnelle de la Mémoire Humaine», Université de Caen Basse-Normandie, GIP Cyceron, CHU Côte de Nacre, Caen - France 2 UPRES EA 2646, «Processus de Pensée et Interventions», Angers - France 3 Stanford University School of Medicine, California - USA Summary Alcoholism affects cognitive processes, including components of memory, and our research focuses on metamemory, the ability to predict memory performance relative to actual recall and recognition of information. A convergent monitoring measure of metamemory, the «Feeling-Of-Knowing» (FOK), was presented to patients with chronic alcoholism and age-matched healthy controls. All of these subjects were administered an episodic memory task. An episodic memory FOK measure was collected (Gamma index), to evaluate the agreement between a prediction of future performance of recognition and the real performance of recognition. For the episodic memory task, the results revealed deficits in both recognition and the Feeling-Of-Knowing accuracy in the alcoholics. Chronic alcoholism affects both an episodic and metamemory for novel information. More precisely, patients with chronic alcoholism were relatively unaware of their memory deficits and believed their memory to be as effective as healthy controls. Patients with chronic alcoholism overestimated their memory capacities relative to healthy controls. Mots clefs Alcoolisme, mémoire épisodique, métamémoire Il est aujourd hui établi que la consommation chronique d alcool peut provoquer, chez les patients alcoolodépendants (AC), des troubles neuropsychologiques en lien avec des atteintes cérébrales. L étude des atteintes cérébrales liées à la consommation d alcool a permis d identifier un certain nombre de régions sensibles à son effet toxique. L atrophie corticale est l une des conséquences le plus souvent rapportées (Harper et al., 2003) et touche plus particulièrement le lobe frontal (Pfefferbaum et al., 1997). Le système limbique et les régions diencéphaliques sont aussi particulièrement sensibles aux effets toxiques de l alcool (Sullivan et al., 1995 ; Chanraud et al., 2007). Ces atteintes cérébrales vont se traduire par des troubles neuropsychologiques. On estime que 50 à 80 % des patients AC présentent des troubles neuropsychologiques (Bates et al., 2002). Les fonctions exécutives sont très souvent décrites comme altérées chez les patients AC (Sullivan et al., 2000 ; Pitel et al., 2008). Outre ce dysfonctionnement exécutif en lien avec leur atrophie frontale, les patients AC se caractérisent également par des troubles mnésiques touchant notamment la mémoire épisodique. Les troubles de ce système de mémoire dans l AC sont décrits comme modérés (Weingartner et al., 1996 ; Ihara et al., 2000) et semblent relativement indépendants des déficits exécutifs (Pitel et al., 2007a). Ces troubles neuropsychologiques ont un effet délétère sur l adhésion des patients au traitement et le maintien de l abstinence. Les thérapies cognitivo-comportementales (TCC), fréquemment employées dans la prise en charge de la dépendance alcoolique, requièrent un apprentissage de nouvelles connaissances complexes altéré chez les patients AC (Pitel et al., 2007b). Cette difficulté d apprentissage pourrait expliquer leur inefficacité relative. Un déficit de métamémoire pourrait également contribuer aux difficultés des patients à bénéficier des TCC. La métamémoire correspond à un large construit englobant plusieurs aspects de la connaissance que nous avons de notre propre mémoire, incluant la connaissance à long terme des exigences inhérentes aux tâches, la connaissance des stratégies qui peuvent aider la mémoire, et les processus de surveillance de Cahiers de l Ireb n 19,

116 la mémoire (Nelson et Narens, 1990). Le concept de métamémoire renvoie, de ce fait, à la connaissance que nous possédons sur nos capacités et nos stratégies de mémoire contribuant à une mémorisation optimale ainsi qu à la connaissance des processus impliqués dans la surveillance et le contrôle du fonctionnement mnésique. Les TCC sont des techniques qui tentent d apprendre aux patients AC à anticiper les situations «à risque de rechute» et à s y adapter de façon à ne pas reboire. Cet apprentissage implique que les patients puissent évaluer la dangerosité des futures situations en considération de leurs propres capacités à s y adapter. Cette connaissance du fonctionnement cognitif propre renvoie aux capacités de métacognition et notamment de métamémoire. Nelson et Narens (1990) ont tenté de modéliser l expérience de métamémoire c est-à-dire le «memory monitoring» en respectant le déroulement temporel d une épreuve mnésique avec ces trois étapes que sont l encodage, le stockage et la consolidation. Ils ont, ainsi, proposé différents paradigmes de métamémoire dont le jugement de sentiment de savoir (FOK : Feeling of knowing) relevé lors de la récupération. Le FOK correspond à une prédiction de performance lors d une épreuve de reconnaissance sur des informations qui n ont pu être rappelées par le sujet lors d une épreuve de rappel libre. Les liens entre déficits de métamémoire et déficits exécutifs ont été largement documentés Vilkki et al. (1998, 1999) Schnyer et al. (2004) et Kennedy et al. (2000, 2003, 2004). Cependant, bien que les patients présentent des déficits exécutifs, aucune étude n a, jusqu à présent, exploré la métamémoire des patients AC. Ainsi les objectifs de cette étude sont d explorer la métamémoire chez des patients alcooliques chroniques en comparaison à un groupe de sujets témoins au moyen d une mesure concourante (Feeling-Of-Knowing, FOK). MATÉRIEL ET MÉTHODE Population d étude Notre population est constituée d un groupe de 16 patients AC et d un groupe de 15 sujets sains appariés en âge (p = 0,94) et en niveau d étude (p = 0,51). Les patients alcooliques ont été recrutés au sein du service d addictologie du CHR de Caen et répondent aux critères de dépendance à l alcool fournis par l article du DSM-IV (1994). Les critères d inclusion pour les sujets sains sont les mêmes que ceux des patients alcooliques auxquels s ajoute l absence d antécédents d alcoolisme et de perturbation des capacités cognitives. Ont été exclus les sujets ou patients sous traitement psychotrope susceptible d interférer avec les mesures mnésiques ou présentant des antécédents neurologiques, neurochirurgicaux, psychiatriques ou de syndrome d alcoolisation fœtale. Evaluation de la métamémoire La métamémoire a été évaluée au moyen d une mesure concourante FOK (Feeling-Of-Knowing) qui est relevée au cours d un test de rappel de 20 couples de mots après un délai de 20 minutes (Pinon et al., 2005). Dans ce test, les paires de mots sont constituées, pour moitié, de mots faiblement associés sémantiquement (foulard - téléphone) et, pour moitié, de mots fortement liés sémantiquement (papillon - chenille). Les sujets doivent apprendre 20 paires de mots et rappeler d abord immédiatement, puis au bout de 20 minutes, le second mot de chaque couple en réponse à la présentation du premier (rappel indicé différé). Enfin, ils effectuent une tâche de reconnaissance où chaque item non rappelé lors du rappel indicé est présenté parmi quatre. Avant de procéder à la reconnaissance proprement dite, nous demandons à la personne, pour chaque item non rappelé à 20 minutes, de juger de sa capacité à reconnaître l item correct parmi trois distracteurs et ce sur une échelle de pourcentage allant de 0 % = pas du tout sûr à 100 % = tout à fait sûr. Tout jugement en dessous de 50 % correspond à un jugement «non» et tout jugement au dessus de 50 % correspond à un jugement «oui». La précision du jugement Feeling-Of-Knowing (FOK = sentiment de savoir) sera obtenue en comparant les prédictions FOK et la performance effective de reconnaissance. Un cœfficient de concordance (Goodman-Kruskal Gamma) (entre -1 et 1) entre les jugements FOK et les performances de reconnaissance est alors calculé. De grandes valeurs positives correspondent à une 116 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

117 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» forte association entre la performance de reconnaissance et les jugements FOK, des valeurs proches de 0 indiquent l absence de lien, et des valeurs négatives soulignent une relation inverse. Des indices plus qualitatifs ont également été relevés. Parmi ceux-ci, le FOK OUI indique que le sujet s est estimé capable de reconnaître un item non rappelé quel que soit le résultat ultérieur, c est-à-dire qu il reconnaisse ou non l item. A l inverse, le FOK NON relève le nombre de fois où il ne s en est pas estimé capable, qu il reconnaisse ou non l item. Le FOK OUI peut être divisé en deux types d indices : Les HITS OUI % (le sujet se juge capable de reconnaître l item et il le reconnaît) et le FOK MISSES OUI % (le sujet se juge capable de reconnaître l item et il ne le reconnaît pas). apprentissage Rappel indicé immédiat 20 min Rappel indicé différé reconnaissance Prédiction de reconnaissance Réelle performance de reconnaissance Quel est votre FOK OUI capacité à oui rappeler le 1 er mot de chaque paires de mots oui dans 20 min? oui non HITS OUI MISSES OUI Quelle est votre capacité à reconnaître l item cible parmi 3 distracteurs? FOK FOK NON non non non oui Figure 1 : mesure concourante «Feeling-Of-Knowing FOK (Pinon et al., 2005). RÉSULTATS L analyse statistique des performances des deux groupes lors de la tâche de mémoire épisodique montre un effet délétère de la consommation chronique d alcool sur le rappel indicé différé et la reconnaissance d informations (Tableau 1). Patients AC Sujets contrôles p Rappel différé 17,59 (± 2,42) 19,12 (± 1,41) 0,03* Reconnaissance % 78,18(± 19,11) 90,46 (± 15,16) 0,05* Gamma -0,16 (± 0,59) 0,45 (± 0,49) 0,004* FOK OUI 0,27 (± 0,35) 0,71 (± 0,35) 0,002* NON 0,73 (± 0,35) 0,28 (± 0,35) 0,002* HITS OUI 0,68 (± 0,24) 0,88 (± 0,18) 0,02* MISSES OUI 0,32 (± 0,24) 0,12 (± 0,18) 0,02* Tableau 1 : comparaison des performances de métamémoire entre les patients AC et le groupe témoin. Cahiers de l Ireb n 19,

118 La comparaison des index FOK montre une différence significative entre les deux groupes de sujets : les patients alcooliques chroniques sont moins précis que les sujets sains pour évaluer leurs capacités à reconnaître la bonne réponse parmi des distracteurs (Indice Gamma). L analyse statistique révèle également que les patients produisent plus de jugement «non» (FOK NON) et moins de jugement «oui» (FOK OUI) que les sujets sains. Enfin, les sujets alcooliques chroniques produisent, de manière significative, moins de succès HITS et plus d échecs MISSES pour les jugements «oui» que les sujets sains. DISCUSSION Cette étude préliminaire a confirmé l existence de difficultés de mémoire épisodique dans ce groupe de patients alcoolodépendants, en accord avec des études antérieures (Weingartner et al., 1996 ; Ihara et al., 2000 ; Pitel et al., 2007a). Par ailleurs, nous montrons pour la première fois que ces difficultés mnésiques sont associées à un déficit de métamémoire, les sujets alcoolodépendants étant moins aptes que les sujets sains à prédire avec exactitude leurs futures performances de reconnaissance. De plus, les sujets alcoolodépendants ne semblent pas se comporter comme les sujets sains face à l estimation de leurs capacités de reconnaissance. En effet, ils ont tendance à produire davantage de jugements «non» (ne s estimant pas capable de reconnaître l item correct) et moins de jugements «oui» que les sujets sains. Si nous considérons les indices plus qualitatifs, nous constatons que les personnes alcoolodépendantes produisent plus d échecs pour les jugements «oui» (MISSES OUI). Ils auraient une plus grande tendance que les sujets sains à s estimer, à tort, aptes à reconnaître l item cible, ce qui indique une surestimation de leurs facultés de mémoire. Ce déficit de métamémoire pourrait donc être l une des raisons des difficultés d apprentissage de nouvelles connaissances des patients lors des TCC (Pitel et al., 2007b) mais également compromettre l estimation de la dangerosité de certaines situations à risque de rechute et donc leur abstinence. Ce déficit de conscience des difficultés mnésiques chez les patients AC doit également amener à reconsidérer la notion de déni souvent évoquée dans cette maladie. Ces premières données seront complétées dans nos études ultérieures et les liens entre métamémoire d une part et déficits exécutifs, apprentissage et rechute seront explorés. Références Bates M.E., Bowden S.C., Barry D. Neurocognitive impairment associated with alcohol use disorders: implications for treatment. Exp Clin Psychopharmacol 2002, vol. 10, n 3, p Chanraud S., Martelli C., Delain F., Kostogianni N., Douaud G., Aubin H.J., Reynaud M., Martinot J.L. Brain morphometry and cognitive performance in detoxified alcohol-dependents with preserved psychosocial functioning. Neuropsychopharmacology 2007, vol. 32, n 2, p Harper C., Dixon G., Sheedy D., Garrick T. Neuropathological alterations in alcoholic brains. Studies arising from the New South Wales Tissue Ressource Centre. Prog NeuroPsychopharmacol Biol Psychiatry 2003, vol. 27, n 6, p Ihara H., Berrios G.E., London, M. Group and case study of the dysexecutive syndrome in alcoholism without amnesia. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2000, vol. 68, n 6, p Kaszniak A.W., Zak M.G. On the neuropsychology of metamemory: Contributions from the study of amnesia and dementia. Learning of Individual Differences 1996, vol. 8, p Kennedy M.R.T., Carney E., Peters S.M. Predictions of recall and study strategy decisions after brain injury. Brain Inj 2003, vol. 17, n 12, p Kennedy M.R.T., Yorkston K.M. Accuracy of metamemory after traumatic brain injury: Predictions during verbal learning. J Speech Lang Hear Res 2000, vol. 43, n 5, p Kennedy M.R.T., Yorkston K.M. The effects of frontal injury on «on-line» self-monitoring during verbal learning by adults with diffuse brain injury. Neuropsychological Rehabilitation 2004, vol. 14, p Nelson T.O., Narens L. Metamemory: A theorical framework and new findings. The Psychology of Learning and motivation 1990, vol. 26, p Pfefferbaum A., Sullivan E.V., Mathalon D.H., Lim K.O. Frontal lobe volume loss observed with magnetic resonance imaging in older chronic alcoholics. Alcohol Clin Exp Res 1997, vol. 21, n 3, p Pinon K., Allain P., Kefi M.Z., Dubas F., Le Gall D. Monitoring processes and metamemory experience in patients with dysexecutive syndrome. Brain Cog 2005, vol. 57, n 2, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

119 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» Pitel A.L., Beaunieux H., Witkowski T., Vabret F., de la Sayette V., Viader F., Desgranges B., Eustache F. Episodic and working memory deficits in alcoholic Korsakoff patients: the continuity theory revisited. Alcohol Clin Exp Res 2008, vol. 32 n 7, p Pitel A.L., Beaunieux H., Witkowski T., Vabret F., Guillery-Girard B., Quinette P., Desgranges B., Eustache F. Genuine episodic memory deficits and executive dysfunctions in alcoholic subjects early in abstinence. Alcohol Clin Exp Res 2007a, vol. 31, n 7, p Pitel A.L., Witkowski T., Vabret F., Guillery-Girard B., Desgranges B., Eustache F., Beaunieux H. Effect of episodic and working memory impairments on semantic and cognitive procedural learning at alcohol treatment entry. Alcohol Clin Exp Res 2007b, vol. 31, n 2, p Schnyer D.M., Verfaelli M., Alexander M.P., LaFleche G., Nicholls L., Kaszniak A.W. A role for right medial prefrontal cortex in accurate feeling-of-knowing judgments: evidence from patients with lesions to frontal cortex. Neuropsychologia 2004, vol. 42, n 7, p Sullivan E.V., Marsh L., Mathalon D.H., Lim K.O., Pfefferbaum A. Anterior hippocampal volume deficits in nonamnesic aging chronic alcoholics. Alcohol Clin Exp Res 1995, vol. 19, n 1, p Sullivan E.V., Rosenbloom M.J., Pfefferbaum A. Pattern of motor and cognitive deficits in detoxified alcoholic men. Alcohol Clin Exp Res 2000, vol. 24, n 5, p Vilkki J., Surma-aho O., Servo A. Word list learning and prediction of recall after frontal lobe lesions. Neuropsychology 1998, vol. 12, n 2, p Vilkki J., Surma-aho O., Servo A. Inaccurate prediction of retrieval in a face matrix learning task after right frontal lobe lesions. Neuropsychology 1999, vol. 13, n 2, p Weingartner H.J., Andreason P.J., Hommer D.W., Sirocco K.Y., Rio D.E., Ruttimann U.E., Rawlings R.R., Eckardt M.J. Monitoring the source of memory in detoxified alcoholics. Biol Psychiatry 1996, vol. 40, n 1, p Weinstein C.S., Shaffer H.J. Neurocognitive aspects of substance abuse treatment: a psychotherapist s primer. Psychotherapy 1993, vol. 30, n 2, p Cahiers de l Ireb n 19,

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121 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» IMPACT DE LA CONSOMMATION D ALCOOL SUR LES FONCTIONS COGNITIVES CHEZ DES SUJETS ACTIFS : RESULTAT DE L ETUDE VISAT (VIEILLISSEMENT, SANTE, TRAVAIL) OLIVIA BOEUF-CAZOU, LAURE POURCEL ET MARYSE LAPEYRE-MESTRE Service de Pharmacologie Médicale et Clinique, EA3696, Unité de Pharmacoépidémiologie, Faculté de Médecine, Toulouse - France Summary Alcohol is the second psychoactive drug consumed in France after tobacco. Many studies have underlined that alcohol abuse was associated with an impairment of cognitive functions among the elderly. Nevertheless, the protective effect of low-to-moderate consumption of alcohol has been discussed by several authors in the last few years. We evaluated the impact of alcohol consumption on cognitive performance among workers from the VISAT cohort (Vieillissement, Santé, Travail) with a 10-year follow-up. Subjects were interviewed at baseline (in 1996), at 5 years (in 2001) and at 10 years (in 2006) with a standardized questionnaire. Psychometric tests were realized in each survey. Alcohol exposure was measured according to chronicity (chronic or occasional) or oldness of use (recent or past). Changes in cognitive scores were evaluated by analysis of covariance after adjustment for confounding factors. 15% of workers, mostly men, were chronic users (28% were occasional users) and 28% were recent users (15% were past users). On one hand, we found negative impact of the occasional use of alcohol on long-term memory in men, and on the other hand, an improvement of selective attention among women with a past use of alcohol. These results confirm the positive impact of light alcohol consumption on cognitive functions among women. Mots clefs Consommation d alcool, performances cognitives, travail, genre INTRODUCTION La France se caractérise par une importante consommation d alcool qui la classe en tête des pays de l Union Européenne malgré une baisse progressive des indicateurs depuis plus de trente ans (Besson, 2004). Les indicateurs de consommation d alcool sont relativement stables en France, que ce soit pour la consommation, l ivresse ou la consommation problématique (Costes et Bellot, 2003). L alcool est la seconde substance psychoactive la plus consommée et possède des propriétés psychoactives responsables d une modification de l état mental pouvant entraîner des conséquences néfastes sur le sujet lors d une consommation avant ou pendant le travail et de surcroit si le travail nécessite une attention particulière. Dans une récente étude (Com-Ruelle et al., 2008) visant à identifier les populations à risque, les auteurs ont mis en évidence différents facteurs associés avec la consommation d alcool comme par exemple le genre, l âge, le contexte familial, l emploi ou encore la région d habitation. Le milieu professionnel peut donc être un facteur de risque de la consommation d alcool mais aussi un milieu particulièrement dangereux pour un consommateur régulier (Gournay et Mathys, 2000). L étude de Demortière (Demortière et al., 2001), menée auprès des médecins du travail, avait indiqué que 8,2 % des salariés vus au cours de la visite médicale étaient des consommateurs d alcool à risque ou problématique. En France, très peu d études se sont préoccupées de l impact d une consommation régulière d alcool chez des sujets en activité professionnelle. Or l alcool agit sur de nombreux récepteurs du système nerveux central et donc sur les fonctions cognitives (Nutt, 1999). La cognition est le processus d acquisition et d utilisation des connaissances. Elle fait donc intervenir plusieurs fonctions comme la mémoire, l apprentissage, la pensée, le Cahiers de l Ireb n 19,

122 raisonnement et les fonctions réceptives et exécutives telles que le langage. Ces fonctions peuvent donc être modifiées par la prise d alcool. En effet, les deux syndromes cognitifs connus et attribués à l alcool sont le syndrome de Wernicke-Korsakoff responsable d une amnésie et d un dysfonctionnement exécutif et la démence alcoolique principalement retrouvée chez le sujet âgé (Urucu-Milcent, 2005). Depuis quelques années, les recherches se sont focalisées sur la relation entre la consommation d alcool et le fonctionnement cognitif. Beaucoup d études ont démontré que le fait de boire était associé à une diminution des performances aux tests cognitifs. Chez le sujet âgé, l abus d alcool semble altérer les fonctions cognitives et semble responsable du développement de démence (Parker et al., 1983 ; Hendrie et al., 1996 ; Heishman et al., 1997 ; Edelstein et al., 1998 ; Weissenborn et Duka, 2003). Mais actuellement, de nombreuses études se focalisent sur l effet d une consommation légère à modérée d alcool sur les fonctions cognitives et soulèvent la possibilité d un effet protecteur contre la démence particulièrement chez les femmes (Elias et al., 1999 ; Espeland et al., 2005 ; Stampfer et al., 2005 ; Ganguli et al., 2005). De nos jours, les effets délétères d un abus d alcool sur le fonctionnement cognitif sont des faits bien établis, mais son rôle protecteur lors d un usage modéré n est pas clairement défini. Le but de cette étude était de décrire la consommation d alcool dans une cohorte de salariés du Sud de la France à travers la réalisation de profils de consommateurs et de déterminer l impact d une consommation quotidienne d alcool à long terme sur les performances cognitives. MATERIEL ET METHODES Population source : la cohorte VISAT (Vieillissement, Santé, Travail) Les données utilisées dans ce travail sont issues de l étude de cohorte VISAT (Vieillissement, Santé, Travail) conçue pour préciser dans quelles mesures et comment la nature des tâches, l organisation du travail, modifient la qualité du vieillissement. Il s agit d une étude de cohorte fixe prévue pour dix ans ( ) et incluant salariés de trois régions du Sud de la France (Aquitaine, Midi-Pyrénées, Languedoc-Roussillon) nés en 1934, 1944, 1954 et Ces sujets ont été tirés au sort parmi les effectifs des médecins du travail participants à la cohorte et ont été sollicités pour participer à l étude et à son suivi à 10 ans. Tous les sujets ont été volontaires et ont signé un consentement éclairé. L étude a été faite dans le respect de la réglementation, avec l accord de la CNIL (Commission Nationale de l Informatique et des Libertés) et un respect strict de l anonymat. L inclusion a eu lieu lors de la visite médicale annuelle obligatoire et systématique dans le cadre de la médecine du travail ou au cours de la visite médicale d embauche pour les nouveaux salariés. Les entretiens ont été réalisés par les médecins du travail à l inclusion (en 1996), à cinq ans (en 2001) et à dix ans (en 2006). Population d étude Pour cette étude, les sujets inclus devaient participer à la cohorte VISAT depuis 1996, être actifs tout au long de l enquête et avoir réalisé les deux entretiens de suivi (en 2001 et 2006). Nous avons exclus les retraités, les sans emploi et les sujets nés en 1934 représentant un effectif trop faible. Recueil des données A chaque recueil, les données ont été obtenues de façon identique à partir des questionnaires standardisés. Le questionnaire VISAT envisageait les caractéristiques générales et professionnelles du sujet, des données médicales et psychométriques, des données sur les conditions de vie hors du travail et des mesures médicales. Pour chaque recueil, la consommation d alcool est évaluée à partir de deux questions permettant de savoir si le sujet consomme de l alcool quotidiennement et s il présente des difficultés à s abstenir de consommer pendant quatre jours. Le questionnaire comporte également un certain nombre de tests psychométriques permettant d évaluer l évolution des fonctions cognitives : le test de mémoire adapté du REY Verbal Learning Test permettant d évaluer la mémoire à court terme, à long terme et la stratégie de mémorisation, 122 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

123 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» le Digit Symbol Substitution Subtest du Wechsler Adult Intelligence Scale reflétant l attention soutenue, la vitesse psychomotrice et le raisonnement, et enfin, le test de Sternberg ou de recherche visuelle spatiale évaluant l attention sélective du sujet. Nous avons comparé la moyenne des scores obtenus en 2006 avec ceux de Une amélioration des performances cognitives sera observée lors d une augmentation générale des scores au REY Verbal Learning Test et au Digit Symbol Substitution Subtest et d une diminution générale des scores au test de la recherche visuelle spatiale. Mesure de l exposition à l alcool L exposition à l alcool a été mesurée selon la chronicité d usage ou son ancienneté. Nous avons défini un groupe non consommateur d alcool regroupant les sujets n ayant jamais rapporté de consommation quotidienne d alcool au cours des dix ans de suivi. Dans cette étude, nous n avions pas d information sur le type de boisson, ni sur la quantité absorbée quotidiennement mais l intérêt de ce travail était d étudier un usage quotidien et relativement modéré permettant aux sujets inclus dans notre étude de continuer à travailler. Nous avons ainsi défini et analysé de manière distincte deux catégories d exposition (selon la chronicité et l ancienneté). Chaque catégorie est formée de 3 modalités. Selon la chronicité d exposition Non consommateurs quotidien d alcool : pas d exposition aux 3 enquêtes (1996, 2001 et 2006). Usage chronique : consommation quotidienne d alcool à chaque enquête (1996, 2001 et 2006). Usage ponctuel : consommation quotidienne d alcool au cours d une enquête au minimum (1996 ou 2001 ou 2006). Selon l ancienneté d exposition Non consommateurs quotidien d alcool : pas d exposition aux 3 enquêtes (1996, 2001 et 2006). Usage ancien : consommation quotidienne d alcool en 1996 et/ou en 2001 mais pas en Usage récent : consommation quotidienne d alcool au moins en Analyse statistique L analyse statistique a été réalisée sur le logiciel SAS version 9.1. Dans ce travail, nous avons analysé les hommes et les femmes séparément en raison des habitudes de consommation très différentes selon le genre. Dans un premier temps, nous avons décrit la population d étude et la consommation quotidienne d alcool au cours du suivi. Nous avons utilisé un test du χ² afin de comparer les hommes et les femmes. Dans un second temps, nous avons effectué une analyse factorielle des correspondances multiples qui a permis d identifier et de représenter graphiquement des profils de salariés selon leur consommation d alcool au cours du suivi. Nous avons inclus les variables actives suivantes : l âge, la situation matrimoniale, la pratique du sport, le stress perçu élevé, les caractéristiques du travail, la peur de perdre son emploi, le tabac et la prise de médicament psychoactif au cours de la semaine précédant l enquête. La profession et l exposition à l alcool au cours du suivi (selon la chronicité ou selon l ancienneté dans deux modèles distincts) ont été introduites comme variables supplémentaires afin d identifier les groupes de salariés selon la consommation d alcool. L analyse a été complétée par une classification ascendante hiérarchique afin de caractériser avec précision les différents groupes. Enfin, nous avons évalué l impact de la consommation quotidienne d alcool sur les performances cognitives entre 1996 et 2006 à l aide d une analyse de covariance en tenant compte de l ensemble des facteurs de confusion pouvant influer sur la prise d alcool ou sur les performances cognitives. Cahiers de l Ireb n 19,

124 RESULTATS ET DISCUSSION Description de la population d étude Notre analyse a porté sur sujets actifs suivis pendant dix ans (52 % d hommes et 48 % de femmes) (Tableau 1). Parmi ces sujets, 15 % étaient des consommateurs chronique d alcool, majoritairement des hommes (23,7 % des hommes et 5,5 % des femmes, p < 0,001). D autre part, 28,2 % étaient considérés comme des consommateurs d alcool ponctuels (35,4 % des hommes et 20,5 % des femmes, p < 0,001). Si nous nous intéressons à l ancienneté de l usage d alcool, nous avons identifié 27,8 % de consommateurs quotidiens d alcool en 2006 (39,4 % des hommes et 15,3 % des femmes, p < 0,001) et 15,4 % qui avaient arrêté au cours du suivi (19,7 % des hommes et 10,7 % des femmes, p < 0,001). Ces résultats confirment les données de la littérature, montrant une plus forte prévalence de consommation, quelque soit leur type, chez l homme. Principaux profils de consommateurs d alcool parmi des sujets actifs L analyse factorielle et la classification ascendante hiérarchique ont permis d identifier des profils de consommateurs quotidiens d alcool selon le genre (Figure 1). Chez les hommes, nous n avons identifié qu un seul profil associé à un usage chronique ou actuel d alcool. Ces hommes étaient plutôt âgés ( 2 ans en 2006), stressés, consommant des médicaments psychoactifs et occupant un emploi avec des contraintes particulières. Chez les femmes, au contraire, nous avons identifié trois profils selon l exposition à l alcool au cours du suivi : un groupe de non consommatrices plutôt jeunes (42 ans en 2006), employées, vivant en couple, sans stress, pratiquant une activité physique, non fumeuses, ne consommant pas de psychotropes et sans difficultés professionnelle particulières, un groupe de consommatrices ponctuelles ou anciennes plus âgées ( 62 ans en 2006), plus stressées, consommant des médicaments psychoactifs et occupant un emploi avec des contraintes particulières et enfin un groupe de consommatrices chroniques ou actuelles plutôt cadres, vivant en couple, sans stress et avec un emploi sans difficulté particulière. Population totale n = 1250 (%) Hommes n = 650 (52 %) Femmes n = 600 (48 %) Age en ans 395 (31,6) 199 (30,6) 196 (32,7) 42 ans 410 (32,8) 205 (31,5) 205 (34,2) 52 ans 445 (35,6) 246 (37,8) 199 (33,2) Catégorie socioprofessionnelle Cadres 141 (11,3) 106 (16,3) 35 (5,8)*** Intermédiaires 366 (29,3) 195 (30,0) 171 (28,5) Employés 418 (33,4) 99 (15,2) 319 (53,2)*** Ouvriers 294 (23,5) 230 (35,4) 64 (10,7)*** Vivre en couple 963 (77,0) 536 (82,5) 427 (71,2)*** Fumeurs 251 (20,1) 147 (22,6) 104 (17,3)** Absence d activité sportive 343 (27,4) 156 (24,0) 187 (31,2)** Stress perçu élevé 545 (43,6) 236 (36,3) 309 (51,5)*** Prise de médicaments 203 (16,2) 80 (12,3) 123 (20,5)*** psychoactifs Alcool quotidiennement au cours du suivi Absence d usage 710 (56,8) 266 (40,9) 444 (74,0)*** Usage chronique / ponctuel 187 (15,0) / 353 (28,2) 154 (23,7) / 230 (35,4) 33 (5,5)*** / 123 (20,5)*** Usage récent / ancien 348 (27,8) / 192 (15,4) 256 (39,4) / 128 (19,7) 92 (15,3)*** / 64 (10,7)*** Tableau 1 : description générale de la population d étude à l inclusion et comparaison selon le genre. Comparaison des hommes et des femmes : *p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0, Cahiers de l Ireb n 19, 2009

125 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» Hommes Usage chronique ou actuel : hommes stressés avec des contraintes professionnelles 62 ans ou plus, stressés, avec un emploi nécessitant de faire plusieurs choses à la fois, de prendre en charge la souffrance des gens, d être au contact du public, avec des difficultés à obtenir de l aide si besoin et consomment des psychotropes. Femmes Non consommatrices : employées sans stress et sans contraintes professionnelles 42 ans, employées, vivant en couple, sans stress, pratiquent une activité physique, non fumeuses, ne consomment pas de psychotropes, avec une sécurité d emploi et sans difficulté professionnelle particulière excepté devoir faire plusieurs choses à la fois et être souvent interrompu. Usage ponctuel ou ancien : femmes stressées avec des contraintes professionnelles 62 ans ou plus, stressées, avec un emploi nécessitant de faire plusieurs choses à la fois, de prendre en charge la souffrance des gens, souvent interrompu, dans la promiscuité, ont des problèmes de communication et des difficultés à obtenir de l aide si besoin et consomment des psychotropes. Usage chronique ou actuel : cadres sans stress et sans contraintes professionnelles 62 ans ou plus, cadres, vivant en couple, sans stress et avec un emploi sans difficulté particulière excepté devoir effectuer des gestes précis. Figure 1 : profils des consommateurs quotidiens d alcool au cours du suivi selon le genre. Impact d une consommation quotidienne d alcool sur les performances cognitives Evolution des performances cognitives au cours du suivi Au cours du suivi, les performances aux tests psychométriques évaluant la mémoire, la reconnaissance ou l attention et la concentration ont montré une légère tendance à s améliorer (Tableau 2). Ceci est généralement habituel dans les études longitudinales, suggérant un apprentissage du test cognitif au cours des enquêtes, seul le test de la recherche visuelle spatiale est resté stable au cours des 10 ans de suivi. Par ailleurs, les résultats chez les femmes sont en moyenne meilleurs que chez les hommes, quel que soit le test. Total n = 1250 Hommes n = 650 Femmes n = Rappel immédiat 8,1 (2,1) 8,6 (2,2)** 7,7 8,1 8,5 9,1 (2,1)** (2,1) (2,1)** (2,0) Rappel différé 7,7 (2,8) 8,1 (2,6)** 7,1 7,5 (2,8)* 8,4 8,7 (2,9)* (2,7) (2,8) Reconnaissance 13,0 (2,5) 13,4 12,5 12,9 13,6 13,9 (2,1)* (2,4)** (2,7) (2,4)* (2,2) Digit Symbol Substitution Test 50,8 (14,6) 53,4 (16,6)** 48,2 (13,8) 50,7 (14,7)* 53,6 (14,9) 56,3 (18,0)* Recherche visuelle spatiale 3,5 (1,6) 3,4 (1,5) 3,6 (1,7) 3,5 (1,5) 3,5 (1,6) 3,4 (1,5) Tableau 2 : évolution des scores aux tests cognitifs au cours du suivi. REY Verbal Learning Test Comparaison par année : * p < 0,05 ; ** p < 0,001 Cahiers de l Ireb n 19,

126 Résultats de l analyse de covariance Les résultats de l analyse de covariance après ajustement sur l ensemble des facteurs de confusion sont présentés dans le Tableau 4. Nous observons une diminution significative des performances chez les hommes au test du rappel de mots différé lors d un usage ponctuel (aβ = -0,32) ou ancien (aβ = -0,41) mais également au test du rappel de mots immédiat lors d un usage récent d alcool (aβ = -0,30). Au contraire, chez les femmes, nous avons mis en évidence une amélioration des performances au test de la recherche visuelle spatiale (aβ = -0,34) lors d un usage quotidien et ancien d alcool au cours des dix ans de suivi. Nous observons donc un impact positif de l arrêt d une consommation quotidienne d alcool sur les performances attentionnelle uniquement chez les femmes. Rappel Reconnaissance TYPE D USAGE Population totale Hommes Femmes aβ # (ET) aβ (ET) aβ (ET) immédiat Jamais Chronique -0,01 (0,13) -0,20 (0,19) 0,12 (0,39) Ponctuel -0,05 (0,10) -0,27 (0,15) 0,19 (0,18) Récent -0,05 (0,11) -0,30 (0,15)* 0,18 (0,22) Ancien -0,01 (0,13) -0,20 (0,18) 0,18 (0,23) Rappel différé Jamais Chronique 0,27 (0,23) 0,18 (0,25) 0,06 (0,55) Ponctuel -0,32 (0,16)* -0,59 (0,20)* 0,08 (0,24) Récent 0,05 (0,15) -0,15 (0,21) 0,24 (0,30) Ancien -0,41 (0,18)* -0,59 (0,24)* -0,26 (0,31) Jamais Chronique 0,23 (0,90) 0,19 (0,23) 0,07 (0,39) Ponctuel -0,10 (0,13) -0,29 (0,18) 0,08 (0,18) Récent 0,03 (0,13) 0,01 (0,19) 0,15 (0,21) Ancien -0,20 (0,15) -0,34 (0,22) -0,07 (0,23) Digit Symbol Substitution Test Jamais Chronique 0,66 (1,14) 1,21 (1,07) 0,71 (3,97) Ponctuel 0,84 (0,86) 0,95 (0,91) -0,16 (1,76) Récent 0,54 (1,07) 1,46 (0,91) -1,02 (2,15) Ancien 0,49 (1,17) 0,33 (1,08) 1,02 (2,23) Recherche visuelle spatiale Jamais Chronique -0,17 (0,12) -0,19 (0,15) 0,35 (0,30) Ponctuel -0,09 (0,09) -0,09 (0,12) 0,04 (0,16) Récent -0,06 (0,08) 0,04 (0,12) -0,20 (0,13) Ancien -0,09 (0,10) 0,05 (0,14) -0,34 (0,17)* Tableau 3 : évaluation de l impact d une consommation quotidienne d alcool sur les performances cognitives. REY Verbal Learning Test # Ajustement sur l âge, le sexe, le niveau d étude et le score cognitif en 1996, sur le statut marital, le travail posté, l indice de masse corporelle, l absence d activité sportive et le tabac en 2006 et enfin sur la prise d un médicament psychoactif, d un antiparkinsonien, une dépression, un diabète, une hypercholestérolémie, un problème thyroïdien, une pathologie cardiovasculaire dans le passé ou au cours du suivi. * p < 0, Cahiers de l Ireb n 19, 2009

127 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» CONCLUSION Cette étude souligne les grandes différences selon le sexe lorsque l on s intéresse à l alcool. Tout d abord, les consommateurs chroniques d alcool sont majoritairement des hommes (23,7 % de consommateurs chez les hommes versus 5,5 % chez les femmes, p < 0,001). D autre part, nous avons identifié des profils opposés selon le sexe pour l usage chronique d alcool : les hommes sont stressés et ont des contraintes dans leur travail alors que les femmes ne sont pas stressées et occupent plutôt un poste à responsabilités sans contrainte particulière. Ces résultats sont en accord avec une récente étude française qui a également montré l existence d une association entre un statut social élevé et la consommation d alcool chez les femmes pouvant s expliquer par un environnement professionnel majoritairement masculin (Com-Ruelle et al., 2008). Enfin, l analyse des effets d une exposition à l alcool au cours du suivi sur les performances cognitives a permis là encore de mettre en évidence des différences marquées entre les hommes et les femmes. Pour interpréter nos résultats, il aurait été intéressant de connaître le type de boisson et la quantité consommée. Sachant que la quantité moyenne d alcool absorbée par les Français est inférieure à trois verres/jour (Beck et al., 2007) et que nous nous intéressons à des salariés, nous supposons un usage modéré au sein de notre population d étude. De nombreux travaux ont démontré l impact négatif d une consommation élevée d alcool sur les facultés cognitives (Parker et al., 1983 ; Hendrie et al., 1996 ; Heishman et al., 1997 ; Edelstein et al., 1998 ; Weissenborn et Buka, 2003). Or, dans notre étude, malgré un niveau d exposition modéré, nous avons retrouvé cet effet négatif sur la mémoire explicite lors d un usage actuel ou ancien d alcool chez les hommes. Alors que chez les femmes, l effet devient positif sur l attention sélective lors d un usage ancien. Ces résultats suggèrent que l association entre les performances cognitives et l alcool est fortement dépendante du genre. Références Beck F., Guilbert P., Gautier A. Baromètre santé Attitudes et comportements de santé. INPES, coll. Baromètres santé 2007, p Besson D. Boisson alcoolisées : quarante ans de baisse de consommation. INSEE Première 2004, n 966, p Com-Ruelle L., Dourgnon P., Jusot F., Lengagne P. Les problèmes d alcool en France : quelles sont les populations à risque? Questions d Economie de la Santé 2008, n 129, p Costes J., Bellot P. Les adultes et les drogues en France : niveau d usage et évolutions récentes. Tendances récentes 2003, n 30, p Demortière G., Pessione F., Batel P. Problèmes liés à l alcool en médecine du travail. Dépistage par l utilisation d autoquestionnaires : intérêt, faisabilité, limites. Documents pour le médecin du travail 2001, n 86, p Edelstein S.L., Kritz-Silverstein D., Barrett-Connor E. Prospective association of smoking and alcohol use with cognitive function in an elderly cohort. J Womens Health 1998, vol. 7, n 10, p Elias P.K., Elias M.F., D Agostino R.B., Silbershatz H., Wolf P.A. Alcohol consumption and cognitive performance in the Framingham Heart Study. Am J Epidemiology 1999, vol. 150, n 6, p Espeland M.A., Gu L., Masaki K.H., Langer R.-D., Coker L.H., Stefanick M.L., Ockene J., Rapp. S.R. Association between reported alcohol intake and cognition: results from the women s health initiative memory study. Am J Epidemiol 2005, vol. 161, n 3, p Ganguli M., Vander Bilt J., Saxton J.A., Shen C., Dodge H.H. Alcohol consumption and cognitive function in late life: a longitudinal community study. Neurology 2005, vol. 65, n 2, p Gournay M., Mathys M.T. Alcoolisation en milieu de travail. Documents pour le médecin du travail 2000, n 81, p Hendrie H.C., Gaos S., Hall K.S., Hui S.L., Unverzagt F.W. The relasionship between alcohol consumption, cognitive performance, and daily functioning in an urban sample of older black Americans. J Am Geriatr Soc 1996, vol. 44, n 10, p Heishman S.J., Arasteh K., Stitzer M.L. Comparative effects of alcohol and marijuana on mood, memory and performance. Pharmacol Biochem Behav 1997, vol. 58, n 1, p Nutt D. Alcohol and the brain. Pharmacological insights for psychiatrists. Br J Psychiatry 1999, n 175, Parker D.A., Parker E.S., Brody J.A., Schoenberg R. Alcohol use and cognitive loss among employed men and women. Am J Public Health 1983, vol. 73, n 5, p Cahiers de l Ireb n 19,

128 Stampfer M.J., Kang J.H., Chen J., Cherry R., Grodstein F. Effects of moderate alcohol consumption on cognitive function in women. N Engl J Med 2005, vol. 352, n 3, p Urucu-Milcent D. Troubles cognitifs associés à l usage de l alcool. Alcoologie et Addictologie 2005, vol. 27, n 3, p Weissenborn R., Duka T. Acute alcohol effects on cognitive function in social drinkers: their relationship to drinking habits. Psychopharmacology 2003, vol. 165, n 3, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

129 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» LA MENACE D UNE REACTION AVERSIVE REDUIT-ELLE LE CRAVING D ALCOOL? ETUDE DE LA REACTION A L EXPOSITION AU STIMULUS ALCOOL CHEZ DES PATIENTS ALCOOLODEPENDANTS MARILYN SKINNER, LAURENT MICHEL ET HENRI-JEAN AUBIN Centre de Traitement des Addictions, Hôpital Emile Roux, 1, avenue de Verdun, Limeil Brévannes Cedex - France INSERM U669, 97 boulevard de Port Royal, Paris Cedex 14 - France Summary Little is known about how abstinent alcoholics would react to the sight and smell of their favorite drink if they were warned that even a sip would provoke an intensely unpleasant physical reaction. This study examines the impact on craving of the belief that drinking alcohol will provoke a disulfiram ethanol reaction (DER). We hypothesized that the fear of experiencing nausea, vomiting, and a racing heartbeat after drinking alcohol might have an effect on subjective and autonomic craving. In this study, we exposed 38 abstinent alcoholics in treatment to the sight and smell of the alcoholic beverage most likely to evoke a craving. We asked patients to take a medication and then exposed them to water and alcohol at each of two visits. At each visit, they were told they had received either a placebo or disulfiram. Measures included subjective report of craving, heart rate, blood pressure and emotional state. The analyses are in process with results expected in December. Mots clefs Craving, réaction éthanol-disulfirame, disulfirame, exposition visuelle, exposition olfactive, aversion, alcool, dépendance INTRODUCTION Le craving, ou envie compulsive de consommer, est vécu péniblement par les patients alcoolodépendants abstinents. Il augmenterait la probabilité d une rechute (Bottlender and Soyka, 2004, Monti et al., 1990). L objectif de cette étude était d évaluer l impact sur le craving de la menace d une réaction aversive, la réaction éthanol-disulfirame (RED) chez des patients alcoolodépendants hospitalisés. Aucune étude n avait jusqu à présent exploré directement cette question. En quoi la RED est-t-elle menaçante? Le disulfirame est employé dans le traitement de l alcoolisme depuis une soixantaine d années. Son mécanisme d action est à la fois pharmacologique et psychologique. En ce qui concerne son action pharmacologique, le disulfirame bloque l action de l enzyme ALDH (acétaldéhyde déshydrogénase) dès trente minutes après la prise orale. L ALDH est responsable du métabolisme d un dérivé toxique de l alcool, l acétaldéhyde. L accumulation d acétaldéhyde se fait donc suite à la consommation d alcool chez un individu ayant pris du disulfirame, provoquant la réaction éthanol-disulfirame. Cette réaction aversive est caractérisée par des céphalées, des palpitations, une tachycardie, une hypotension, des nausées, des vomissements, une sensation de chaleur et une vasodilatation cutanée prédominante au niveau du thorax et du visage. L intensité et la durée de ces effets sont variables selon les individus (Petersen, 1992). Selon certains auteurs, l effet dissuasif psychologique semblerait l emporter sur l effet pharmacologique (Wilson et al., 1984). Il a été suggéré que la menace seule d une RED plutôt que l effet pharmacologique explique l efficacité du traitement (Fuller and Gordis, 2004). Pour différencier l action pharmacologique du Cahiers de l Ireb n 19,

130 disulfirame de l effet psychologique de la menace, nous avons utilisé un placebo dans les deux conditions expérimentales (menace et absence de menace). METHODOLOGIE Il s agit d une étude en cross-over, monocentrique et randomisée en simple aveugle. Trente-huit patients hospitalisés pour sevrage alcoolique ont été exposés à la vue et à l odeur de leur boisson préférée au cours de deux séances. A chaque visite, ils ont été informés qu ils avaient reçu soit un placebo, soit du disulfirame. L envie subjective de boire, l aversion à l idée de boire, la fréquence cardiaque, la pression artérielle et l état émotionnel ont été évalués lors de ces expositions. Critères d inclusion : hommes ou femmes, hospitalisés au Centre de Traitement des Addictions de l Hôpital Emile Roux à Limeil-Brévannes, âgés d au moins 18 ans, ayant signé un consentement éclairé, capables de comprendre et de suivre les consignes orales et écrites de l étude, dépendants de l alcool selon le DSM-IV (évaluation par le MINI - Mini International Psychiatric Interview) (Sheehan et al., 1998), sevrés de l alcool depuis au moins une semaine, ayant pour objectif de rester abstinent au moins six mois, jamais traités par disulfirame. Critères de non-inclusion : contre-indication au disulfirame, traitement par antidépresseur ou neuroleptique au cours des six jours précédant l étude ; traitement par Aotal (acamprosate), Revia (naltrexone), bêta bloquants ou clonidine au cours des sept derniers jours ; traitement par benzodiazépines et/ou neuroleptiques, classiques ou atypiques (sauf diazépam, maximum 30 mg par jour) au cours des trois derniers jours ; modification de traitement susceptible de modifier leur envie de boire entre les deux expositions ; malentendant ; anosmie, y compris rhinite. Chaque patient a été vu trois fois. La première visite d inclusion a compris le recueil du consentement, l administration de l Alcohol Dependence Scale (ADS) (Skinner et Allen, 1982), le recueil des données démographiques et de la consommation quotidienne d alcool et une évaluation multidimensionnelle de la personnalité (le TCI, le Temperament and Character Inventory (Cloninger et al., 1993) version française Pélissolo et Lépine, 1997). Elle a eu lieu au moins six jours après la dernière consommation. Les visites 2 et 3 ont été des séances expérimentales qui pour la clarté seront dorénavant appelées exposition 1 et exposition 2. Les sujets ont reçu un placebo à 8 h 10 avant chacune des deux expositions, qui ont commencé à 13 h 30. La séance a démarré par une période de relaxation de trois minutes pour chaque sujet. Ensuite les sujets ont été exposés à un stimulus neutre (eau) suivi par une nouvelle période de relaxation de trois minutes. L objectif de l exposition à l eau a été d établir une ligne de base pour comparaison ensuite avec le craving pour l alcool. L exposition à la vue et à l odeur de leur boisson favorite a suivi et une troisième période de relaxation a clôturé la séance. Une voix enregistrée a expliqué au sujet étape par étape la procédure de l exposition à l eau et à l alcool. La première exposition a eu lieu entre un et sept jours après la visite d inclusion et la deuxième, de quatre à huit jours après la première. Pendant l exposition à l eau, l investigateur a apporté une bouteille d eau et un verre couvert par un couvercle sur un plateau. Il a versé un demi verre d eau devant le sujet et est revenu ensuite derrière le miroir sans tain. Les instructions enregistrées ont précisé au sujet de porter le verre sous son nez et de le sentir quand il entendait les tonalités aiguës et de poser le verre quand il entendait les tonalités graves. Il a été demandé de ne pas boire. Quelques secondes plus tard, les paires de tonalités ont commencé. Le temps entre chaque paire (au total 13) a été irrégulier pour éviter un effet d habituation et la durée totale de l exposition à la vue et à l odeur a été de trois minutes. En même temps, les mesures de la fréquence cardiaque et de la tension artérielle ont été prises. Ensuite, le sujet a été instruit de remplir un questionnaire où étaient présentées les échelles visuelles analogiques (EVA) comportant quatre questions d évaluation de la réaction à l alcool selon deux dimensions, l envie de 130 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

131 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» boire et l aversion à l envie de boire. Une autre question a évalué la perception de nausées pendant l exposition. Le sujet a rempli aussi le PANAS, une mesure d affect positif et négatif. A la fin de cette période, une des deux inductions ont été annoncées, dans un ordre contrebalancé par une procédure de randomisation. Induction 1 : vous avez pris ce matin un comprimé neutre, sans effet sur une éventuelle prise d alcool. Si vous buviez, l alcool aurait l effet habituel. Induction 2 : vous avez pris ce matin un comprimé qui provoquerait rapidement une forte réaction de malaise si jamais vous consommiez de l alcool (nausées, vomissements, chaleur intense, très forts battements cardiaques). Mais ce comprimé restera sans effet si vous ne consommez pas d alcool. Les procédures d exposition visuelle et olfactive à l alcool ainsi que les évaluations subjective et physiologique étaient identiques à celles pour l eau. Chaque sujet a eu un entretien avec une psychologue à la fin de l étude pour consolider les bénéfices des expositions. La durée de l étude pour un patient a été de 6 à 15 jours sauf exception. HYPOTHESES Hypothèses primaires sur l effet de la menace sur la réaction à l alcool ( alcool et eau) : la menace d une RED réduira l envie de boire subjective chez les sujets alcoolodépendants. Nous utiliserons les réponses à EVA 1 (Jusqu à quel point désirez-vous boire de l alcool maintenant?) dans l analyse ; dans la condition menace (M+), la fréquence cardiaque (FC) sera moins élevée que dans la condition sans menace (M-) ; dans la condition menace (M+), la tension artérielle (TA) sera moins élevée que dans la condition sans menace (M-). Hypothèses secondaires : la sévérité de la dépendance sera positivement corrélée avec l envie de boire ( alcool et eau EVA 1) dans les conditions M+ et M- ; il existera une corrélation positive entre l affect négatif (NA) et l envie de boire ( alcool et eau EVA 1) dans les conditions M+ et M- ; le TCI sous échelle «évitement du danger» sera associée à la différence entre les conditions M+ et M- pour EVA 1 alcool et eau ; les mesures subjectives (EVA 1 alcool et eau) et physiologiques (FC et TA) seront indépendantes dans les conditions M+ et M- ; la dimension désir [EVA 1 ( alcool et eau)] et la dimension aversion [EVA 2 Jusqu à quel point l idée de consommer un verre d alcool maintenant vous déplaît-elle? ( alcool et eau)] seront indépendantes dans les conditions M+ et M-. DEROULEMENT DE L ETUDE Au cours de l étude, nous avons rencontré plusieurs problèmes liés au recrutement qui ont fait l objet de deux amendements, l un en février 2007 et l autre en décembre Ces amendements étaient en accord avec l Unité de Recherche Clinique de la Pitié-Salpêtrière et approuvé par le CCP Pitié- Salpêtrière. Lors du premier amendement, nous avons changé le nombre de jours de traitement par antidépresseur ou neuroleptique précédant l étude de 30 jours à 6 jours. A partir du début de l étude en novembre 2006 jusqu à fin février 2007, nous avons observé que le nombre de patients qui n étaient pas sous antidépresseurs et/ou neuroleptiques était limité. Après évaluation des troubles qui auraient nécessité ces traitements, nous avons constaté que certaines de ces inclusions potentielles n avaient plus les symptômes pour lesquels le médicament avait été prescrit. Cependant, ils avaient manifestement des Cahiers de l Ireb n 19,

132 difficultés à gérer leurs envies de boire. Ce changement nous a donné accès à un plus grand nombre de sujets. La deuxième partie de cet amendement s est focalisée sur la modification du traitement entre les deux expositions. Au lieu de n exiger aucune modification, nous avons interdit uniquement les modifications de traitement susceptibles de modifier leurs envies de boire. Entre les deux expositions au stimulus alcool de l étude, occasionnellement un patient a demandé un traitement, par exemple, du paracétamol pour calmer une douleur quelconque ou un autre médicament n ayant pas de lien avec l envie de boire. Nous avons décidé d accorder tout traitement à l exception de ceux ayant un effet sur l envie de boire. Dans tous les cas, si le démarrage d un traitement non compatible avec l étude était jugé nécessaire, le traitement avait priorité. L amendement de décembre 2007 avait pour objet d augmenter le nombre d inclusions à 38 et de prolonger le nombre de mois d inclusion de neuf mois. Le rythme des inclusions a été irrégulier. En novembre 2006, nous n avions qu une seule inclusion. Aucune inclusion n a eu lieu en décembre 2006, ni en février, avril, août et septembre Un an environ après le début, le 11 décembre 2007, nous avions recruté 23 patients, dont six se sont révélés non évaluables pour les raisons suivantes : troubles cognitifs excessifs, prise d Aotal par accident, ré-alcoolisation entre deux séances, retrait de consentement, refus d avaler le comprimé de l étude et ré-alcoolisation avant la première exposition. Il était prévu dans le calcul initial du nombre de sujets un taux de 10 % de sujets inexploitables. Ce taux a été en réalité de 26 %. Si nous voulions analyser les résultats de 27 sujets, comme nous l avions initialement calculé, nous ne devions pas inclure 30 (27 + 3), mais 38 sujets. Finalement la période d inclusion a donc été prolongée de neuf mois. Une deuxième modification de cet amendement a affecté les règles de sorti d essai. Il s agissait de notre décision de garder dans l étude les patients qui ont consommé entre les trois visites au lieu de les exclure. Nous avons néanmoins adhéré strictement au critère qu aucun patient ne soit exposé à l alcool à moins de six jours de sa dernière consommation. Nous avons donc remplacé dans le protocole «prise d alcool entre les visites 1 et 3» par «décision de l investigateur». Actuellement, la dernière inclusion date de la fin septembre Les résultats sont en cours d analyse et seront disponibles en décembre Remerciements : ce protocole est inspiré du modèle publié par l équipe de Brown University (Rohsenow et Monti, 1999), qui nous a aidé à transférer la technique. Il a reçu un financement dans le cadre des CIRC (Contrats d Initiation à la Recherche Clinique du promoteur l AP-HP) : APHP CRC05131, et une subvention de l IREB, renouvelée une fois. Références Bottlender M., Soyka M. Impact of craving on alcohol relapse during, and 12 months following, outpatient treatment. Alcohol Alcohol 2004, vol. 39, n 4, p Cloninger C.R., Svrakic D.M., Przybeck T.R. A psychobiological model of temperament and character. Arch Gen Psychiatry 1993, vol. 50, n 12, p Fuller R.K., Gordis E. Does disulfiram have a role in alcoholism treatment today? Addiction 2004, vol. 99, n 1, p Monti P.M., Abrams D.B., Binkoff J.A., Zwick W.R., Liepman M.R., Nirenberg T.D., Rohsenow D.J. Communication skills training, communication skills training with family and cognitive behavioral mood management training for alcoholics. J Stud Alcohol 1990, vol. 51, n 3, p Pélissolo A., Lépine J. Traduction française et premières études de validation du questionnaire de personnalité TCI. Annales Médico-Psychologiques 1997, vol. 155, p Petersen E.N. The pharmacology and toxicology of disulfiram and its metabolites. Acta Psychiatr Scand Suppl 1992, vol. 369, p Rohsenow D.J., Monti P.M. Does urge to drink predict relapse after treatment? Alcohol Res Health 1999, vol. 23, n 3, p Sheehan D.V., Lecrubier Y., Sheehan K.H., Amorim P., Janavs J., Weiller E., Hergueta T., Baker R., Dunbar G.C. The Mini-International Neuropsychiatric Interview (M.I.N.I.): the development and validation of a structured diagnostic psychiatric interview for DSM-IV and ICD-10. J Clin Psychiatry 1998, vol. 59, Suppl. 20, p , quiz p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

133 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» Skinner H.A., Allen B.A. Alcohol dependence syndrome: measurement and validation. J Abnorm Psychol 1982, vol. 91, n 3, p Wilson A., Blanchard R., Davidson W., McRae L., Maini K. Disulfiram implantation: a dose response trial. J Clin Psychiatry 1984, vol. 45, n 6, p Cahiers de l Ireb n 19,

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135 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» ETUDE DES REPRESENTATIONS SOCIALES QU ONT LES SOIGNANTS DES PATIENTS EN DIFFICULTES AVEC L ALCOOL AU CHU DE CLERMONT-FERRAND AUDREY SCHMITT 1, MELANIE LOUBEYRE 2, JULIETTE. RICHETIN 3, NATHALIE DALLE 4, JEAN-CHRISTOPHE GIGER 5, MICHAEL DAMBRUN 2 ET PIERRE-MICHEL LLORCA 1 1 Unité d alcoologie de liaison, Service de Psychiatrie B, CHU, rue Montalembert, BP 69, Clermont Ferrand - France 2 UFR Psychologie Blaise Pascal, 34, avenue Carnot, Clermont-Ferrand - France 3 University of Milan-Bicocca, Piazza dell'ateneo Nuovo, 1, 20126,Milan - Italie 4 Centre d investigation clinique, CHU, rue Montalembert, BP 69, Clermont Ferrand - France 5 Faculty of Psychology, Warsaw School of Social Psychology, Varsovie - Pologne. Summary A review of the literature provides evidence that people who provide health care to patients with alcohol problems consider this caring to be a difficult experience and provide negative attitudes towards them. The objective of our study consisted in observing if regular meeting with a mobile hospital team specialised in addictology which trains nurses, allowed to modify these negatives attitudes. This study shows that nurse participants demonstrated (explicit and implicit) negative attitudes towards patients with alcohol problems, whatever the service they come from and the frequency of meeting with the addictology mobile team. Furthermore, we describe that attitudes influence stereotypical or neutral behavioural intentions. Consequently, our study shows that it is important to consider these attitudes because they have a key role in the establishment of a good therapeutic alliance. Mots clefs Unité d addictologie de liaison, attitude, patient, alcool, intention comportementale INTRODUCTION Dans les hôpitaux, les soins auprès des patients en difficultés avec l alcool sont souvent vécus comme des expériences difficiles pouvant générer des jugements négatifs (préjugés, émotions et sentiments négatifs) ainsi que des comportements discriminatoires de la part du personnel soignant (Riley, 1996 ; Vega, 2000 ; Giger et al., 2006). La principale explication avancée de ces réactions négatives consiste à invoquer un manque de formation envers cette pathologie (Happell et Taylor, 2001), ou une formation inadaptée. En effet, en fonction des différentes disciplines médico-chirurgicales, les connaissances à l échelle individuelle d un soignant sont souvent différentes de part l intérêt qu il peut porter à l égard de cette pathologie ainsi que du service où il exerce (fréquence plus ou moins importante de patients en difficultés avec l alcool). En 1996, est apparue la circulaire de création des unités d alcoologie de liaison (Journal Officiel, 1996), qui ont pour rôle d une part, de prendre en charge les patients en difficultés avec l alcool, et d autre part, de former le personnel soignant aux pratiques addictives. A ce jour, aucune étude ne permet de dire si la création de ces équipes de liaison a un impact sur les attitudes des soignants à l égard des patients en difficultés avec l alcool, et si ces patients souffrent moins de discrimination. Le but de notre étude est ainsi d évaluer l effet des interventions des équipes de liaison sur le personnel soignant, et plus spécifiquement sur les représentations sociales qu ils ont des patients présentant des problèmes d alcool. Nous avons recueilli les attitudes implicites (associations mentales très fortement établies non contrôlées par l individu) et explicites (ce qui est directement exprimé en Cahiers de l Ireb n 19,

136 public et donc soumis au biais de désirabilité sociale). L étude a été menée au CHU de Clermont- Ferrand. METHODOLOGIE Participants : 99 soignants femmes et 10 soignants hommes (M âge = 38,67 ; SD = 10,08) dans dix services différents du CHU de Clermont-Ferrand ont participé à cette étude. Cinq services travaillent régulièrement avec l alcoologie de liaison (plus de 25 interventions/an), et cinq services assez rarement (moins de 20 interventions/an). Parmi les soignants, 48 étaient des infirmiers et 47 des aides soignants. Procédure : les participants ont réalisé individuellement et volontairement une série de tâches sur ordinateur. Les participants complétaient dans l ordre : un test d association implicites (IAT) alcoolique, une mesure d intuition versus délibération (PID), un IAT alcool, une mesure explicite des préjugés à l égard des personnes atteintes de pathologie alcoolique, une mesure d intention comportementale, une mesure du sentiment d auto-efficacité dans le travail suivi des échelles IMS (Internal Motivation to respond without prejudice Scale) et EMS (External Motivation to respond without prejudice Scale), enfin, une mesure de la fréquence et de la qualité des relations soignants-soignés ainsi que des questions démographiques étaient proposées. Suite à la passation, nous remerciions les participants et nous leur demandions de ne pas divulguer le contenu de l étude à leurs collègues afin de ne pas affecter les réponses de ces derniers. Nous les informions aussi que lorsque l étude serait terminée, nous leur ferions parvenir un compte rendu des résultats. MATERIEL Mesures implicites IAT «alcoolique» Lors de cette tâche, les participants devaient catégoriser les stimuli selon deux catégories cible («alcoolique» versus «meuble») et deux catégories attributs («positif» versus «négatif»). Le but de ces tâches étant d aller le plus vite possible en essayant de faire le moins d erreurs possibles, il est précisé aux participants que si une erreur était faite, un «X» apparaîtrait en dessous du mot. Les participants devaient catégoriser un stimulus qui apparaissait au centre de l écran de l ordinateur selon les catégories cibles. Le logiciel employé était inquisiet. IAT «alcool» Concernant l IAT alcool, le principe était exactement le même que l IAT «alcoolique». En effet, la première partie consistait à catégoriser des mots dans les catégories «soda» (exemple : «Orangina») ou «alcool» (exemple : «bière»). La deuxième partie était identique à celle de l IAT «alcoolique». Dans une troisième partie, les combinaisons étaient «soda» ou «positif» d un côté et «alcool» ou «négatif» de l autre. Dans la quatrième partie, les participants devaient catégoriser des mots dans «alcool» ou «soda» mais en utilisant les touches inversées par rapport à la première partie. Enfin, la dernière partie inversait les paires avec : «alcool» ou «positif» d un côté et «soda» ou «négatif» de l autre. 136 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

137 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» Mesure explicite des préjugés La mesure explicite des préjugés à l égard des personnes ayant des problèmes avec l alcool se compose de dix items sélectionnés et est utilisée par Richetin et al. (2008b). Les participants devaient alors indiquer dans quelles mesures chaque item s appliquait à une personne ayant un problème avec l alcool grâce à une échelle allant de 1 «pas du tout» à 7 «tout à fait». Cinq de ces items étaient positifs («accueillant», «heureux», «dynamique», «modeste», «ouvert»). Un score élevé à l un des cinq items indiquait une attitude positive à l égard des personnes ayant un problème avec l alcool. Les cinq autres items étaient négatifs («impulsif», «triste», «désocialisé», «dépendant», «instable»). Un score élevé à l un de ces items négatifs indiquait une attitude négative à l égard des personnes ayant un problème avec l alcool. Mesure PID («Preference for Intuition versus Deliberation») L échelle utilisée ici a été traduite, en français, à partir de la version originale allemande de Betsch et de la version anglaise (Richetin et al., 2008a). Elle permet de mesurer les stratégies utilisées de manière préférentielle dans les processus de prise de décision. L échelle se compose de 18 items, neuf items mesurent l intuition (PID-I) (exemple : «je suis quelqu un de très intuitif»). Les neuf autres items, quant à eux, mesurent la délibération (PID-D), (exemple : «avant de prendre une décision, j envisage tous les aspects»). Pour chaque proposition, il était demandé au participant d indiquer dans quelles mesures chaque proposition le décrivait en prenant en compte sa vie générale, sur une échelle en cinq points allant de 1 «pas du tout d accord» à 5 «tout à fait d accord». Mesure d intention comportementale Cinq scénarii décrivant des situations concrètes possibles en milieu hospitalier, impliquant des patients alcooliques et un scénario où le patient n est pas étiqueté alcoolique étaient présentés aux participants. Pour chaque scénario, les participants devaient indiquer la probabilité de se comporter selon six possibilités. Chaque proposition correspond à une attitude de Porter (1971) c'est-à-dire qu elle correspond soit à l évaluation à l égard d autrui, soit à une interprétation, soit à un soutien, soit à une enquête, soit à une décision, soit à une compréhension. Trois sont des propositions stéréotypées (soutien, évaluation, décision) alors que trois sont des propositions neutres (compréhension, enquête, interprétation). Pour chaque proposition, les participants devaient indiquer la probabilité de réagir ainsi grâce à une échelle allant de 1 «pas du tout probable» à 7 «tout à fait probable». Mesure du sentiment d auto-efficacité L échelle, créée par Jérusalem et Scharzer (1992), se compose de dix items et permet d appréhender le sentiment d auto-efficacité (exemple : «vous arrivez toujours à résoudre des problèmes difficiles si vous insistez»). Pour répondre à ces situations, une échelle en quatre points allant de 1 «faux» à 4 «vrai» était proposée. Mesure de la motivation Les échelles d IMS (Internal Motivation to respond without prejudice Scale) et d EMS (External Motivation to respond without prejudice Scale), créées par Plant et Devine (1998), ont étés proposées. Ces échelles ont pour objectif de définir la motivation (c'est-à-dire motivation interne ou externe) qui sous tend le désir des gens de ne pas répondre en utilisant les préjugés. Mesure de la fréquence et de la qualité de la relation soignants-soignés Pour cela, quatre questions abordant la fréquence et la qualité des relations avec le patient ayant des problèmes avec l alcool ont été proposées. Pour répondre aux deux questions concernant la fréquence Cahiers de l Ireb n 19,

138 de ces relations, par exemple «durant la journée et en général, quelle est la fréquence de vos relations avec les patients alcooliques», une échelle avec quatre possibilités de réponse était proposée (jamais, rarement, souvent, constamment). En ce qui concerne la qualité de la relation, deux énoncés (exemple : «quelle est la qualité de vos relations avec les patients atteints de pathologie alcoolique») étaient proposés. Les soignants répondaient sur une échelle en sept points allant de 1 «très mauvaise» à 7 «très bonne». Enfin, les participants répondaient à des questions nous renseignant sur leur ancienneté, sur leur formation éventuelle et spécifique en alcoologie. Nous récoltions aussi des données démographiques pour chaque participant (sexe, âge, profession). RESULTATS Pour l IAT «alcoolique» L attitude implicite du personnel soignant à l égard de la catégorie alcoolique (M = 0,63 ; SD = 0,31) était significativement négative (t(97) = 19,74 ; p < 0,000). Ce qui signifie que les participants sont plus rapides pour associer «alcoolique» avec «négatif», que «alcoolique» avec «positif». Pour l IAT «alcool» On note alors une attitude implicite du personnel soignant à l égard de la catégorie alcool (M = 0,73 ; SD = 0,34) qui est significativement négative (t(97) = 21,18 ; p < 0,000). Ce qui signifie que les participants sont plus rapides pour associer «alcool» avec «négatif», que «alcool» avec «positif». Pour les mesures explicites On note alors que le personnel soignant à une attitude négative à l égard des patients ayant un problème avec l alcool (M = 2,70 ; SD = 1,52) et cela de façon significative (t(97) = 46,38 ; p < 0,000). Pour le sentiment d auto-efficacité Le personnel soignant rapportait un sentiment d auto-efficacité faible (M = 2,61 ; SD = 0,50), et ceci est très significatif (t(97) = 2,17 ; p < 0,03). Pour la mesure de préférence La préférence rapportée par le personnel soignant n est pas très élevée que ce soit pour des comportements intuitifs (M = 3,89 ; SD = 0,61) ou des comportements réfléchis (M = 3,87 ; SD = 0,54) et ceci de façon significative (t(97) = 14,24 ; p < 0,000 et t(97) = 15,97, p < 0.000). Pour les propositions stéréotypées Lors de la mesure d intention comportementale, les participants n étaient pas d accord pour agir dans le sens des propositions stéréotypées (M = 3,18 ; SD = 0,82) et cela de manière significative (t(97) = -9,89 ; p < 0,000). Pour les propositions neutres Lors de la mesure d intention comportementale, les participants étaient moyennement d accord pour agir dans le sens des propositions neutres (M = 4,61 ; SD = 0,85) et cela de manière significative (t(97) = 7,06 ; p < 0,000). 138 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

139 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» Pour le niveau de fréquence de contact Le niveau de fréquence de contact avec les patients alcooliques n est pas très élevé que ce soit le jour (M = 2,41 ; SD = 0,64) ou la nuit (M = 1,67 ; SD = 0,81) et ceci de manière significative. Ce qui signifie que le personnel soignant ne considère pas rencontrer beaucoup de patients ayant des problèmes avec l alcool lors de leur pratique. Pour la qualité de contact Les réponses du personnel soignant font apparaître une qualité positive (M = 5,00 ; SD = 1,17) du contact avec les patients ayant des problèmes avec l alcool et cela de façon significative (t(97) = 8,59 ; p < 0,000) IAT alcoolique 1 2.IAT alcool.232* 1 3.freqpatientsjour 4.freqpatientsnuit 5.autoefficacité " * ** Tableau 3. Corrélations entre les différentes mesures. 6.pid-I.244* * 1 7.pid-D **.309** 1 8.qualité ** formation ancienneté * 1 11.attitude explicite.231* ** intervention ** propo stéréotypées.218* **.241* propo neutres ** * ** 1 N = 98; * p <.05, ** p <.01 Freqpatientsjour : fréquence de contact le jour avec les patients ayant un problème avec l alcool Freqpatientsnuit : fréquence de contact la nuit avec les patients ayant un problème avec l alcool Propo stéréotypées : intentions comportementales stéréotypées Propo neutres : intentions comportementales neutres Effets de l intervention Les résultats mettent en évidence le fait que l intervention de l unité d addictologie de liaison n a pas d impact sur les attitudes. On note cependant une corrélation positive et significative entre la fréquence de contact jour avec les patients ayant un problème avec l alcool et l intervention de l équipe de liaison. Ce qui revient à dire que plus les participants ont une moyenne élevée de contact avec les patients alcooliques le jour, plus ils ont tendance à faire appel à l équipe d addictologie de liaison. Prédicteurs des intentions comportementales Comme le démontre le tableau 1, une série de corrélation positive et significative a été observée entre : les scores à l IAT «alcoolique» et les propositions stéréotypées des scénarii : ceci met en évidence le fait que plus le personnel soignant a des attitudes négatives implicites à l égard des patients ayant un problème avec l alcool, plus ses intentions comportementales sont stéréotypées. le sentiment d auto-efficacité et les propositions stéréotypées des scénarii : cela indique que plus les soignants se sentent efficaces dans leur travail, plus ils adoptent des comportements Cahiers de l Ireb n 19,

140 stéréotypés face aux patients. Ce résultat pourrait suggérer que lorsque le personnel soignant se sent efficace dans son travail, il attribue l échec de la relation à autrui. On sait que la relation avec les patients alcooliques est jugée difficile, par conséquent les soignants pourraient utiliser les stéréotypes négatifs pour justifier cette dernière. le sentiment d auto-efficacité et les propositions neutres des scénarii : ce qui revient à dire que plus les soignants se sentent efficaces dans leur travail, plus leurs intentions comportementales sont neutres. r p IAT_Alcoolique et intervention -0,017 0,872 IAT_Alcool et intervention 0,054 0,617 AE positives et intervention 0,080 0,460 AE négatives et intervention 0,022 0,841 AE et intervention -0,035 0,749 Note : AE : attitudes explicites Tableau 1 : corrélations entre l intervention et les différents types d attitudes CONCLUSION Les mesures utilisées lors de notre étude nous ont permis de mettre en évidence, aux niveaux implicite et explicite, des attitudes négatives de la part des soignants envers l alcool et les patients ayant un problème avec cette substance. Les résultats au niveau explicite vont donc à l encontre de ce qui est traditionnellement démontré dans les études sur les attitudes. L existence de différentes formes de préjugés peut alors expliquer ce résultat. En effet, ce dernier correspondrait à la forme moderne des préjugés : c est-à-dire à une expression subtile de ces derniers, reflétant le conflit entre l égalitarisme et la négativité sous jacente envers un groupe social particulier. Ici la négativité est seulement exprimée ouvertement quand cela est justifié ou non préjudiciable. Les résultats que nous avons obtenus cette année ne mettent pas en évidence un impact de l unité d addictologie de Clermont-Ferrand sur les attitudes des soignants des services somatiques de ce même CHU. Ce résultat atypique peut s expliquer par plusieurs arguments issus de notre recherche ou de la pratique quotidienne des membres de l équipe d addictologie de liaison. Cette dernière peut servir de «protection» pour des soignants ayant un fort ou faible sentiment d auto-efficacité par exemple. Le meilleur moyen de développer un sentiment d efficacité personnelle est de vivre des expériences maitrisées et réussies. Par conséquent, les participants avec un fort sentiment d autoefficacité préfèrent rejeter l échec de la prise en charge du patient sur l équipe d addictologie de liaison. Références Circulaire DH/EO du 10 septembre 1996 relative à la constitution d'équipes d'alcoologie hospitalière de liaison. Journal officiel, Giger J.C., Richetin J., Dambrun M., Pochwatko G. Alcooliques français, polonais et anglais : Trois pays et un seul stéréotype? Poster affiché au 6ème Congrès International de Psychologie Sociale en Langue Française (CIPSLF) -ADRIPS, 30 août - 2 sept Cahiers de l Ireb n 19, 2009

141 «Vulnérabilité : impacts psycho-sociaux» Happell B., Taylor C. Negative attitudes towards clients with drug and alcohol related problems: Finding the elusive solution. Aust N Z J Ment Health Nurs 2001, vol. 10, n 2, p Jerusalem M., Schwarzer R. Self-efficacy as a resource factor in stress appraisal processes. In, Schwarzer R. (Ed.), Self-efficacy: thought control of action. Washington, DC: Hemisphere 1992, p Plant E.A., Devine P.G. Internal and external motivation to respond without prejudice. J Pers Soc Psychology 1998, vol. 75, p Porter E.H. Strength Deployment Inventory. Pacific Palisades, CA : Personal Strengths Assessment Service Richetin J., Betsch C., Perugini M., Giger J.C. Cross-cultural comparison of the Preference for Intuition and Deliberation scale. 2008a, soumis à publication. Richetin J., Giger J.C., Dambrun M. Attitudes towards alcoholics among nurses and well-being of alcoholics. 2008b, manuscrits de travail. Riley A.J. Perceived career attitudes to alcohol dependent patients. Nurs Stand 1996, vol. 10, n 27, p Vega A. Une ethnologue à l hôpital. L ambiguïté du quotidien infirmier. Paris: Archives contemporaines 2000, 248 p. Cahiers de l Ireb n 19,

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143 5. «METABOLISME ET COMPORTEMENT»

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145 «Métabolisme et comportement» ALCOOL, POLYPHENOLS ET ACIDES GRAS OMEGA-3 MICHEL DE LORGERIL, PATRICIA SALEN, MARIE-CLAIRE TOUFEKSTIAN, FRANÇOIS LAPORTE ET LES INVESTIGATEURS DU CONSORTIUM EUROPÉEN IMMIDIET DU 5 ÈME PCRD Laboratoire TIMC-IMAG, CŒUR et NUTRITION, UJF CNRS UMR 5525, Faculté de Médecine, Domaine de la Merci, La Tronche - France Summary Omega-3 fatty acids are major mediators of cell physiology and implicated in various acute and chronic diseases. Their endogenous metabolism remains partly unknown humans especially regarding the elongation and desaturation process leading to the synthesis of the very long chain fatty acids EPA and DHA from their vegetable precursor ALA. During the last decade, our group has demonstrated that moderate alcohol intake (mainly under the form of wine) is associated with increasing plasma levels of EPA and DHA for the same levels of their dietary intake (de Lorgeril et al., 2008a). We call that important phenomenon «fish-like effect of moderate wine drinking» which could explain some of the protective effects of moderate alcohol drinking and of the Mediterranean diet for instance. No factor other than wine drinking could indeed explain that observation. In animal experiments, we then confirmed that ethanol drinking results in higher plasma and cell levels in EPA and DHA (Guiraud et al., 2008) although the increases seemed less impressive than in human wine drinkers. In the context of the large European epidemiologic study IMMIDIET, we observed that the increase in EPA and DHA was more important in wine than beer or spirit drinkers suggesting that components of wines other than ethanol (probably polyphenols) could play an important role in that phenomenon (di Guiseppe et al., 2009). Finally in a rat model of experimental nutrition, we have investigated the effects of polyphenols (in the absence of ethanol) on the metabolism of EPA and DHA and confirmed that vegetable polyphenols actually increase the endogenous synthesis of the major cardioprotective omega-3 fatty acids EPA and DHA (manuscript in preparation). The next step of our investigation will be to study the effects of polyphenols on EPA and DHA in humans in the context of a randomized clinical trial. Mots clefs Alcool, éthanol, acides gras oméga-3, polyphénol, épidémiologie, essai clinique INTRODUCTION Les acides gras oméga-3 sont des acides gras essentiels et indispensables à la physiologie cellulaire. Des déficits relatifs ont été impliqués dans des conditions pathologiques variées notamment les maladies cardiovasculaires, les cancers et les maladies inflammatoires chroniques incluant les démences type maladie d Alzheimer. Comme ces acides gras doivent être apportés par l alimentation (ALA notamment) et/ou synthétisés par les cellules (EPA et DHA) pour atteindre des concentrations suffisantes pour assurer un fonctionnement normal des organes, il est crucial d en comprendre les mécanismes de régulation. C est cette investigation conduite au cours de la décennie que décrivent les paragraphes suivants de façon schématique. PREMIÈRE DECOUVERTE La première observation qui orienta la totalité de notre investigation concernait des patients coronariens recrutés dans la Lyon Diet Heart Study, un essai qui permit entre 1987 et 1999 de démontrer les bienfaits de la diète méditerranéenne pour la prévention des cardiopathies ischémiques. Cahiers de l Ireb n 19,

146 Les patients recrutés dans cet essai étaient français et pour près de 90 % buveurs de vin. Nous avons montré que pour des apports identiques en oméga-3, ces patients présentaient des taux d autant plus élevés d EPA et de DHA qu ils buvaient plus de vin, tout en restant dans des consommations modérées (de Lorgeril et al., 2008b - reproduction ci-dessous). Un des points les plus importants de cette étude était que la combinaison de l alcool et des oméga-3 végétaux pouvait induire une augmentation de plus de 80 % de l EPA, ce qui pouvait avoir une importante signification clinique. La question posée était de savoir si finalement une grande partie des effets protecteurs du vin (ou de l alcool consommé de façon modérée) n était pas due à l effet sur les oméga-3. Mais il fallait tout d abord confirmer ces données. L idéal eût été de conduire un essai clinique avec tirage au sort sur une période suffisamment longue pour pouvoir réellement évaluer les effets de l alcool sur les métabolismes. Pour des raisons éthiques et techniques, ce type d essai est impossible à conduire chez l homme. Nous avons donc d abord étudié l effet de la consommation d alcool sur le métabolisme des oméga-3 chez le rat. DEUXIEME DECOUVERTE Chez le rat, nous avons à nouveau observé que pour des apports identiques en oméga-3, aussi bien végétaux que marins, leurs concentrations dans le sang augmentaient de façon parallèle à la consommation d alcool (reproduction partielle ci-dessous). 146 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

147 «Métabolisme et comportement» Chez le rat, toutefois, les augmentations en EPA et DHA étaient semble t-il moins importantes que dans notre étude précédente chez des humains essentiellement buveurs de vin. Autrement dit, si nous avions vraiment confirmé le phénomène du «fish-like» de la consommation d alcool, une partie des mécanismes impliqués semblait nous échapper. La première hypothèse à évoquer était que le rat a probablement des métabolismes de l alcool et des acides gras oméga-3 différents de ceux des humains. Il fallait donc revenir à des études chez les humains. C est ce que nous avons fait avec nos collègues du consortium européen IMMIDIET avec lesquels nous avons pu étudier les correspondances entre consommation de diverses boissons alcoolisées, apports nutritionnels en oméga-3 végétaux et marins et les concentrations plasmatiques et cellulaires en oméga-3. TROISIÈME DECOUVERTE L étude IMMIDIET nous a permis de confirmer une nouvelle fois que la consommation modérée d alcool dans plusieurs populations (anglaise, belge et italienne) était associée à une augmentation significative des oméga-3 EPA et DHA (reproduction de l abrégé de l article sous presse). Alcohol drinking and omega-3 polyunsaturated fatty acids in healthy men and women from three European populations Romina di Giuseppe, Michel de Lorgeril, Patricia Salen, François Laporte, Augusto Di Castelnuovo, Vittorio Krogh, Alfonso Siani, Jozef Arnout, Francesco P Cappuccio, Martien van Dongen, Giovanni de Gaetano, Licia Iacoviello, on behalf of the European Collaborative Group of the IMMIDIET Project ABSTRACT Background: Since high dietary and tissue omega-3 fatty acids (FA) are protective against coronary heart disease and sudden cardiac death, the alcoholinduced increase in blood and cell omega-3 FA could be considered an original mechanism of the protective effect of alcohol. Objective: To assess whether moderate alcohol consumption is associated with increasing levels of very long-chain (marine) omega-3 fatty acids (FA) both in plasma and in red blood cell membranes. Design: In the framework of the IMMIDIET study, 1,604 subjects (802 women-men pairs), aged years were enrolled in Italy, Belgium and England. A one year recall food frequency questionnaire (FFQ) was used to evaluate dietary intake. Results: In women in fully adjusted multivariate analyses alcohol intake was associated with plasma EPA, DHA and EPA+DHA (<0.0001, p=0.025 and p=0.0007, respectively) and with EPA and EPA+DHA index in red blood cells (p< and p=0.045, respectively). In men, only plasma and red blood cell EPA were associated with alcohol intake (p= and p=0.013, respectively). Stratified analyses showed an association between alcohol and both plasma and red cell EPA (p=0.025 and p=0.02, respectively), DHA (p=0.03 and p=0.02, respectively) and EPA+DHA index (p=0.025 and p=0.01 respectively), in wine drinkers, while in beer and spirits drinkers only an association with DHA in plasma (p=0.036) was found. Conclusions: Alcohol intake was associated with plasma and red blood cell levels of omega-3 FA. Components of wine other than alcohol (polyphenols) might exert the effects. We propose that part of the alcohol-induced cardioprotection may be mediated through increased marine omega-3 FA. Cahiers de l Ireb n 19,

148 Mais dans cette étude, nous avons pu aussi observer que cette augmentation était beaucoup plus importante chez les buveurs de vin que chez les buveurs de bière, ce qui confirmait complètement nos précédentes observations chez les patients français comme chez les rats. En effet, quoique plus important avec le vin, l effet était observable aussi avec les autres boissons alcoolisées. Mais ces résultats suggéraient immédiatement une autre hypothèse, celle que des composés du vin autres que l éthanol étaient impliqués dans la régulation du métabolisme des oméga-3. Les polyphénols étaient en premier sur la liste. Pour cette raison, nous avons élaboré un protocole d étude des polyphénols sur le rat avec nos collègues du consortium européen FLORA. Ces études sont en cours et nous ne présentons que des données préliminaires. QUATRIÈME DECOUVERTE Les expériences conduites chez le rat soumis à des régimes variés ont totalement confirmé que des polyphénols type anthocyanidines avaient un puissant effet sur le métabolisme des oméga-3, notamment EPA et DHA. Nous reproduisons ci-dessous un des tableaux d un article en préparation pour illustrer notre propos. Ce tableau ne concerne qu un seul type de régime mais les résultats observés avec les autres régimes sont comparables. Fatty acids ACN-free ACN-rich (n = 18) (n = 11) Linoleic (LA) 18:2 n-6 21,96 ± 0,63 20,85 ± 0,76 α-linolenic (α-lna) 18:3 n-3 0,38 ± 0,03 0,43 ± 0,03 Eisopentaenoic (EPA) 20:5 n-3 4,11 ± 0,18 5,09 ± 0,38 * Tetracosapentaenoic 22:4 n-6 0,19 ± 0,01 0,23 ± 0,03 Docosapentaenoic (DPA) 22:5 n-3 1,36 ± 0,06 1,56 ± 0,08 * Docosahexanoic (DHA) 22:6 n-3 7,74 ± 0,31 9,00 ± 0,30 ** Total saturated 31,33 ± 0,48 30,68 ± 1,01 Total monounsaturated 16,83 ± 0,62 17,68 ± 0,99 Total ω ± 0,46 16,07 ± 0,60 ** Total ω-6 38,04 ± 0,94 35,39 ± 1,59 ω-3 : ω-6 ratio 0,36 ± 0,02 0,47 ± 0,36 ** * : P < 0,05 ; ** : P < 0,01 vs. ACN-free. ACN means «anthocyanins». On peut conclure de cette investigation sur le rat qu en l absence d éthanol, une supplémentation en polyphénols a effectivement induit une augmentation très significative des oméga-3 à très longue chaîne. La conclusion immédiate à en tirer c est que même en l absence de consommation de poissons gras riches en EPA et DHA, une consommation d oméga-3 végétaux associés à des polyphénols également végétaux permettait d obtenir des concentrations significatives en oméga-3 présumés d origine animale exclusive. Cette observation cruciale permettrait d expliquer un des mystères de la nutrition des végétariens, c est-à-dire la source des oméga-3 à très longue chaîne (considérés comme d origine marine quasi exclusive) et indispensables au développement du système nerveux central. PROCHAINE ETAPE DE L INVESTIGATION Il nous faut maintenant confirmer que chez les humains aussi, et à condition d être dans des conditions expérimentales acceptables, nous pouvons à nouveau observer l effet des polyphénols (ou de certains polyphénols) sur le métabolisme endogène des oméga Cahiers de l Ireb n 19, 2009

149 «Métabolisme et comportement» Références de Lorgeril M., Salen P. The mediterranean diet: rationale and evidence for its benefit. Curr Atheroscler Rep 2008a, vol. 10, n 6, p de Lorgeril M., Salen P., Martin J.L., Boucher F., de Leiris J. Interactions of wine drinking with omega-3 fatty acids in patients with coronary heart disease: a fish-like effect of moderate wine drinking. Am Heart J 2008b, vol. 155, n 1, p Di Guiseppe R., de lorgeril M., Salen P., Laporte F., di Castelnuovo A., Krogh V., Siani A., Arnout J., Cappucio F.P., van Dongen M., Donati M.B., de Gaetano G., Iacoviello L., European Collaborative of the IMMIDIET Project. Alcohol consumption and n-3 polyunsaturated fatty acids in healthy man and women from 3 European populations. Am J Clin Nutr 2009, vol. 89, n 1, p Guiraud A., de Lorgeril M., Zeghichi S., Laporte F., Salen P., Saks V., Berraud N., Boucher F., de Leiris J. Interactions of ethanol drinking with n-3 fatty acids in rats: potential consequences for the cardiovascular system. Br J Nutr 2008, vol. 100, n 6, p Toufektsian M.C., de Lorgeril M., Nagy N., Salen P., Donati M.B., Giordano L., Mock H.P., Peterek S., Matros A., Petroni R., Pilu R., Rotillio D., Tonelli C., de Leiris J., Boucher F., Martin C. Chronic dietary intake of plant-derived anthocyanins protects the rat heart against ischemia-reperfusion injury. J Nutr 2008, vol. 138, n 4, p Cahiers de l Ireb n 19,

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151 «Métabolisme et comportement» EFFET DU SCYLLO-INOSITOL SUR LE METABOLISME, L OSMOREGULATION ET LA PLASTICITE CEREBRALES XAVIER COMBAZ 1, MYRIAM CAYRE 2, YANN LE FUR 1, PATRICK J. COZZONE 1 ET ANGÈLE VIOLA 1 1 Centre de Résonance Magnétique Biologique et Médicale, UMR CNRS 6612, Faculté de Médecine, 27 boulevard Jean Moulin, Marseille - France 2 Institut de Biologie du Développement de Marseille Luminy, UMR 6216, Case 907, Marseille Cedex 9 - France Summary Chronic alcoholism leads to cerebral dysfunction as a result of structural and metabolic damage. We recently identified in long-term alcoholics an unknown anomaly of cerebral metabolism consisting of the accumulation of scyllo-inositol, as a probable consequence of defective glycolysis. Here, we were interested in studying the effects of high doses of this polyol on the brain of healthy C57BL/6J mice. To this end, the animals were intracerebroventricularly injected with scyllo-inositol under stereotaxic conditions and explored by magnetic resonance imaging (MRI) and spectroscopy (MRS). At the end of the MRI/MRS protocol, the effects of scyllo-inositol on cell proliferation and apoptosis were assessed by immunohistochemistry. Mots clefs Scyllo-inositol, alcoolisme, cerveau, souris, Imagerie par Résonance Magnétique, Spectroscopie par Résonance Magnétique, métabolisme INTRODUCTION L alcoolisme chronique est responsable de dommages métaboliques, structuraux et fonctionnels à l origine de déficits neurologiques (Charness, 1993 ; Jensen et Pakkenberg, 1993 ; Fadda et Rossetti, 1998 ; Mann et al., 2001 ; Viola et al., 2004). Nous avons récemment identifié une anomalie métabolique cérébrale majeure consistant en l accumulation de scyllo-inositol (Viola et al., 2001 ; Viola et al., 2004), en relation avec une glycolyse défectueuse chez le sujet alcoolique (Viola et al., 2004). Afin de déterminer si le scyllo-inositol possède des propriétés neuroactives, nous avons débuté une étude visant à analyser l impact cérébral métabolique et fonctionnel de ce polyol chez la souris. Sachant que le passage du myo-inositol, principal épimère du scyllo-inositol dans le système nerveux central, est finement régulé par un système de transport, également emprunté par le scyllo-inositol (Spector, 1978), nous avons mis au point un modèle de surcharge consistant en l injection intracérébroventriculaire en conditions stéréotaxiques du scyllo-inositol chez des souris saines C57BL/6J. Les souris ont été explorées in vivo, par IRM anatomique, par IRM de diffusion, et imagerie métabolique du proton (CSI-2D) sur un spectromètre imageur à 11,75 T. L IRM de diffusion permet d étudier la microstructure du tissu cérébral en analysant notamment les variations de volume cellulaire, tandis que l imagerie métabolique du proton donne accès au métabolisme cérébral. Ces études in vivo ont été complétées par des études immunohistochimiques de l effet du scyllo-inositol sur la prolifération cellulaire et l apoptose. Cahiers de l Ireb n 19,

152 MATERIELS ET METHODES Réactifs Le myo-inositol et le scyllo-inositol (Sigma-Aldrich) ont été solubilisés dans un tampon phosphate (PBS) isotonique au plasma à une concentration de 308 mm. Deux µl de ces solutions ont été injectés aux animaux. Le modèle murin de surcharge cérébrale en scyllo-inositol Des souris mâles C57BL/6J âgées de huit semaines ont été utilisées (CER janvier). Les animaux ont été répartis en quatre groupes, le premier n a reçu aucune injection, le second a été injecté avec la solution saline servant de véhicule aux polyols, le troisième a reçu la solution de myo-inositol, et le quatrième celle de scyllo-inositol. Les différentes solutions ont été administrées par injection stéréotaxique intracérébroventriculaire. Les études réalisées sont en accord avec la réglementation française et approuvées par le comité local d éthique. Les protocoles d IRM et de SRM cérébrales in vivo Les protocoles d IRM et de SRM ont été conduit sur un spectromètre imageur vertical Bruker AVANCE 500WB à large trou opérant à 11,75 T, équipé d un résonateur dédié à l exploration du cerveau de souris et fonctionnant en transmission et réception. Les souris anesthésiées à l isoflurane (1,5 %) étaient placées dans un berceau doté d un équipement de contention stéréotaxique, d un système de chauffage permettant le maintien d une température corporelle d environ 36 C pendant la durée de l examen, et d un capteur de pression pour le suivi respiratoire de l animal. Acquisition des données IRM Une acquisition anatomique IRM RARE pondérée T 2 de 30 coupes jointives axiales de 0,5 mm sur l ensemble du cerveau a été réalisée, avec une matrice de 512X256, un temps d écho de 37 ms, un temps de répétition de 4998 ms et un champ de vision de 20X20 mm 2. Une image axiale correspondant à la coupe sélectionnée pour l imagerie métabolique a été obtenue au moyen d une séquence GEFI avec les paramètres suivants : matrice : 128 x 128 ; temps d écho : 1,864 ms ; temps de répétition : 60 ms ; champ de vision 20 x 20 mm 2 ; épaisseur de la coupe : 2 mm, nombre d acquisitions : 1. L IRM de diffusion a été acquise au moyen d une séquence écho de spin echo planar imaging (EPI) avec huit valeurs de b. Acquisition des données d imagerie métabolique Les données d imagerie métabolique (CSI-2D) ont été générées au moyen d une méthode modifiée dérivée de celle de Bruker. Le Fastmap a été utilisé pour le shim (taille du voxel : 5 3 mm 3 ). Des pas de codage (15 x 15) avec un champ de vision de 2 2 cm 2 ont été utilisés produisant une résolution spatiale nominale de 1,33 mm. Les données ont été acquises avec les paramètres suivants : temps de répétition : 3000 ms ; temps d écho : 6 ms ; épaisseur de la coupe : 2 mm ; nombres de scans : 943 ; temps total d acquisition : 47 minutes. La position de la coupe sélectionnée était mi-axiale. La suppression du signal de l eau a été obtenue grâce à l utilisation du motif VAPOR, tandis que celle des lipides a été réalisée par le positionnement de six tranches de saturation définissant les limites de la boîte crânienne sur la coupe. La créatine (3,04 p.p.m.) a été employée comme référence de déplacement chimique. 152 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

153 «Métabolisme et comportement» Traitement des données IRM et SRM Les données IRM et SRM ont été traitées au moyen de logiciels «maison» développés sous l environnement IDL (Interactive Data Language Research System). Des cartes du cœfficient de diffusion apparent de l eau (ADC) ont été générées à partir des acquisitions d IRM de diffusion. En ce qui concerne l imagerie métabolique, les taux de plusieurs métabolites ont été évalués : le N- acétylaspartate (NAA), le glutamate (Glu) et la glutamine (Gln), la créatine+la phosphocréatine (tcr), les composés contenant la choline (Cho), la taurine (tau), le scyllo-inositol (scyllo-ins), et le myoinoistol (myo-ins). L estimation a été réalisée de façon semi-quantitative grâce au rapport entre un métabolite donné et la somme des autres métabolites (S = NAA + Glu +Gln + tcr + Cho + myo-ins + tau + scyllo-ins). Histologie A la fin du protocole IRM-SRM, les souris ont été sacrifiées pour histologie. Après perfusion des souris avec du paraformaldehyde 4 %, dissection du cerveau et post-fixation durant 2 heures dans la même solution, deux types de coupes ont été réalisées : soit au vibratome (épaisseur de 50 µm) soit en paraffine (épaisseur de 6 µm). La détection des cellules en division a été obtenue avec un anticorps anti-phosphohistone 3 (PH3) qui permet de marquer les cellules en phase M du cycle cellulaire (Upstate, 1/250) suivi d'un anticorps secondaire anti-lapin (Alexa 488, 1/400). Les cellules positives pour la PH3 ont été comptées dans la zone sous-ventriculaire. La détection des cellules apoptotiques dans la zone sous-ventriculaire a été obtenue par le marquage des cellules exprimant la caspase 3 activée avec un anticorps anti-caspase 3 activée au 1/200 (Cell Signaling Technology) suivi d'un anticorps anti-lapin biotinylé (1/500) et streptavidine-oregon green (1/500). Analyse statistique Les résultats ont été analysés à un jour post-injection (J1) et quatre jours post injection (J4) dans l hémisphère gauche (hémisphère d injection) et l hémisphère droit. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne±erreur type. Une analyse statistique nonparamétrique a été réalisée au moyen du logiciel Prism Graph Pad. Les comparaisons appariées ont été obtenues avec le test de Wilcoxon. Les comparaisons de deux groupes ont été réalisées au moyen du test de Mann-Whitney, les comparaisons de plus de deux groupes avec le test de Kruskal Wallis suivi du test a posteriori de Dunn. RESULTATS ET DISCUSSION Etude métabolique Les spectres obtenus par CSI-2D dans la zone sous-ventriculaire ont mis en évidence une persistance du signal du scyllo-ins dans cette zone jusqu à quatre jours après l injection du polyol, tandis que le taux de myo-inositol visible par SRM revient à un niveau normal dès le premier jour post-injection (Figure 1). Cahiers de l Ireb n 19,

154 Figure 1 : évolution des taux cérébraux de NAA et de Cho dans la zone sous-ventriculaire après injection intracérébroventriculaire. CTL : contrôles (souris non opérées), PBS : souris ayant reçu une injection intracérébroventriculaire de tampon phosphate, myo-ins : souris injectées avec du myo-inositol ; scyllo-ins : souris injectées avec du scyllo-inositol. HG : hémisphère gauche (hémisphère d injection), J1 : jour 1 post-injection, J4 : jour 4 post-injection, Cho : composés contenant la choline, NAA : N-acétylaspartate. CTL : n = 11 ; PBS J1 : n = 8 ; PBS J4 : n = 7 ; myo-ins J1 : n = 8 ; myo-ins J4 : n = 7 ; scyllo-ins J1 et J4 : n = 8. Par ailleurs une diminution du taux de NAA est observée chez les souris ayant été injectées avec du scyllo-ins ou du myo-ins qui persiste jusqu à J4 (Figure 2). Figure 2 : évolution des taux cérébraux de NAA et de Cho dans la zone sous-ventriculaire après injection intracérébroventriculaire. CTL : contrôles (souris non opérées), PBS : souris ayant reçu une injection intracérébroventriculaire de tampon phosphate, myo-ins : souris injectées avec du myo-inositol ; scyllo-ins : souris injectées avec du scyllo-inositol. HG : hémisphère gauche (hémisphère d injection), J1 : jour 1 post-injection, J4 : jour 4 post-injection, Cho : composés contenant la choline, NAA : N-acétylaspartate. CTL : n = 11 ; PBS J1 : n = 8 ; PBS J4 : n = 7, myo-ins J1 : n = 8 ; myo-ins J4 : n = 7 ; scyllo-ins J1 et J4 : n = 8. La chute du taux de NAA s accompagne d une baisse du niveau des composés contenant la choline (Figure 2). Etude de la microstructure du tissu cérébral L étude de la microstructure du tissu cérébral par IRM de diffusion montre que l injection de PBS induit une diminution de l ADC dès J1, ce qui indique que la tonicité du PBS est différente de celle du liquide céphalorachidien. Le même effet est observé à J1 avec les solutions de polyols, en revanche à J4, l effet du PBS n est plus perceptible et les animaux présentent des valeurs normales d ADC, tandis que les souris injectées avec les polyols ont toujours des valeurs d ADC abaissées. Ce résultat indique que l effet à J4 est dû aux polyols et non à la solution saline (Figure 3). 154 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

155 «Métabolisme et comportement» Figure 3 : évolution du cœfficient de diffusion apparent (ADC) de l eau dans la zone sous-ventriculaire après injection intracérébroventriculaire. CTL: contrôles (souris non opérées), PBS : souris ayant reçu une injection intracérébroventriculaire de tampon phosphate, myo-ins : souris injectées avec du myo-inositol ; scyllo-ins : souris injectées avec du scyllo-inositol. G : hémisphère gauche (hémisphère d injection), J1 : jour 1 post-injection, J4 : jour 4 post-injection, ZSV : zone sous-ventriculaire. CTL : n = 19 ; PBS J1 : n = 10 ; PBS J4 : n = 9 ; myo-ins J1 : n = 10 ; myo-ins J4 : n = 7 ; scyllo-ins J1 : n = 9 ; scyllo-ins J4 : n = 11. Barre d échelle = 1 mm ; * p < 0,05. Etude de la prolifération cellulaire et de l apotose Les études par immunohistochimie concernant l effet de l administration des polyols sur la prolifération cellulaire et l apoptose ont montré une diminution des cellules en division dans la zone sous-ventriculaire, cette baisse étant plus importante chez les souris ayant reçu du scyllo-ins. Par ailleurs, l administration de polyols induit une réduction de l apoptose dans cette même zone, encore une fois plus marquée chez les souris ayant reçu du scyllo-ins. CONCLUSION Nos résultats d IRM de diffusion indiquent que le scyllo-inositol, tout comme le myo-insitol, possède un effet osmorégulateur et qu en concentration élevée il peut entraîner la formation d un œdème cellulaire. Par ailleurs, notre étude démontre, pour la première fois, la toxicité du scyllo-inositol à forte dose sur le cerveau. Cet effet a été particulièrement étudié dans la zone sous-ventriculaire, une niche neurogénique de cellules souches neurales à l origine de progéniteurs pouvant être spontanément recrutés pour la réparation de lésions dans le cerveau adulte. Cette toxicité se traduit par un effet délétère sur les neurones (diminution du NAA), par une baisse des composés contenant la choline, précurseurs des phospholipides, de la prolifération cellulaire et de l apoptose. La diminution de cellules en état de mort programmée en conjonction avec la chute de la prolifération cellulaire ainsi que la baisse des composés à base de choline indiquent une diminution du renouvellement cellulaire et par conséquent de la plasticité cérébrale. Nos résultats suggèrent que de fortes doses de scyllo-inositol dans le cerveau sont susceptibles d amplifier les effets délétères de l alcool. Remerciements : ces travaux sont financés par le CNRS, l Institut Universitaire de France et par une subvention de l IREB. Références Charness M.E. Brain lesions in alcoholics. Alcohol Clin Exp Res 1993, vol. 17, n 1, p Fadda F., Rossetti Z.L. Chronic ethanol consumption: from neuroadaptation to neurodegeneration. Prog Neurobiol 1998, vol. 56, n 4, p Jensen G.B., Pakkenberg B. Do alcoholics drink their neurons away? Lancet 1993, vol. 342, n 8881, p Cahiers de l Ireb n 19,

156 Mann K., Agartz I., Harper C., Shoaf S., Rawlings R.R., Momenan R., Hommer D.W., Pfefferbaum A., Sullivan E.V., Anton R.F., Drobes D.J., George M.S., Bares R., Machulla H.J., Mundle G., Reimold M., Heinz A. Neuroimaging in alcoholism: ethanol and brain damage. Alcohol Clin Exp Res 2001, vol. 25, n 5 Suppl., p. 104S-109S. Spector R. The transport and metabolism of scyllo-inositol in the central nervous system. J Neurochem 1978, vol. 31, n 4, p Viola A., Nicoli F., Confort-Gouny S., Le Fur Y., Ranjeva J.P., Cozzone P.J. Applications de la spéctrométrie de résonance magnétique (SRM) à l'étude des perturbations métaboliques affectant le cerveau au cours de l'alcoolisme. Pathol Biol (Paris) 2001, vol. 49, n 9, p Viola A., Nicoli F., Denis B., Confort-Gouny S., Le Fur Y., Ranjeva J.P., Viout P., Cozzone P.J. High cerebral scyllo-inositol: a new marker of brain metabolism disturbances induced by chronic alcoholism. Magma 2004, vol. 17, n 1, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

157 «Métabolisme et comportement» PROLONGED ACCESS TO SUCROSE, BUT NOT ALCOHOL, DURING ADOLESCENCE ALTERS MOTIVATION FOR SWEET AND ALCOHOL SOLUTIONS IN ADULT RATS LEANDRO F. VENDRUSCOLO 1, ALIOU B. GUEYE 1, JANAÍNA C.M. VENDRUSCOLO 1, PIERRE MORMEDE 2, MURIEL DARNAUDERY 3 ET MARTINE CADOR 1 CNRS UMR5227, Université Victor Segalen, 146 rue Léo Saignat, Bordeaux Cedex - France 2 INRA-UMR1286, CNRS UMR5226, Université Victor Segalen,146 rue Léo Saignat, Bordeaux Cedex - France 3 Laboratoire Neurostress EA 4347, Université de Lille 1, Villeneuve d'ascq - France Summary Intake of sweet alcoholic solutions (Premixed drinks) during adolescence might favor higher alcohol intake in adulthood. This study examined the influence of chronic exposure to sweet and/or alcohol solutions during adolescence on emotional and consummatory behaviors in adulthood. Adolescent rats were given continuous free-choice access to water and either a 5% sucrose solution, a 5% alcohol solution or a mixed 5% alcohol-sucrose solution. The control group had access to water only. Upon reaching adulthood, rats were tested for locomotion, anxiety-related behaviors, novelty preference and then on a two-bottle choice test for saccharin, quinine and alcohol. Surprisingly, adult rats that had prolonged access to sucrose during adolescence showed a decreased consumption of both sweet and alcohol solutions. Pre-exposure to alcohol (with or without sugar), however, had no effect on these consummatory measures. Moreover, no significant effects were observed for any other behavioral parameters studied. As alcohol consumption is influenced by its gustative and pharmacological properties, additional groups of rats were tested for intravenous alcohol selfadministration in order to test the effect of sucrose pre-exposure specifically on the pharmacological properties of alcohol. In this test, no differences were seen, suggesting that the reduction in alcohol intake by sucrose pre-exposed rats is likely due to changes in alcohol palatability. Altogether, the results suggest that chronic exposure of adolescent rats to a very reinforcing sweet solution induces persistent changes in the reward system and offers a useful model for studying the neural aspects related to alcohol taste acceptance, a factor involved in the development of alcoholism. Key-words Natural reward, operant self-administration, consummatory behaviors, elevated plus-maze, novelty seeking. INTRODUCTION High levels of alcohol abuse during adolescence have been associated with future alcohol dependence (Bates and Labouvie, 1997). Flavored and sweet alcoholic beverages, known as Ready to Drink, Alcopop or Premixed drinks, have become increasingly popular. These drinks are often served in small bottles with attractive packaging, and contain between 4 to 7% alcohol. These drinks can contribute to the excessive alcohol consumption among adolescents. Despite the fact that teen drinking is not a new problem, little is known about the effects of alcohol on the developing adolescent brain and its consequences in adulthood. Similar neurobiological changes have been observed in humans during adolescence and rodents aged between post-natal days (PND) 30 to 46, thus this period has been considered to be a good animal model of adolescence (Spear, 2000). The present study examined in rats the influence of chronic Cahiers de l Ireb n 19,

158 exposure to alcohol and/or sucrose solutions during adolescence on emotional and consummatory behaviors in adulthood. MATERIALS AND METHODS Wistar rats were individually housed in plastic cages and maintained with food and water ad libitum under a 12 h light/dark cycle at 21±2 C. Animals were given 16 days of continuous free-choice access between water and either 5% alcohol, 5% sucrose or 5% alcohol-sucrose solutions during adolescence (PND30-46). The control group had two water bottles. Adolescent rats receiving sucrose alone had a significantly higher daily fluid intake (70.9±4 ml) than all other groups (25.1±0.5 ml). The caloric ingestion and body weight did not differ between the groups (data not shown). The consumption of 5% alcohol was moderate (2.1±0.3 g/kg/day), but significantly increased when mixed with sucrose (approx. 57% higher; 3.3±0.5 g/kg/day). When reaching adulthood (>PND60), rats were subjected successively to a battery of behavioral tests (Figure 1). This battery of tests is described below in the order of testing. Figure 1: time-line and experimental groups (N=8). Activity cages Animals were individually placed for 120 min inside wire-mesh cages with transparent plastic sides located inside a rack equipped with infra-red photo beams connected to a computer which recorded the number of cage crossings (Imetronic, Pessac, France). Elevated plus-maze The apparatus was made of gray Plexiglas and had four elevated arms in a cross-like arrangement, with two opposite arms being enclosed and two being open, and a central platform at the intersection that gave access to any one of the four arms. The time spent in the open arms was measured during 5 min test and considered as an index of experimental anxiety. Novelty preference This test was carried out in a Y-maze made of three rectangular boxes arranged radially. Two compartments were white with a smooth floor whereas a third one had black stripes with a rough floor. During the habituation phase (4 days), rats were allowed to explore the white compartments for 30 min. For the test day, the animals were allowed to explore all three compartments for 10 min. The percentage of time spent in the novel box relative to the familiar compartments was used as an index of novelty seeking. 158 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

159 «Métabolisme et comportement» Saccharin and quinine consumption The animals were given free choice between two bottles containing either sweet saccharin solution (0.13%) or water on 24 hours. For bitter quinine, the test followed the same protocol as for saccharin, with 2 µm quinine solution being used and was performed 48 hours following the saccharin test. The data were expressed as percentage of increase in fluid intake when saccharin (or quinine) was available relative to the basal water consumption. Two-choice alcohol The animals were given free choice between water and 10% (v/v) alcohol (a classical dose used in studies with adult rats, e.g., Vendruscolo et al., 2008b). The bottles were weighed (refilled if necessary) every two days for 18 days. Data are expressed as g of alcohol/day/kg of body weight. Intravenous alcohol self-administration Additional groups of rats exposed to sucrose or water during adolescence were tested for intravenous alcohol self-administration. Testing was conducted in standard operant chambers (Imetronic, Pessac, France). Rats were trained to press a lever for intravenous alcohol (50 µl, 1%) injections in 1-h daily sessions on a fixed ratio 1 schedule of reinforcement (each lever press reinforced). Statistical analysis Data were analyzed using ANOVA with or without repeated measures. When appropriate, a Fisher s LSD test was used for post-hoc comparisons. The accepted level of significance for all tests was p<0.05. RESULTS Effect of pre-exposure to different kinds of solutions during adolescence on locomotion, anxietylike behaviors and novelty seeking measured at adulthood The statistical analyses did not reveal any significant effect on locomotion in activity cages, nor on the time spent in the open arms of the elevated plus-maze or on the percentage time spent in the novel compartment of the Y-maze (Figure 2). Figure 2: locomotion in activity cages, time spent in the open arms (s) of the elevated plus-maze and preference for a novel compartment in the Y-maze displayed by adult rats exposed to different solutions during adolescence. No differences were found between groups. Cahiers de l Ireb n 19,

160 Effect of pre-exposure to different solutions on saccharin and quinine consumption As shown in Figure 3, the two-way ANOVA revealed a sucrose effect (F (1, 27) =9.56, p<0.005) for the increase of fluid consumption (relative to basal water consumption) induced by the availability of saccharin. Rats exposed to sucrose during adolescence showed lower saccharin intake than animals not exposed to sucrose. For quinine intake, no differences were found. Figure 3: increase of fluid consumption induced by the availability of saccharin (0.13%) or quinine (2 µm) solutions in free choice with water (24 h) displayed by adult rats pre-exposed to different solutions during adolescence. Effect of pre-exposure to different solutions on voluntary alcohol drinking As presented in Figure 4, the ANOVA revealed a significant effect of sucrose on alcohol intake (F (1, 25) =4.93, p<0.04) and preference (F (1, 24) =5.80, p<0.03), with adult rats previously exposed to sucrose showing lower alcohol intake and preference than the rats which were not exposed. Figure 4: voluntary ethanol drinking. The animals were given a choice between ethanol at 10% (v/v) and water over 18 days. Data are expressed as average of the amount of ethanol in grams per kilogram body weight per day (g/kg/day) and preference. * P<0.05 Effect of pre-exposure to sucrose on intravenous alcohol self-administration The ANOVA did not reveal any significant effect on intravenous alcohol self-administration (Figure 5). 30 water 25 sucrose Infusions Daily sessions (1-h) Figure 5: intravenous alcohol self-administration. The animals were allowed to press a lever for an intravenous alcohol infusion (50 µl; 1%) in daily sessions of 1 hour. No differences were found between sucrose and water pre-exposed rats. 160 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

161 «Métabolisme et comportement» DISCUSSION The results of this study show that chronic exposure of rats to a highly palatable solution during adolescence reduces the consumption of both sweet and alcohol solutions at adulthood. The emotional reactivity (forced novelty, anxiety-like behaviors, novelty preference), bitter preference and intravenous alcohol self-administration were not altered by this treatment when measured at adulthood. Past studies reported that alcohol intake during adolescence increases the risk of alcoholism later in life (Hawkins et al., 1997). Contrary to our expectations, the exposure of adolescent rats to alcohol (alone or in combination with sucrose) in free choice with water did not alter subsequent alcohol intake at adulthood. This outcome is probably due to the relatively low levels of alcohol intake (even when combined with sucrose) displayed by adolescent rats in this study. This finding confirms that adolescent rats are poor alcohol drinkers (Bell et al., 2006; Füllgrabe et al., 2006) and/or resistant to its enduring effects (Tolliver and Samson, 1991; Slawecki and Betancourt, 2002). The main finding of the present study was that pre-exposure of adolescent rats to sucrose significantly reduces the subsequent consumption of sweet (saccharin) and alcohol solutions in adulthood. Two main possibilities can be proposed to explain this result: 1) changes in taste sensitivity or 2) changes in the rewarding properties of sweet and alcohol solutions. It should be noted, however, that the preference for the sweet solution was almost 100% in all groups (data not shown). This evidence suggests that all groups perceived the sweet taste and liked it. However, the increase in fluid intake (an index of reinforcement) induced by the availability of saccharin was lower in the animals pre-exposed to sucrose as compared to control rats, thus suggesting a change in the reinforcing effects of sweet and alcohol solutions at adulthood. This latter possibility is strengthened by our recent study showing that rats pre-exposed to sucrose, relative to control rats, are less willing to work for a saccharin solution in a progressive ratio schedule of reinforcement whereas no differences in taste sensitivity were observed in a concentration-response test (Vendruscolo et al., 2008a). From these results, however, it was not possible to know whether pre-exposure to sucrose induces changes in alcohol palatability or its pharmacological effects. The results of intravenous alcohol self-administration, that showed no differences between rats pre-exposed to sucrose or water, suggest that chronic exposure to sucrose during adolescence has rather an enduring effect on the gustative properties of alcohol than on its pharmacological properties. Finally, exposure to sucrose and/or alcohol on adolescence did not alter emotional reactivity as evaluated in the elevated-plus maze and novelty tests. Although novelty seeking and anxiety-like behaviors may sometimes predict drug effects (Cloninger, 1987), under our experimental conditions, no relationship was found between these behavioral characteristics and alcohol or saccharin intake. In conclusion, early developmental exposure of rats to a highly palatable solution induces persistent changes in the reward system and offers a useful model for studying the neural aspects related to alcohol taste acceptance, a factor potentially involved in the development of alcoholism. Acknowledgments: the research was supported by Ireb. L.F.V. receives a post-doctoral fellowship from FONDATION FYSSEN. The authors thank Dr. Kelly J. Clemens for comments on this manuscript. References Bates M.E., Labouvie E.W. Adolescent risk factors and the prediction of persistent alcohol and drug use into adulthood. Alcohol Clin Exp Res 1997, vol. 21, n 5, p Bell R.L., Rodd Z.A., Sable H.J., Schultz J.A., Hsu C.C., Lumeng L., Murphy J.M., McBride W.J. Daily patterns of ethanol drinking in peri-adolescent and adult alcohol-preferring (P) rats. Pharmacol Biochem Behav 2006, vol. 83, n 1, p Cloninger C.R. Neurogenetic adaptative mechanisms in alcoholism. Science 1986, vol. 236, n 4800, p Füllgrabe M.W., Vengeliene V., Spanagel R. Influence of age at drinking onset on the alcohol deprivation effect and stress-induced drinking in female rats. Pharmacol Biochem Behav 2007, vol. 86, n 2, p Hawkins J.D., Graham J.W., Maguin E., Abbott R., Hill K.G., Catalano R.F. Exploring the effects of age of alcohol use initiation and psychosocial risk factors on subsequent alcohol misuse. J Stud Alcohol 1997, vol. 58, n 3, p Cahiers de l Ireb n 19,

162 Slawecki C.J., Betancourt M. Effects of adolescent ethanol exposure on ethanol consumption in adult rats. Alcohol 2002, vol. 26,n 1, p Spear L.P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neurosci Biobehav Rev 2000, vol. 24, n 4, p Tolliver G.A., Samson H.H. The influence of early postweaning ethanol exposure on oral self-administration behavior in the rat. Pharmacol Biochem Behav 1991, vol. 38, n 3, p Vendruscolo L.F., Gueye A.B., Vendruscolo J.C.M., Darnaudéry M., Mormède P., Cador M. Prolonged access to sucrose, but not alcohol, during adolescence alters motivation for palatable and alcoholic solutions in adult rats. Int J Neuropsychopharmacol 2008a, vol. 11, 234 p. Vendruscolo L.F., Izídio G.S., Takahashi R.N., Ramos A. Chronic methylphenidate treatment during adolescence increases anxiety-related behaviors and ethanol drinking in adult spontaneously hypertensive rats. Behav Pharmacol 2008b, vol. 19, n 1, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

163 «Métabolisme et comportement» VULNERABILITE A LA DEPENDANCE A L ALCOOL APRES UNE EXPOSITION PENDANT L ADOLESCENCE : IMPLICATION DES RECEPTEURS A2A DE L ADENOSINE ET CB1 DES ENDOCANNABINOIDES HAKIM HOUCHI, VINCENT WARNAULT, CATHERINE VILPOUX, OLIVIER PIERREFICHE, MARTINE DAOUST ET MICKAEL NAASSILA INSERM ERI24, GRAP (Groupe de Recherche sur l Alcool et les Pharmacodépendances), Faculté de Pharmacie, 1, rue des Louvels, Amiens - France Summary We have shown previously that mice lacking the adenosine A2A receptor (A2AR) generated on a CD1 background self-administer more ethanol and exhibit hyposensitivity to acute ethanol while mice lacking the endocannabinoid CB1 receptor display the opposite alcohol phenotype. We aimed to investigate if the increased propensity of A2A-/- mice to consume ethanol is associated with an altered sensitivity in the motivational properties of ethanol in the conditioned place preference (CPP) and conditioned taste aversion (CTA) paradigms and with an altered development of sensitization to the locomotor effects of ethanol. We also tested their sensitivity to the anxiolytic effects of ethanol. Our results show that A2A-/- mice produced on a CD1 background displayed a reduced ethanol-induced CPP and an increased sensitivity to the anxiolytic and locomotor stimulant effects of ethanol, but they did not show alterations in ethanol-induced CTA and locomotor sensitization. Ethanol-induced CPP, ethanol consumption and the locomotor effects of ethanol were also tested in A2A-/- mice produced on a C57BL/6J background. Our results emphasized the importance of the genetic background because alterations in ethanol consumption and preference, ethanol-induced CPP and locomotor-stimulant effects were not found in knockout mice produced on the alcohol-preferring C57BL/6J genetic background. In addition, the A2AR agonist, CGS 21680, reduced ethanol consumption and preference in C57BL/6J mice and operant ethanol self-administration in non alcohol-dependent rats. Finally, ethanol binging during adolescence in A2A-/- mice induced an increase in resistance to the intoxicating effects of ethanol later in life. In our rat model of alcohol vulnerability induced by exposure to ethanol binging during adolescence, preliminary results indicate that this vulnerability is not associated with modifications of the CB1 receptor functionality. In conclusion, A2AR deficiency in mice generated on a CD1 background leads to high ethanol consumption that is associated with an increased sensitivity to the locomotor-stimulant/anxiolytic effects of ethanol and a decrease in ethanol-induced CPP. Further investigations are needed in order to demonstrate the potential therapeutic interest of A2A agonists such as testing their effects in alcohol-dependent rats. Mots clefs Alcoolodépendance, vulnérabilité, adolescence, exposition précoce, adénosine A2A, endocannabinoïde, CB1, binge drinking. INTRODUCTION L alcoolodépendance est une maladie chronique et hautement récidivante en dépit des pharmacothérapies et psychothérapies existantes (Naassila, 2008). Son développement est influencé par l interaction entre des facteurs génétiques et environnementaux. Des études cliniques récentes ont démontré que la précocité de l exposition joue également un rôle majeur dans la vulnérabilité à l alcool. Ainsi, l exposition à l alcool pendant la gestation est un facteur très prédictif de la vulnérabilité à l abus ou à la dépendance à l alcool (ou à d autres drogues) chez le jeune adulte et semble même avoir une meilleure prédictibilité que l histoire familiale positive. De même, des études américaines ont clairement montré que l initiation de la consommation d alcool à la pré-adolescence Cahiers de l Ireb n 19,

164 (vers l âge de ans) multiplie par 4 ou 5 le risque de présenter une alcoolodépendance au cours de la vie comparativement à une initiation plus tardive vers l âge de ans. Il semble ainsi que l exposition précoce soit un facteur qui augmente la vulnérabilité ultérieure à l alcool alors qu un premier contact tardif serait plutôt un facteur protecteur. En dépit du problème majeur de santé publique que constitue la consommation d alcool de plus en plus précoce et de la modalité d alcoolisation de type «binge drinking» présentant une forte dangerosité et qui a un impact sanitaire important, assez peu d études précliniques se sont intéressées à modéliser cette vulnérabilité à l alcoolodépendance induite par une exposition précoce et à explorer les mécanismes neurobiologiques impliqués. Nous avons déjà montré que l exposition à l alcool pendant la vie intra-utérine est associée, à très long terme, à une modification des réponses comportementales à l alcool et aux autres drogues ainsi qu à des modifications neurochimiques profondes chez le rat (Naassila et Daoust, 2002 ; Barbier et al., 2008). Ces effets de l exposition précoce à l alcool dépendent de facteurs génétiques car l importance des effets délétères de l alcool, aussi bien au niveau comportemental que neurochimique, n est pas la même chez différentes souches de rats (Barbier et al., soumis à publication). Dans le présent travail, la première partie a consisté en l étude de l implication des récepteurs A2A de l adénosine dans les réponses comportementales à l alcool avec l utilisation de souris chez lesquelles l expression du gène codant ce récepteur a été invalidée ainsi que l utilisation d outils pharmacologiques. L intérêt d agents pharmacologiques ciblant ce récepteur est testé sur la consommation volontaire d alcool des souris et l auto-administration opérante d alcool chez le rat non dépendant et le rat alcoolodépendant. La deuxième partie du travail concerne la modélisation de la vulnérabilité à l alcool induite par une exposition de type «binge drinking» chez le rat adolescent et de l implication des systèmes adénosinergiques et endocannabinoïdergiques et plus particulièrement des récepteurs couplés à des protéines G : les récepteurs A2A et CB1 (Figure 1). Ces deux systèmes de neurotransmission ont été fortement impliqués dans l alcoolodépendance (Naassila et al., 2002, 2004 ; Houchi et al., 2005, 2008 ; Warnault et al., 2007). Figure 1 : effet aigu et chronique de l éthanol sur les systèmes adénosinergique et endocannabinoïdergique. L exposition aiguë à l éthanol inhibe le transporteur équilibrant de type 1 des nucléosides, ENT1, et augmente donc le taux extracellulaire d adénosine qui active alors les récepteurs A1 et A2. Il existe une diminution de l effet inhibiteur de ENT1 après exposition chronique à l éthanol. L éthanol augmente aussi le taux des endocannabinoïdes via une inhibition de l enzyme de dégradation (FAAH) et du transporteur (AEAT). Les endocannabinoïdes sont des modulateurs de la neurotransmission et agissent de manière rétrograde sur les neurones présynaptiques en activant les récepteurs CB1 couplés négativement à une adénylate cylase. La diminution de la production d AMPc qui en découle a un effet inhibiteur sur la libération de neurotransmetteur. L adénosine, un autre neuromodulateur, agit également, entre autres, sur les neurones présynaptiques, mais à l inverse des endocannabinoïdes, l activation des récepteurs A2A entraîne une augmentation des taux d AMPc et facilite ainsi la libération de neurotransmetteurs. 164 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

165 «Métabolisme et comportement» De nombreuses données ont montré l implication de l adénosine dans les effets cellulaires et comportementaux de l éthanol. On sait depuis 20 ans que l éthanol induit in vitro la production d AMPc et que cette stimulation fait intervenir l adénosine (Gordon et al., 1986). Des expériences in vitro ont démontré que l exposition aiguë à l éthanol augmente le taux extracellulaire d adénosine en inhibant de manière sélective le transporteur équilibrant de type 1 des nucléosides (ENT1) (Nagy et al., 1990), alors que l exposition chronique, quant à elle, diminue l expression de ce transporteur et le rend moins sensible à l inhibition par l éthanol de sorte que l éthanol n augmente plus le taux d adénosine extracellulaire (Figure 1). Différents travaux ont déjà mis en évidence des similarités entre les actions de l adénosine et les effets aigus et à long terme de l éthanol dans le SNC. Comme l éthanol, les agents qui stimulent le récepteur A1 de l adénosine sont sédatifs et ces récepteurs A1 pourraient également jouer un rôle dans les effets ataxiques de l éthanol (Meng et Dar, 1995 ; Meng et al., 1998 ; Phan et al., 1997 ; Nyce 1999). De plus, les animaux ayant développé une tolérance à l éthanol sont également tolérants aux effets de l adénosine suggérant ainsi que la transmission adénosinergique est impliquée dans la réponse à l éthanol. Choi et al., (2004) ont démontré récemment que les souris mutées pour le transporteur ENT1 de l adénosine (ENT1-/-) consomment deux fois plus d éthanol (3-10 %) que les souris sauvages et qu elles sont moins sensibles aux effets ataxiques et hypnotiques de l éthanol comparativement aux souris ENT1+/+. Si les premières études comportementales sur l implication des récepteurs de l adénosine semblaient impliquer prioritairement le type A1, nous avons, d après les résultats obtenus in vitro, voulu savoir si le récepteur A2A pouvait lui aussi jouer un rôle dans l auto-administration d éthanol ainsi que dans les réponses comportementales à l éthanol. Nous avons recherché si l absence de récepteurs A2A influence la consommation, la sensibilité et le développement de la tolérance. Nos résultats (Naassila et al., 2002) ont montré que les souris A2A-/- générées sur un fond génétique CD1, consomment plus d éthanol (6-20 %) et présentent une plus forte préférence (éthanol 6-10 %) comparativement aux souris sauvages, que ce soit chez les mâles ou les femelles. Cette plus forte consommation d éthanol n est due ni à une modification de la perception du goût (quinine/saccharose), ni du métabolisme de l éthanol. Nos résultats montrent également que la vitesse d acquisition de la tolérance aux effets hypothermiques de l éthanol (3,0 g/kg) administré tous les jours pendant quatre jours n est pas modifiée. Par contre les souris A2A-/- sont moins sensibles aux effets hypothermiques et sédatifs de l éthanol (1,5-4,0 g/kg). Enfin, nous avons confirmé, au moins pour la sensibilité aux effets hypothermiques, que le phénotype observé est bien dû à l absence de récepteur A2A en analysant l effet d un antagoniste des récepteurs A2A (ZM , mg/kg, i.p.) injecté 15 minutes avant l éthanol (4,0 g/kg). De fait, les résultats indiquent bien, comme attendu, que la chute de température est atténuée de manière dose dépendante par le blocage des récepteurs A2A. L ensemble de ces résultats suggère que le récepteur A2A de l adénosine pourrait jouer un rôle de frein sur l autoadministration d éthanol et semble confirmer que la sensibilité aux effets aigus de l éthanol est inversement corrélée à la propension à consommer des boissons alcoolisées. Ce dernier point semble concorder avec les observations cliniques d une moindre sensibilité initiale à l éthanol dans les populations à risque. De plus, il semble très probable que cette augmentation de la consommation d éthanol, observée chez les souris A2A-/-, implique une altération du système dopaminergique, car un état «hypodopaminergique» dans le striatum a été mis en évidence chez ces souris. Enfin, un agoniste A2A peut diminuer les effets récompensants de l autostimulation cérébrale. Il est important de souligner que cette augmentation de la propension à consommer de l éthanol peut être due aux effets anxiolytiques de l éthanol chez les souris A2A-/- qui présentent un comportement plus anxieux que les souris sauvages. Nous avons, dans la première partie de ce travail, poursuivi l étude des réponses comportementales à l éthanol des souris sauvages A2A+/+ et mutées A2A-/- qui ont été générées sur les fonds génétiques CD1 et C57BL/6J (Dr Catherine Ledent, Bruxelles). Nous avons analysé : la sensibilité aux propriétés récompensantes de l éthanol (Préférence de Place Conditionnée, PPC), aux propriétés aversives de l éthanol (Aversion de goût conditionnée, CTA), aux effets locomoteurs de l éthanol (chambre d activité) et aux effets anxiolytiques de l éthanol (labyrinthe en croix surélevé) ; le phénomène de sensibilisation aux effets locomoteurs de l éthanol ; le niveau basal d anxiété et la sensibilité aux effets anxiolytiques de l éthanol (labyrinthe en croix surélevé) ; l effet d agonistes/antagonistes des récepteurs A2A sur la consommation d éthanol, de manière à Cahiers de l Ireb n 19,

166 envisager de nouvelles pistes thérapeutiques ; les neuro-adaptations des récepteurs NMDA du glutamate et GABAA du GABA avant et après exposition chronique à l éthanol (radioliaison) pour vérifier si l invalidation du gène a induit des neuro-adaptations au niveau de systèmes de neurotransmission jouant un rôle important dans le développement de l alcoolodépendance et pour étudier les neuro-adaptations de ces systèmes après exposition chronique à l éthanol. Différentes études ont mis en évidence l importance que joue le fond génétique des souris utilisées dans les recherches sur l alcool. Nous avons donc étudié certaines réponses comportementales à l éthanol et notamment la consommation, les effets stimulants moteurs de l éthanol et les propriétés récompensantes de l éthanol chez les souris A2A-/- générées sur le fond génétique C57BL/6J. Nous avons ensuite étudié l effet d un agoniste A2A sur la consommation volontaire d alcool des souris alcoolopréférantes et sur l auto-administration opérante d alcool chez le rat non alcoolodépendant. Enfin, l effet des ivresses répétées pendant l adolescence sur la sensibilité ultérieure aux effets d intoxication de l alcool a été analysé chez les souris sauvages et mutées. Dans une deuxième partie de ce travail, nous avons mesuré la fonctionnalité des récepteurs CB1 pour vérifier si une modification du fonctionnement de ces récepteurs est associée à la plus grande propension à boire des boissons alcoolisées observée chez les rats qui ont été exposés à des ivresses répétées pendant l adolescence. MATERIELS ET METHODES Animaux Les souris ont été générées sur deux fonds génétiques par le Dr Catherine Ledent (Ledent et al., 1997). La plupart des tests sont réalisés sur des mâles âgés de 2-6 mois mais la consommation d éthanol a également été appréciée chez les femelles. Les rats mâles utilisés dans le modèle du «binge drinking» sont de souche Wistar (Charles River). En général, 10 à 12 animaux ont été utilisés dans chaque groupe. Préférence de Place Conditionnée (PPC) La procédure de PPC se déroule suivant trois phases : un pré-conditionnement, un conditionnement et le test de préférence, que nous avons déjà décrit précédemment (Houchi et al., 2005). Pendant le préconditionnement, l animal explore les deux environnements distincts, la porte guillotine étant ouverte, pendant une durée de 20 minutes, laps de temps optimal pour l exploration chez le rongeur pour ce type de test. Dans un deuxième temps, un conditionnement de 4 jours avec deux sessions par jour a été défini, ce qui a été aussi choisi d après une revue de la littérature, afin d optimiser la procédure. Deux substances sont administrées pendant le conditionnement : une solution saline (NaCl 0,9 %) et l éthanol (0,5 ; 1,0 ; 2,0 g/kg). Ensuite, l animal est conditionné de telle façon qu il associe un environnement donné à la drogue et l autre à la solution saline. Puis le jour test, l animal est replacé dans l appareil dans les mêmes conditions que le jour du pré-conditionnement sans être sous l effet de la drogue. Différents paramètres sont enregistrés tels que : la distance parcourue, le temps passé, le nombre de passages par la porte guillotine et le temps d inactivité dans chaque environnement. Si l animal attribue à la drogue une valeur appétitive positive, il passera plus de temps dans l environnement dans lequel il a reçu la drogue (PPC). La PPC est exprimée par la différence de temps (en secondes) passé dans le compartiment associé à la drogue pendant le pré-conditionnement et le jour du test. Ces résultats sont exprimés par la moyenne ± e.s.m. Aversion de goût conditionnée (CTA) Dans ce test l'animal associe un goût sucré (saccharine 0,15 %) à un malaise digestif (produit par injection d éthanol). Il évite ultérieurement d'ingérer une boisson sucrée ce qui permet d apprécier la sensibilité des animaux aux propriétés aversives de l éthanol. Les animaux sont adaptés à une restriction hydrique avec un accès restreint à deux heures par jour sur une période de sept jours. A des intervalles de 48 heures et pendant les dix jours suivants, les souris ont accès une heure/jour à une 166 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

167 «Métabolisme et comportement» solution de saccharine (0,15 %). Immédiatement après cet accès à la saccharine, les souris reçoivent une injection soit de NaCl soit d éthanol 2,5 g/kg. Toutes les souris ont accès également à de l eau pendant 30 minutes, cinq heures après l accès à la saccharine pour prévenir toute déshydratation. Un libre accès à l eau est donné pendant deux heures les jours où l accès à la saccharine n est pas donné. Niveau d anxiété et sensibilité aux effets anxiolytiques de l éthanol Le comportement de type anxieux a été apprécié dans le labyrinthe en croix surélevé. L anxiété de base et après injection d éthanol (1,0 ; 1,5 ; 2,0 g/kg i.p.) a été mesurée pendant cinq minutes, comme nous l avons précédemment décrit (Warnault et al., 2007). Les paramètres analysés dans ce test sont le pourcentage de temps passé dans les bras ouverts, le pourcentage d entrées dans les bras ouverts et le nombre total d entrées (bras ouverts + fermés). Activité locomotrice et sensibilité aux effets locomoteurs de l éthanol L activité locomotrice a été appréciée dans une chambre d activité (BIOSEB). Les activités de base et après injection d éthanol (0,5 ; 1,0 ; 1,5 ; 2,0 ; 2,5 et 3,0 g/kg i.p.) ont été mesurées pendant 20 minutes. Sensibilisation à l éthanol La sensibilisation comportementale est définie comme l augmentation progressive et à long terme des réponses locomotrices et motivationnelles à une drogue suite à son administration répétée. Des études ont décrit depuis plus de 20 ans la capacité de l éthanol à induire une sensibilisation locomotrice après son administration répétée. De manière intéressante, la prédisposition génétique à l alcoolodépendance a été associée à une augmentation de ce phénomène. Après avoir mesuré l activité locomotrice de base des souris pendant 10 minutes après injection de NaCl le premier jour et le deuxième jour, la réponse locomotrice à l injection d éthanol 2,0 g/kg est mesurée au troisième jour. Ensuite les animaux reçoivent une injection quotidienne d éthanol à 2,5 g/kg dans leur cage de stabulation pendant dix jours. Au 14ème jour du test, les souris sont à nouveau testées pour leur réponse locomotrice à l injection d éthanol 2,0 g/kg. Le groupe contrôle (non sensibilisé) ne reçoit qu une seule injection d éthanol au 14ème jour (il reçoit une injection de NaCl tous les autres jours). Traitements pharmacologiques et consommation d éthanol Nous avons testé l effet d un agoniste des récepteurs A2A, le CGS21680 [2-p-(2- carboxyéthyl)phénéthyl-amino-5'-n-éthylcarboxamido-adénosine] aux doses de 0,5 et 1,0 mg/kg, sur la consommation d alcool des souris et sur le comportement d auto-administration opérante d éthanol chez le rat. Effet de l exposition intermittente et répétée d alcool pendant l adolescence sur l intoxication induite par l alcool à l âge adulte mesurée avec un rotarod Nous avons mesuré la sensibilité des souris à l intoxication induite par l injection d alcool (2,0 g/kg) et ses effets sur la locomotion à l aide d un rotarod. Radioliaison, récepteurs NMDA et GABAA L études des récepteurs NMDA (glutamate) et GABAA (GABA) a été réalisée avec la technique de radioliaison de [ 3 H]MK801 et [ 3 H]muscimol, respectivement. Les mesures ont été effectuées dans l hippocampe, le cortex cérébral et le striatum des souris exposées ou non à une alcoolisation chronique, comme précédemment décrit (Warnault et al., 2007). La tolérance métabolique a été évaluée à l issue de l exposition chronique à l alcool à l aide de l analyseur d alcool Analox AM1 (IMLAB). Cahiers de l Ireb n 19,

168 Auto-administration opérante d éthanol Le comportement d auto-administration opérante d éthanol est mesuré dans des chambres BIOSEB équipées d un levier actif donnant accès à une solution d éthanol 10 % et un levier inactif ne donnant lieu à aucune réponse. La technique classique d extinction avec des concentrations décroissantes de saccharose (10 % - > 0 %) a été utilisée avec un ratio fixe de 1. L effet du CGS a été mesuré chez des rats non dépendants et sera par la suite testé sur des rats rendus alcoolodépendants et présentant une consommation excessive d alcool après une intoxication chronique et intermittente avec des vapeurs d alcool (Le Bourhis, 1975 ; Aufrère et al., 1997 ; Naassila et al., 1997). Fonctionnalité des récepteurs CB1 mesurée dans l hippocampe et le striatum de rats adultes qui ont été exposés de manière intermittente et chronique à l alcool pendant l adolescence La fonctionnalité des récepteurs CB1 a été étudiée en mesurant la liaison de [ 35 S]GTPγS induite par des doses croissantes de WIN 55, Les EC50 et Emax ont été mesurées dans les conditions basales et après une injection aiguë d alcool à 1,5 g/kg. RESULTATS Réponses comportementales à l alcool chez les souris A2A+/+ et A2A-/- Figure 2 : panneau de gauche : sur le fond génétique C57BL/6J (a et b), il n y a aucune différence génotypique ni dans la consommation d alcool ni dans la préférence envers l éthanol. Une augmentation de la consommation d alcool et de la préférence est observée chez les souris A2A-/- générées sur le fond génétique CD1. panneau de droite : cette augmentation de la consommation d alcool observée chez les souris A2A-/- CD1 est associée à une diminution de la sensibilité des souris aux effets récompensants de l alcool mesurés dans le test de PPC puisque seule la dose de 2,0 g/kg d alcool induit une PPC significative chez les souris A2A-/- alors qu elle est induite dès la dose de 1,0 g/kg chez les souris sauvages. Aucune PPC n est induite chez les souris C57BL/6J, comme déjà décrit dans la littérature. 168 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

169 «Métabolisme et comportement» Figure 3 : panneau de gauche : il n y a aucune différence génotypique dans la sensibilité aux effets aversifs de l alcool mesuré dans le test de CTA. panneau de droite : l augmentation de la consommation d alcool observée chez les souris A2A-/- CD1 est associée à une plus grande sensibilité aux effets stimulants moteurs de l alcool (a) ; cet effet n est pas retrouvé sur le fond C57BL/6J (b) pour lequel aucun effet stimulant de l alcool n est observé (comme décrit dans la littérature). Cahiers de l Ireb n 19,

170 Figure 4 : panneau de gauche : (en haut) aucune différence génotypique n est observée dans le développement de la sensibilisation comportementale aux effets locomoteurs de l alcool induite par des injections répétées d alcool. La consommation volontaire (a) d éthanol 10 % et la préférence (b) sont diminuées par le traitement avec l agoniste des récepteurs A2A, le CGS 21680, aux doses de 0,5 et 1,0 mg/kg. panneau de droite : comportement de type anxieux mesuré dans le test de la croix surélevée. Il n y a aucune différence génotypique dans le niveau basal d anxiété et les souris passent un temps équivalent dans les bras ouverts du labyrinthe. Par contre les souris A2A-/- sont plus sensibles aux effets anxiolytiques de l alcool (1,5 g/kg) puisqu elles vont plus souvent et passent plus de temps dans les bras ouverts du labyrinthe que les souris A2A+/ Cahiers de l Ireb n 19, 2009

171 «Métabolisme et comportement» 80 nombre d'appuis sur le levier "alcool" NaCl CGS ,25mg/kg 0,125mg/kg 0,095mg/kg 0,065mg/kg dose de CGS21680 Figure 5 : effet de l agoniste A2A, le CGS21680, sur l auto-administration opérante d alcool 10 % chez le rat. Le CGS21680 a un effet biphasique, il diminue l auto-administration d alcool aux plus fortes doses chez le rat non alcoolodépendant. A Latence à chuter du rotarod (s) Effet de l'éthanol chez les rats adultes qui ont été exposés au NaCl à l'adolescence éthanol 2.0g/kg A2A +/+ A2A -/ Temps (min) B Effet de l'éthanol chez les rats adultes qui ont été exposés aux ivresses répétées à l'adolescence éthanol 2.0g/kg ** ** * * * A2A +/+ A2A -/ Temps (min) Figure 6 : effet de l exposition intermittente et chronique à l alcool 2,0 g/kg pendant l adolescence (B) ou à l injection d une solution saline (témoins, A) sur la sensibilité aux effets de l injection d alcool 2,0 g/kg sur la coordination motrice à l âge adulte. L exposition aux «ivresses alcooliques» à l adolescence entraîne une plus grande résistance aux effets de l intoxication à l alcool à l âge adulte chez les souris A2A-/-. Cahiers de l Ireb n 19,

172 Ethanol consumption (g /kg body weight/day) A *** ** * 1% 3% 6% 10% 15% EtOH [ 35 S]-GTP γ specefic binding (% of basal) [ 35 S]-GTP γ specefic binding (% of basal) A Ctrl Ctrl EtOH EtOH IEBI Ctrl Ctrl -1 Saline Saline IEBI Ctrl Ctrl EtOH EtOH Ctrl IEB Ctrl EtOH IEB EtOH EtOH IEBI Ctrl Ctrl Saline Saline Ctrl IEB Ctrl Saline IEB Saline Saline IEB BCtrl Ctrl EtOH EtOH IEB IEB EtOH EtOH Ctrl Ctrl Saline Saline IEB IEB Saline Saline Figure 7 : consommation volontaire d alcool et fonctionnalité des récepteurs CB1 à l âge adulte après une exposition intermittente et chronique à l alcool pendant l adolescence. panneau de gauche : l exposition intermittente et chronique à l alcool (ivresses) pendant l adolescence ( ) induit une augmentation ultérieure de la propension à boire des solutions alcoolisées comparativement au groupe témoin qui a reçu des injections répétées de NaCl ( ). panneau de droite : cette augmentation de la consommation d alcool n est pas associée à une modification de la fonctionnalité des récepteurs CB1 dans le striatum (A) et l hippocampe (B). On peut noter que dans le striatum l injection aiguë d alcool (, ) entraîne une diminution de la liaison totale de [ 35 S]GTPγS comparativement à l injection de NaCl (, ). DISCUSSION Implication des récepteurs A2A dans les réponses comportementales à l alcool et nouvelle cible thérapeutique Nous avons montré que les souris dont l expression du gène codant le récepteur A2A de l adénosine est invalidée spécifiquement sur le fond génétique CD1 ont une plus forte propension à boire des boissons alcoolisées qui est associée à une plus faible sensibilité aux effets récompensants de l alcool et à une plus forte sensibilité à ses effets anxiolytiques et stimulants moteurs. La mutation a transformé un phénotype «non alcoolopréférant» en un phénotype «alcoolopréférant», mais n a pas d effet chez les souris C57BL/6J qui présentent déjà une forte alcoolopréférence. Ces résultats mettent en lumière un effet important du fond génétique des souris mutées qui sont phénotypées pour leur réponse à l alcool. Nos études de radioliaison sur les effets de l exposition chronique à l alcool sur les récepteurs NMDA et GABAA dans le cortex cérébral et l hippocampe ont démontré que l augmentation des récepteurs NMDA et la diminution des récepteurs GABAA qui sont normalement observées chez les souris témoins (A2A+/+) ne sont pas observées chez les souris mutantes (résultats non montrés). L absence de ces neuro-adaptations induites par l exposition chronique à l alcool observées chez les souris mutantes expliquerait au moins en partie le fait qu elles soient moins sensibles aux convulsions induites par le sevrage à l alcool. Les résultats obtenus avec le CGS21680, un agoniste A2A, qui montrent une diminution à la fois de la consommation volontaire d alcool chez les souris alcoolopréférantes et de l auto-administration d alcool 10 % chez les rats non alcoolodépendants, appuient l hypothèse d un «frein» sur la consommation d alcool exercé par l activation de ces récepteurs et de l intérêt thérapeutique potentiel des modulateurs de ces récepteurs. Enfin, les souris mutées exposées à des ivresses répétées pendant 172 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

173 «Métabolisme et comportement» l adolescence semblent développer une résistance aux effets de l intoxication de l alcool qui pourrait favoriser encore plus leur propension à boire des boissons alcoolisées. Implication des récepteurs CB1 dans la vulnérabilité à la consommation d alcool induite par des ivresses répétées pendant l adolescence Nous avons montré que les rats exposés à des ivresses répétées pendant l adolescence présentent une augmentation de la propension à boire des boissons alcoolisées. Cette vulnérabilité n est pas associée à une modification de la fonctionnalité des récepteurs CB1 des endocannabinoïdes dans le striatum et l hippocampe. Les perspectives de ce travail sont, entre autres, d analyser les effets d agents pharmacologiques modulant ces deux systèmes de neurotransmission chez des rats rendus alcoolodépendants après une exposition chronique et intermittente à des vapeurs d alcool. Remerciements : INSERM, Mildt, Conseil régional de Picardie, IREB. VW est allocataire INSERM-Mildt et HH est allocataire du Conseil régional de Picardie. Les résultats de ces études ont été présentés lors des derniers meetings «alcool» RSA (Washington 2008), «Stress and Alcoholism» (Volterra, 2007), ESBRA (Berlin 2007), ISBRA (Sydney 2006). Références Aufrère G., Le Bourhis B., Beaugé F. Ethanol intake after chronic intoxication by inhalation of ethanol vapour in rats: behavioural dependence. Alcohol 1997, vol. 14, n 3, p Barbier E., Houchi H., Warnault V., Pierrefiche O., Daoust M., Naassila M. Effects of prenatal and postnatal maternal ethanol on offspring response to alcohol and psychostimulants in Long Evans rats. Neuroscience, soumis à publication. Barbier E., Pierrefiche O., Vaudry D., Vaudry H., Daoust M., Naassila M. Long-term alterations in vulnerability to addiction to drugs of abuse and in brain gene expression after early life ethanol exposure. Neuropharmacology 2008, vol. 55, n 7, p Choi D.S., Cascini M.G., Mailliard W., Young H., Paredes P., McMahon T., Diamond I., Bonci A., Messing R.O. The type 1 equilibrative nucleoside transporter regulates ethanol intoxication and preference. Nat Neurosci 2004, vol. 7, n 8, p Gordon A.S., Collier K., Diamond I. Ethanol regulation of adenosine receptor-stimulated camp levels in a clonal neural cell line: an in vitro model of cellular tolerance to ethanol. Proc Natl Acad Sci USA 1986 vol. 83, n 7, p Houchi H., Babovic D., Pierrefiche O., Ledent C., Daoust M., Naassila M. CB1 receptor knockout mice display reduced ethanol-induced conditioned place preference and increased striatal dopamine D2 receptors. Neuropsychopharmacology 2005, vol. 30, n 2, p Houchi H., Warnault V., Barbier E., Dubois C., Pierrefiche O., Ledent C., Daoust M., Naassila M. Involvement of A receptors in anxiolytic, locomotor and motivational properties of ethanol in mice. Genes Brain Behav 2008, vol. 7, n 8, p Le Bourhis B. Alcohol intoxication via the lung in rats. C R Seances Soc Biol Fil 1975, vol. 169, n 4, p Ledent C., Vaugeois J.M., Schiffmann S.N., Pedrazzini T., El Yacoubi M., Vanderhaeghen J.J., Costentin J., Heath J.K., Vassart G., Parmentier M. Aggressiveness, hypoalgesia and high blood pressure in mice lacking the adenosine A2a receptor. Nature 1997 vol. 388, n 6643, p Meng Z.H., Dar M.S. Possible role of striatal adenosine in the modulation of acute ethanol-induced motor incoordination in rats. Alcohol Clin Exp Res 1995, vol. 19, n 4, p Meng Z.H., Pennington S.N., Dar M.S. Rat striatal adenosinergic modulation of ethanol-induced motor impairment: possible role of striatal cyclic AMP. Neuroscience 1998, vol. 85, n 3, p Naassila M. Du plaisir à la dépendance. Cerveau & Psycho 2008, n 29, p Naassila M., Daoust M. Effect of prenatal and postnatal ethanol exposure on the developmental profile of mrnas encoding NMDA receptor subunits in rat hippocampus. J Neurochem 2002, vol. 80, n 5, p Naassila M., Beaugé F., Daoust M. Regulation of rat neuronal nitric oxide synthase activity by chronic alcoholization. Alcohol Alcohol 1997, vol. 32, n 1, p Naassila M., Ledent C., Daoust M. Low ethanol sensitivity and increased ethanol consumption in mice lacking adenosine A2A receptors. J Neurosci 2002, vol. 22, n 23, p Cahiers de l Ireb n 19,

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175 6. «FOIE»

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177 «Foie» EFFETS CONJOINTS ET/OU SEPARES DE L ETHANOL ET DU RESVERATROL SUR LES METABOLISMES HEPATIQUES ET CEREBRAUX CHEZ LE RAT MARIE-CHRISTINE BEAUVIEUX 1, NIZAR SERHAN 1, PATRICE COUZIGOU 2, HENRI GIN 3 ET JEAN-LOUIS GALLIS 1 1 RMSB UMR5536 CNRS, Université Bordeaux 2, 146 rue Léo Saignat, Bordeaux Cedex - France 2 Service d hépato-gastroentérologie, Hôpital du Haut-Lévêque, avenue Magellan, Pessac Cedex - France 3 Service de nutrition diabétologie, Hôpital du Haut-Lévêque, avenue Magellan, Pessac Cedex - France Summary Ethanol (EtOH) disrupts the energy metabolism of liver and brain. The resveratrol (RSV), a grape polyphenol, is a regulator of energy metabolism by indirect stimulation (via sirtuine) of mitochondria biogenesis and/or direct modulation of their ATP synthase activity. RSV would be beneficial in diseases linked to mitochondrial dysfunctions (type2 diabetes, Alzheimer) in the affected organs (liver, brain). The Nuclear Magnetic Resonance study in rat has shown (A) in vivo: 8 daily intraperitoneal injections of RSV (15 and 40mg/kg) increased the brain myo-inositol and therefore had an effect on glucose metabolism; (B) ex vivo: on the isolated and perfused liver (30mM glucose + insulin) at various doses of EtOH (1.4;14 and 70mM), RSV addition (20µM) improved the ATP metabolism, surely at mitochondrial level and probably also through the glycolytic ATP production. RSV counteracted the distortions of energy metabolism induced by increasing concentrations of ethanol. Mots clefs Ethanol, resvératrol, insulinorésistance, métabolisme énergétique, foie, cerveau INTRODUCTION Le syndrome métabolique englobe des anomalies cardiaques et métaboliques associées à un risque élevé de développer un diabète de type 2 (DT2) et des accidents cardiovasculaires. Des études épidémiologiques récentes démontrent des effets bénéfiques d une consommation modérée d alcool avec une amélioration des paramètres définissant le syndrome métabolique (Dunn et al., 2008). Elle serait ainsi associée à une diminution du risque de diabète en restaurant l insulinosensibilité (Feng et al., 2008). A l inverse, une consommation élevée serait un facteur étiologique de diabète, car corrélée négativement avec l insulinosensibilité et la masse de cellules β-pancréatiques (Zhao et al., 2008). La notion de dose d éthanol est donc fondamentale (Koppes et al., 2005). D autres constituants des boissons alcoolisées comme les polyphénols ont des effets bénéfiques sur le syndrome métabolique grâce à leurs propriétés vasculo-protectrices et insulinosensibilisantes (Liu et al., 2008). Ainsi, le resvératrol (3,4,5-trihydroxystilbène, PM=228,25-RSV), phytoalexine produite par la plante (raisin, myrtille, mûre, cacahuète, ) en réponse aux infections mycosiques ou bactériennes, est retrouvé dans la composition du vin rouge sous sa forme trans à une concentration variant de 0,1 à 15 mg/l. Il induit une protection contre les pathologies cardiovasculaires, l ischémie, l ostéoporose, le cancer, et le vieillissement par le biais de mécanismes tels que la suppression des radicaux libres oxygénés, un mimétisme oestrogénique, l inhibition de la mitose et de l inflammation (Frémont, 2000). Les effets bénéfiques du resvératrol alimentaire semblent dériver de son interaction avec plusieurs sites cellulaires, notamment la mitochondrie. Le déficit énergétique associé à des dysfonctionnements mitochondriaux a été relié à diverses pathologies dégénératives dont les pathologies cardiovasculaires, les lésions neurologiques, le vieillissement (Wallace, 2005) et l insulinorésistance (Lowell et Schulman 2005). Le cerveau constitue un autre tissu cible important de l'action de l insuline (Diamant, Cahiers de l Ireb n 19,

178 2007) et le métabolisme énergétique cérébral étant également affecté dans la maladie d'alzheimer, le RSV est proposé comme outil thérapeutique (Pallas et al., 2008). Les sirtuines représenteraient un lien entre les dysfonctionnements mitochondriaux et les maladies métaboliques liées au vieillissement telles que DT2 et Alzheimer (Westphal et al., 2007). Cependant les effets biochimiques in vitro du RSV sur l ATP synthase mitochondriale (F 1 -F 0 ATPase) plaident en faveur de son action directe dans la prévention ou l amélioration de ces mécanismes physiopathologiques. En effet, l inhibition à la fois de l hydrolyse de l ATP ainsi que sa synthèse par inhibition du mécanisme de rotation de l enzyme ont été démontrées dans le cœur (Gledhill et al., 2007). Cependant la spécificité d organe et les effets «dose» doivent être pris en compte puisque la F 1 -F 0 ATPase est inhibée dans le cœur et le foie dans la gamme du µm alors qu elle est activée dans le foie pour des doses très faibles (nm, pm) plus proches de l apport alimentaire (Kipp et Ramirez 2001). C est également sur les mécanismes de la phosphorylation oxydative que s exerce un des effets de l éthanol (10 mm) qui augmente, dans le foie perfusé, la vitesse de synthèse d ATP mitochondrial et le rendement de la phosphorylation oxydative, par inhibition de la dissipation énergétique au niveau de la chaîne respiratoire (Beauvieux et al., 2002). La perfusion à dose modérée ou élevée (Desmoulin et al., 1987) entraîne une diminution du contenu hépatique en ATP en raison des mécanismes de rééquilibration redox consécutifs à l oxydation hépatique de l éthanol (Beauvieux et al., 2004). Le but de l étude est double et complémentaire : in vivo : effets de l éthanol et/ou du RSV sur les métabolites hépatiques et cérébraux, mesurés par RMN 1H HRMAS sur des petites biopsies, sans altération liée à l'extraction, donnant des spectres hautement résolus de tous les métabolites polaires et apolaires ; ex vivo sur le foie isolé et perfusé par 31P RMN : selon la dose conjointe d éthanol, effets du RSV sur l énergétique cellulaire et l activité phosphorylante mitochondriale. MATERIEL ET METHODES Protocole in vivo Des rats mâles Wistar nourris ad libitum reçoivent durant huit jours une injection quotidienne intra péritonéale de RSV (Sigma France) (en solution d éthanol au 1/10 dans du tampon physiologique) à 15 (RSV15, n = 11) et 40 mg/kg de poids corporel (RSV40, n = 5), les témoins ne recevant que le diluant (n = 8). Trois heures avant sacrifice (délai nécessaire à l augmentation significative du métabolisme énergétique hépatique (Beauvieux et al., 2008)), une partie des témoins (n = 4) et des RSV15 (n = 5) sont gavés avec une solution aqueuse d éthanol (46 mg EtOH/100 g poids corporel, ~2,5 verres de vin pour 70 kg). Après anesthésie (pentobarbital sodique 50 mg/kg), du sang est prélevé pour dosage du glucose et de l insuline ; les foies sont perfusés in situ selon le protocole décrit cidessous pour éliminer le sang perturbant le signal RMN. Après décapitation, les têtes sont plongées dans l'azote liquide. Les foies excisés sont écrasés dans l azote liquide et conservés à -80 C. Des spectres de RMN du proton en HRMAS sont ensuite réalisés sur des biopsies (25 mg) de foie et de cortex cérébral (Brucker AVANCE500 ; 11,7T, séquence d'écho CPMG éliminant la contribution en T2 des lipides). Protocole ex vivo : cinétique RMN sur le foie isolé et perfusé Des rats mâles Wistar (100 g) nourris à volonté sont anesthésiés au pentobarbital sodique. Le foie est perfusé et isolé (5 ml/min/g) avec un tampon Krebs-Henseleit KHB (37 C, O 2 95 %, CO 2 5 %) contenant glucose (30 mm) et insuline (120 mui/l) mimant les conditions portales post-prandiales. L EtOH est ajouté dans le perfusat (en absence ou en présence de 20 µm RSV) à trois concentrations : 1,4, 14 et 70 mm (n = 4 à 5), similaires aux gammes de concentrations portales associée respectivement à la production intestinale d EtOH, et aux consommations modérées ou élevées d EtOH. Les variations du contenu en ATP sont suivies par RMN du 31P (Brucker DPX400, 9,4T). La propriété non destructrice de la RMN en fait un outil de choix pour l étude cinétique fine et en direct du métabolisme de l organe entier au plus près des conditions physiologiques. Les foies frais 178 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

179 «Foie» contiennent 2,3 ± 0,6 µmol/g d ATP. Ce contenu reflète l équilibre entre les flux de synthèse et de consommation. L ajout d inhibiteurs spécifiques de la synthèse d ATP, glycolytique (iodacétate IAA 0,5 mm) et mitochondriale (KCN 2,5 mm), permet alors le calcul in situ de la vitesse de phosphorylation oxydative («turn-over» : R(t 0 ) = -A.k selon la cinétique ATP = A exp -kt ) (Beauvieux et al., 2008). RESULTATS ET DISCUSSION Effets de l éthanol et du RSV in vivo : insulinorésistance et métabolites hépatiques et cérébraux RSV15 Gavé Témoin Gavé EtOH EtOH Témoin RSV15 RSV40 n ± 5,3 INSULINEMIE (m±e.s.m.) 54 ± 9,2 30 ± 3,0 46 ± 5,7 40 ± 3,4 t-test p < 0,005 p < 0,05 - p < 0,05 p < 0,04 INSULINO- RESISTANCE 1,34 ± 0,15 1,64 ± 0,26 2,32 ± 0,21 1,85 ± 0,15 1,98 ± 0,25 p < 0,004 p < 0,05 - p < 0,05 p < 0,04 MYO - INOSITOL CORTEX 0,25 ± 0,017 0,26 ± 0,027 0,20 ± 0,030 0,22 ± 0,019 0,28 ± 0,026 NS NS - NS p < 0,04 L EtOH ou le RSV réduisent l insulinorésistance [(glycémie/insulinémie) x 10], la conjonction des deux est nettement significative. L'effet du RSV sur l'insuline est controversé : insulino-suppresseur sur des îlots pancréatiques isolés (Szkudelski, 2008), augmentant l'insulinémie 30 min après une prise orale (Chi et al., 2007) ou après une injection intrapéritonéale (Chen et al., 2007) en accord avec nos résultats (tableau ci-dessus). Une tendance à la diminution de glutamate-glutamine hépatique après RSV est observée. Dans le cerveau, l augmentation RSV dose-dépendante du myo-inositol, glucide marqueur des cellules gliales, reste à expliquer et pourrait être associée aux inositol phosphoglycanes (IPG) médiatrices de l action de l'insuline sur les métabolismes glucidique et lipidique (Kawa et al., 2003). Le RSV pourrait trouver un rôle thérapeutique via le métabolisme glucidique dans les pathologies cérébrales accompagnées d insulinorésistance (ex : maladie d'alzheimer, où l altération de l'entrée et de l'utilisation du glucose facilite l'hyperphosphorylation de la protéine tau (Gong et al., 2006)) Effets ex vivo de l éthanol et du RSV sur le métabolisme énergétique hépatique Dans le foie témoin mimant les conditions portales post-prandiales, le contenu d ATP reste stable. L addition d EtOH seul entraîne une chute «dose-dépendante» de l ATP, maximale dès 14 mm EtOH (Figure 1). Cet effet reflète une consommation cellulaire accrue d ATP, consécutive à la compensation partielle de l effondrement du potentiel d oxydo-réduction lié à l oxydation de l EtOH même pour des concentrations modérées (< 10 mm ~alcoolémie après deux verres de vin) (Beauvieux et al., 2004). Le RSV réduit fortement l effet de l EtOH sur le contenu d ATP (t-test vs EtOH, p = 0,04 à 14 mm, p = 0,0001 à 70 mm). Cette action du RSV peut s expliquer par une forte stimulation de la phosphorylation oxydative mitochondriale (Figure 1), réponse efficace à l accroissement de la demande énergétique. Cependant, l observation de l existence d ATP résiduel après inhibition de la phosphorylation oxydative, plaide pour un effet stimulant de la production glycolytique d ATP, la présence de RSV avant l IAA pouvant limiter l action inhibitrice de ce dernier sur la G3PDHase. Cahiers de l Ireb n 19,

180 Chute du contenu ATP (% ATP initial) Ethanol seul Avec RSV 20 µm Vitesse de Renouvellement ATP (µmol/min.g) Ethanol seul Avec RSV 20 µm Concentration Ethanol (mm) Concentration Ethanol (mm) Figure 1 : effets de la concentration en éthanol, avec ou sans resvératrol 20 µm, sur des paramètres hépatiques du métabolisme énergétique étudié par 31P NMR. CONCLUSION L effet insulinosensibilisant d une consommation modérée de vin peut être lié à l éthanol et au RSV (Liu et al., 2008). Sur le plan énergétique, le RSV peut s opposer aux effets de l EtOH dans le foie en maintenant élevé le contenu d ATP via la stimulation de la production mitochondriale. L EtOH inhibant la glycolyse, via l inhibition de l AMPKinase, l action du RSV (activateur de l AMPkinase) sur la production d ATP glycolytique, doit être approfondie. L étude plus fine in vivo des effets conjoints de l EtOH et du RSV sur les métabolites cérébraux et hépatiques impose des durées de traitement supérieures à huit jours en raison de leurs actions biogénétiques probables via la SIRT1 (You et al., 2008). Remerciements : Subvention IREB Références Beauvieux M.C., Couzigou P., Gin H., Canioni P., Gallis J.L. Some processes of energy saving and expenditure occurring during ethanol perfusion in the isolated liver of fed rats; a Nuclear Magnetic Resonance study. BMC Physiol 2004, vol. 1, n 4, p. 3. Beauvieux M.C., Couzigou P., Gin H., Rigalleau V., Gallis J.L. In the simulated postprandial state ethanol prevents insulin-dependent stimulation of mitochondrial turnover: NMR study of isolated and perfused rat liver. Proc Nutr Soc 2008, n 67 (OCE), p. E193. Beauvieux M.C., Tissier P., Couzigou P., Gin H., Canioni P., Gallis J.L. Ethanol perfusion increases the yield of oxidative phosphorylation in isolated liver of fed rats. Biochim Biophys Acta 2002, vol. 1570, n 2, p Chen W.P., Chi T.C., Chuang L.M., Su M.J. Resveratrol enhances insulin secretion by blocking K(ATP) and K(V) channels of beta cells. Eur J Pharmacol 2007, vol. 568, n 1-3, p Chi T.C., Chen W.P., Chi T.L., Kuo T.F., Lee S.S., Cheng J.T., Su M.J. Phosphatidylinositol-3-kinase is involved in the antihyperglycemic effect induced by resveratrol in streptozotocin-induced diabetic rats. Life Sci 2007, vol. 80, n 18, p Desmoulin F., Canioni P., Crotte C., Gérolami C., Cozzone P.J. Hepatic metabolism during acute ethanol administration: a phosphorus-31 nuclear magnetic resonance study on the perfused rat liver under normoxic or hypoxic conditions. Hepatology 1987, vol. 7, n 2, p Diamant M. Brain insulin signalling in the regulation of energy balance and peripheral metabolism. Ideggyogy Sz 2007, vol. 60, n 3-4, p Dunn W., Xu R., Schwimmer B. Modest wine drinking and decreased prevalence of suspected nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2008, vol. 47, n 6, p Feng L., Gao L., Guan Q., Hou X., Wan Q., Wang X., Zhao J. Long-term moderate ethanol consumption restores insulin sensitivity in high-fat-fed rats by increasing SLC2A4 (GLUT4) in the adipose tissue by AMPactivated protein kinase activation. J Endocrinol 2008, vol. 199, n 1, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

181 «Foie» Frémont L. Biological effects of resvératrol. Life Sci 2000, vol. 66, n 8, p Gledhill J.R., Montgomery M.G., Leslie A.G., Walker J.E. Mechanism of inhibition of bovine F1-ATPase by resveratrol and related polyphenols. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2007, vol. 104, n 34, p Gong C.X., Liu F., Grundke-Iqbal I., Iqbal K. Impaired brain glucose metabolism leads to Alzheimer neurofibrillary degeneration through a decrease in tau O-GlcNAcylation. J Alzheimer Dis 2006, vol. 9, n 1, p Kawa J.M., Przybylski R., Taylor C.G. Urinary chiro-inositol and myo-inositol excretion is elevated in the diabetic db/db mouse and streptozotocin diabetic rat. Exp Biol Med (Maywood) 2003, vol. 228, n 8, p Kipp J.L., Ramirez V.D. Effect of estradiol, diethylstilbestrol and resveratrol on F0F1-ATPase activity from mitochondrial preparations of rat heart, liver and brain. Endocrine 2001, vol. 15, n 2, p Koppes L.L.J., Dekker J.M., Hendricks H.F.J., Bouter L.M., Heine R.J. Moderate alcohol consumption lowers the risk of type 2 diabetes. Diabetes Care 2005, vol. 28, n 3, p Liu L., Wang Y., Lam K.S., Xu A. Moderate wine consumption in the prevention of metabolic syndrome and its related medical complications. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 2008, vol. 8, n 2, p Lowell B.B., Shulman G.I. Mitochondrial dysfunction and type 2 diabetes. Science 2005, vol. 307, n 5708, p Pallas M., Verdaguer E., Tajes M., Gutierrez-Cuesta J., Carmins A. Modulation of sirtuins: new targets for antiageing. Rec Pat CNS Drug Discov 2008, vol. 3, n 1, p Szkudelski T. The insulin-suppressive effect of resveratrol - an in vitro and in vivo phenomenon. Life Sci 2008, vol. 82, n 7-8, p Wallace D.C. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging and cancer: a dawn for evolutionary medicine. Annu Rev Genet 2005, vol. 39, p Westphal C.H., Dipp M.A., Guarente L. A therapeutic role for sirtuins in diseases of aging? TRENDS Biochem Sci 2007, vol. 32, n 12, p You M., Liang X., Ajmo J.M., Ness G. Involvement of mamalian sirtuin1 in the action of ethanol in the liver. Am J Physiol Gastronintest Liver Physiol 2008, vol. 294, n 4, p. G892-G898. Zhao L.N., Hao L.P., Yang X.F., Ying C.J., Yu D., Sun X.F. The diabetogenic effects of excessive ethanol: reducing beta-cell mass, decreasing phosphatidylinositol 3-kinase activity and GLUT-4 expression in rats. Br J Nutr 2008, p.1-7. Cahiers de l Ireb n 19,

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183 «Foie» IMPLICATION DES CARACTERISTIQUES MEMBRANAIRES DANS LA TOXICITE (STRESS OXYDANT ET MORT CELLULAIRE) INDUITE PAR L'ETHANOL : INFLUENCE D'UNE SURCHARGE EN ACIDES GRAS FATIHA DJOUDI 1, MARIE-THERESE DIMANCHE-BOITREL 1,2, MARTINE CHEVANNE 1, XAVIER TEKPLI 1,2, MARY RISSEL 1,2, DOMINIQUE LAGADIC-GOSSMANN 1,2 ET ODILE SERGENT 1 1 EA SeRAIC, Université de Rennes 1, UFR des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, 2 avenue Professeur Léon Bernard, Rennes Cedex - France 2 INSERM UMR U620, Université de Rennes 1, Faculté de Médecine, 2 avenue Professeur Léon Bernard, Rennes Cedex - France Summary Previously, we showed that changes in membrane properties, such as their fluidity or microstructure (lipid rafts) alterations, are involved in ethanol-induced oxidative stress in primary rat hepatocyte cultures. As lipids are major components in membranes, we were interested in studiing the effect of an overload of polyunsaturated fatty acids (eicosapentaenoic acid or docosahexaenoic acid) or of saturated fatty acid (stearic acid) before ethanol addition. Pretreatment of hepatocytes with eicosapentaenoic acid led to an increase in ethanol-induced apoptosis and oxidative stress while pretreatment with docosahexaenoic acid or stearic acid protected from ethanol toxicity. Various changes in membrane fluidity and in physical and chemical properties of lipid rafts could explain those opposite effects of fatty acids on ethanol-induced hepatocyte toxicity. Mots clefs Toxicité hépatique de l'éthanol, stress oxydant, fluidité membranaire, radeaux lipidiques, acide gras, hépatocyte de rat en culture primaire INTRODUCTION Le stress oxydant fait partie des nombreux mécanismes de toxicité de l'éthanol dans le foie en relation avec son métabolisme, l'inflammation ou encore l'altération des voies de signalisation. Or, nous avons montré que la modification de certaines caractéristiques membranaires par l'éthanol est impliquée dans le développement du stress oxydant et de la mort cellulaire induite par l'éthanol dans les hépatocytes de rat en culture primaire. Ainsi l'élévation de la fluidité membranaire due au métabolisme de l'éthanol entraîne une cytotoxicité en provoquant une élévation en fer de bas poids moléculaire, un facteur prooxydant (Sergent et al., 2005). En outre, l'agrégation des radeaux lipidiques, microstructures enrichies en cholestérol, sphingolipides et phospholipides à acides gras saturés, participe également à ce stress et ceci en relation avec l'augmentation de la fluidité membranaire (Nourissat et al., 2008). Les radeaux lipidiques, par leur composition lipidique, sont donc des régions membranaires ordonnées à fluidité réduite où se localisent préférentiellement certaines protéines, présentant une forte affinité pour la structure ordonnée et compactée des radeaux. Les lipides étant les constituants majeurs des membranes et la distinction entre les microdomaines étant essentiellement basée sur l'enrichissement en certains lipides, une modification de leur répartition dans les membranes pourrait altérer le niveau de fluidité de celles-ci et la composition physicochimique des radeaux lipidiques. Ainsi, chez le rat, des régimes enrichis en acides gras saturés protègent des dommages hépatiques liés à l'éthanol (Nanji et al., 2001), alors que ceux à base d'acides gras polyinsaturés les favorisent (Nanji et al., 1994). Cependant, à notre connaissance, aucune étude ne s'est intéressée de façon claire au retentissement du remodelage membranaire lié à la surcharge en acides gras sur le stress oxydant et la mort cellulaire Cahiers de l Ireb n 19,

184 induits par l'éthanol. Pourtant, des études, réalisées sur les lymphocytes essentiellement, montrent que l'enrichissement en acides gras polyinsaturés de type n-3 entraîne un profond remaniement lipidique et protéique des radeaux lipidiques (Ma et al., 2004 ; Li, 2006) ce qui peut conduire à une altération de la signalisation cellulaire dépendante des radeaux. Notre objectif est donc d'étudier, dans les hépatocytes de rat en culture primaire, l'effet des acides gras saturés et polyinsaturés à longue chaîne, sur la fluidité membranaire et sur le comportement des radeaux en terme de marqueurs protéiques et lipidiques, et ses conséquences sur le stress oxydant et la mort cellulaire induits par l'éthanol. METHODOLOGIE Hépatocytes de rat en culture primaire Les hépatocytes sont obtenus par dissociation du foie de rat à la libérase (Guguen-Guillouzo et al., 1983) permettant de récupérer 400 à 700 millions d'hépatocytes. Ils sont prétraités par les différents acides gras (200 µm) pendant 18 heures avant l'addition de l'éthanol (50 mm) pendant une ou cinq heures en fonction de l'expérimentation. Les différents acides gras étudiés sont les suivants : l'acide stéarique (SA) (C18:0), l'acide eicosapentaénoique (EPA) (C20:5 n-3) et l'acide docosahexaénoique (DHA) (C22:6 n-3). Nous avons choisi l'epa et le DHA car ces acides gras présentent une forte insaturation et une longue chaîne laissant présager un remaniement membranaire plus important. Fluidité membranaire Les variations de fluidité membranaire sont suivies par résonance paramagnétique électronique (RPE) (Sergent et al., 2005). Une sonde de spin est incorporée dans les membranes à étudier. Il s'agit d'un acide gras, l'acide stéarique, greffé par un nitroxyde, un doxyl (acide doxyl stéarique ou DSA). Le spectre RPE obtenu rend compte de l'état dynamique de la zone de substitution par le nitroxyde. Ainsi, le 12-DSA permet l'examen de la zone hydrophobe de la membrane alors que le 5-DSA permet l'étude de l'environnement des têtes polaires des phospholipides. En fonction de la forme du spectre, est calculé le paramètre d'ordre (S) qui est inversement proportionnel à la fluidité membranaire. Radeaux lipidiques La préparation des radeaux lipidiques est basée sur leur propriété de résistance (Type triton X100) à 4 C et de flottaison sur un gradient de saccharose (Nourissat et al., 2008). Cette technique permet ainsi de séparer les fractions radeaux des fractions solubles (appelées «non radeaux»). A partir de 80 millions d'hépatocytes, onze fractions sont ainsi récupérées et analysées pour déterminer les marqueurs des radeaux (cholestérol, protéines spécifiques résidentes) (Nourissat et al., 2008). Le dosage du cholestérol est effectué par colorimétrie à l'aide d'un kit Randox après extraction des lipides totaux selon la méthode de Folch. Des marqueurs protéiques sont aussi étudiés comme la phosphatase alcaline, protéine à groupement glycosyl phosphatidylinositol et la flotilline, protéine acylée. L'activité de la phosphatase alcaline est évaluée par colorimétrie en utilisant le paranitrophénylphosphate comme substrat et l'expression de la flotilline est suivie par Western-Blot. L'agrégation des radeaux lipidiques est détectée par immunolocalisation grâce à la toxine du choléra couplée au FITC qui reconnaît spécifiquement le ganglioside GM1 présent dans les radeaux lipidiques (Nourissat et al., 2008). Stress oxydant La quantification de la production des espèces activées de l'oxygène est réalisée par spectrofluorimétrie après incorporation d'une sonde, la dihydrofluorescéine diacétate dans les cellules (Sergent et al., 2005). Celle-ci devient fluorescente lorsqu'elle est oxydée par les espèces activées de l'oxygène. La péroxydation lipidique est suivie par le dosage du malondialdéhyde par HPLC-UV et par spectrofluorimétrie grâce à la sonde BODIPY C11 (Nourissat et al., 2008), qui s'incorpore dans les membranes. Cette sonde, sous forme réduite, est déjà fluorescente et son oxydation provoque le glissement du spectre vers les basses longueurs d'onde. 184 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

185 «Foie» Mort cellulaire L'apoptose est estimée par le comptage, au microscope à fluorescence, du nombre de cellules à noyaux condensés et fragmentés suite au marquage des noyaux par le Hoescht RESULTATS ET DISCUSSION Etude de la toxicité Elle a été réalisée par l'évaluation de la mort cellulaire et du stress oxydant. Etude de la mort cellulaire Dans notre modèle, l'éthanol entraîne une mort cellulaire par apoptose via le stress oxydant (Sergent et al., 2005). Le prétraitement par l'epa augmente cette mort cellulaire alors que l'acide stéarique et le DHA présentent un effet protecteur (Figure 1). % noyaux condensés et fragmentés Sans éthanol Avec éthanol - EPA DHA SA Figure 1 : effet du prétraitement par les acides gras sur l'apoptose induite par l'éthanol dans des hépatocytes de rat traités par l'éthanol pendant cinq heures. Les résultats représentent la moyenne de trois expériences indépendantes ± écart-type. Etude du stress oxydant Une approche est réalisée en estimant la production des espèces activées de l'oxygène et la péroxydation lipidique. Le prétraitement par l'epa potentialise la production des espèces activées de l'oxygène induite par l'éthanol (Figure 2A). Il entraîne également une augmentation de la péroxydation lipidique induite par l'éthanol (Figure 2B). Par contre, le SA protège de la formation des espèces activées de l'oxygène induite par l'éthanol (Figure 2A) et le prétraitement par le DHA inhibe la péroxydation lipidique induite par l'éthanol (Figure 2C). Cahiers de l Ireb n 19,

186 A B C Intensité de fluorescence (unités arbitraires/mg protéine) Sans éthanol Avec éthanol MDA (ng/mg protéine) Sans éthanol Avec éthanol Oxydation du BODIPY C11 (fluorescence relative) Sans éthanol Avec éthanol 0 - EPA SA 0 - EPA 0 - DHA Figure 2 : effet du prétraitement par les acides gras sur le stress oxydant induit par l'éthanol dans des hépatocytes de rats traités par l'éthanol pendant une heure (A) ou cinq heures (B et C) : étude de la formation des espèces activées de l'oxygène (A) et de la péroxydation lipidique par le dosage du malondialdéhyde (B) et l'oxydation de la sonde BODIPY (C). Les résultats représentent la moyenne de trois expériences indépendantes ± écart-type sauf en C où n = 2. Approche du mécanisme membranaire Afin d'expliquer la différence de toxicité des acides gras testés, nous nous sommes intéressés à leur effet sur différentes caractéristiques membranaires comme la fluidité et la structure physicochimique des radeaux lipidiques. La fluidité membranaire Comme déjà publié pour la sonde 12-DSA (Sergent et al., 2005), l'éthanol provoque bien une augmentation de la fluidité membranaire. L'EPA entraîne aussi une augmentation de la fluidité membranaire dans les cultures sans éthanol, mais pas d'élévation supplémentaire de la fluidité des membranes des hépatocytes traités par l'éthanol (Figure 3A). En outre, l'epa est capable de fluidifier la région polaire de la membrane (Figure 3B), pourtant connue pour être moins fluide que la région hydrophobe. Ceci est bien observé dans les hépatocytes des cultures témoins où une augmentation de SA est obtenue avec le 5-DSA par rapport au 12-DSA. Le SA est sans effet significatif par rapport aux cultures traitées ou non par l'éthanol. Ces résultats auraient pu nous permettre de conclure que la toxicité apportée par le prétraitement par l'epa provient de sa capacité à fluidifier les membranes, car nous avons montré qu'une augmentation de fluidité participe au développement du stress oxydant (Sergent et al., 2005). En fait, le DHA, qui protège du stress oxydant induit par l'éthanol, a le même effet fluidifiant que l'epa (Figure 3). 186 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

187 «Foie» A B Paramètre d'ordre (S) Sans éthanol Avec éthanol Paramètre d'ordre (S) Sans éthanol Avec éthanol EPA DHA SA EPA DHA SA Figure 3 : effet du prétraitement par les acides gras sur la fluidité membranaire dans des hépatocytes de rat traités par l'éthanol pendant une heure en utilisant le 12-DSA (A) ou le 5-DSA (B) comme spin label. Les résultats représentent la moyenne de trois expériences indépendantes ± écart-type. Les radeaux lipidiques Nous avons d'abord réalisé une étude biochimique afin d'étudier les marqueurs de radeaux lipidiques comme le cholestérol, la phosphatase alcaline et la flotilline-1. L'EPA et le DHA entraînent une augmentation de la concentration en cholestérol dans les radeaux lipidiques issus d'hépatocytes traités ou non par l'éthanol, contrairement au SA qui n'a aucun effet (Figure 4A). Aucun effet significatif n'est observé pour la phosphase alcaline. Par contre, le marqueur protéique, la flotilline-1, semble être exclu des radeaux sous l'influence de l'epa. Aucun changement n'est observé pour le DHA ou l'acide stéarique (Figure 4B). Comme certains marqueurs des radeaux lipidiques semblent être modifiés sous l'influence du prétraitement par l'epa, nous avons également étudié ceux-ci par immunolocalisation de l'un de leur marqueur, le ganglioside GM1. En présence d'éthanol, nous avions déjà observé une ponctuation importante, significative d'une agrégation des radeaux (Nourissat et al., 2008). L'EPA accentue l'agrégation liée à l'éthanol, alors que le DHA et le SA l'inhibent (Figure 4C). Or, nous avons montré que l'agrégation des radeaux lipidiques peut participer au développement du stress oxydant (Nourissat et al., 2008). Au vu de ces résultats, il semble que l'effet toxique de l'epa pourrait s'expliquer par une altération des radeaux accentuant l'agrégation des radeaux lipidiques induite par l'éthanol. Cahiers de l Ireb n 19,

188 Figure 4 : effet du prétraitement par les acides gras sur la structure physicochimique des radeaux lipidiques dans les hépatocytes de rat traités par l'éthanol pendant une heure : concentration en cholestérol (A), expression de la flotilline-1 (B) et agrégation des radeaux lipidiques (C). Trois expériences indépendantes ont été réalisées. CONCLUSION Au total, nous avons montré que l'epa, en modifiant la structure membranaire, et plus particulièrement celle des radeaux lipidiques, augmente la toxicité de l'éthanol alors que le DHA protège de cette toxicité en empêchant l'agrégation des radeaux. L'approche membranaire que nous avons réalisée, demande à être complétée d'un point de vue mécanistique en dosant les acides gras dans les radeaux lipidiques et en utilisant des outils pharmacologiques et/ou une technologie de type sirna. Ainsi, nous espérons mettre en évidence des facteurs de risque, vis-à-vis de la toxicité hépatique de l'alcool, en matière de surcharge lipidique et de composition lipidique des régimes, mais aussi déterminer les lipides protecteurs afin de trouver de nouvelles orientations thérapeutiques prenant en compte des lipides bioactifs. Remerciements : les auteurs souhaitent remercier l'ireb pour son soutien financier. Fatiha Djoudi est bénéficiaire d'une bourse doctorale accordée par la région Bretagne. Références Guguen-Guillouzo C., Clement B., Baffet G., Beaumont C., Morel-Chany E., Glaise D., Guillouzo A. Maintenance and reversibility of active albumin secretion by adult rat hepatocytes co-cultured with another liver epithelial cell type. Exp Cell Res 1983, vol. 143, n 1, p Li Q., Tan L., Wang C., Li N., Xu G., Li J. Polyunsaturated eicosapentaenoic acid changes lipid composition in lipid rafts. Eur J Nutr 2006, vol. 45, n 3, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

189 «Foie» Ma D.W., Seo J., Switzer K.C. n-3 PUFA and membrane microdomains : a new frontier in bioactive lipid research. J Nutr Biochem 2004, vol. 15, n 11, p Nanji A.A., Zhao S., Sadrzadeh S.M., Dannenberg A.J., Tahan S.R., Waxman D.J. Markedly enhance P450 2E1 induction and lipid peroxidation is associated with severe liver injury in fish oil-ethanol-fed rats. Alcohol Clin Exp Res 1994, vol. 18, n 5, p Nanji A.A., Jokelainen K., Tipoe G.L., Rahemtulla A., Dannenberg A.J. Dietary saturated fatty acids reverse inflammatory and fibrotic changes in rat liver despite continued ethanol administration. J Pharmacol Exp Ther 2001, vol. 299, n 3, p Nourissat P., Travert M., Chevanne M., Tekpli X., Rebillard A., Le Moigne-Müller G., Rissel M., Cillard J., Dimanche-Boitrel M.T., Lagadic-Gossmann D., Sergent O. Involvement of lipid rafts in ethanol-induced oxidative stress. Hepatology 2008, vol. 47, n 1, p Sergent O., Pereira M., Belhomme C., Chevanne M., Huc L., Lagadic-Gossmann D. Role for membrane fluidity in ethanol-induced oxidative stress of primary rat hepatocytes. J Pharm Exp Ther 2005, vol. 313, n 1, p Cahiers de l Ireb n 19,

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191 «Foie» EFFET DE L ETHANOL SUR LA PROLIFERATION CELLULAIRE DANS LA LIGNEE D HEPATOME HUMAIN HEPARG : MISE EN EVIDENCE D INTERRELATIONS AVEC LES METABOLISMES DU FER ET DES POLYAMINES THI HONG TUOI DO 1, FRANÇOIS GABORIAU 1, ROMAIN MOIRAND 1,2, CAROLINE LE LAN 1,2, ISABELLE CANNIE 1, LUCIE GOUFFIER 1, PIERRE BRISSOT 1,2 ET GERARD LESCOAT 1 1 Inserm U522, Université de Rennes 1, IFR 140, CHU Pontchaillou, 2 rue Henri Le Guilloux, Rennes - France 2 Service des maladies du foie, CHU Pontchaillou, 2 rue Henri Le Guilloux, Rennes - France Summary The toxicity of ethanol increases the risk of cirrhosis and/or hepatocellular carcinoma development. It has been suggested close interrelationships between ethanol and polyamines and iron metabolisms. Ethanol, like these two metabolisms, modulates cell proliferation. However, the relationship between these metabolisms and cell proliferation is not clearly understood. In this study, the human hepatoma HepaRG model is used to evaluate the effect of ethanol on cell proliferation and to correlate this effect to a modulation of iron and polyamines metabolisms. Ethanol exposure of HepaRG cells during 48 or 72 hours induces a reduction, in a dose- and time-dependent manner, of cellular viability, proteins level and DNA synthesis. This phenomenon is associated with apoptosis and necrosis. The antiproliferative effect of ethanol is intensified by addition of 20 µm iron-citrate or iron-nta. On the contrary, the presence of 50 µm putrescine, one of the polyamines, or its metabolite, gammaaminobutyric acid (GABA), reversed the antiproliferative and apoptotic effects of ethanol. Moreover, ethanol-induced inhibition on cell proliferation is accompanied by a modulation in expression of iron and polyamines metabolism markers which is also partially or completely inhibited by putrescine or GABA. In conclusion, our results show that ethanol effects are closely related to iron and polyamines metabolisms. Moreover, putrescine and GABA could protect against the toxicity of ethanol. Mots clefs: Ethanol, fer, polyamine, cellules hépatiques, proliferation cellulaire INTRODUCTION L éthanol, comme le fer et les polyamines, module la prolifération cellulaire, notamment celle des hépatocytes. Il diminue la viabilité cellulaire, la synthèse d ADN, de protéines et le nombre des cellules répondant au facteur de croissance hépatique HGF (Choi et al., 1999 ; Norikura et al., 2007). Il induit aussi l'apoptose et la nécrose par une augmentation de l activité de la caspase 3 et la libération de lactate déshydrogénase (LDH) (Castilla et al., 2004). Le fer est impliqué dans la synthèse d ADN et une déplétion en fer entraîne un arrêt des cellules en phase G1/S (Lescoat et al., 2007). Cependant, l excès en fer provoque un stress oxydatif aboutissant à l apoptose ou la nécrose et aux pathologies hépatiques (Huang et al., 2002). Les polyamines sont essentielles pour la division cellulaire. Leur déplétion inhibe les croissances cellulaires normale et tumorale. La concentration élevée des polyamines par activation de l ornithine décarboxylase (ODC) est associée aux transitions G1- S et G2- M du cycle cellulaire (Catros-Quemener et al., 1999). La toxicité de l éthanol peut être liée au métabolisme du fer et des polyamines. L éthanol augmente le taux de fer sérique, de fer labile intracellulaire de bas poids moléculaire ainsi que l expression de la ferritine et des transporteurs du fer tels que DMT1 et ferroportine (Moirand et al., 1990 ; Sergent et al., 1997 ; Harrison-Findik et al., 2006). Chez les alcooliques, on a observé une modulation de Cahiers de l Ireb n 19,

192 l activité de la céruloplasmine (CP) et une surexpression du récepteur de la transferrine (RTf1) associée à une accumulation de fer hépatique (Suzuki et al., 2002 ; Le Lan et al., 2004). En revanche, le fer catalyse la synthèse d espèces radicalaires induite par l éthanol via la réaction de Fenton et potentialise donc la toxicité de l éthanol. Des surcharges en fer hépatique sont observées lors des cirrhoses alcooliques et représentent un facteur de risque de survenue d un cancer du foie (Turlin et al., 1995). L éthanol réduit l expression de l ODC et inhibe la synthèse des polyamines. L ajout de putrescine ou son métabolite, l acide gamma-aminobutyrique (GABA) limite l effet antiprolifératif de l éthanol (Norikura et al., 2007). Il existe aussi un lien fort entre le métabolisme du fer et celui des polyamines. En effet, les polyamines pourraient moduler les flux cellulaires du fer dans la mesure où leur système de transport pourrait constituer une voie d entrée du fer dans les cellules (Gaboriau et al., 2004). Par ailleurs, la déplétion en fer par les chélateurs du fer modifie le métabolisme des polyamines, via l inhibition de l ODC et de la spermidine/spermine N-acetyltransferase -SSAT- (Lescoat et al., 2007). Le but de la présente étude est tout d abord de rechercher un effet de l éthanol sur la prolifération cellulaire dans la lignée d hépatome humain HepaRG, puis ensuite de corréler cet effet à une modulation du métabolisme du fer et des polyamines. MATERIEL ET METHODES Lignée d hépatome humain HepaRG La lignée HepaRG est issue d'un carcinome hépatocellulaire. C est une lignée humaine bipotente qui évolue d une phase proliférative vers un stade différencié au cours duquel apparaissent deux types cellulaires, l un hépatocytaire et l autre épithélioïde biliaire. La différenciation est maximale au 21 ème jour de culture et peut être potentialisée par addition de 1 à 2 % de DMSO au milieu de culture (Gripon et al., 2002). Les hépatocytes expriment des fonctions hautement différenciées proches de celles d un hépatocyte normal. Grâce à une approche transcriptionnelle, nous avons montré que cette lignée est capable de stocker le fer dans les hépatocytes différenciés (Troadec et al., 2006). Exprimant aussi les enzymes du métabolisme de l éthanol (alcool déshydrogénase, aldéhyde déshydrogénase et cytochrome P4502E1-CYP2E1) et des polyamines (ODC, spermidine/spermine N1-acétyltransférase, polyamine oxydase, S-adenosylméthionine décarboxylase), ce modèle nous a permis d évaluer l effet de l éthanol sur le métabolisme du fer et des polyamines en phases proliférative/différenciée. Traitement des cultures cellulaires Les cellules HepaRG sont ensemencées à J0 dans les plaques de culture en utilisant le milieu de Williams E supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal, de pénicilline-streptomycine 5000 µg/ml, d'insuline bovine 5 µl/ml et d hydrocortisone 5,10-5 M. Les cultures sont incubées à 37 C, 5 % CO 2 et traitées au cours de la phase proliférative, à partir du jour J1, par l éthanol seul ou en présence des composés à tester. Le traitement est renouvelé toutes les 24 heures. Mesure de la viabilité cellulaire L activité oxydative mitochondriale (succinate déshydrogénase mitochondriale - SDH), un marqueur des cellules viables, est détectée après quatre heures d incubation des cellules dans le milieu de culture contenant 0,25 mg/ml de MTT (3-(4,5-diméthyl-thiazol-2-yl) 2,5-diphényl tétrazodium bromide) à 37 C, 5 % CO 2. Les cristaux de formazan formés sont solubilisés par le DMSO en donnant une solution de couleur rouge-violet détectable par spectrophotométrie à une longueur d onde de 535 nm. Mesure de la synthèse d ADN Après 24 heures d incubation dans le milieu de culture en présence de 0,5 µci/ml ( mm) de thymidine tritiée, les cellules sont lavées et lysées par sonication (30 secondes) dans 1 ml de PBS. La radioactivité du lysat cellulaire dans le liquide scintillant est mesurée au moyen d un compteur à 192 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

193 «Foie» scintillation β. La thymidine incorporée est exprimée en cpm/µg de protéines dosées selon la méthode de Bradford avec le réactif Bio-Rad. Analyse de la cytotoxicité La cytotoxicité est évaluée par le rapport LDH extracellulaire/ldh totale en utilisant le kit «Cytotoxicity detection (LDH)» (Roche). L'activité LDH extra ou intra-cellulaire est déterminée par la lecture de DO à 485 nm. Une gamme préparée à partir de la référence de LDH (0 à 4000 mu/ml) est utilisée pour la quantification de l activité LDH. Mesure de l activité caspase 3/7 Le kit «AMC caspase-3/7 assay» (AnaSpec) est utilisé afin d évaluer l apoptose. Les cellules sont placées sur de la glace, lavées au PBS, puis receuillies dans le tampon de lyse. Après six heures d incubation avec 50 µl du substrat des caspases (Ac-DEVD-AMC), l'activité caspase 3/7 des 150 µl d extrait est mesurée par la lecture de fluorescence à 440/460 nm et exprimée en RFU/µg de protéines. Etude de l expression des ARNm L ARN total est extrait en utilisant le kit «SV total RNA isolation systems» (Promega). Un µg de l'arnm total est rétro-transcrit en utilisant l enzyme Moloney Murine Leukemia Virus - MMLV (Promega) en présence d amorces aléatoires (Promega). Les PCR quantitatives en temps réel sont réalisées, en triplicats sur le «7000 Sequence Detection System» (Applied Biosystems), en utilisant le kit «qpcr MasterMix Plus for SYBR Green Iz» et des amorces spécifiques d ARNm humains (Eurogentec). Les résultats sont normalisés en tenant compte de l expression de 18S et exprimés en pourcentage par rapport aux cultures témoins (100 %). Test statistique Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type et analysés par le test statistique non paramétrique de Mann-Whitney. Le seuil de significativité est fixé à p < 0,05. Les caractères *, ** et *** sur les histogrammes représentent successivement p < 0,05, p < 0,01 et p < 0,001. RESULTATS ET DISCUSSION Effet de l éthanol sur la prolifération des cellules HepaRG Nous avons trouvé que l éthanol diminue d une manière dose- et temps-dépendante la viabilité cellulaire après 48 ou 72 heures d'exposition aux concentrations testées (Figure 1A). La baisse maximale de 45 à 55 % de l activité SDH est obtenue avec la concentration 300 mm. Mais, dans la mesure où la concentration de l éthanol sanguin chez les alcooliques excessifs est de 100 à 200 mm (Henzel et al., 2004), nous avons choisi ces deux concentrations pour les autres expériences. L éthanol réduit aussi la teneur totale en protéines et l incorporation de thymidine de la même façon que la viabilité cellulaire (Figure 1B et 1C). Ces résultats sont en accord avec d autres travaux montrant que l éthanol diminue la prolifération des cultures d ostéoblastes (Vignesh et al., 2006) et d hépatocytes. Nous avons précisé aussi les mécanismes par lesquels l éthanol induit une baisse du nombre de cellules viables. Dans nos conditions, l accroissement du rapport LDH extracellulaire/ldh totale témoigne d une cytotoxicité de l éthanol. En outre, une augmentation significative de l activité caspase 3/7 est également observée, surtout à la concentration 200 mm (+140 % et +208 % respectivement pour 48 et 72 heures, Figure 1D). Ces observations sont en accord avec l étude de Robin et al. selon laquelle l éthanol produit des radicaux libres par activation du cytochrome P450 2E1 ou par dysfonctionnement mitochondrial. Ceci augmente donc la susceptibilité des cellules aux signaux d apoptose ou de nécrose (Robin et al., 2005). Cahiers de l Ireb n 19,

194 Viabilité cellulaire (%) * ** ** ** ** ** ** ** ** 24h 48h 72h Incorporation de thymidine (%) ** ** ** ** ** ** 24h 48h 72h Protéines totales (%) * 80 ** ** 60 ** h 48h 72h Control Et 50 mm Et 100 mm Et 200 mm Et 300 mm % par rapport aux témoins ** ** ** ** ** ** ** ** 48h 72h 48h 72h Activité caspase 3/7 LDH extra/ldh totale Figure 1 : effet de l éthanol sur la prolifération des cellules HepaRG : une diminution de la viabilité cellulaire (A), de la teneur en protéines totales (B), de la réplication d ADN (C) et une augmentation de l activité caspase 3/7 et du rapport LDH extra/ldh totale (D). Les résultats sont exprimés en % par rapport aux témoins. Relation entre l éthanol et le fer Nous avons réalisé deux études : l influence du fer-citrate ou du fer-nta, des formes de fer non lié à la transferrine, sur l effet antiprolifératif de l éthanol et l impact de l'éthanol sur l expression de gènes du métabolisme du fer dont la ferritine, la transferrine, le récepteur de la transferrine 1 (RTf1), le Divalent Metal Transporter 1 (DMT1) et la céruloplasmine (CP). Augmentation de l effet antiprolifératif de l éthanol par le fer-citrate ou le fer-nta Dans les cellules HepaRG exposées à l éthanol pendant 48 ou 72 heures, la réduction de la viabilité cellulaire est potenlisée par l addition du fer-citrate ou du fer-nta 20 µm (Figure 2A). Au niveau des protéines totales et de l incorporation de thymidine, la potentialisation de la toxicité de l éthanol par le fer est plus forte à 72 qu à 48 heures de traitement (Figure 2B et 2C). L intensification de l effet antiprolifératif de l éthanol par le fer-citrate ou le fer-nta est confirmée par un accroissement du rapport LDH extracellulaire/ldh totale (Figure 2D). En général, peu de différences sont observées entre le fer-citrate et le fer-nta. Cependant, en présence de fer-citrate, l effet apparaît plus tôt (48 au lieu de 72 heures). De plus, comme le fer-citrate est une forme de fer non lié à la transferrine qui apparaît au cours des situations de surcharge en fer (Grootveld et al., 1989), nous avons choisi de traiter les cellules pendant 72 heures avec cette forme de fer pour les expériences concernant l effet de l éthanol sur l expression des gènes du métabolisme du fer. Effet de l éthanol sur l expression des gènes du métabolisme du fer L expression de la L-ferritine et de la transferrine est augmentée par l éthanol 100 mm (+63 et 84 % respectivement) et cet effet n est pas modifié par le fer-citrate (Figure 3). Les niveaux d ARNm du RTf1 et de la CP ne sont pas modifiés par le fer-citrate 20 µm seul, mais sont augmentés par l éthanol et diminués par l éthanol plus le fer-citrate (Figure 3). Ces résultats sont en accord avec les études réalisées in vitro et in vivo selon lesquelles l éthanol augmente l expression du RTf1 et de la ferritine 194 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

195 «Foie» (Suzuki et al., 2002, Suzuki et al., 2004). L augmentation de la CP confirme les observations chez les cirrhotiques alcooliques (Le Lan et al., 2004). L expression du DMT1 est augmentée par le fer-citrate mais n est pas modifiée significativement par l éthanol seul ou en présence de fer-citrate. Viabilité cellulaire (%) Protéines totales (%) A B ** * * 48h ** ** ** * * * Témoin FeC 20 µm FeNTA 20 µm Et 100 mm Et 100mM+FeC 20µM Et 100mM+FeNTA 20µM Et 200 mm Et 200mM+FeC 20µM Et 200mM+FeNTA 20µM 72h ** * * Incorporation de thymidine (%) extra/ldh total (%) LDH extra/ldh C D * * * * 48h * * ** 72h * * * * * 0 48h 72h 0 48h 72h Figure 2 : effet antiprolifératif de 100 et 200 mm d éthanol en présence du fer-citrate ou de fer-nta (20 µm) Fe Citrate 20 µm Ethanol 100 mm Et FeC 20 µm L-ferritine Transferrine RTf1 DMT1 CP Figure 3 : effets de l éthanol sur l expression des gènes du métabolisme du fer dans les cellules HepaRG prolifératives. L expression des gènes dans les cultures traitées est rapportée à celle des témoins (fixée arbitrairement à 100 %). Les écarts-types représentent les variations de deux expériences différentes. Relation entre l éthanol et les polyamines Nous avons étudié l influence de la putrescine et du GABA sur l effet antiprolifératif de l éthanol et l impact de l éthanol sur l expression des gènes du métabolisme des polyamines dont la polyamine oxydase (PAO), l ornithine décarboxylase (ODC) et la spermidine synthase (SPDS). Cahiers de l Ireb n 19,

196 Réversion de l'effet antiprolifératif de l'éthanol par la putrescine ou le GABA Après 48 heures de traitement, nous avons observé une augmentation significative de la viabilité cellulaire, des protéines totales et de la synthèse d ADN en présence de l'éthanol 100 ou 200 mm plus la putrescine ou le GABA 50 µm par rapport à l éthanol seul (Figure 4A, B, C). L'adjonction de ces deux molécules induit également un effet protecteur contre l'apoptose et la nécrose des cellules induites par l'éthanol. L'activité caspase 3 induite par 200 mm d éthanol baisse de 12 à 22 % en présence de la putrescine ou du GABA. Les résultats montrent aussi une baisse du rapport LDH extracellulaire/ldh totale des cellules exposées à l éthanol par ces deux agents exogènes (Figure 4D). Concernant les cultures traitées par 100 mm d'éthanol, la réversion de l effet antiprolifératif ou apoptotique et de la cytotoxicité par la putrescine ou le GABA 50 µm est beaucoup plus élevée, voire presque totale (Figure 4). Viabilité cellulaire (%) Protéines totales (%) A 0 B * ** ** * * * 48 h 48 hour ** * 48 h 48 hour Témoin Putrescine 50 µm GABA 50 µm Et 100 mm Et 100mM+Put 50µM Et 100mM+GABA 50µM Et 200 mm Et 200mM+Put 50µM Et 200mM+GABA 50µM ** ** Incorporation de thymidine (%) % par % of rapport control aux C D ** ** ** ** ** * * * * 48 h 48 hour * * * * * * Activité Caspase 3/7 caspaseldh activity LDHe/LDHt extra/ ratio LDH Figure 4 : réversion de l'effet antiprolifératif de l'éthanol sur les cellules HepaRG par la putrescine ou le GABA 50 µm. Effet de l'éthanol sur l'expression des gènes du métabolisme des polyamines L exposition des cellules HepaRG à l éthanol 100 mm pendant 72 heures diminue de 18 % l expression de l ODC. Il est intéressant de noter qu en rajoutant 50 µm de putrescine, l expression de ce gène est totalement réversée, presque égale à celle du témoin (une augmentation de 22 % par rapport à l éthanol seul). Cependant, le GABA 50 µm ne change pas l effet de l éthanol sur l expression de l ODC. En parallèle, l éthanol augmente les niveaux d ARNm de la PAO (+45 %) et de la SPDS (+57 %). La putrescine réverse partiellement l augmentation de l expression de ces deux gènes. Le GABA annule complètement l effet de l éthanol seulement sur l expression de la SPDS (Figure 5). Des travaux antérieurs (Ray et al., 2001) montrent que la déplétion en polyamines induit une augmentation des taux de p53 et p21 CIP1, ce qui aboutit à la fois à l activation de l apoptose et au blocage des cellules en phase G1. Nos résultats montrent que l éthanol ralentit la prolifération cellulaire en déplétant le métabolisme des polyamines par inhibition de l ODC et stimulation de la 196 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

197 «Foie» PAO et de la SPDS. Cette hypothèse est confortée par la réversion de l effet de l éthanol sur la prolifération et sur l expression des gènes du métabolisme des polyamines des cellules HepaRG en présence de la putrescine. Ainsi, nos résultats : montrent que l altération des activités ODC, PAO et SPDS sont en partie responsables de l effet antiprolifératif de l éthanol, permettent d établir l existence d une relation entre le métabolisme de l éthanol et celui des polyamines Put 50 µm GABA 50 µm Ethanol 100 mm Et Put 50 µm Et GABA 50 µm PAO ODC SPDS Figure 5 : effet de l éthanol sur l expression des gènes du métabolisme des polyamines dans les cellules HepaRG prolifératives. L expression des gènes dans les cultures traitées est rapportée à celle des cultures témoins (fixée arbitrairement à 100 %). Les écarts-types représentent les variations des 2 expériences différentes. CONCLUSION Cette étude nous a permis de démontrer que l éthanol exerce un effet antiprolifératif dans les cellules HepaRG d une manière dose- et temps-dépendante par une diminution de la viabilité cellulaire, de la synthèse d ADN et des protéines totales des cultures cellulaires. Ce phénomène s accompagne d une apoptose mais aussi d une nécrose. L effet de l éthanol est associé à une modulation de l expression de marqueurs des métabolismes du fer (surexpression de la ferritine, de la Tf, du RTf1 et de la CP) et des polyamines (diminution de l expression d ODC, surexpression de la PAO et de la SPDS). La putrescine et le GABA réversent l effet de l éthanol sur la prolifération hépatocytaire et sur l expression des gènes du métabolisme des polyamines. Ces résultats mettent en évidence l existence d une forte relation entre l effet de l éthanol et les métabolismes du fer et des polyamines et suggèrent que la putrescine et le GABA pourraient protéger de la toxicité de l éthanol. Références Castilla R., Gonzalez R., Fouad D., Fraga E., Muntane J. Dual effect of ethanol on cell death in primary culture of human and rat hepatocytes. Alcohol Alcohol 2004, vol. 39, n 4, p Castros-Quemener V., Chamaillard L., Bouet F. Les polyamines : rôle diagnostique et cible thérapeutique en cancérologie. Médecine/science 1999, vol. 15, n 10, p Choi S.W., Stickel F., Baik H.W., Kim Y.I., Seitz H.K., Mason J.B. Chronic alcohol consumption induces genomic but not p53-specific DNA hypomethylation in rat colon. J Nutr 1999, vol. 129, n 11, p Gaboriau F., Kreder A., Clavreul N., Moulinoux J., Delcros J., Lescoat G. Polyamine modulation of iron uptake in CHO cells. Biochem Pharmacol 2004, vol. 67, n 9, p Gripon P., Rumin S., Urban S., Le Seyec J., Glaise D., Cannie I., Guyomard C., Lucas J., Trepo C., Guguen- Guillouzo C. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc Natl Acad Sci USA 2002, vol. 99, n 24, p Grootveld M., Bell J.D., Halliwell B., Aruoma O.I., Bomford A., Sadler P.J. Non-transferrin-bound iron in plasma or serum from patients with idiopathic hemochromatosis. Characterization by high performance liquid chromatography and nuclear magnetic resonance spectroscopy. J Biol Chem 1989, vol. 264, n 8, p Harrison-Findik D.D., Schafer D., Klein E., Timchenko N.A., Kulaksiz H., Clemens D., Fein E., Andriopoulos B., Pantopoulos K., Gollan J. Alcohol metabolism-mediated oxidative stress down-regulates Cahiers de l Ireb n 19,

198 hepcidin transcription and leads to increased duodenal iron transporter expression. J Biol Chem 2006, vol. 281, n 32, p Henzel K., Thorborg C., Hofmann M., Zimmer G., Leuschner U. Toxicity of ethanol and acetaldehyde in hepatocytes treated with ursodeoxycholic or tauroursodeoxycholic acid. Biochim Biophys Acta 2004, vol. 1644, n 1, p Huang X., Dai J., Fournier J., Ali A.M., Zhang Q., Frenkel K. Ferrous ion autoxidation and its chelation in iron-loaded human liver HepG2 cells. Free Radic Biol Med 2002, vol. 32, n 1, p Le Lan C., Ropert M., Laine F., Medevielle M., Jard C., Pouchard M., Le Treut A., Moirand R., Loreal O., Brissot P. Serum ceruloplasmin and ferroxidase activity are not decreased in hepatic failure related to alcoholic cirrhosis: clinical and pathophysiological implications. Alcohol Clin Exp Res 2004, vol. 28, n 5, p Lescoat G., Chantrel-Groussard K., Pasdeloup N., Nick H., Brissot P., Gaboriau F. Antiproliferative and apoptotic effects in rat and human hepatoma cell cultures of the orally active iron chelator ICL670 compared to CP20: a possible relationship with polyamine metabolism. Cell prolif 2007, vol. 40, n 5, p Moirand R., Lescoat G., Hubert N., Dezier J.F., Pasdeloup N., Brissot P. Alcohol induction of ferrtin expression in a human hepatoblastoma cell line (HepG2). Alcohol Clin Exp Res 1990, vol. 14, n 6, p Norikura T., Kojima-Yuasa A., Opare Kennedy D., Matsui-Yuasa I. Protective effect of gammaaminobutyric acid (GABA) against cytotoxicity of ethanol in isolated rat hepatocytes involves modulations in cellular polyamine levels. Amino Acids 2007, vol. 32, n 3, p Ray R.M., Mccormack S.A., Johnson L.R. Polyamine depletion arrests growth of IEC-6 and Caco-2 cells by different mechanisms. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2001, vol. 281, n 1, p. G37-G43. Robin M.A., Demeilliers C., Sutton A., Paradis V., Maisonneuve C., Dubois S., Poirel O., Letteron P., Pessayre D., Fromenty B. Alcohol increases tumor necrosis factor alpha and decreases nuclear factor-kappab to activate hepatic apoptosis in genetically obese mice. Hepatology 2005, vol. 42, n 6, p Sergent O., Anger J.P., Lescoat G., Pasdeloup N., Cillard P., Cillard J. EPR determination of low molecular weight iron content applied to whole rat hepatocytes. Cell Mol Biol 1997, vol. 43, n 5, p Suzuki M., Fujimoto Y., Suzuki Y., Hosoki Y., Saito H., Nakayama K., Ohtake T., Kohgo Y. Induction of transferrin receptor by ethanol in rat primary hepatocyte culture. Alcohol Clin Exp Res 2004, vol. 28, n 8 Suppl., p. 98S-105S. Suzuki Y., Saito H., Suzuki M. Up-regulation of transferrin receptor expression in hepatocytes by habitual alcohol drinking is implicated in hepatic iron overload in alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res 2002, vol. 26, n 8 Suppl., p. 26S-31S. Troadec M.B., Glaise D., Lamirault G., Le Cunff M., Guerin E., Le Meur N., Detivaud L., Zindy P., Leroyer P., Guisle I., Duval H., Gripon P., Theret N., Boudjema K., Guguen-Guillouzo C., Brissot P., Leger J., Loreal O. Hepatocyte iron loading capacity is associated to differenciation and repression of motility in the HepaRG cell line. Genomics 2006, vol. 87, n 1, p Turlin B., Juguet F., Moirand R., Le Quilleuc D., Loreal O., Campion J.P., Launois B., Ramée M.P., Brissot P., Deugnier Y. Increased liver iron stores in patients with hepatocellular carcinoma developed on a noncirrhotic liver. Hepatology 1995, vol. 22, n 2, p Vignesh R.C., Djody S.S., Jayasudha E., Gopalakrishnan V., Ilangovan R., Balaganesh M., Veni S., Sridhar M., Srinivasan N. Effect of ethanol on human osteosarcoma cell proliferation, differentiation and mineralization. Toxicology 2006, vol. 220, n 1, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

199 «Foie» LE CYP2E1 ET L ALCOOL INDUISENT ATF4, UN FACTEUR DE TRANSCRIPTION CENTRAL DE LA REPONSE AUX STRESS DANS LES CELLULES HEPATOCYTAIRES ETIENNE BLANC, BEATRICE LEGRAND, HELENE ROUACH ET MICHELE GARLATTI INSERM U747, Laboratoire de Pharmacologie, Toxicologie et Signalisation Cellulaire, Université René Descartes Paris V, 45, rue des Saints-Pères, Paris Cedex 06 - France Summary Rationale: excessive alcohol consumption generally leads to alcoholic liver disease (ALD). The mechanisms underlying alcohol-induced tissue injury are very complex and still not fully understood, they include cell-cycle arrest and apoptosis of hepatocytes, extensive extracellular matrix deposition and activation of proinflammatory cytokines. Alcohol toxicity has been shown to be largely mediated by its oxidative metabolism. Cytochrome P4502E1 (CYP2E1) contributes to oxidative metabolism of ethanol and is induced 5 to 10 times upon ethanol exposure. Our project aims to dissect the signaling pathways involved in alcoholic cellular injury. Results: we showed that ethanol metabolized by CYP2E1 induce the integrated stress response (ISR) in hepatocytes. The ISR is a pathway shared by various stress signals which promotes both a prosurvival and a pro-apoptotic program. ATF4 is the master transcription factor of the ISR. We showed that ethanol metabolized by CYP2E1 induces ATF4 and several pro-apoptotic targets genes of the ISR: ATF3, GADD34 and CHOP. This response is associated with a decrease in cell viability by 20% and a 16% increase in apoptosis. These results suggest that the pro-apoptotic target genes of the ISR may play an important role in hepatocyte apoptosis observed during ALD. Project: the ISR is shared by other stressors such as hepatitis C virus infection which act on synergy with alcohol to develop liver diseases. During the following year, we will delineate the contribution of the integrated stress response and oxidative stress in the interaction and synergy between alcohol and HCV in the pathogenesis of liver disease. Mots clés Alcool, foie, stress cellulaire, apoptose INTRODUCTION Contexte général et objectifs La consommation chronique et excessive d alcool est à l origine de pathologies hépatiques importantes qui peuvent aller jusqu à entraîner la mort de l individu (environ décès par cirrhose alcoolique ont été recensés en France en 1998 selon une expertise INSERM). Le foie assure en temps normal trois fonctions vitales : épuration, synthèse et stockage ; des fonctions essentiellement remplies par les hépatocytes qui représentent plus de 80 % de la masse cellulaire de l organe. Les autres types cellulaires sont : les cellules de Küppfer (macrophages du foie), les cellules étoilées, les cellules endothéliales et les cellules des canaux biliaires. Dans le foie, l alcool subit un métabolisme oxydatif qui implique diverses enzymes et notamment l alcool déshydrogénase, le cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) et l acétaldéhyde déshydrogénase. Il produit de l acétaldéhyde et un stress oxydant qui endommagent les cellules hépatiques (Zakhari, 2006). Mais l alcool peut subir également un métabolisme non oxydatif et donner des composés toxiques ou agir sans être métabolisé (en modifiant la fluidité membranaire, l osmolarité...) (Magne et al., 2007). Cahiers de l Ireb n 19,

200 Le diagnostic des maladies alcooliques du foie (MAFs) est difficile et souvent tardif, car ces maladies restent longtemps asymptomatiques (Walsh et Alexander, 2000). Elles comportent trois types d atteintes : la stéatose correspond à l accumulation, à un degré varié, de triglycérides dans les hépatocytes ; l hépatite alcoolique aiguë correspond à une association d apoptose hépatocytaire, d inflammation à polynucléaires et de fibrose ; le troisième stade, la cirrhose alcoolique, est une maladie chronique et irréversible qui se caractérise par une atteinte des hépatocytes et l apparition de nodules de régénération délimités par de la fibrose. La cirrhose entraîne une perte de fonctionnalité du foie qui peut avoir des répercussions sur d autres organes, comme le cerveau avec l apparition d encéphalopathies ; enfin, un hépatocarcinome (HCC) peut se développer ; il s'agit d'une prolifération cancéreuse d'origine hépatocytaire dont le pronostic est très mauvais. Sur une population de buveurs excessifs, 80 % développeront une stéatose, 10 à 35 % une hépatite alcoolique, 10 % une cirrhose et 1 à 2 % développeront un HCC. Des avancées très importantes ont été faites sur la compréhension des mécanismes moléculaires responsables du développement des MAFs ; ils impliquent en partie des modifications du métabolisme lipidique, des processus inflammatoires, l apoptose des hépatocytes et l apparition d une fibrose. Cependant de nombreuses inconnues persistent quant au mode d action cellulaire de l alcool et les moyens thérapeutiques restent très limités. Notre objectif est de caractériser les voies de signalisation intracellulaire empruntées par l alcool pour mieux comprendre la toxicité de ce composé et envisager de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous étudions en particulier l impact de l alcool et de son métabolisme oxydatif par le cytochrome P450 2E1 sur les voies de stress intracellulaires dans les hépatocytes. L alcool induit la réponse intégrée aux stress (RIS) dans les hépatocytes humains D une façon générale, les réponses développées en cas de stress cellulaire stimulent deux programmes divergents : un programme d adaptation qui permet la survie de la cellule et un programme de mort qui conduit à la destruction de la cellule si le stress est chronique ou trop sévère. Nous avons tout d abord testé l effet de l alcool sur les voies de réponses aux stress dans des cultures primaires d hépatocytes humains qui réalisent le métabolisme oxydatif de l alcool. Nous avons montré que l éthanol active une voie de signalisation commune à plusieurs stress cellulaires et conduit à «la réponse intégrée aux stress» (RIS) dans les hépatocytes humains en culture primaire. La réponse intégrée aux stress appelée aussi «réponse commune aux stress» est activée par des stress aussi variés que la déplétion en hème, l hypoxie, la déplétion en acides aminés, l infection virale ou le stress du réticulum endoplasmique (Figure 1) (Wek et al., 2006). Ainsi, l éthanol induit des gènes importants pour l adaptation des cellules hépatiques aux conséquences métaboliques des stress : insulin-like growth factor binding protein-1, IGFBP-1 (Marchand et al., 2006), asparagine synthétase, AsnS. Mais l éthanol active également le programme de mort cellulaire puisque les gènes proapoptotiques : growth arrest and DNA damage 34 gene, GADD34, GADD153/CHOP et ATF3 sont aussi induits par l éthanol dans les hépatocytes humains. 200 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

201 «Foie» Signaux de stress : stress du réticulum endoplasmique infection virale (VHC) stress nutritionnel déficience en hème kinases elf-2 α elf-2 α -P GADD34 phosphatase 1 ATF4 Activation de la transcription des gènes cibles Réponse de survie cellulaire : Réponse pro-apoptique : - AsnS (métabolisme) - CHOP - IGFBP-1 (croissance, métabolisme, survie) - ATF3 - GADD34 (déphosphorylation elf2α) - GADD34 - HO-1, GCLC (anti-oxydante) Figure 1 : la réponse intégrée aux stress (RIS). MORT CELLULAIRE/SURVIE L alcool induit la réponse intégrée aux stress et le facteur de transcription central de la réponse aux stress, ATF4 dans la lignée hépatocytaire humaine HepG2 exprimant le CYP2E1 Le CYP2E1 participe au métabolisme oxydatif de l alcool et a la particularité d être augmenté de 5 à 10 fois dans les hépatocytes lors de l alcoolisation. Nous avons émis l hypothèse que l induction du CYP2E1 pouvait créer les conditions d un stress et donc participer à l induction de la réponse RIS observée dans les hépatocytes humains. Pour tester notre hypothèse, nous avons exprimé le CYP2E1 par un adénovirus recombinant dans les cellules HepG2. Nous avons montré que le CYP2E1, en métabolisant l alcool induit l ensemble de la réponse intégrée aux stress. Le programme transcriptionnel permettant l adaptation et la mort cellulaire est déclenché : les gènes de survie (AsnS, IGFBP-1, GADD34, HO-1 et GCLC, réponse anti-oxydante) et les gènes proapoptotiques (CHOP, ATF3, GADD34) sont induits. Nous avons aussi caractérisé partiellement la voie de transduction du signal permettant la régulation des gènes de la réponse RIS. En effet, nous avons montré que le CYP2E1 et l alcool augmentent le facteur transcriptionnel central de la réponse commune aux stress, ATF4 (les expériences de western blot révèlent une augmentation d environ trois fois des niveaux protéiques d ATF4 par le Cahiers de l Ireb n 19,

202 CYP2E1 et l alcool). L utilisation d un anti-oxydant, le glutathion ethyl ester a montré l implication du stress oxydant dans l induction d ATF4 et des gènes de la réponse RIS par le CYP2E1 et l alcool. ATF4 joue un rôle crucial dans la réponse des cellules exposées aux stress, dans les cancers et la résorption de l os (Ameri et Harris, 2008 ; Harding et al., 2003). ATF4 peut former des homodimères ou hétérodimères avec les facteurs Fos, C/EBP, Jun ; les nombreux partenaires de dimérisation ou d interaction déterminent les diverses fonctions d ATF4. L expression du facteur ATF4 a la particularité d être régulée à différents niveaux selon les situations (Ameri et Harris, 2008). La régulation la mieux caractérisée d ATF4 se situe au niveau traductionnel. En effet, la phosphorylation du facteur d initiation de la traduction eif2α par des kinases sensibles aux stress permet la traduction de l ARN messager codant pour la protéine ATF4. Il existe également des régulations posttraductionnelles de la protéine ATF4. La protéine ATF4 a une demi-vie très courte : environ 30 minutes ce qui limite ses effets. Mais cette demi-vie peut être encore réduite par phosphorylation qui permet la reconnaissance d ATF4 par le complexe SCF-βTrCP et la dégradation d ATF4 par le protéasome. En revanche, l histone acetyltransferase p300 augmente la demi-vie d ATF4 en inhibant l interaction ATF4-βTrCP. Une régulation transcriptionelle a été décrite également. Nous avons cherché à identifier le(s) niveau(x) de régulation d ATF4 par le CYP2E1 et l alcool et nous avons obtenu les résultats suivants : aucune variation de la phosphorylation du facteur traductionnel eif2α n a été visualisée. L induction d ATF4 par le CYP2E1 et l alcool n est donc pas due à une augmentation de la traduction d ATF4 ; nous avons mesuré la demi-vie de la protéine ATF4 dans les conditions contrôles et en présence de CYP2E1 et d alcool ; elle est dans les deux cas de 30 min dans les cellules HepG2. L induction d ATF4 par le CYP2E1 et l alcool n est donc pas due à un allongement de la demi-vie de la protéine ATF4 ; nous avons mesuré une augmentation de la quantité d ARNm ATF4 de deux à trois fois. L ensemble de ces résultats suggère que l induction d ATF4 par le CYP2E1 et l alcool met en jeu une augmentation des ARNm ATF4 qui peut être due à une régulation de la transcription du gène ATF4 et/ou une augmentation de la demi-vie de l ARNm ATF4. L induction de la réponse intégrée aux stress par le CYP2E1 et l alcool s accompagne d une augmentation de la mortalité des cellules hépatocytaires. Nous avons vu que l alcool métabolisé par le CYP2E1 induit à la fois les programmes transcriptionnels de survie et de mort cellulaire de la réponse intégrée aux stress. Nous avons voulu connaître les répercussions d un tel programme sur la survie cellulaire. Ainsi, nous avons montré que l ensemble de cette réponse est associée à une baisse de la survie cellulaire de 20 % (test MTT) et à une augmentation de l apoptose de 17 % (mesure des activités caspase 3/7). CONCLUSION ET PERSPECTIVES Cette étude est la première démonstration de l induction de la réponse intégrée aux stress et du facteur de transcription central de cette voie, ATF4 par le CYP2E1 et l alcool. Cette réponse est associée à une augmentation de la mortalité cellulaire (Figure 2). Au cours des MAFs, les hépatocytes sont progressivement détruits. En effet, le TNFα sécrété par les cellules de Küpffer induit l apoptose des hépatocytes fragilisés par l exposition à l alcool (Fernandez-Checa et al., 1997 ; Pastorino et Hoek, 2000). Les résultats de notre étude suggèrent que l activation prolongée des voies de stress pourrait être un des mécanismes de sensibilisation des hépatocytes à l apoptose. Les protéines apoptotiques de la voie RIS (ATF3, GADD34, CHOP) pourraient constituer à terme, des cibles thérapeutiques 202 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

203 «Foie» permettant de ralentir la progression des maladies alcooliques du foie. Ces résultats font l objet d un article en préparation. Hépatocytes alcool/cyp2e1 ARNm ATF4 ATF4 activation de la transcription gènes de survie cellulaire gènes pro-apototiques mort des hépatocytes maladies alcooliques du foie Figure 2 : alcool métabolisé par le CYP2E1 induit le facteur central de la réponse aux stress ATF4, ses gènes cibles et la mort des hépatocytes. Nos perspectives portent sur l étude du rôle d ATF4 dans la synergie observée entre alcool et virus de l hépatite C (VHC) sur le développement des pathologies hépatiques. En effet, il est connu en clinique que l infection au VHC et l alcool sont des facteurs aggravant le développement des maladies du foie (Peters et Terrault, 2002). Cependant, les mécanismes à l origine de cette intéraction entre VHC et alcool restent très mal compris. Plusieurs études ont montré que le VHC induit un stress du réticulum endoplasmique, ATF4 et la voie RIS (Ciccaglione et al., 2007 ; Tardif et al., 2002). Nous avons montré que l alcool, métabolisé par le CYP2E1, induit aussi le facteur ATF4 et la voie RIS (article en préparation). Puisque l activation sévère ou prolongée de la voie RIS conduit à la mort cellulaire, nous avons émis l hypothèse que la synergie de toxicité hépatique observée entre VHC et alcool pourrait résulter de la convergence de ces stress sur ATF4 et la voie RIS. Ce projet sera réalisé en collaboration avec l équipe d Arielle Rosenberg (Institut Cochin) qui a mis au point un modèle unique d infection et de réplication du VHC dans des hépatocytes humains en culture primaire. Ces cellules exprimant les enzymes du métabolisme de l alcool, elles constituent un modèle de choix pour étudier l interaction entre VHC et alcool. Si cette étude permet de révéler une voie cellulaire de synergie entre alcool et VHC, cela pourrait à terme révéler de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou des biomarqueurs de la pathologie hépatique. Remerciements : nous remercions l IREB, l ATC Alcool et le PNR Alcool (INSERM) pour leur soutien dans la réalisation de ces travaux. Cahiers de l Ireb n 19,

204 Références Ameri K., Harris A.L. Activating transcription factor 4. Int J Biochem Cell Biol 2008, vol. 40, n 1, p Ciccaglione A.R., Marcantonio C., Tritarelli E., Equestre M., Vendittelli F., Costantino A., Geraci A., Rapicetta M. Activation of the ER stress gene gadd153 by hepatitis C virus sensitizes cells to oxidant injury. Virus Res 2007, vol. 126, n 1-2, p Fernandez-Checa J.C., Kaplowitz N., Garcia-Ruiz C., Colell A., Miranda M., Mari M., Ardite E., Morales A. GSH transport in mitochondria: defense against TNF-induced oxidative stress and alcohol-induced defect. Am J Physiol 1997, vol. 273, n 1 Pt1, p. G7-G17. Harding H.P., Zhang Y., Zeng H., Novoa I., Lu P.D., Calfon M., Sadri N., Yun C., Popko B., Paules R., Stojdl D.F., Bell J.C., Hettmann T., Leiden J.M., Ron D. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell 2003, vol. 11, n 3, p Magne L., Blanc E., Marchand A., Fafournoux P., Barouki R., Rouach H., Garlatti M. Stabilization of IGFBP-1 mrna by ethanol in hepatoma cells involves the JNK pathway. J Hepatol 2007, vol. 47, n 5, p Marchand A., Tomkiewicz C., Magne L., Barouki R., Garlatti M. Endoplasmic reticulum stress induction of insulin-like growth factor-binding protein-1 involves ATF4. J Biol Chem 2006, vol. 281, n 28, p Pastorino J.G., Hoek J.B. Ethanol potentiates tumor necrosis factor-alpha cytotoxicity in hepatoma cells and primary rat hepatocytes by promoting induction of the mitochondrial permeability transition. Hepatology 2000, vol. 31, n 5, p Peters M.G., Terrault N.A. Alcohol use and hepatitis C. Hepatology 2002, vol. 36, n 5 Suppl. 1, p. S220- S225. Tardif K.D., Mori K., Siddiqui A. Hepatitis C virus subgenomic replicons induce endoplasmic reticulum stress activating an intracellular signaling pathway. J Virol 2002, vol. 76, n 15, p Walsh K., Alexander G. Alcoholic liver disease. Postgrad Med J 2000, vol. 76, n 895, p Wek R.C., Jiang H.Y., Anthony T.G. Coping with stress: eif2 kinases and translational control. Biochem Soc Trans 2006, vol. 34, n Pt1, p Zakhari S. Overview: how is alcohol metabolized by the body? Alcohol Res Health 2006, vol. 29, n 4, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

205 «Foie» L ADMINISTRATION CHRONIQUE D ALCOOL ALTERE L ADN MITOCHONDRIAL ET LA FONCTION MITOCHONDRIALE CHEZ DES SOURIS TRANSGENIQUES SUREXPRIMANT LA MNSOD ISABELLE LAROSCHE, BERNARD FROMENTY, PHILIPPE LETTERON, AMAL CHOUMAR, HOLLY VAN REMMEN, CHARLES J. EPSTEIN, ARLAN RICHARDSON, GERARD FELDMANN, DOMINIQUE PESSAYRE ET ABDELLAH MANSOURI INSERM, U773, Centre de Recherche Biomédicale Bichat Beaujon (CRB3), Equipe Mitochondries et Foie, 75018, Paris - France Summary Alcohol consumption increases reactive oxygen species (ROS) formation and lipid peroxidation, whose products can damage mitochondrial DNA (mtdna) and alter mitochondrial function. A possible role of manganese superoxide dismutase (MnSOD) on these effects has not been investigated. To test whether MnSOD overexpression modulates alcohol-induced mitochondrial alterations, we added ethanol to the drinking water of transgenic MnSOD-overexpressing (TgMnSOD) mice and their wild type (WT) littermates for 7 weeks. In TgMnSOD mice, alcohol administration further increased the activity of MnSOD, but decreased cytosolic glutathione as well as cytosolic glutathione peroxidase activity and peroxisomal catalase activity. Whereas ethanol increased cytochrome P450 2E1 and mitochondrial ROS generation in both WT and TgMnSOD mice, hepatic iron, lipid peroxidation products and respiratory complex I protein carbonyls were only increased in ethanol-treated TgMnSOD mice but not in WT mice. In ethanol-fed TgMnSOD mice, but not ethanol-fed WT mice, mtdna was depleted, and mtdna lesions blocked the progress of polymerases. The iron chelator, DFO, prevented hepatic iron accumulation, lipid peroxidation, protein carbonyl formation and mtdna depletion in alcohol-treated TgMnSOD mice. Alcohol markedly decreased the activities of complexes I, IV and V of the respiratory chain in TgMnSOD, with absent or lesser effects in WT mice. There was no inflammation, apoptosis or necrosis, and steatosis was similar in ethanol-treated WT and TgMnSOD mice. In conclusion, prolonged alcohol administration selectively triggers iron accumulation, lipid peroxidation, respiratory complex I protein carbonylation, mtdna lesions blocking the progress of polymerases, mtdna depletion and respiratory complex dysfunction in TgMnSOD mice but not in WT mice. Mots clefs Mitochondrie, foie, alcool, stress oxydant, superoxyde dismutase à manganèse INTRODUCTION La consommation d alcool augmente la formation des radicaux libres et des espèces réactives de l oxygène (ERO) par les mitochondries, cytochrome P450 2E1 (CYP2E1), NADPH oxydases (Dey et Cerderbaum, 2006 ; Albano, 2008). L alcool peut ainsi entraîner un stress oxydant et un dysfonctionnement mitochondrial au niveau hépatique chez l homme. Dans le foie, l éthanol est responsable d altérations oxydatives des protéines, des lipides et de l ADN mitochondrial (ADNmt) (Wieland et Lauterburg, 1995). L ADNmt code pour treize protéines de la chaîne respiratoire, et il est plus sensible au stress oxydant que l ADN nucléaire (ADNn) du fait de l absence d histones protectrices dans la mitochondrie et de sa proximité de la chaîne respiratoire qui est la source principale des ERO (Yakes et Van Houten, 1997). Le stress oxydant induit par l alcool entraîne la formation de 8-hydroxydeoxyguanosine dans l ADNmt (Wieland et Lauterburg, 1995), des sites abasiques et cassures des brins de l ADNmt. Ces lésions peuvent conduire à une déplétion de Cahiers de l Ireb n 19,

206 l ADNmt chez les animaux (Mansouri et al., 1999, 2001 ; Demeilliers et al., 2002) et à des délétions prématurées chez l homme (Mansouri et al., 1997). La consommation d alcool peut ainsi diminuer la synthèse des 13 protéines codées par l ADNmt (Coleman et Cunningham, 1990 ; Demeilliers et al., 2002). Bien que la majorité des altérations de l ADNmt causées par les ERO puissent être réparées dans la mitochondrie, les adduits de la péroxydation lipidique peuvent ne pas être enlevés de l ADNmt (Croteau et al., 1999). Après 4 doses d éthanol chez la souris, l accumulation de lésions non réparées empêchait la resynthèse de nouvelles molécules d ADNmt contribuant à une déplétion prolongée de cet ADN après arrêt d alcool (Demeillers et al., 2002). L anion superoxyde produit par la chaîne respiratoire est éliminé par l action successive de la superoxyde dismutase à manganèse (MnSOD) et de la glutathione peroxydase-1 (GPx-1) (Wallace, 1999). MnSOD transforme l anion superoxyde en peroxyde d hydrogène, qui est ensuite détoxiqué en eau par GPx-1. MnSOD est inductible par les ERO. Les cytokines et l alcool (Koch et al., 1994). Une augmentation de MnSOD pourrait diminuer le taux basal de l anion superoxyde (Liochev et Fridovich, 2007). Ceci pourrait diminuer sa réaction avec le NO pour former des peroxynites qui semblent impliqués dans les lésions hépatiques induites par l alcool (McKim et al., 2003). Bien qu une augmentation de MnSOD puisse avoir des effets bénéfiques pour certaines cibles d éthanol, elle pourrait aussi avoir des effets délétères sur d autres. Le but de ce travail a été d étudier les effets d une surexpression de MnSOD sur les altérations mitochondriales induites par l alcool. Nous avons exposé des souris transgéniques surexprimant MnSOD (TgMnSOD) et des souris wild type (WT) à l alcool pendant sept semaines. Ce traitement altère et déplète l ADNmt chez les souris TgMnSOD mais pas chez les souris WT. La déféroxamine (chélateur du fer) prévenait la déplétion de l ADNmt chez les souris TgMnSOD alcoolisées suggérant l implication du fer dans ces lésions alcooliques. MATERIEL ET METHODES Animaux et traitements Les souris TgMnSOD utilisées dans cette étude étaient développées dans le laboratoire de Charles Epstein à l univesité de Californie (Raineri et al., 2001). Ces souris ont été croisées avec des souris WT C57BL/6 et la descendance est génotypée par PCR. Des mâles adultes de deux mois sont soumis soit à l eau ou à l alcool ajouté dans leur eau de boisson : 5 % (v/v) d alcool la première semaine, 10 % la seconde semaine, 15 % la troisième et 20 % jusqu à la fin de la septième semaine. Certaines souris WT et TgMnSOD ont été traitées avec la deferoxamine (DFO) seule (50 mg/kg/d, s.c., cinq fois par semaine) ou DFO et alcool comme indiqué ci-dessus. Concentration sérique d éthanol L éthanol sérique a été mesuré grâce à un kit commercial (ADH-NAD Reagent Multiple Test Vial, Sigma) en se basant sur la conversion alcool dépendante de NAD + en NADH en présence de l alcool déshydrogénase. Taux et activité de MnSOD et Cu,ZnSOD Les protéines MnSOD, Cu,ZnSOD et β-actine ont été détectées par des anticorps polyclonaux spécifiques. Nous avons également utilisé des gels natifs non dénaturants pour estimer les activités de MnSOD et de Cu,ZnSOD (Sutton et al., 2005). Le test est basé sur la compétition entre la superoxyde dismutase et le nitro blue tetrazolium (indicateur de l anion superoxyde). Glutathion, activité GPx et activité catalase Les taux du glutathion réduit mitochondrial et cytosolique ont été déterminés selon Tietze et al. (1969). L activité GPx a été mesurée dans les fractions mitochondriales et cytosoliques en suivant la 206 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

207 «Foie» conversion de NADPH en NADP + à 340 nm en présence de H 2 O 2, la glutathion réductase et le glutathion réduit. L activité catalase a été déterminée dans l homogénat hépatique comme l a rapporté Wheeler et al Etude des effets de l alcool sur les taux et les altérations de l ADNmt La méthode du slot blot a été utilisée pour rechercher une déplétion de l ADNmt (Mansouri et al., 1999). La technique de PCR longue a été employée pour rechercher des lésions (sites abasique, cassures de brins, cross links ) susceptible d empêcher la progression des polymérases et la synthèse d ADNmt (Mansouri et al., 1999). Production mitochondriale des espèces réactives de l oxygène (ERO) et péroxidation lipidique Les mitochondrie hépatiques ont été isolées et la production des ERO a été déterminée grâce à 2,7 - dichlorofluorescein (DCF) (Zuo et Clanton, 2002). Pour évaluer la péroxydation lipidique, nous avons mesuré les acides thiobarbituriques réactants (TBARs) dans l homogénat hépatique. Détermination des protéines carbonylées Les protéines carbonylées ont été mesurées grâce au kit Oxyblot de détection des protéines oxydées. Le complexe I de la chaîne respiratoire a été d abord isolé sur des gels natifs non dénaturants et les sous-unités constitutives de ce complexe ont été ensuite séparées sur des gels dénaturants et transférés sur membranes de nitrocellulose. Les carbonyles ont mis en évidence par un anticorps polyclonal contre le dinitrophenyl (DNP). Analyse du CYP2E1, Tfam, PGC-1, inos, COX2 et la sous unité α du complexe V Ces protéines ont été analysées par Western Blot grâce à des anticorps spécifiques. Protéines et activité des complexes I, IV et V de la chaîne respiratoire Des altérations des taux et des activités des complexes I, IV et V ont été examinées par utilisation des gels bleu natifs (BN-PAGE) comme décrit par Schägger et von Jagow (1991). Fer hépatique et plasmatique Le fer a été extrait par digestion acide comme décrit par Torrance et Bothwell (1968), puis dosé grâce au kit OSR6186 (Olympus Diagnostic, Rungis, France). Analyse statistique Les résultats ont été analysés par le test ANOVA à 2 facteurs (génotype et traitement). Les moyennes des différents groupes ont été ensuite comparées par le test de Fisher (PLSD). RESULTATS Poids corporel, consommation d alcool et concentration d éthanol plasmatique Le gain du poids durant les sept semaines de traitement, la consommation d alcool ainsi que les concentrations plasmatiques d éthanol ne sont pas significativement différents entre les souris WT et TgMnSOD. Cahiers de l Ireb n 19,

208 Taux et activité de MnSOD et Cu,ZnSOD Pour vérifier que MnSOD est surexprimée chez les souris transgéniques, des gels d activité et le Western Blot ont été utilisés (Figures 1A et 1B). L activité MnSOD est 74 % plus élevée dans le foie des souris TgMnSOD que dans le foie des souris WT (Figure 1) (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD). L administration d alcool ne modifie pas l activité MnSOD chez les WT mais l augmente encore davantage chez les souris TgMnSOD (Figure 1A). Des modifications similaires ont été également révélées par Western Blot (Figure 1B). L activité et le taux protéique de la Cu,ZnSOD étaient essentiellement identiques dans les quatre groupes. Figure 1 : activité et protéine de MnSOD et de Cu,ZnSOD. U, indique des souris non traitées et A, correspond aux souris traitées pendant sept semaines par l alcool. (A) Activité MnSOD (B) Protéine MnSOD, (C) Activité Cu,ZnSOD (D) Protéine Cu,ZnSOD Les lettres en italique au-dessus des graphes indiquent un effet du génotype (G) ou du traitement (T) (p < 0,05 ; two-way ANOVA). * Différent des souris WT correspondantes (p < 0,05, PLSD ; test post hoc). # Différent des souris non traitées correspondantes (p < 0,05 ; PLSD test). Glutathion (GSH), activité GPx et activité catalase Nous avions ensuite mesuré le taux du GSH et les activités de GPx et de la catalase dans les quatre groupes de souris (Table 1). Pour le GSH mitochondrial, le test ANOVA a révélé des effets du génotype et du traitement ainsi qu une intéraction significative entre ces deux facteurs. Le GSH mitochondrial est 23 % moindre chez les souris TgMnSOD non traitées que chez les WT (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD) (Table 1). L administration de l alcool diminuait le GSH mitochondrial par 30 % chez les WT (p < 0,05) mais ne diminuait pas davantage le GSH chez les souris TgMnSOD (Table 1). Seul un effet du traitement a été observé pour le GSH cytosolique et les activités de GPx et catalase (Table 1). Le GSH cytosolique, identique chez les souris WT et TgMnSOD non traitées, est diminué de 31 % chez les WT et de 41 % chez les souris TgMnSOD (p < 0,05). L activité de GPx cytosolique 208 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

209 «Foie» est également similaire chez les souris WT et TgMnSOD non traitées. Cette activité est diminuée par l alcool de 36 % chez les souris WT et de 53 % chez les souris TgMnSOD (Table 1). L alcool diminue également l activité catalase dans les deux groupes de souris. WT TgMnSOD Témoins Alcool Témoins Alcool GSH Mitochondrial 13,7 ± 1,2 9,6 ± 0,6 # 10,6 ± 1,3* 10,8 ± 0,1 G, T, GxT GSH Cytosolique 91 ± ± 5 # 103 ± ± 3 # T Activité GPx Mitochondriale 246 ± ± ± ± 13 Activité GPx Cytosolique 1378 ± ± 148 # 1074 ± ± 190 # T Activité Catalase 326 ± ± 20 # 313 ± ± 14 # T Table 1 : le taux du Glutathion est exprimé en nmol/mg protéine et les activités de GPx et de catalase en nmol/mg protéine/min. Les résultats sont des moyennes ± SEM pour 5-13 souris. Les lettres en italique indiquent les effets du génotype (G) ou traitement (T) ou une interaction significative entre génotype et traitement (GxT) (p < 0,05 ; two-way ANOVA). * Différent des souris WT correspondantes (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi de test PLSD). # Différent des souris témoins correspondantes (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi de test PLSD). L alcool augmente la production mitochondriale des ERO et l expression de CYP2E1 La production mitochondriale des ERO a été évaluée sur mitochondries hépatiques isolées et incubées avec le succinate et le H 2 DCF-DA (Figure 2A). L éthanol augmente significativement la formation des ERO à la fois chez les souris WT et chez les souris TgMnSOD sans aucune différence entre ces deux groupes (Figure 2A). Nous avons aussi examiné l expression protéique de CYP2E1 qui est une autre source des ERO après intoxication alcoolique. Le test ANOVA a révélé un effet du traitement et du génotype avec une interaction significative de ces deux facteurs. L alcool augmente cinq fois le CYP2E1 chez les WT mais seulement de trois fois chez les souris TgMnSOD (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD) (Figure 2B). Figure 2 : la consommation chronique d alcool augmente la production mitochondriale des ERO et la protéine CYP2E1 chez les souris WT et TgMnSOD. (A) Formation mitochondriale de H 2 O 2 et autres peroxydes. (B) Expression de la protéine CYP2E1. Les lettres en italique indiquent un effet du génotype (G) ou de traitement (T) ou une interaction entre génotype et traitement (GxT) (p < 0,05 ; two-way ANOVA). * Différent des souris WT correspondantes (p < 0,05 ; PLSD. test post hoc). # Différent des souris non traitées correspondantes (p < 0,05 ; PLSD test). Cahiers de l Ireb n 19,

210 L alcool augmente les TBARs hépatiques et l oxydation des protéines du complexe I chez les souris TgMnSOD mais pas chez les WT L augmentation de la production mitochondriale des ERO et de la protéine CYP2E1 pourrait entraîner la péroxydation lipidique. Le test ANOVA a révélé un effet de l alcool et une interaction entre génotype et alcool (Figure 3A). Alors que l alcool ne modifie pas les TBARs hépatiques chez les souris WT, il augmente significativement ces produits de la péroxydation lipidique chez les souris TgMnSOD (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD) (Figure 3A). La mesure des carbonyles est souvent utilisée comme marqueur d oxydation des protéines. Les carbonyles étaient abondants au niveau des sous-unités du complexe I chez les souris TgMnSOD intoxiquées mais indétectables chez les souris WT (Figure 3B). Les effets du chélateur du fer DFO (Figures 3A et 3C) sont considérés plus loin. Figure 3 : la consommation d alcool augmente les TBARs hépatiques et les carbonyles au niveau du complexe I de la chaîne respiratoire chez les souris surexprimant MnSOD (TgMnSOD) mais pas chez les WT. Partie A : TBARs. (U) Témoins, (A) Alcool, (DFO) déferoxamine, (T) effet du traitement, (GxT) interaction entre génotype et traitement (p < 0,05 ; two-way ANOVA). # Différent des témoins non traités, p < 0,05 (twoway ANOVA et test PLSD post hoc). Différent des souris TgMnSOD traitées par l alcool sans DFO [one-way ANOVA en comparaison avec U, DFO seul (non montré), A et A + DFO chez les souris TgMnSOD]. Partie B : les protéines mitochondriales traitées par 2,4-Dinitrophenylhydrazine (DNP) ont été séparées sur gels non dénaturants BN-PAGE. Les bandes correspondantes aux protéines du complexe I étaient ensuite coupées du gel et leurs polypeptides constitutifs ont été séparés sur gels SDS dénaturants, transférés sur membranes de nitrocellulose. Les protéines ont été visualisées par le bleu de coomassie (à gauche) et leurs carbonyles par un anticorps anti-dnp (à droite). Partie C : le co-traitement avec DFO prévenait la formation des carbonyles des protéines du complexe I chez les souris TgMnSOD. 210 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

211 «Foie» L administration chronique d alcool endommage l ADNmt chez les souris TgMnSOD, mais pas chez les souris WT L ADN total a été hybridé avec une sonde spécifique de l ADNmt puis avec une sonde spécifique de l ADNn. Les taux d ADNn étaient similaires dans les quatre groupes de souris (Figure 4A), et nous avons ainsi utilisé les rapports ADNmt/ADNn pour déceler des changements dans les taux de l ADNmt. Le test 2-way ANOVA a démontré un effet du génotype avec une interaction significative entre génotype et traitement (Figure 4B). Bien que l alcool ne modifie pas les taux d ADNmt chez les souris WT, il déplète significativement cet ADN chez les souris TgMnSOD (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD) (Figures 4A et 4B). Les effets de DFO (Figure 4B) sont considérés ciaprès. Pour examiner la présence de lésions de l ADNmt susceptibles de bloquer la progression d ADN polymérases, nous avons co-amplifié par PCR un fragment long (8636 pb) et un fragment court (316 pb) (Figure 4C). La probabilité que des lésions d ADN bloquant la réplication soient présentes est plus forte dans un fragment long que dans un court (Demeilliers et al., 2002). En effet, l amplification du fragment court est identique chez les quatre groupes de souris (Figure 4C). Nous avons alors utilisé les rapports fragment long/fragment court comme indice d intégrité de l ADNmt (Figure 4D). Le test 2-way ANOVA a mis en évidence un effet significatif du génotype et du traitement ainsi qu une interaction significative entre ces deux facteurs (Figure 4D). Alors que le rapport des intensités du fragment 8636 pb/316 pb n était pas affecté par l alcool chez les souris WT, il était diminué de 60 % chez les souris TgMnSOD alcoolisées (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD) (Figure 4D). Figure 4 : la consommation chronique d éthanol déplète en endommageant l ADNmt chez les souris transgéniques surexprimant MnSOD (TgMnSOD) mais pas chez les WT. (U) souris non traitées, (A) souris alcoolisées. Certaines souris étaient co-traitées par la déferoxamine (DFO). (A) Slot blot montrant les signaux de l ADNmt et de l ADNn. (B) Rapports ADNmt/ADNn. Les lettres en italique indiquent un effet du génotype (G) ou de traitement (T) ou une interaction entre ces deux facteurs (GxT) (p < 0,05 ; two-way ANOVA). *Différent des souris WT correspondantes, (p < 0,05 ; 2-way ANOVA et test PLSD post hoc). # Différent des souris non traitées correspondantes (p < 0,05 ; two-way ANOVA et test PLSD post hoc). Différent des souris TgMnSOD traitées par l alcool sans DFO [p < 0,05 ; one-way ANOVA en comparaison avec U, DFO seul (non montré), A et A + DFO chez les souris TgMnSOD TgMnSOD]. (C) Détection des lésions bloquant la progression des polymérases sur l ADNmt par PCR longue. (D) Rapport fragment long/fragment court. Effet du génotype (G) ou du traitement (T) ou interaction entre ces deux facteurs (GxT) sont indiqués (p < 0,05 ; two-way ANOVA). * Différent des souris WT correspondantes (p < 0,05 ; two-way ANOVA et test PLSD post hoc). # Différent des souris non traitées correspondantes (p < 0,05 ; two-way ANOVA et test PLSD). Cahiers de l Ireb n 19,

212 L alcool augmente le fer plasmatique et hépatique chez les souris TgMnSOD Le fer hépatique et plasmatique n a pas été modifié par l alcool chez les souris WT (Figures 5A et 5B). Cependant, l alcool augmente significativement le fer chez les souris TgMnSOD alcoolisées (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD) (Figures 5A et 5B). La déferoxamine (DFO) prévenait l accumulation du fer, la péroxydation lipidique, l oxydation des protéines du complexe I et la déplétion de l ADNmt chez les souris TgMnSOD La DFO pévenait complètement l augmentation des concentrations du fer hépatique ou plasmatique par l alcool chez les souris TgMnSOD traitées par l alcool (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD) (Figures 5A et 5B). De même, la DFO protégeait contre les effets de l alcool sur les TBARs (Figure 3A), les protéines carbonyles du complexe I (Figure 3C) et l ADNmt chez les souris TgMnSOD) (Figures 4A et 4B). Cette protection par DFO suggère que la toxicité de l alcool sur l ADNmt pourrait être causée par le radical hydroxyle synthétisé par réaction entre le fer et l H 2 O 2 et/ou par un effet du fer sur l activité MnSOD comme discuté plus loin. Figure 5 : le traitement chronique par l éthanol augmente le fer plasmatique et hépatique chez les souris transgéniques TgMnSOD mais pas chez les WT. La DFO prévenait cet effet. (U) souris non traitées, (A) souris traitées pendant sept semaines par l alcool. T indique un effet du traitement (p < 0,05 ; two-way ANOVA). * Différent des souris WT correspondantes (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD). # Différent des souris TgMnSOD non traitées correspondantes (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD). Différent des souris TgMnSOD traitées par l alcool mais sans DFO [p < 0,05 ; one-way ANOVA en comparaison de U, DFO seul (non montré), A et A + DFO dans le groupe des souris TgMnSOD]. 212 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

213 «Foie» L alcool diminue la protéine Tfam chez les souris TgMnSOD mais pas chez les WT Tfam est nécessaire pour la réplication, la transcription et la stabilité de l ADNmt (Kang et al., 2007). Après sept semaines d intoxication alcoolique, l expression de Tfam diminuait de 31 % chez les souris TgMnSOD (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD) sans aucun effet chez les WT (Figure 6A). L effet de l alcool sur les protéines PGC-1 et inos est plus important chez les souris WT que chez les souris TgMnSOD Puisque PGC-1 peut augmenter la réplication de l ADNmt (Lin et al., 2003; Leone et al., 2005), l expression de cette protéine a également été examinée (Figure 6B). Le traitement par l éthanol augmente de cinq fois la protéine PGC-1 chez les souris WT mais seulement de trois fois chez les souris TgMnSOD (Figure 6B). Le taux de PGC-1 a ainsi été plus élevé chez les souris WT comparées aux souris TgMnSOD (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD). Comme l alcool induit inos (McKim et al., 2003) et NO stimule PGC-1 (Nisoli et al., 2003), nous avons aussi étudié l expression protéique de inos (Figure 6C). Bien que l alcool induise la inos aussi bien chez les WT que chez les TgMnSOD, l expression finale de cette protéine était deux fois plus élevée chez les souris WT que chez les souris TgMnSOD (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD) (Figure 6C). Figure 6 : effets de l éthanol sur les protéines Tfam, PGC-1 et inos. (U) souris non traitées, (A) souris traitées pendant sept semaines par l alcool. Effet du génotype (G), du traitement (T) ou interaction entre ces deux facteurs (GxT) (p < 0,05 ; two-way ANOVA). * Différent des souris WT correspondantes (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD). # Différent des souris non traitées correspondantes (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD). Cahiers de l Ireb n 19,

214 L administration d alcool ne modifie pas les taux des protéines des complexes de la chaîne respiratoire mais diminue plus sévèrement leurs activités chez les souris TgMnSOD que chez les souris WT Le taux des protéines et l activité des complexes I, IV et V ont été évalués sur gels bleus natifs (Schägger et Von Jagow, 1991). Le niveau d expression de ces protéines est similaire dans les quatre groupes de souris (Figure 7A). Chez les souris WT, l alcool diminue de façon modérée les activités des complexes I et V sans aucun effet sur le complexe IV (Figures 7B, 7C et 7D). En revanche, l alcool diminue fortement ces trois activités chez les souris TgMnSOD (Figures 7B, 7C et 7D) (p < 0,05 ; two-way ANOVA suivi du test PLSD). Figure 7 : l alcool diminue sévèrement l activité des complexes I, IV et V de la chaîne respiratoire. U : souris non traitées, A : souris traitées par l alcool. (A) Les complexes de la chaîne respiratoire séparés sur gradient de polyacrylamide non dénaturant et colorés au bleu de coomassie G25. (B), (C) et (D) les bandes de chaque complexe ont été découpées du gel et incubées avec des substrats spécifiques pour évaluer l activité in situ des complexes I (B), IV (C) et V (D). Les lettres en italique indiquent un effet du génotype (G) ou de traitement (T) ou une interaction entre génotype et traitement (GxT) (p < 0,05 ; two-way ANOVA). * Différent des souris WT correspondantes (p < 0,05 ; PLSD, test post hoc). # Différent des souris non traitées correspondantes (p < 0,05 ; PLSD test). DISCUSSION Cette étude montre qu un traitement des souris par l alcool pendant sept semaines diminue de 52 % les taux d ADNmt chez les souris TgMnSOD comparées aux les WT (Figures 4A et 4B). Le métabolisme hépatique de l alcool augmente la formation des ERO, des espèces réactives d azote, de l acétaldéhyde et du radical 1-hydroxyéthyl, et augmente aussi le rapport NADH/NAD + pouvant causer la réduction des ions ferriques en ions ferreux, générateurs du radical hydroxyle (Dey et Cerderbaum, 2006; Albano, 2008). Le radical hydroxyle cause la péroxydation lipidique (Esterbauer et al., 1991). L acétaldéhyde, le radical 1-hydroxyéthyle, les ERO, les espèces réactives d azote et les produits de la 214 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

215 «Foie» péroxydation lipidique peuvent tous endommager l ADN (Brooks, 1997). Des molécules d ADNmt fortement altérées pourraient être dégradées par des nucléases mitochondriales entraînant une déplétion aiguë de l ADNmt (Mansouri et al., 1999). L administration intragastrique d une dose unique d alcool (5 g/kg) entraîne une forte déplétion transitoire d ADNmt (Mansouri et al., 1999, 2001). Cette déplétion de l ADNmt est prévenue par le 4-méthylpyrazole (inhibiteur du métabolisme d alcool), la mélatonine, la vitamine E ou l ubiquinone (antioxydants) (Mansouri et al., 1999, 2001). Après une dose unique d alcool, la déplétion de l ADNmt entraîne une augmentation compensatoire de sa réplication qui restaure les taux de cet ADNmt 24 heures après administration d alcool (Mansouri et al., 1999, 2001). La re-synthèse d ADNmt nécessite des molécules non endommagées ou réparées pour servir de matrice à sa réplication. Bien que la majorité des lésions de l ADNmt induites par les ERO puissent être réversibles, les adduits des produits de la peroxydation lipidique et les liaisons inter-brins pourraient ne pas être réparées (Croteau et al., 1999). Le mécanisme des effets synergiques de la surexpression de la MnSOD et de l alcool sur l ADNmt est inconnu. L oxydation de H 2 DCF-DA en DCF par les peroxydes est similaire dans les mitochondries isolées de souris WT et TgMnSOD traitées par l alcool (Figure 2A). Cet effet négatif exvivo n exclue pas nécessairement une augmentation in vivo de H 2 O 2 dans les mitochondries des souris TgMnSOD intoxiquées par l alcool. Il a été suggéré que le déséquilibre induit par l alcool entre une forte activité MnSOD et une faible activité GPx pourrait augmenter l état stationnaire de H 2 O 2, qui pourrait ensuite interagir avec le fer et former le radical hydroxyle (Sutton et al., 2006). Plusieurs autres possibilités sont également considérées pour expliquer pourquoi la surexpression de Cu,ZnSOD ou de MnSOD pourrait avoir des effets néfastes dans certaines circonstances (Kowald et al., 2006 ; Liochev et Fridovich, 2007). Un mécanisme, bien que non validé par Kowald et al. (2006) et Liochev et Fridovich (2007), pourrait être qu à faible concentration, l anion superoxyde, peut avoir des effets bénéfiques en inhibant la propagation de la péroxydation lipidique. En accord avec ce schéma, l anion superoxyde pourrait réagir avec un radical lipidique (L) et un proton pour former un lipide hydroperoxyde (LOOH) non réactif. Cette réaction pourrait prévenir le radical lipidique de réagir avec l oxygène et de former en chaîne des radicaux peroxyl (LOO. ). Selon un tel mécanisme, la surexpression de MnSOD pourrait aggraver la péroxydation lipidique induite par l alcool en causant des concentrations d anion superoxyde anormalement faibles. Une autre possibilité est que la MnSOD surexprimée pourrait développer certaines nouvelles activités délétères (Kowald et al., 2006 ; Liochev et Fridovich, 2007). Des progrès récents dans l interconnexion entre l alcool, le fer, le manganèse et la MnSOD rendent cette dernière hypothèse particulièrement intrigante. En effet, l administration d alcool diminue l expression de l hepcidine (Harrison-Findick et al., 2007). Ceci maintien la ferroportine duodénale anormalement active, augmentant ainsi l absorption intestinale du fer et son accumulation dans le foie (Harrison-Findick et al., 2007). Dans notre étude, l alcool ne modifie pas le fer hépatique chez les souris WT, mais augmente significativement à la fois le fer plasmatique et hépatique chez les souris TgMnSOD (Figures 5A et 5B). Il a été montré qu une forte activité de MnSOD module l expression de nombreuses protéines impliquées dans l homéostasie du fer et augmente l accumulation du fer dans les cellules Huh7 de l hépatome humain (Nahon et al., 2008). De même, une forte activité de MnSOD favorise l accumulation du fer dans le foie de patients alcooliques (Sutton et al., 2006 ; Nahon et al., 2008). L accumulation du fer semble jouer un rôle important dans les effets de l alcool chez les souris TgMnSOD. La prévention de l accumulation du fer par DFO (Figure 5) prévenait l augmentation des TBAR S (Figure 3A) et l oxydation des protéines (Figure 3C) et protégeait contre la déplétion de l ADNmt chez les souris TgMnSOD (Figures 4A et 4B). Dans un modèle d hémochromatose héréditaire (souris Hfe -/- ), la surcharge en fer hépatique était associée avec une inhibition de l absorption du magnésium par la mitochondrie et une réduction de l activité de MnSOD (Jouihan et al., 2008). De plus, plusieurs mutants de levure ayant de fortes surcharges mitochondriales en fer et de faibles concentrations mitochondriales en manganèse incorporent le fe 2+ au lieu du Mg 2+ dans le site actif de MnSOD (Yang et al., 2006). La FeMnSOD qui en résulte est caractérisée par une forte stabilité, une absence de l activité dismutase de l anion superoxyde et une nouvelle activité génératrice du radical hydroxyle probablement parce que la FeMnSOD catalyse la réduction monoélectronique de H 2 O 2 en. OH (Yamakura et al., 2007). Une partie de MnSOD pourrait en effet se transformer en FeSOD durant l administration prolongée d alcool chez les souris TgMnSOD. La MnSOD peut ensuite former H 2 O 2 qui pourrait ensuite être transformé en radical hydroxyle par la FeSOD. Une Cahiers de l Ireb n 19,

216 élévation du radical hydroxyle dont la formation est liée au fer pourrait expliquer l augmentation des TBARs et des carbonyles chez les souris TgMnSOD alcoolisées même si la formation mitochondriale de H 2 O 2 et l expression du CYP2E1 sont similaires dans les 2 groupes (Figure 2). Le radical hydroxyle attaque les lipides insaturés entraînant la peroxydation lipidique et la formation secondaire des produits de la péroxydation à proximité de l ADNmt. Comme le radical hydroxyle, les produits de la péroxydation lipidique réagissemnt aussi avec l ADN (Esterbauer et al., 1991). Bien que les lésion de l ADNmt causées par les ERO puissent être réparées, les adduits de l ADN causés par les produits de la péroxydation lipidique ne sont pas réparés (Croteau et al., 1999). En accord avec l augmentation des TBARs et des carbonyles exclusivement chez les souris TgMnSOD, nous avons trouvé que seul l ADNmt des souris surexprimant MnSOD présentait des lésions bloquant les polymérases et empêchant son amplification (Figures 4C et 4D). Ces lésions pourraient vraisemblablement diminuer la resynthèse de l ADNmt par la polymérase γ in vivo (Demeilliers et al., 2002). Un autre facteur contribuant à un défaut de maintenir des taux normaux de l ADNmt pourrait s agir d anomalie d induction de inos et PGC-1 chez les souris TgMnSOD alcoolisées comparées aux souris WT intoxiquées (Figures 6B et 6C). Chez les souris WT, l éthanol active la NADPH oxydase, qui forme l anion superoxyde et ainsi induit inos ((McKim et al., 2003). Cette séquence d événements pourrait être partiellement anormale chez les souris TgMnSOD, car la surexpression de MnSOD pourrait diminuer les concentrations de l anion superoxyde (Buettner et al., 2006). En effet, inos était moins induite par l alcool chez les souris TgMnSOD que chez les WT (Figure 6C). De manière identique, l addition de SOD prévenait l induction de inos par l anion superoxyde dans trois autres études précédentes (Kuo et al., 2000 ; Mendes et al., 2003 ; San Martin et al., 2007). Finalement, à l inverse des souris WT, les souris transgéniques surexprimant Cu,ZnSOD n induisent pas inos dans une autre étude (Saito et al., 2001). Puisque inos libère NO, un stimulus potentiel de l activation de PGC-1 (Nisoli et al., 2003 ; Bossy-Wetzel et Lipton, 2003), la faible induction d inos chez les souris TgMnSOD traitées par l alcool pourrait expliquer l induction modeste de PGC-1 obtenue chez ces souris. PGC-1 sur-régule la réplication de l ADNmt et la biogenèse mitochondriale souvent dans le tissu adipeux brun et muscle, mais aussi dans le foie (Lin et al., 2003 ; Leone et al., 2005). Alors que la remarquable induction de PGC-1 par l alcool pourrait aider à maintenir les taux d ADNmt et prévenir sa déplétion chez les souris WT, sa plus modeste réponse chez les souris TgMnSOD favorise au contraire cette déplétion. Une autre différence entre les souris WT et TgMnSOD traitées par l alcool est la protéine Tfam significativement diminuée par l alcool chez les souris TgMnSOD mais pas chez les WT (Figure 6A). Puisque Tfam participe à la réplication et la stabilité de l ADNmt, cette différence pourrait également jouer un rôle dans la déplétion de l ADNmt observée chez les souris TgMnSOD. En conclusion, la surexpression de MnSOD augmente les dommage de l ADNmt après une administration prolongée d alcool. Cette déplétion est associée avec une augmentation du fer et des TBARs hépatiques. Le chélateur du fer, la DFO, prévient l ensemble de ces effets suggérant un rôle important du fer. Références Albano E. Oxidative mechanisms in the pathogenesis of alcoholic liver disease. Mol Aspects Med 2008, vol. 29, n 1-2, p Bossy-Wetzel E., Lipton S.A. Nitric oxide signaling regulates mitochondrial number and function. Cell Death Differ 2003, vol. 10, n 7, p Brooks P.J. DNA damage, DNA repair, and alcohol toxicity - a review. Alcohol Clin Exp Res 1997, vol. 21, n 6, p Buettner G.R., Ng C.F., Wang M., Rodgers V.G.J., Schafer F.Q. A new paradigm: manganese superoxide dismutase influences the production of H 2 O 2 in cells and thereby their biological state. Free Rad Biol Med 2003, vol. 41, p Coleman W.B., Cunningham C.C. Effects of chronic ethanol consumption on the synthesis of polypeptides encoded by the hepatic mitochondrial genome. Biochim Biophys Acta 1990, vol. 1019, n 2, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

217 «Foie» Croteau D.L., Stierum R.H., Bohr V.A. Mitochondrial DNA repair pathways. Mutat Res 1999, vol. 434, n 3, p Demeilliers C., Maisonneuve C., Grodet A., Mansouri A., Nguyen R., Tinel M., Letteron P., Degott C., Feldmann G., Pessayre D., Fromenty B. Impaired adaptive resynthesis and prolonged depletion of hepatic mitochondrial DNA after repeated alcohol binges in mice. Gastroenterology 2002, vol. 123, n 4, p Dey A., Cederbaum A.I. Alcohol and oxidative liver injury. Hepatology 2006, vol. 43, n 2 Suppl.1, p. S63- S74. Esterbauer H., Schaur R.J., Zollner H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malondialdehyde and related aldehydes. Free Radic Biol Med 1991, vol. 11, n 1, p Harrison-Findick D.D., Klein E., Crist C., Evans J., Timchenko N., Gollan J. Iron-mediated regulation of liver hepcidin expression in rats and mice is abolished by alcohol. 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218 San Martin A., Foncea R., Laurindo F.R., Ebensperger R., Griendling K.K., Leighton F. Nox1-based NADPH oxidase-derived superoxide is required for VSMC activation by advanced glycation end-products. Free Radic Biol Med 2007, vol. 42, n 11, p Schägger H., von Jagow G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem 1991, vol. 199, n 2, p Sutton A., Imbert A., Igoudjil A., Descatoire V., Cazanave S., Pessayre D., Degoul F. The manganese superoxide dismutase Ala16Val dimorphism modulates both mitochondrial import and mrna stability. Pharmacogenet Genomics 2005, vol. 15, n 5, p Sutton A., Nahon P., Pessayre D., Rufat P., Poire A., Ziol M., Vidaud D., Barget N., Ganne-Carrie N., Charnaux N., Trinchet J.C., Gattegno L., Beaugrand M. Genetic polymorphisms in antioxidant enzymes modulate hepatic iron accumulation and hepatocellular carcinoma development in patients with alcohol-induced cirrhosis. Cancer Res 2006, vol. 66, n 5, p Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues. Anal Biochem 1969, vol. 27, n 3, p Torrance J.D., Bothwell T.H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. S Afr J Med Sci 1968, vol. 33, p Wallace D.C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science 1999, vol. 283, n 5407, p Wheeler M.D., Nakagami M., Bradford B.U., Uesugi T., Mason R.P., Connor H.D., Dikalova A., Kadiiska M., Thurman R.G. Overexpression of manganese superoxide dismutase prevents alcohol-induced liver injury in the rat. J Biol Chem 2001, vol. 276, n 39, p Wieland P., Lauterburg B.H. Oxidation of mitochondrial proteins and DNA following administration of ethanol. Biochem Biophys Res Commun 1995, vol. 213, n 3, p Yakes F.M., Van Houten B. Mitochondrial DNA damage is more extensive and persists longer than nuclear DNA damage in human cells following oxidative stress. Proc Natl Acad Sci USA 1997, vol. 94, n 2, p Yamakura F., Kobayashi K., Furukawa S., Suzuki Y. In vitro preparation of iron-substituted human manganese superoxide dismutase: Possible toxic properties for mitochondria. Free Rad Biol Med 2007, vol. 43, n 3, p Yang M., Cobine P.A., Molik S., Naranuntarat A., Lill R, Winge D.R., Culotta V.C. The effects of mitochondrial iron homeostasis on cofactor specificity of superoxide dismutase 2. EMBO J 2006, vol. 25, n 8, p Zuo L., Clanton T.L. Detection of reactive oxygen species and nitrogen species in tissues using redoxsensitive fluorescent probes. Methods Enzymol 2002, vol. 352, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

219 «Foie» IMPACT DE LA LOCALISATION MITOCHONDRIALE DU CYTOCHROME P4502E1 SUR LE STRESS OXYDANT INDUIT PAR L'ALCOOL LAETITIA KNOCKAERT, BERNARD FROMENTY ET MARIE-ANNE ROBIN INSERM U773, Faculté de Médecine Denis Diderot, site Bichat, 16 rue Henri Huchard, Paris - France Summary Cytochromes P450 (CYP) belong to a superfamily of hemoproteins implicated in the metabolism of endogenous and exogenous compounds. The main cellular localization of these enzymes is the endoplasmic reticulum, but numerous of them, particularly CYP2E1, are also detected within mitochondria. The presence of CYP metabolizing xenobiotics in mitochondria raises questions about their function in these organelles. CYP2E1 metabolizes many low molecular weight compounds including toxics (alcohol), procarcinogens (nitrosamines) or drugs (acetaminophen). Moreover, CYP2E1 generates reactive oxygen species (ROS) through its catalytic cycle. The aim of this study was 1) to develop a cellular model allowing CYP2E1 expression only in mitochondria and to compare it with a model in which CYP2E1 would be expressed naturally in both endoplasmic reticulum and mitochondria; 2) to determine the effect of mitochondrial localization of CYP2E1 on cell viability and ROS production after incubation with ethanol. Our preliminary results show that ethanol induces an oxidative stress even in the absence of CYP2E1. However, this stress is clearly amplified after CYP2E1 transfection and ROS production increases similarly weather CYP2E1 is expressed only in mitochondria or in both compartments (mainly in the endoplasmic reticulum and weakly in mitochondria). These results indicate that mitochondrial CY2E1 seems to play a major role in the potentialisation of ethanol-induced oxidative stress. Other markers are under study to confirm these preliminary results. Mots clefs Cytochrome P450 2E1, mitochondrie, stress oxydant, alcool INTRODUCTION Le cytochrome P450 (CYP) 2E1 est une enzyme qui joue un rôle important dans la détoxication de substances endogènes (acétone, acide arachidonique) ou exogènes telles que certains médicaments (halothane, paracétamol, chlorzoxazone) et toxiques (alcool) ainsi qu un large spectre de composés hydrophobes procarcinogènes de faible poids moléculaire (tétrachlorure de carbone, nitrosamines, benzène ). De plus, le CYP2E1 peut être induit dans différentes situations physiopathologiques comme le diabète, l obésité ou l intoxication alcoolique (Chiturri et Farell, 2001 ; Robertson et al., 2001). Une induction du CYP2E1 peut avoir des effets délétères sur les cellules, notamment les hépatocytes, car cette enzyme est une source importante d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) et de métabolites réactifs pouvant induire diverses altérations cellulaires. De nombreux travaux ont montré que le stress oxydant peut, par divers mécanismes, entraîner des modifications membranaires au niveau mitochondrial (perméabilité de la membrane externe, induction du pore de transition de perméabilité mitochondriale impliquant les membranes externes et internes) aboutissant à la libération de cytochrome c et d autres facteurs pro-apoptotiques (Haouzi et al., 2000 ; Petrosillo et al., 2001). Comme tous les CYP qui métabolisent des xénobiotiques, le CYP2E1 présente une localisation majoritairement microsomale. Toutefois, il a été également purifié et caractérisé dans des mitochondries hépatiques de rat (Robin et al., 2001). Les CYP2E1 d origine mitochondriale et microsomale possèdent la même structure primaire mais diffèrent par leur structure secondaire. En effet, le CYP2E1 mitochondrial présente un degré d'hélicité plus faible que celui d'origine Cahiers de l Ireb n 19,

220 microsomale, suggérant une structure moins compacte et moins repliée. Une autre différence majeure entre les deux formes est leur degré de phosphorylation, plus important pour le CYP2E1 mitochondrial. Enfin, selon leur localisation, les deux formes de CYP2E1 requièrent pour leur activité des systèmes donneurs d électrons différents. Le CYP2E1 mitochondrial n est actif qu en présence d adrénodoxine et d adrénodoxine réductase alors que le CYP2E1 microsomal reçoit ses électrons de la NADPH CYP réductase (Robin et al., 2001). Le signal d'adressage mitochondrial du CYP2E1 est constitué des acides aminés Lys 24 et Lys 25. C'est la phosphorylation de la Ser 129 du CYP2E1 par la protéine kinase A qui active le signal cryptique d'adressage mitochondrial, augmentant ainsi son affinité pour la protéine chaperonne Hsp70 (Heat shock protein 70) et les translocases mitochondriales. Ces mécanismes sont à l'origine du transport accru de la protéine dans la mitochondrie (Robin et al., 2002). Principalement hépatique, le métabolisme de l alcool implique plusieurs complexes enzymatiques. L éthanol est d abord dégradé en acétaldéhyde puis en acétate. La voie prépondérante est constitutive et localisée dans le cytoplasme. Elle fait intervenir l alcool déshydrogénase et l aldéhyde déshydrogénase (Abittan et Lieber 1999). Il existe une voie inductible microsomale qui prend en charge le métabolisme de l éthanol lorsque la voie constitutive est dépassée, en cas d intoxication alcoolique par exemple. C est au sein de cette voie qu intervient le CYP2E1. L abus d alcool est susceptible d'entraîner diverses lésions hépatiques, telles que les stéatoses et les stéatohépatites, qui peuvent évoluer vers l insuffisance hépatique et la cirrhose (Chiturri et Farell, 2001 ; Pessayre et al., 2001). Il semble maintenant établi que le stress oxydant lié au métabolisme de l éthanol joue un rôle majeur dans la physiopathologie de ces lésions hépatiques (Fromenty et al., 1995, 2000). Divers organites et/ou systèmes enzymatiques sont impliqués dans la surproduction d ERO au cours de l intoxication alcoolique, et parmi eux, il semble que les mitochondries et le CYP2E1 jouent un rôle majeur (Pessayre et al., 2001). L altération oxydative des constituants mitochondriaux a pour conséquence une diminution de l activité de la chaîne respiratoire, ce qui entraîne une augmentation de la production des ERO au niveau de certains sites de cette chaîne (Pessayre et al., 2001). Ainsi, un cercle vicieux peut être envisagé, au cours duquel le stress oxydant va entraîner, par l intermédiaire de l altération de la chaîne respiratoire, une production encore plus importante d ERO, produisant ainsi encore plus de stress oxydant. Au cours de l intoxication alcoolique, le stress oxydant initial pourrait provenir des mitochondries elles-mêmes, en particulier par l intermédiaire d une augmentation de l expression du CYP2E1 au niveau de ces organites. En effet, nous avons montré que l alcool pouvait induire le CYP2E1 mitochondrial à la fois dans des modèles in vitro (hépatocytes de rat en culture primaire) et in vivo (souris Swiss intoxiquées de façon répétée ou chronique avec de l'éthanol) (Robin et al., 2005). Afin de mieux comprendre le rôle du CYP2E1 mitochondrial dans la survenue d'un stress oxydant lié à l'alcool, nous avons réalisé un modèle cellulaire exprimant le CYP2E1 uniquement dans la mitochondrie en transfectant des cellules COS7 avec une construction plasmidique comportant une séquence d'adressage mitochondrial en amont du CYP2E1. Nous avons ensuite étudié l impact de la localisation mitochondriale du CYP2E1 sur la viabilité cellulaire et quelques paramètres du stress oxydant comme la production d ERO ou le potentiel de membrane mitochondrial après incubation des cellules avec de l éthanol. MATERIELS ET METHODES Constructions plasmidiques Nous avons réalisé deux constructions plasmidiques intégrant le CYP2E1 sauvage, l'une permettant un adressage naturel de la protéine, l'autre un adressage spécifique vers la mitochondrie. Dans ce but, nous avons utilisé des vecteurs «pshooter» commercialisés par Invitrogen. Le vecteur pef/myc/mito comporte une séquence d'adressage mitochondriale issue de la sous-unité VIII de la cytochrome c oxydase humaine. Le vecteur pef/myc/cyto ne contient aucun signal et permet un adressage naturel de la protéine d'intérêt. 220 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

221 «Foie» Culture cellulaire, transfections transitoires et traitement des cellules Les cellules COS7 utilisées pour cette étude proviennent d une lignée dérivée d un rein de singe. Ces cellules ont été cultivées dans du milieu DMEM enrichi en glucose, additionné de 10 % de sérum de veau fœtal décomplémenté et d'antibiotiques, à 37 C dans une atmosphère saturée en eau à 5 % de CO 2. La transfection des plasmides a été réalisée par lipofection à l aide du Kit FuGENE6 Transfection Reagent de Roche. Les cellules ont ensuite été traitées ou non par de l'alcool à différentes doses (de 25 à 600 mm) pendant 18 heures. Test de viabilité cellulaire (MTT) Le principe de ce test réside en la réduction par la succinate deshydrogénase mitochondriale du MTT, un sel de tétrazolium, en un produit coloré insoluble, le bleu de formazan. La quantité de bleu de formazan formée est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes. Mesure de paramètres relatifs du stress oxydant par cytométrie de flux Dosage des espèces réactives de l'oxygène Nous avons mesuré la production cellulaire de l'anion superoxyde O 2 - et d'hydroperoxydes (dont le peroxyde d hydrogène H 2 O 2 ) grâce à deux marqueurs fluorescents : l hydroxyéthidine (HE) pour O 2 - et la 2,7-dichlorohydrofluorescéine diacétate (DCFDA) pour les hydroperoxydes. Mesure du potentiel de membrane mitochondrial Ce paramètre a été mesuré grâce à une sonde fluorescente verte JC1 qui lorsqu elle est sous forme monomérique émet en vert à 525 nm (FL1) et sous forme d agrégats en rouge à 585 nm (FL2). L émission à 585 nm correspond à une forte concentration de JC1 indiquant un fort potentiel de membrane mitochondrial. Le rapport FL2/FL1 nous donne une évaluation de ce potentiel de membrane mitochondrial. Si ce rapport diminue, le potentiel chute. Microscopie confocale Des cellules COS7 ont été mises en culture sur des lamelles de verre puis transfectées pendant 18 heures avec les deux constructions (pef/myc/mito/2e1 et pef/myc/cyto/2e1) lorsqu'elles étaient à 50 % de confluence. Le CYP2E1 a été visualisé en immunofluorescence avec un anticorps secondaire fluorescent vert. Afin de visualiser une éventuelle co-localisation du CYP2E1 avec les mitochondries, les cellules ont été incubées à la fin de la transfection avec du mitotracker CMX ROS qui fluoresce en rouge (Molecular probes). Pour mettre en évidence une co-localisation du CYP2E1 avec le réticulum endoplasmique, les cellules ont été incubées avec un anticorps anti-calréguline (spécifique du réticulum), suivi d'un anticorps secondaire Alexa fluor 562 (Molecular Probes), qui fluoresce en rouge. RESULTATS ET DISCUSSION Adressage spécifique du CYP2E1 vers la mitochondrie Les deux constructions que nous avons réalisées avaient pour but d'envoyer le CYP2E1 uniquement dans la mitochondrie (pef/myc/mito/2e1) ou dans les deux compartiments (réticulum endoplasmique et mitochondries) (pef/myc/cyto/2e1). Le bon adressage de ces constructions a été évalué par microscopie confocale. Après transfection des cellules avec le plasmide pef/myc/mito/2e1, le CYP2E1 co-localisait de façon importante avec le mitotracker (marqueur mitochondrial) et pratiquement pas avec la calréguline (marqueur du réticulum endoplasmique) (Figure 1A). Pour la transfection avec le plasmide Cahiers de l Ireb n 19,

222 pef/myc/cyto/2e1, nous avons bien retrouvé un adressage mixte vers les deux compartiments avec une prédominance pour le réticulum endoplasmique (Figure 1B). A pef/myc/mito/2e1 Mitotracker Superposition pef/myc/mito/2e1 Calréguline Superposition B pef/cyto/2e1 Mitotracker Superposition pef/cyto/2e1 Calréguline Superposition Figure 1 : colocalisation du CYP2E1 avec la mitochondrie ou le réticulum endoplasmique. A) Transfection avec le plasmide pef/myc/mito/2e1, B) Transfection avec le plasmide pef/myc/cyto/2e Cahiers de l Ireb n 19, 2009

223 «Foie» Impact de la localisation du CYP2E1 sur la viabilité cellulaire et sur le stress oxydant après exposition des cellules à l'éthanol Sur la viabilité cellulaire L'effet de l'éthanol sur la viabilité cellulaire en fonction de la présence et de la localisation du CYP2E1 a été mesuré par le test du MTT pour différentes doses allant de 25 à 600 mm d éthanol. En l'absence de transfection, la toxicité est apparue seulement aux doses de 400 mm (chute de 20 % de la viabilité cellulaire) et 600 mm (chute de 60 % de la viabilité cellulaire), indiquant que des cellules ne possédant ni alcool/aldéhyde déshydrogénase, ni CYP2E1, sont relativement résistante à la toxicité de l'éthanol. En revanche, après transfection du CYP2E1, la toxicité liée à l'éthanol était dose dépendante et apparaissait dès 25 ou 50 mm, que le CYP2E1 soit uniquement localisé dans la mitochondrie ou qu'il soit distribué naturellement dans le réticulum endoplasmique et la mitochondrie. Sur la production d'ero Pour évaluer le stress oxydant induit par l'alcool au sein des cellules transfectées ou non par le CYP2E1, nous avons mesuré la production d'ero (Hydroperoxydes et O 2 -) par cytométrie de flux pour des doses d éthanol allant de 100 à 400 mm. Il est à noter qu'à la dose de 400 mm, la mortalité cellulaire avoisinait les 60 % dans les cellules transfectées. Cependant, les mesures en cytométrie de flux ont été réalisées sur les cellules vivantes en excluant les cellules mortes grâce à l'iodure de propidium. impact sur la production d'hydroperoxydes Dans les cellules non transfectées, nous avons observé une augmentation significative de la production d hydroperoxydes à la dose de 400 mm d éthanol, avec une production deux fois plus importante que celle du témoin. Dans le cas de la transfection avec le plasmide pef/myc/mito/2e1, l'effet de l éthanol sur le stress oxydant est apparu également à la dose de 400 mm, mais par contre, les quantités d hydroperoxydes produites étaient plus importantes (multipliées par 3,5 par rapport au témoin). Lorsque le CYP2E1 était adressé dans les deux compartiments (pef/myc/cyto/2e1), la production d hydroperoxydes était augmentée dès la dose de 200 mm et multipliée par quatre à la dose de 400 mm d'éthanol. impact sur la production d'anion superoxyde Que les cellules aient été transfectées ou non par le CYP2E1, l augmentation significative de la production d'o 2 - se produisait à partir de la dose de 400 mm d éthanol. Toutefois, dans les cellules non transfectées, l'augmentation de la production d O 2 - n'était que de 50 % par rapport au témoin alors qu'elle était de 150 % après transfection des cellules par les plasmides pef/myc/mito/2e1 et pef/myc/cyto/2e1. Ces résultats indiquent que l'éthanol induit un stress oxydant, même en l'absence de CYP2E1, mais que ce stress est majoré quand les cellules sont transfectées avec le CYP2E1. L'augmentation de la production d'ero induite par l'éthanol est comparable quelque soit la construction plasmidique utilisée. Sur le potentiel de membrane mitochondrial Afin d'évaluer si le stress oxydant intra-mitochondrial entraînait des dysfonctionnements mitochondriaux, nous avons ensuite mesuré le potentiel de membrane mitochondrial. En effet une chute de ce potentiel peut refléter un découplage ou un arrêt de la chaîne respiratoire, conduisant à une diminution de l'atp (Pessayre et al., 2001). Dans les cellules non transfectées, l exposition à des concentrations croissantes d éthanol a conduit à une augmentation du potentiel de membrane mitochondrial de 20 % à 200 mm d éthanol allant jusqu à 40 % à 400 mm. A la suite des deux Cahiers de l Ireb n 19,

224 transfections, nous observons une chute du potentiel de membrane d'environ 25 % en présence de faibles doses d'éthanol (100 mm), ce qui a déjà été rapporté in vivo (Yan et al., 2007) et in vitro (Otani et al., 2005) et relié à un dysfonctionnement de la chaîne respiratoire. De façon plus inattendue, il se produit une repolarisation des cellules à des doses plus importantes. Il pourrait s'agir d'un mécanisme de compensation comme cela a été observé pour des myocytes incubés pendant 24 heures avec 200 mm d'éthanol (Mashimo et Ohno, 2006). Le CYP2E1 est une enzyme capable de produire des quantités importantes d'ero, et ceci même en l'absence de substrats métaboliques (Chen et Cederbaum, 1998). Nous avons montré au laboratoire que l'induction du CYP2E1 par l'alcool intéressait également le compartiment mitochondrial (Robin et al., 2005). Plusieurs études ont montré que l'accumulation de CYP2E1 dans la mitochondrie pouvait être à l'origine d'une toxicité mitochondriale et cellulaire. En effet, Bai et Cederbaum (2006) ont montré que la transfection d'un CYP2E1 tronqué dans des cellules HepG2 déplétées en glutathion pouvait induire un stress oxydant, endommager le potentiel de membrane mitochondrial et entraîner in fine une diminution de la viabilité cellulaire. Dans une autre étude, il a été montré que le CYP2E1 s'accumulait dans les mitochondries de rats rendus diabétiques par la streptozotocine (Raza et al., 2004). Cette augmentation de CYP2E1 mitochondrial était corrélée à une génération d'ero au sein même de la mitochondrie. Ces deux études suggèrent que l'accumulation de CYP2E1 dans la mitochondrie, qu'elle soit d'origine alcoolique ou pathologique, pourrait jouer un rôle important dans le stress oxydant observé dans certaines maladies hépatiques. CONCLUSION Les résultats que nous avons obtenus semblent indiquer que la présence de CYP2E1 uniquement dans la mitochondrie est suffisante pour potentialiser un stress oxydant induit par une exposition à de l alcool. En effet, l'augmentation des ERO consécutive à l'exposition des cellules à l'alcool est identique que le CYP2E1 soit localisé majoritairement dans le réticulum et minoritairement dans la mitochondrie ou qu'il soit uniquement mitochondrial. Le CYP2E1 mitochondrial semble donc jouer un rôle primordial dans la survenue du stress oxydant induit par l'alcool. Toutefois, ce résultat reste à confirmer par d'autres marqueurs du stress oxydant et de la fonction mitochondriale comme les taux de glutathion réduit et oxydé, la péroxydation lipidique, la respiration mitochondriale, la mesure de l'activité des complexes de la chaîne respiratoire De plus, il manque un modèle cellulaire où le CYP2E1 serait uniquement exprimé dans le réticulum endoplasmique. Enfin, l'efficacité des transfections transitoires est aléatoire et il est difficile d'évaluer la quantité de CYP2E1 exprimé dans la mitochondrie, après l'une ou l'autre des transfections. C'est pourquoi nous nous dirigeons vers des modèles cellulaires d'hépatome humain HepG2 qui seront infectés par un adénovirus contenant les différentes constructions plasmidiques (adressage uniquement mitochondrial, uniquement réticulum endolasmique, ou dans les deux compartiments). Grâce à ces modèles, nous pouvons espérer un taux d'infection des cellules de 90 %. Il nous faudra ensuite quantifier les pourcentages de CYP2E1 allant dans l'un ou l'autre des compartiments pour les trois constructions plasmidiques en déterminant l'activité enzymatique du CYP2E1 vis-à-vis de l'aniline ou de la chlorzoxazone. Enfin, il sera primordial de déterminer le mode d'insertion du CYP2E1 transfecté dans le réticulum endoplasmique et dans la mitochondrie. Plus généralement, la présence de certains cytochromes inductibles comme le CYP2E1 dans les mitochondries pose de nombreuses questions. En effet, les mitochondries sont des organites spécialisés dans la dégradation de substrats : acides gras, pyruvate et acides aminés afin de générer de l énergie via la phosphorylation oxydative. Bien que pour l'instant nous n'ayons détecté que des effets délétères pour la cellule, il n'est pas impossible, étant donné le rôle crucial des mitochondries pour la vie cellulaire, que la présence d enzymes de détoxication dans la mitochondrie (GST ou autres CYP) puisse avoir également un rôle protecteur. 224 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

225 «Foie» Références Abittan C.S., Lieber C.S. Alcoholic liver disease. Curr Treat Options Gastroenterol 1999, vol. 2, n 1, p Bai J., Cederbaum A.I. Overexpression of CYP2E1 in mitochondria sensitizes HepG2 cells to the toxicity caused by depletion of glutathione. J Biol Chem 2006, vol. 281, n 8, p Chen Q., Cederbaum A.I. Cytotoxicity and apoptosis produced by cytochrome P450 2E1 in HepG2 cells. Mol Pharmacol 1998, vol. 53, n 4, p Chitturi S., Farrell G.C. Etiopathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis. Semin Liver Dis 2001, vol. 21, n 1, p Fromenty B., Grimbert S., Mansouri A., Beaugrand M., Erlinger S., Rötig A., Pessayre D. Hepatic mitochondrial DNA deletion in alcoholics: association with microvesicular steatosis. Gastroenterology 1995, vol. 108, n 1, p Fromenty B., Mansouri A., Degoul F., Demeilliers C., Gaou I., Pessayre D. Vieillissement, alcool et mitochondries. Gastroenterol Clin Biol 2000, vol. 24, n 3, p Haouzi D., Lekéhal M., Moreau A., Moulis C., Feldmann G., Robin M.A., Lettéron P., Fau D., Pessayre D. Cytochrome P450-generated reactive metabolites cause mitochondrial permeability transition, caspase activation, and apoptosis in rat hepatocytes. Hepatology 2000, vol. 32, n 2, p Mashimo K., Ohno Y. Ethanol hyperpolarizes mitochondrial membrane potential and increases mitochondrial fraction in cultured mouse myocardial cells. Arch Toxicol 2006, vol. 80, n 7, p Otani K., Korenaga M., Beard M.R., Li K., Qian T., Showalter L.A., Singh A.K., Wang T., Weinman S.A. Hepatitis C virus core protein, cytochrome P450 2E1, and alcohol produce combined mitochondrial injury and cytotoxicity in hepatoma cells. Gastroenterology 2005, vol. 128, n 1, p Pessayre D., Berson A., Fromenty B., Mansouri A. Mitochondria in steatohepatitis. Semin Liver Dis 2001, vol. 21, n 1, p Petrosillo G., Ruggiero F.M., Pistolese M., Paradies G. Reactive oxygen species generated from the mitochondrial electron transport chain induce cytochrome c dissociation from beef-heart submitochondrial particles via cardiolipin peroxidation. Possible role in the apoptosis. FEBS Lett 2001, vol. 509, n 3, p Raza H., Prabu S.K., Robin M.A., Avadhani N.G. Elevated Mitochondrial Cytochrome P450 2E1 and Glutathione S-Transferase A4-4 in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats: Tissue Specific Variations and Roles in Oxidative Stress. Diabetes 2004, vol. 53, n 1, p Robertson G., Leclercq I., Farrell G.C. Nonalcoholic steatosis and steatohepatitis.ii. Cytochrome P-450 enzymes and oxidation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2001, vol. 281, n 5, p. G1135-G1139. Robin M.A., Anandatheerthavarada H.K., Biswas G., Sepuri N.B., Gordon D.M., Pain D., Avadhani N.G. Bimodal targeting of microsomal CYP 2E1 to mitochondria through activation of an N chimeric signal by camp-mediated phosphorylation. J Biol Chem 2002, vol. 277, n 43, p Robin M.A., Anandatheerthavarada H.K., Fang J.K., Cudic M., Otvos L., Avadhani N.G. Mitochondrial targeted cytochrome P450 2E1 contains an intact N-terminus and requires mitochondrial specific electron transfer protein for activity. J Biol Chem 2001, vol. 276, n 27, p Robin M.A., Sauvage I., Grandperret T., Descatoire V., Pessayre D., Fromenty B. Ethanol increases mitochondrial cytochrome P450 2E1 in mouse liver and rat hepatocytes. FEBS Lett 2005, vol. 579, n 30, p Yan M., Zhu P., Liu H.M., Zhang H.T., Liu L. Ethanol induced mitochondria injury and permeability transition pore opening: role of mitochondria in alcoholic liver disease. World J Gastroenterol 2007, vol. 13, n 16, p Cahiers de l Ireb n 19,

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227 7. «SPORT»

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229 «Sport» ALCOOLS, SPORTS ET ETUDES UNIVERSITAIRES : DES RELATIONS ETROITES STEPHANE HEAS, DOMINIQUE BODIN, LUC ROBENE, GAELLE SEMPE, FLORIAN LEBRETON, YANNICK LE HENAFF, DAMIEN PHILIPPE ET GUILLAUME ROUTIER Laboratoire de recherches en sociologie (LARES, LAS, EA 2241), UFR APS, Université Européenne de Bretagne, avenue Charles Tillon, Rennes - France Summary The relationship between sports, alcohol and sport students are analyzed from direct observations on public and private student celebrations in the city of Rennes, and from semi-structured face to face interviews (N = 20, almost half of young women). Two opposing attitudes address this issue: a frank resistance, or less often a strong enthusiasm. Interviews target two distinct populations: the first-year students and those who are the culmination of the academic (PhD). The trajectories of those surveyed some similarities and strong differences according to their academic level and their sports specialties. The first admitted contact with the alcohol is early, around or even before age 15. It occurs by family member s influences, the father especially, during holidays, weddings or anniversaries. This new contact is «light» as students tell it. Then, years of high school and university couple with most freedom hardened and trivialized alcohol consumption. Gradually, the opportunities to drink alcohol are increasing. A majority of students drink alcohol at least 1 to 3 times per week. It does more than celebrate an anniversary, but appointments weekly, delivered to carpe diem where drunkenness is the ultimate recognition. Sometimes a few hours before, a private meeting is organized in an apartment for example during the week. The weekend always brings a lot of alcoholics opportunities, within the framework of team sports. In doing so, gradually, the occasional becomes habitual and alcohol consumption spread throughout the year, put off periods of examinations. With the advance in studies carrier, a pattern of trivialization is coupled with rationalization. The management of alcohol is an imperative to avoid disappointment (being sick during the evening, sickness the next day, regret gestures or words, etc.) Most respondents whether men or women show alcoholic self-control process, but also concealing the extent of alcoholic impregnation. Indeed, for the youngest students the major consumption is hidden most parents. An unspoken moved these interrelations: parents know well that the evenings are «drinked» and the children/young adults carefully avoid the subject with them. For the vast majority, rationalizing the consumption of alcohol does not exclude pleasured parties. It promotes the adoption of a qualitative alcoholic consumption, cocktail made up for the occasion replace strong spirits drink in large quantities. Thus, while the younger students involve alcohol at the party (and vice versa), older students rationalized their consumption in terms of quality, not quantity. Indeed, older students emphasize the pleasure linked to alcohol consumption and enhance the quality of their consumption rather than quantity. Mots clefs Etudiant en sciences des sports, sport, alcool, jeu «pour boire», routinisation INTRODUCTION Les relations entre sports et alcools sont bien documentées (Stainback, 1997 ; Waddington, 2000 ; Collins et Vamplew, 2002 ; Mottram, 2005). Nous précisons ici la place des alcools dans le cadre des études universitaires, et notamment parmi les étudiants de la filière STAPS (Sciences et Techniques des Activités Physiques et Sportives). Ces derniers se forgent en effet bien souvent une solide réputation de consommateurs alcooliques hors pairs. Qu en est-il vraiment? Comment les étudiants de première année et ceux qui réussissent leur parcours STAPS, les doctorants, vivent-ils leurs Cahiers de l Ireb n 19,

230 consommations d alcool? Leur réputation est-elle galvaudée? Nuit-elle à leur réussite universitaire? Telles sont quelques questions qui ont guidé notre enquête. Comment boivent les étudiant(e)s STAPS à Rennes 2, plus précisément comment vivent-ils leur alcoolisation? Selon la première hypothèse formulée, les étudiant(e)s pratiquant de sports collectifs (tels le football, le handball et le rugby) vont plus loin dans leur alcoolisation étant donné une socialisation ad hoc par les sports collectifs et une surenchère entre pairs où il s agit de boire avec panache. Les théories classiques de P. Bourdieu et de E. Goffman permettent d affiner l analyse avec les concepts de socialisation, habitus d un côté et le «faire face», les rites d interaction et la mise en scène de la vie sportive de l autre. Nous accordons toute notre attention aux étudiants mixant les sports collectifs et individuels. Les étudiant(e)s de première année vivent l acmé de leur alcoolisation, seconde hypothèse, puis, progressivement une rationalisation des comportements réduit sensiblement les consommations. L objectif initial est d analyser les conduites d excès en général et d alcoolisation en particulier, pour mieux saisir s il y a un lien entre excès alcoolique et réussite sportive ou universitaire. Le soubassement théorique relève également de D. Le Breton et V. Nahoum-Grappe qui montrent qu une conduite d excès n est pas exempte de contrôles et que les liens entre les deux sont peut-être proportionnels et en tous les cas valorisés dans le milieu sportif. ELEMENTS DE METHODE Quelles sont les significations et les expériences vécues des enquêté(e)s face à l alcool? Les observations in situ in vivo (12 soirées) et des entretiens en face à face (N = 20) découvrent «la diversité des points de vue (où il s agit) d y mettre un ordre» (Demazière et Dubar, 1997, p.103). Les «homologies structurales», issues de la sémiotique narrative (Greimas, 1966, 1970) comparent les ruptures et continuités des histoires de vie recueillies à travers le repérage d expériences communes à différents individus, l identification d épisodes biographiques similaires mais, aussi et surtout, dans l émergence de logiques sociales et d univers de croyances partagés. Un repérage en trois niveaux des discours a été utilisé (Barthes, 1966, 1981) : le niveau des fonctions dans lequel se déploient les différents événements qui émaillent le récit des étudiant(e)s. Ces événements racontent leurs parcours en réponse à la question : «Pourriez-vous me dire quels sont vos rapports avec l alcool?», le niveau des actions qui mettent en scène des «actants», c est-à-dire des personnages qui sont intervenus, ont participé, ont agi pour faciliter, ou à l inverse contrecarrer, le recours à ces produits alcooliques, le niveau de la narration, qui met en évidence la dimension dialogique du récit, dans lequel le narrateur défend son point de vue, émet des arguments et des thèses, pour convaincre, notamment, l interviewer. Les homologies sont donc des catégorisations a posteriori des discours tenus par les étudiant(e)s à partir de ces trois niveaux d analyse. PRINCIPAUX RESULTATS Les temps variés de l alcool Les consommations alcooliques parmi les étudiant(e)s ne sont pas linéaires et régulières. Des temps forts et des temps faibles sont observés, y compris parfois au cours d une même soirée. Les enquêté(e)s aménagement leurs soirées en fonction des cours du lendemain, et bien sûr des sessions d examens. Nous assistons là à une certaine planification, à quelque chose qui ressemble à un emploi du temps du boire. Il participe de fait à une gestion anticipée de temps libre consacré à une pratique sociale à part entière. Ce qui relativise l hypothèse de la rationalisation plus tard au cours des études. Il y a également une gestion de l alcool par rapport aux compétitions. Suivant l importance des matchs, les étudiant(e)s se permettent de sortir la veille, voire de boire (beaucoup pour certains). Lors d un 230 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

231 «Sport» stage sportif à l étranger, une enquêtée explique qu elle «se l était collée avant un match». Ce qu elle ne se permet pas pendant un match de championnat, jugé plus important. Les consommations alcooliques semblent autrement plus fortes dans la semaine que le week-end. Les jeux et les défis en sont l archétype. Il s agit de «mettre la machine en marche», soit, d ingurgiter progressivement des volumes de plus en plus importants d alcool, de boire plus que les compères de fêtes, devenus des concurrents ou des adversaires, en somme redevenus des sportifs même hors du terrain. Or, la concurrence par alcool interposé est aussi ambiguë que la concurrence sportive et la troisième mi-temps dans les sports collectifs tels le rugby. En effet, les concurrents deviennent des compagnons de boissons. Pendant le jeu à boire il y a une concurrence, mais le concurrent se change rapidement en compagnon de la soirée. Dans ce cadre d émulation groupale, «ne pas boire» devient une attitude suspecte, voire un stigmate difficile à assumer. L étudiant(e) sobre risque de se sentir exclu(e). Le sentiment de ne pas participer au «même délire» le conduit souvent à écourter sa soirée. La place du «conducteur» est à ce titre inconfortable, il endosse à la fois un rôle particulier, valorisé car utile, à la fois il est «chambré» et peut rester spectateur, en dehors de l ambiance. La «soirée» entre étudiant(e)s est alors le strict synonyme de «cuite». Cette dernière n est pas définie précisément, toutefois un critère semble prépondérant : l altération des sensations physiques, avec la difficulté à marcher normalement. La face positive de cette ivresse est répétée comme un leitmotiv par les enquêté(e)s : la consommation d alcool permet de se lâcher et de faire des choses que l on ne ferait pas habituellement, à sortir de l ordinaire, faire des rencontres, etc. La consommation alcoolique en semaine est essentiellement le fait d un entre-soi privé, autrement dit de soirées organisées entre étudiants en appartement. Plusieurs raisons à cela, les prix des alcools dans les établissements spécialisés (bars, boîtes de nuit) sont souvent hors de portée des enquêté(e)s en raison de la quantité d alcool ingérée. Ensuite, certains de ces établissements leur interdisent l entrée souvent. Et pour cause, l état des étudiants provoque parfois des échauffourées, des bagarres suite à la surenchère du boire. Le week-end, les soirées se déroulent, elles aussi, dans des appartements ou dans des maisons. Le groupe est cependant différent et plutôt composé de copains de lycée pour ceux qui pratiquent un sport individuel. Ce groupe semble davantage mixé pour les pratiquants de sports collectifs qui retrouvent parfois le week-end des compagnons de soirées étudiantes (notamment grâce au match de championnats). Il y a là, une première différence entre sports individuels et sports collectifs dans la composition groupale de l entre-soi entre semaine et week-end. Les volumes ingurgités comme standards Comme toutes les consommations dans nos sociétés marchandes, les alcools sont proposés sous des formats particuliers : litres, bouteilles, cannettes, verre, etc. Ces quantités sont évidemment à mettre en rapport avec les proportions d alcool présentes dans les produits proposés. Reste qu à écouter les étudiants, des standards se dégagent clairement. La quantité ingurgitée est très souvent valorisée. Il s agit de boire plusieurs bouteilles de vin rosé par exemple ou encore plusieurs litres de bière. Le coût de l alcool a, en effet, une incidence importante sur les modes de consommations : privilégiant des alcools forts discount ou alors des vins rosés, de la bière considérée comme ayant un meilleur rapport qualité-prix (devons-nous entendre meilleurs rapport effet/prix?!). Concernant les alcools forts, la mise en scène de la performance alcoolique est évidente, elle n est pas nouvelle : «A la moitié d une bouteille je suis déjà saoul. Mais je peux aller beaucoup plus loin. J ai déjà fait une bouteille de sky [whisky] tout seul. Avec des apéros avant et des shooters en boîte par exemple!». Dans les soirées, l alcoolisation entre dans le cadre de joutes réelles et symboliques où ces standards doivent être vérifiés, c est-à-dire les boissons doivent être bues in vivo in situ, difficile d échapper à ces passages à l acte d alcoolisation. Les jeux «pour boire» participent de la logique sportive de l agôn (Caillois, 1958), particulièrement valorisée à la fois dans notre société et au sein même des UFR APS. Cette logique est couplée à la quantification à l œuvre dans notre société et, a fortiori, dans les sports (Héas, 2006). Les leaders à ces jeux tiennent l alcool et sont reconnus pour cela. Les quantités absorbées ne sont pas systématiquement et strictement comptabilisées, par contre, les performances alcooliques prennent souvent des allures de records à battre. Par exemple, l un des étudiants de 20 ans, volleyeur à un niveau prénational parle des shooters, soit, du whisky versé dans le bouchon de la bouteille : «On le Cahiers de l Ireb n 19,

232 brûle j avais bu 27 shooters un truc comme ça plus les apéros avant. Et du coup [rires] c était pendant la coupe du monde 2006 et au bout mes potes m avaient rasé les jambes!». Apparaissent parfois des effets pervers de la spirale de ces rencontres alcooliques étudiantes. Certains n ont pas hésité à nous indiquer qu ils restreignaient leur alimentation afin d avoir suffisamment d argent pour participer aux soirées prévues à l avance, notamment le jeudi soir. Une spécificité STAPS? Aujourd hui, les étudiant(e)s STAPS ne sont plus sélectionné(e)s par leurs APS. Désormais, nombreux sont ceux qui ne pratiquent pas régulièrement, ni même dans un cadre fédéral. En ce sens, la différence entre les profils des STAPS et des autres étudiants s est réduite depuis l abandon de la sélection à l entrée. Logiquement, les enquêté(e)s estiment largement qu il n y a pas de différences fondamentales entre leurs manières de boire et les autres étudiant(e)s. Les soirées organisées par d autres filières comme Médecine et les écoles de commerce et d ingénieur sont aussi marquées par des consommations particulièrement importantes d alcool. Deux exceptions notables toutefois : les rencontres sportives et l importance de l étiquette STAPS. Ils reconnaissent, en effet, que les compétitions (avec leur lot de déplacements en bus, en voiture, loin de chez soi) sont des occasions supplémentaires de boire. Les victoires difficiles sur l équipe d un soir sont des moments propices à boire beaucoup plus qu à l accoutumée. Comme si une victoire «un peu dure» physiquement et mentalement se devait d être relayée par un autre engagement corporel : boire ensemble au-delà des doses habituelles. Ce boire collectif entraîne immanquablement des surenchères, comme si ces joutes étaient le pendant des joutes sportives qui les ont précédées. Notons aussi la complicité des membres et des responsables des clubs sportifs qui sont au courant de ces pratiques et qui pourtant laissent les clefs du bar et de la salle où s est déroulé le match, voire qui participent directement à ces beuveries d après match Les étudiant(e)s STAPS sont aussi contraint(e)s par leur réputation historique. Lors des soirées, et plus particulièrement le jeudi soir à Rennes, tout se passe comme s ils étaient «attendus au tournant» : «Oui, oui [en première année] on était challenge, débile, bébête même. Surtout pour les gars Je pense que c était une question d étiquette. On était fière d être en STAPS». En un sens cette réputation les contraint à faire preuve d une grande capacité à boire et à résister. Il y a en effet une certaine forme de défi et d adhésion au groupe : «alors t es un STAPS ou pas?», qui, pour les enquêtés, prend également la forme d une concurrence géographique : «moi, je suis Morbihannais, et on a une réputation à tenir quand même!». Un modèle d inconduite tolérée et contrôlée L idée de la rencontre «pour boire» est une conduite acceptée par la culture STAPS et plus largement par la culture étudiante. L action de boire au sein d un collectif est très souvent explicitée dans les entretiens. Les enquêté(e)s savent que ce boire collectif est loin d être acceptable aux yeux de tous (acteurs politiques et sanitaires de la ville par exemple, médias, etc.). Ils ont conscience de participer à une forme de délinquance tolérée seulement à l intérieur du groupe de pairs Cette alcoolisation est ce qu il ne faut pas faire en dehors du milieu étudiant, mais c est pourtant une déviance agréée au sein du groupe estudiantin. Les enquêtées, les jeunes femmes, précisent qu elles tentent de contrôler leur consommation, même si elles n y parviennent pas toujours, le groupe de copines est toujours présent pour éviter des dérapages qui pourraient être lourds de conséquences. C est plus particulièrement le cas dans les relations à l autre sexe : «et puis je suis toujours avec des copines enfin voilà, on fait attention entre nous!». Le boire féminin semble davantage prendre les contours d une pratique de type parenthèses. Elles déclarent souvent au regard de certains copains qu elles côtoient qu ils sont déjà «trop dedans», et que cela risque de leur poser des problèmes dans le futur. En ce sens, la période étudiante apparaît circonscrite. Par conséquent, il s agit d en profiter, d en abuser tout en gardant en tête que c est une période définie et circonscrite, tout en maintenant aussi des garde-fous (notamment sexuels). 232 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

233 «Sport» Il n est pas rare non plus d entendre les étudiant(e)s parler d une autorégulation de leur consommation alcoolique sous une forme un peu particulière, il est vrai. En première année, trois sorties ne sont pas rares sur une semaine. L une d elle est souvent dite «soft», entendre sans alcools forts. Dans ces soirées, ils et elles s autorisent tout de même la bière et des boissons alcoolisées sucrées, certains parlent «d alcool de femme». Le contrôle alcoolique prend aussi la forme de supposés antidotes et/ou des moyens de tenir le rythme des soirées qui s enchaînent. Le café, les boissons énergétiques pour les sportifs, mais aussi les médicaments de type Doliprane, Spasfon ou Citrate de Bétadine (aussi efficaces?!), complètent la panoplie. Elles permettent de tenir le cap et le coup à la fois lors des soirées et ensuite à l université. Il s agit de connaître l ivresse, mais sans tomber malade, ce qui va à l encontre des représentations récentes sur le binge drinking (qui nous laisse penser que ces étudiants recherchent l excès jusqu à être malades). Cela dit, la santé est loin d être la priorité. Cela concerne davantage les activités du lendemain, soit une vue à très court terme des retombées alcooliques. La poursuite d études : une raison en action? La comparaison entre les primo entrants à l université, ici en STAPS et ceux qui poursuivent leurs études, parfois jusqu à leur terme (la thèse), est intéressante. On assiste progressivement à une exigence accrue dans la qualité des alcools consommés et à une modération intime des consommations alcooliques. Si «se mettre minable» était de rigueur à l entrée à l université, plus tard, la cuite est dissociée progressivement de la fête. Lorsque l alcool permettait de prolonger la sortie tard dans la nuit pour les primo entrants, ensuite, il n en est plus l ingrédient essentiel, même s il n a pas totalement disparu. L alcoolisation excessive et la cuite prennent des allures péjoratives. Malgré le retentissement de la campagne de prévention des risques liés à la consommation d alcool à Rennes, les enquêté(e)s n ont pas abordé souvent ce point lors des entretiens. Certains ont toutefois été particulièrement interpellés par ces visuels de choc et ont depuis tenté de mieux gérer leurs consommations depuis. Références Barthes R. Introduction à l analyse structurale du récit. Communications 1966, n 8, p Barthes R. L analyse structurale du récit. Le Seuil, coll. Points et Essais, Paris 1981, n 129, 178 p. Caillois R. Les jeux et les hommes. Gallimard, Paris 1958, 378 p. Collins T., Vamplew W. Mud, Sweat and Beers. A Cultural History of Sport and Alcohol. Berg Editions, NY, 2002, 151 p. Demazière D., Dubar C. Analyser les entretiens biographiques. Nathan, Paris 1997, 350 p. Greimas A.J. Du sens. Essais sémiotiques. Le Seuil, Paris 1970, 318 p. Greimas A.J. Sémantique structurale. Larousse, Paris 1966, 262 p. Héas S. Normes. In, Andrieu B. (dir.) Le dictionnaire du corps. Editions du CNRS, Paris, 2006, février, p Mottram D. R. Drugs in Sport. Taylor & Francis, NY 2005, 420 p. Stainback R.D. Alcohol and Sport. Human Kinetics 1997, 219 p. Waddington I. Sport, Health and Drugs: A Critical Sociological Perspective. Taylor & Francis, London 2000, 214 p. Cahiers de l Ireb n 19,

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235 «Sport» EFFETS COMBINES D UNE CONSOMMATION CHRONIQUE D ALCOOL ET DE L EXERCICE PHYSIQUE SUR LE CONTENU, LA DENSITE MINERALE OSSEUSE, L ARCHITECTURE OSSEUSE, ET LE REMODELAGE OSSEUX CHEZ LE RAT DELPHINE MAUREL 1, NATHALIE BOISSEAU 2, CLAUDE-LAURENT BENHAMOU 1 ET CHRISTELLE JAFFRE 1 1 Unité INSERM 658, Caractérisation du tissue osseux par imagerie : techniques et applications, Hôpital Porte Madeleine, 1 rue Porte Madeleine, BP 2439, Orléans Cedex 01 - France 2 Laboratoire des Adaptations Physiologiques aux Activités Physiques (LAPHAP), EA 3813, Faculté des Sciences du Sport, 4 allée Jean Monnet, Poitiers - France Summary Introduction: It is well known that chronic alcohol consumption decreases bone quality and quantity (BMC, BMD, bone turnover). On the opposite, physical activity has positive effects on bone metabolism. The aim of this study is to analyze the effects of a chronic alcohol consumption associated to a physical training on bone metabolism in rats. Method: 48 male Wistar rats have been divided into 4 groups: Controls, Alcohol, Exercise and Alcohol + Exercise groups. The rats from the Alcohol and the Alcohol + Exercise groups drank a solution composed of 20% of ethanol and 80% of water. The rats from the Exercise and Alcohol + Exercise groups have been trained on a treadmill for 2 months (40-45 min, 5 times a week). Results: We did not observe any significant difference between the groups for BMC, BMD, and for the microarchitectural parameters. Alcohol increases bone resorption while exercise increases both bone formation and bone resorption. Conclusion: Exercise helps limiting the deleterious effects of alcohol on bone remodelling. Mots-clefs Alcool, activité physique, métabolisme osseux, rat INTRODUCTION Il est maintenant bien connu que la consommation chronique d alcool diminue la densité minérale osseuse (DMO), le contenu minéral osseux (CMO) et la résistance osseuse. Nyquist et al. (1999) ont ainsi montré chez le rat une diminution de la DMO totale à la suite d une consommation chronique d alcool tandis que Nishiguchi et al. (2000) observent, quant à eux, une diminution de la DMO totale ou des vertèbres ainsi qu un moindre CMO total chez le rat et la ratte. Chez l homme, il a été observé, dans plusieurs études, que la consommation d alcool entraîne une diminution de la formation osseuse, en raison d une inhibition de la prolifération et de l activité des ostéoblastes (Klein, 1997 ; Nyquist et al., 1996 ; Dyer et al., 1998). Medras et Jankowska (2000) observent que la prise d alcool diminue la masse osseuse en affectant également l activité des ostéoclastes, et donc en modifiant la résorption osseuse. La consommation d éthanol fragilise ainsi les os, bouleverse le processus de remodelage osseux, ce qui diminue leur résistance et les rend plus vulnérables lorsqu ils sont soumis à des charges importantes. A l opposé, l exercice physique améliore le CMO ainsi que la DMO chez le rat comme chez l Homme. Newhall et al. (1991) ont montré que l activité physique augmente la longueur, le poids et le volume de la fibula et du fémur chez des rats actifs comparés à des rats contrôles. Le CMO et la DMO étaient également supérieurs chez les rats actifs comparés aux rats contrôles. Cela a été Cahiers de l Ireb n 19,

236 démontré avec différentes activités physiques (Notomi et al., 2001 ; Yeh et al., 1993). Cependant, il semblerait que les os soient différemment stimulés suivant le type de pratique physique réalisé. En effet, il a été observé chez le rat que le CMO et la DMO du tibia et du fémur étaient augmentés après que les rats aient couru sur une roue, sur un tapis roulant ou qu ils aient grimpé à une tour, alors que la DMO des vertèbres n était seulement augmentée qu avec le tapis roulant. Il semble en fait que l influence positive de l activité physique sur l os soit liée aux forces de gravité puisqu il est reporté que la natation, sport hypo gravitaire, n engendre pas d amélioration du CMO ni de la DMO (Bourrin et al., 1992). Compte tenu des effets positifs de l exercice, il est possible de penser que la pratique sportive permettrait de limiter les effets délétères de la consommation chronique d alcool sur les paramètres osseux. Or à ce jour et à notre connaissance, une seule étude s est intéressée aux effets d une prise chronique d alcool combiné à l exercice physique chez le rat. Cette seule étude n a pas permis de mettre en évidence une amélioration du CMO ou de la DMO suite à l entraînement (Reed et al., 2002). En augmentant cette quantité d entraînement, nous aimerions mettre en évidence les effets de l activité physique régulière sur la masse, la densité ainsi que sur le remodelage osseux chez des rats alcoolisés de façon chronique. MATERIEL ET METHODE Cette étude a été réalisée sur 48 rats Wistar mâles (CPA, France) âgés de 2 mois en début d expérience. Les rats ont été répartis en quatre groupes : Contrôle (C), Alcool (A), Exercice (E) et Alcool+Exercice (AE). Le protocole a duré 8 semaines. Les rats des groupes Alcool (A) et Alcool+Exercice (AE) ont bu ad libitum une solution composée d éthanol et d eau durant ces 8 semaines. Le pourcentage d éthanol dans la solution a été augmenté progressivement de 8 % à 20 % (v/v). Comme la boisson, les aliments étaient consommés à volonté (aliment A04, SAFE, France). Les quantités hydriques et solides consommées ont été vérifiées chaque semaine. Les rats des groupes Exercice (E) et Alcool+Exercice (AE) ont été entraînés sur tapis roulant cinq fois par semaine, à raison de 40 à 45 minutes par jour (intensité équivalente à ± 50 % des capacités maximales). La vitesse du tapis a été augmentée au cours des 8 semaines de10 m.min -1 à 22,5 m.min -1. Les rats ont été pesés chaque semaine. CMO et DMO La densité minérale osseuse du corps entier (DMO) et le contenu minéral osseux du corps entier (CMO) ont été évalués par absorptiométrie biphotonique à rayons X (DXA) (Discovery, Hologic, USA) au début du protocole et huit semaines plus tard. L appareil nous a permis de mesurer également la composition corporelle (masse maigre, masse grasse). Microarchitecture Les paramètres microarchitecturaux du fémur gauche ont été obtenus par microtomographie à rayons X après le sacrifice (Skyscan 1072, Belgique). Ces paramètres comprennent : le volume du tissu osseux (TV en mm 3 ), le volume des trabécules osseuses (BV en mm 3 ), la proportion de volume osseux correspondant au rapport du volume des trabécules osseuses sur le volume de tissu osseux (BV/TV en %), la surface du tissu (TS en mm 2 ), la surface de l os (BS en mm 2 ), l épaisseur des trabécules osseuses (Tb.Th en mm), le nombre de trabécules osseuses (Tb.N en 1/mm), la taille des espaces entre les trabécules osseuses (Tb.Sp en mm) et le degré d anisotropie DA qui caractérise l orientation de la structure dans l espace. 236 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

237 «Sport» Remodelage osseux Le remodelage osseux a été analysé à partir des échantillons sanguins prélevés le jour des absorptiométries, juste avant le sacrifice. Les marqueurs retenus pour étudier le remodelage osseux sont l ostéocalcine pour la formation osseuse et les crosslaps du collagène (CTx) pour la résorption osseuse. La mesure de l ostéocalcine a été réalisée avec le kit commercial Metra Osteocalcin (Quidel Corporation, USA) et les CTx ont été mesurés avec un kit commercial de type ELISA (Nordic Bioscience Diagnostics, Danemark). La procédure concernant l entretien et le sacrifice des animaux était en accord avec les standards européens concernant l entretien et l utilisation des animaux de laboratoire (Ministère de l agriculture, France, Authorisation INSERM45-001). RESULTATS Les concentrations en ostéocalcine sont significativement supérieures dans les groupes E et AE comparés au groupe A (respectivement 27,12 ± 2,1 et 27,39 ± 2,7 vs 21,05 ± 2,3 ng.ml -1, p = 0,001 et p = 0,002) (Figure 1). Les concentrations en CTx dans les groupes A, E et AE sont significativement supérieures à celles du groupe C, avec une concentration significativement plus importante pour les groupes E et AE comparés au groupe A (respectivement 101,39 ± 4,6 ; 127,65 ± 4,0 et 143,42 ± 3,7 vs 49,00 ± 5,7 ng.ml -1, p = 0,001, p = 0,0001 et p = 0,0004) (figure 2). OC CTx 35, , , [C] (ng/ml) 20,00 15,00 10,00 ng/ml ,00 0,00 C A E AE C A E AE Figure 1 : concentrations en ostéocalcine (OC). Figure 2 : concentrations en CTx. C : groupe Contrôle. A : groupe Alcool. E : groupe Exercice. AE : groupe Alcool+Exercice. Les résultats sont exprimés sous la forme moyenne ± SEM. Concernant la microarchitecture, la proportion de volume osseux (BV/TV) est significativement inférieure dans le groupe AE comparé aux groupes C et A (respectivement 57,21 ± 4,67 vs 64,81 ± 3,52 et 63,8 5± 7,32 %, p = 0,004 et p = 0,03). Nous n avons pas observé de différence significative entre les groupes en ce qui concerne le contenu minéral osseux du corps entier suite aux huit semaines (C : 14,5 ± 0,7 ; A : 14,6 ± 0,7 ; E : 13,9 ± 0,7 ; AE : 14,2 ± 0,5 g, p = non significatif) (Figure 3). Aucune différence significative n apparaît également entre les groupes pour la densité minérale osseuse du corps entier en post test (C : 0,17 ± 0,004 ; A : 0,18 ± 0,006 ; E : 0,17 ± 0,006 ; AE : 0,18 ± 0,005 g.cm -2, p = non significatif) (Figure 4). Cahiers de l Ireb n 19,

238 CMO DMO 18,00 17,00 16,00 15,00 14,00 13,00 12,00 11,00 10,00 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 C A E AE 0,20 0,19 0,18 0,17 0,16 0,15 0,14 0,13 0,12 0,11 0,10 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 C A E AE Figure 3 : contenu minéral osseux du corps Figure 4 : densité minérale osseuse du corps entier entier à la fin du protocole. à la fin de l étude. C : groupe Contrôle. A : groupe Alcool. E : groupe Exercice. AE : groupe Alcool+Exercice. Les résultats sont exprimés sous la forme moyenne ± écart-type. DISCUSSION Notre étude met en évidence que le remodelage osseux est modifié par la consommation chronique d alcool et par l activité physique régulière sans modification, à ce stade, de la DMO et du CMO. La consommation chronique d alcool affecte ici les fonctions ostéoclastique et ostéoblastique, comme l ont montré Medras et Jankowska en La résorption osseuse est accrue et la formation osseuse est inhibée chez nos rats alcoolisés comme en témoigne la plus faible concentration en ostéocalcine dans le groupe A comparé au groupe C. D autre part, l exercice physique augmente à la fois la résorption et la formation osseuse (concentrations en ostéocalcine et en CTx supérieures dans les groupes E et AE comparées aux groupes C et A). La formation osseuse est supérieure dans le groupe AE comparé au groupe A, ce qui montre un effet positif de l exercice sur le remodelage osseux chez les rats alcoolisés. En revanche comme Reed et al. (2002), nous n avons pas observé d amélioration du CMO et de la DMO chez les rats alcoolisés et entraînés comparés aux rats sédentaires alcoolisés. De plus, nous n avons pas pu montrer d «effet exercice» sur les paramètres microarchitecturaux. Cela peut être dû au modèle utilisé, c est-à-dire la quantité d alcool ingéré par jour et/ou le volume et l intensité de l entraînement choisi, ou encore, la durée de notre étude. Cette deuxième hypothèse est peu valide car certains protocoles de huit semaines ont réussi à démontrer quant à eux l effet positif de l entraînement physique (Notomi et al., 2001) ou un effet négatif de l alcool sur le CMO et la DMO (Nishiguchi et al., 2000). Dans notre étude, la quantité d alcool et la durée des sessions d entraînement étaient inférieures et pourraient justifier nos résultats. Dans la littérature, il a été montré que des quantités d alcool représentant 26 % et 36 % de l apport énergétique total quotidien (AETQ) ont un impact négatif sur l os. Dans cette étude, nous avons utilisé un nouveau modèle afin de mieux imiter le comportement humain. Dans ce modèle, nous séparions la nourriture de la boisson qui intégrait ou non l alcool. La quantité d énergie quotidienne apportée par l alcool représentait, dans notre étude, 22 à 25 % de l AETQ. Concernant l exercice, Yeh et al. (1993) ont réussi à montrer une augmentation de la quantité d os après entraînement des rats sur tapis roulant pendant neuf semaines, à raison de cinq séances par semaine. Chacun des entraînements durait une heure. Dans notre étude, les rats étaient entraînés pendant 40 à 45 minutes par jour, cinq fois par semaine. La quantité d alcool ainsi que la durée des entraînements devraient être accentuées dans le futur afin d observer un effet potentiel de l alcool sur la microarchitecture osseuse, ainsi que sur le contenu et la densité minérale osseuse. 238 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

239 «Sport» Nos résultats montrent tout de même que le modèle que nous avons utilisé est valide, puisqu il permet d observer des différences entre les groupes ayant consommé ou non de l alcool. Cette étude montre aussi que l exercice physique a un effet positif sur le remodelage osseux et permet de limiter les effets délétères de l alcool sur l os. Références Bourrin S., Ghaemmaghami F., Vico L., Chappard D., Gharib C., Alexandre C. Effect of a five-week swimming program on rat bone: a histomorphometric study. Calcif Tissue Int 1992, vol. 51, n 2, p Dyer S.A., Buckendahl P., Sampson H.W. Alcohol consumption inhibits osteoblastic cell proliferation and activity in vivo. Alcohol 1998, vol. 16, n 4, p Klein R.F. Alcohol-induced bone disease: impact of ethanol on osteoblast proliferation. Alcohol Clin Exp Res 1997, vol. 21, n 3, p Medras M., Jankowska E.A. The effect of alcohol on bone mineral density in men. Przegl Lek 2000, vol. 57, n 12, p Newhall K.M., Rodnick K.J., Van Der Meulen M.C., Carter D.R., Marcus R. Effects of voluntary exercise on bone mineral content in rats. J Bone Miner Res 1991, vol. 6, n 3, p Nishiguchi S., Shiomi S., Tamori A., Habu D., Takeda T., Tanaka T., Ochi H. Effect of ethanol on bone mineral density of rats evaluated by dual-photon X-ray absorptiometry. J Bone Miner Metab 2000, vol. 18, n 6, p Notomi T., Okimoto N., Okazaki Y., Tanaka Y., Nakamura T., Suzuki M. Effects of tower climbing exercise on bone mass, strength, and turnover in growing rats. J Bone Miner Res 2001, vol. 16, n 1, p Nyquist F., Halvorsen V., Madsen J.E., Nordsletten L., Obrant K.J. Ethanol and its effects on fracture healing and bone mass in male rats. Acta Orthop Scand 1999, vol. 70, n 2, p Nyquist F., Ljunghall S., Berglund M., Obrant K. Biochemical markers of bone metabolism after short and long time ethanol withdrawal in alcoholics. Bone 1996, vol. 19, n 1, p Reed A.H., McCarthy H.L., Evans G.L., Turner R.T., Westerlind K.C. The effects of chronic alcohol consumption and exercise on the skeleton of adult male rats. Alcohol Clin Exp Res 2002, vol. 26, n 8, p Yeh J.K., Aloia J.F., Tierney J.M., Sprintz S. Effect of treadmill exercise on vertebral and tibial bone mineral content and bone mineral density in the aged adult rat: determined by dual energy X-ray absorptiometry. Calcif Tissue Int 1993, vol. 52, n 3, p Cahiers de l Ireb n 19,

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241 8. «VULNERABILITE : IMPACTS BIOLOGIQUES»

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243 «Vulnérabilité : impacts biologiques» GENETIQUE DES COMPORTEMENTS ADDICTIFS : ANALYSE DE GENES CANDIDATS DE L ANIMAL A L HOMME YANN LE STRAT 1, SABAH KELAÏ 1, FLORENCE NOBLE 2, GILLES MAUSSION 1, JEAN-MARIE MOALIC 1, MICHEL SIMONNEAU 1, PHILIP GORWOOD 1,3 ET NICOLAS RAMOZ 1 1 INSERM U675, IFR02, Faculté de Médecine Xavier Bichat, 16 rue Henri Huchard, Paris - France 2 INSERM U705/CNRS UMR 7157, Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Hôpital Fernand-Widal, 200, rue du Faubourg Saint-Denis, Paris - France 3 Clinique des Maladies Mentales et de l'encéphale (CMME), Hôpital Sainte-Anne, 1 rue Cabanis, Paris - France Summary Alcohol dependence (AD; MIM ) is a major public health problem which results from many factors of risk, including genetics. In 247 AD patients, we previously observed a significant association between AD clinical features and single nucleotide polymorphisms (SNPs) encompassing the DRD2 and ANKK1 genes in 11q23.1 region. Here, we analyzed SNPs covering the DRD2-ANKK1 locus, extended to TTC12 and NRCAM1 genes, in 146 families of the Collaborative Studies on Genetics of Alcoholism (COGA), including 406 AD patients, siblings and parents. Using Family- Based Association Test, we found an association between AD and SNPs encompassing the NCAM1 gene, suggesting a modest role of their genetic marker and alcohol dependence in most of the AD families. Furthermore, we also investigated a novel AD candidate gene, named HANGOVER that was identified in alcohol tolerance in fruitfly. In COGA cohort, two SNPs were found significantly overtransmitted with AD. This confirmed previous observation on Irish AD patients and HANGOVER association. Finally, gene expression analysis in Accumbens, Pallidum and Subthalamic Nucleus of mice in early developmental step of addiction, allows us to identify novel AD candidate genes that will be screened in the COGA cohort to search gene-gene interactions and the weight of association with specific subgroups of AD patients with any clinical feature or severity of alcohol dependence. Mots clefs Alcoolo-dépendance, COGA, DRD2, ANKK1, HANGOVER, SNP INTRODUCTION L alcoolo-dépendance (AD ; MIM ), de part sa fréquence dans la population générale et le coût de sa prise en charge, constitue un problème de santé publique majeur. Cette dépendance résulte de nombreux facteurs de risque, et notamment génétiques puisque son héritabilité est estimé à ~50 % (Ramoz et al., 2006 ; Le Strat et al., 2008). Le gène DRD2, codant le récepteur dopaminergique D2, est un candidat majeur de susceptibilité à l'alcoolo-dépendance. Ainsi la méta-analyse de l allèle TaqI- A1, ou allèle T du polymorphisme nucléotidique (SNP) rs , montre clairement le rôle modéré mais très significatif de ce variant dans la vulnérabilité à l alcoolo-dépendance (Ramoz et al., 2006). Le polymorphisme rs est extra-génique au DRD2 puisqu il est situé 9,4 kb en aval de son codon stop. Il est localisé dans un nouveau gène ANKK1, découvert dans l unité et codant pour la protéine X-kinase (Dubertret et al., 2004). Enfin, deux autres gènes, TTC12 et NCAM1, sont également localisés dans ce locus (Le Strat et al., 2008). L analyse de 12 SNPs dans la région DRD2- ANKK1 nous avait permis d identifier des associations significatives à l alcoolo-dépendance et à des sous-groupes cliniques de sévérité, tels que l âge de début moyen de l AD chez les hommes, la consommation d'alcool et son retentissement (MAST élevée) chez les femmes, ou les antécédents de Cahiers de l Ireb n 19,

244 tentative de suicide chez une population de 247 patients (Ramoz et al., 2007). De plus, trois autres travaux ont confirmé une association entre des variants de ce locus et l AD (Ponce et al., 2008 ; Dick et al., 2007 ; Yang et al., 2007). Aussi, nous analyserons des marqueurs génétiques de cette région sur la cohorte familiale du consortium sur les études génétiques à l alcool-dépendance (COGA), pour confirmer ces observations et affiner la région impliquée. L intérêt majeur d étudier une cohorte familiale, à l instar de cas versus contrôles, est de ne pas avoir de biais de stratification, tels que l origine géographique, l âge ou le sexe. De part la grande hétérogénéité de l AD, il est vraisemblable que plusieurs gènes soient impliqués dans la dépendance. Ainsi, il a récemment été mis en évidence un gène de tolérance à l alcool, nommé ZNF699 ou HANGOVER (Scholz et al., 2005). Ce gène est localisé en 19p13.2 et code un facteur de transcription à doigts de zinc. L étude de 7 SNPs chez 547 patients, 484 apparentés atteints et 597 contrôles de la population Irlandaise a montré que la combinaison de ces marqueurs, ou haplotype, est significativement associée à l AD. De plus, les sujets porteurs de cet haplotype ont une expression réduite de HANGOVER dans la région cérébrale préfrontale dorsolatérale (Riley et al., 2006). Nous avons donc également étudiés des SNP s couvrant HANGOVER sur la cohorte COGA. MATERIEL ET METHODES Patients Nous disposons de l ADN génomique de 712 proposants, parents et apparentés de 146 familles de la cohorte COGA du consortium américain sur les études génétiques à l alcoolo-dépendance mis en place par le National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (Schuckit et al., 1994). Les critères d inclusion sont ceux de l alcoolo-dépendance décrits dans le DSM-III-R, DSM-IV et la CIM-10. Cela représente un total de 406 patients AD et 306 apparentés sains. Génotypage Le génotypage des 14 polymorphismes génétiques pour la région chromosomique NCAM1-DRD2 et des quatre variants pour le gène HANGOVER a été réalisé selon le protocole de PCR Taqman SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems). La réaction de PCR a été effectuée dans un volume final de 7 µl, en présence de 10 ng d ADNg, du mix de PCR et pour chaque SNP des amorces de PCR et des sondes fluorophores spécifiques de chaque allèle, dans les conditions d amplification suivantes : 10 minutes à 95ºC de dénaturation et d activation de la Taq polymérase, puis 15 secondes à 92ºC de dénaturation et une minute à 60ºC d hybridation/élongation pendant 40 cycles. La détection de la fluorescence correspondant à chaque allèle a été réalisée en temps réel dans un Opticon 2 (BioRad-MJ Research). Analyses statistiques Le calcul du taux d hétérozygotie, de la fréquence de l allèle mineur (MAF), de l équilibre de Hardy- Weinberg et du déséquilibre de liaison entre les marqueurs a été réalisé avec le programme Haploview 4.1. Le test de déséquilibre de transmission (TDT) pour rechercher une association a été calculé avec ce même programme. Les distributions alléliques et génotypiques ont également été comparées avec le programme Family-Based Association Test (FBAT 1.73). RESULTATS ET DISCUSSION Association de l AD et de marqueurs du locus NCAM1-DRD2 Le génotypage des 14 marqueurs génétiques du locus NCAM1-TTC12-ANKK1-DRD2 (Figure 1) a montré que le marqueur rs n était pas en équilibre de Hardy-Weinberg. 244 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

245 «Vulnérabilité : impacts biologiques» Parmi les SNP s, rs et rs sont associés à l AD par le test familial FBAT (Tableau 1). De plus, trois autres variants présentent également une tendance à l association (rs618114, rs et rs ). L absence d association par déséquilibre de transmission suggère que les marqueurs associés ont un effet modeste mais global sur la majorité des familles. Il est également à noter que nous ne répliquons pas l association avec des marqueurs des gènes DRD2 et ANKK1. Cette association pourrait donc être plus spécifique de sous-groupes cliniques plus sévères dans la dépendance à l alcool, qu il conviendra de définir. Figure 1 : organisation génomique du locus NCAM1-DRD2 et déséquilibre de liaison entre SNP. SNP Position Gène Hétérozygotie Allèle mineur Allèles TDT FBAT additif FBAT récessif rs NCAM1 0,438 0,442 C:A 0,052 0,108 0,009 rs NCAM1 0,261 0,161 C:T 0,089 0,024 0,022 rs NCAM1 0,43 0,343 G:A 1 0,807 0,089 rs TTC12 0,478 0,397 T:G 0,183 0,089 0,067 rs TTC12 0,45 0,372 A:C 0,221 0,489 0,152 rs TTC12 0,454 0,376 A:G 1 0,588 0,405 rs ANKK1 0,44 0,336 C:A 0,526 0,237 0,088 rs ANKK1 0,374 0,462 A:G 0,077 0,031 0,735 rs ANKK1 0,502 0,388 C:T 0,787 0,695 0,569 rs ANKK1 0,329 0,192 T:C 0,647 0,457 0,445 rs DRD2 0,222 0,118 T:G 0,683 0,51 0,362 rs DRD2 0,455 0,424 C:T 0,727 0,822 0,766 rs DRD2 0,467 0,498 T:C 0,528 0,264 0,282 rs DRD2 0,008 0,004 G:A 0, Tableau 1 : association génétique de l AD et des marqueurs du locus NCAM1-DRD2. Cahiers de l Ireb n 19,

246 Association de l AD et de marqueurs du gène HANGOVER Le génotypage de quatre SNPs du gène HANGOVER a permis d observer une association pour les SNP s rs et rs avec l AD par le test de déséquilibre de transmission (Figure 2). En effet, on montre une sur-transmission d un allèle spécifique pour chacun de ces SNPs. Pour le rs cela confère un Odds Ratio (OR) de 1,75 avec un intervalle de confiance (IC) à 95 % compris entre 1,06 et 2,89. Pour le rs , cela confère un OR de 1,42 avec un IC 95 % de 1,02 à 1,97 (Tableau 2). Cependant, ces associations ne sont pas retrouvées par les tests d association familiale additive ou récessive. Cela suggère que seulement quelques familles présenteraient une association entre le gène HANGOVER et l AD. Figure 2 : organisation génétique de HANGOVER et déséquilibre de liaison entre SNP. SNP Position Hétérozygotie additif récessif MAF Allèles TDT FBAT FBAT rs ,446 0,355 C:T 0,105 0,152 0,056 rs ,253 0,153 C:G 0,027 0,541 0,536 rs ,467 0,454 T:C 0,038 0,219 0,306 rs ,479 0,451 G:T 0,167 0,179 0,253 Tableau 2 : association génétique entre les variants du gène HANGOVER et l AD. CONCLUSION Nous avons identifié des associations entre plusieurs SNP s et l alcoolo-dépendance, cela pour le locus NCAM1-DRD2 et le gène HANGOVER dans la cohorte familiale COGA. Par ailleurs, nous avons récemment développé un protocole chez la souris qui permet d identifier les gènes dont l expression est dérégulée durant la phase précoce de l addiction pour les régions cérébrales impliquées dans les processus de récompense, le noyau accumbens, le pallidus, ainsi que le noyau subthalamique (Kelai et al., 2008). Ces gènes, tels que NRXN3, sont de nouveaux candidats pour l alcoolo-dépendance qu il convient d évaluer dans la cohorte COGA. De plus, cela permettra d identifier les interactions gènegène, avec HANGOVER, NCAM1, ANKK1 et DRD2. Cela devrait également permettre d identifier les 246 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

247 «Vulnérabilité : impacts biologiques» gènes impliqués spécifiquement avec un trait clinique particulier, ou la sévérité de l alcoolodépendance. Références Dick D.M., Wang J.C., Plunkett J., Aliev F., Hinrichs A., Bertelsen S., Budde J.P., Goldstein E.L., Kaplan D., Edenberg H.J., Nurnberger J. Jr, Hesselbrock V., Schuckit M., Kuperman S., Tischfield J., Porjesz B., Begleiter H., Bierut L.J., Goate A. Family-based association analyses of alcohol dependence phenotypes across DRD2 and neighboring gene ANKK1. Alcohol Clin Exp Res 2007, vol. 31, n 10, p Dubertret C., Gouya L., Hanoun N., Deybach J.C., Ades J., Hamon M., Gorwood P. The 3' region of the DRD2 gene is involved in genetic susceptibility to schizophrenia. Schizophr Res 2004, vol. 67, n 1, p Kelai S., Maussion G., Noble F., Boni C., Ramoz N., Moalic J.M., Peuchmaur M., Gorwood P., Simonneau M. Nrxn3 upregulation in the globus pallidus of mice developing cocaine addiction. Neuroreport 2008, vol. 19, n 7, p Le Strat Y., Ramoz N., Schumann G., Gorwood P. Molecular genetics of alcohol dependence and related endophenotypes. Current Genomics 2008, vol. 9, n 7, p Ponce G., Hoenicka J., Jiménez-Arriero M.A., Rodríguez-Jiménez R., Aragüés M., Martín-Suñé N., Huertas E., Palomo T. DRD2 and ANKK1 genotype in alcohol-dependent patients with psychopathic traits: association and interaction study. Br J Psychiatry 2008, vol. 193, n 2, p Ramoz N., Le Strat Y., Pickering P., Burger V., Gorwood P. Association génétique entre l X-kinase et l alcoolo-dépendance. Cahiers de l IREB 2007, n 18, p Ramoz N, Schumann G., Gorwood P. Pharmacogenomics aspects of the treatment of alcohol-dependence. Current Pharmacogenomics 2006, vol. 4, n 1, p Riley B.P., Kalsi G., Kuo P.H., Vladimirov V., Thiselton D.L., Vittum J., Wormley B., Grotewiel M.S., Patterson D.G., Sullivan P.F., van den Oord E., Walsh D., Kendler K.S., Prescott C.A. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish Affected Sib Pair Study of Alcohol Dependence (IASPSAD) sample. Mol Psychiatry 2006, vol. 11, n 11, p Scholz H., Franz M., Heberlein U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature 2005, vol. 436, n 7052, p Schuckit M.A., Hesselbrock V., Tipp J., Anthenelli R., Bucholz K., Radziminski S. A comparison of DSM- III-R, DSM-IV and ICD-10 substance use disorders diagnoses in 1922 men and women subjects in the COGA study. Collaborative Study on the Genetics of Alcoholism. Addiction 1994, vol. 89, n 12, p Yang B.Z., Kranzler H.R., Zhao H., Gruen J.R., Luo X., Gelernter J. Association of haplotypic variants in DRD2, ANKK1, TTC12 and NCAM1 to alcohol dependence in independent case control and family samples. Hum Mol Genet 2007, vol. 16, n 23, p Cahiers de l Ireb n 19,

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249 «Vulnérabilité : impacts biologiques» EFFETS DE L ETHANOL SUR LES CELLULES CANCEREUSES MAMMAIRES : IMPLICATION D UN CROSS-TALK ENTRE RECEPTEUR A 2A DE L ADENOSINE ET RECEPTEUR DES ŒSTROGENES NICOLAS ETIQUE, ISABELLE GRILLIER-VUISSOZ, JULIE LECOMTE ET STEPHANE FLAMENT UPRES EA 3442 Aspects Cellulaires et Moléculaires de la Reproduction et du Développement, Université Henri Poincaré Nancy 1, Faculté des Sciences, BP 239, Vandœuvre-lès-Nancy - France Summary Epidemiological studies have shown that alcohol consumption increases significantly breast cancer incidence but the underlying molecular mechanisms are not well understood. Our previous studies have shown that in breast cancer cells, ethanol induces a ligand-independent activation of estrogen receptor (ERα) associated to the camp/pka signaling pathway. The A 2A adenosine receptor (A 2A AR) mediates ethanol action in other cell types and could be also involved. We show that A 2A AR is expressed and functional in MCF-7 breast cancer cells. Its activation by a selective agonist stimulates estrogen signaling. In the presence of an A 2A AR antagonist, ethanol does not activate the estrogen signaling pathway. These results, highlighting a cross-talk between A 2A AR and ERα, contribute to the understanding of ethanol effects on breast cancer cells and suggest to use A 2A AR as target in therapeutics. Mots clefs Ethanol, cancer du sein, récepteur des œstrogènes, récepteur de l adénosine INTRODUCTION Chaque année dans le monde, un million de cas de cancer du sein sont découverts et femmes en meurent. En France, ce cancer représente 35,7 % des cancers féminins et nouveaux cas sont dénombrés annuellement. Les œstrogènes jouent un rôle capital dans la cancérogenèse mammaire car dans environ 70 % des cas, ces hormones stimulent la prolifération des cellules cancéreuses : il s agit alors de cancers du sein hormono-dépendants. Les œstrogènes proviennent d une modification des androgènes effectuée par l enzyme aromatase (Simpson et al., 1994). Les œstrogènes agissent principalement par le biais de leur récepteur nucléaire ERα (Récepteur α des œstrogènes) qui active la transcription de gènes cibles dont le promoteur possède un élément de réponse spécifique (ERE). Les études épidémiologiques indiquent qu'une consommation régulière d'alcool, même modérée (10 g/jour), augmente significativement la probabilité de développer un cancer mammaire (environ 7 %) (Hamajima et al., 2002 ; Zhang et al., 2007 ; Suzuki et al., 2008). La consommation d'alcool est capable d'induire expérimentalement la carcinogenèse mammaire chez le rat (Singletary et al., 1991). Les raisons pour lesquelles l'éthanol favorise l'apparition du cancer du sein sont mal connues. Une des hypothèses avancées est l interférence avec le métabolisme et la réponse aux œstrogènes (Dumitrescu et Shields, 2005). En effet, les tumeurs mammaires développées chez les patientes alcooliques sont principalement ER+/PR+ et une relation inverse entre consommation d'alcool et développement de tumeurs ER- a été rapportée (Singletary et al., 2001 ; Suzuki et al., 2005). De plus, l'ingestion d'un punch à base de vodka (0,7 g d'alcool/kg) augmente de 55 à 66 % le taux d'œstradiol circulant chez des femmes en phase folliculaire du cycle menstruel (Mendelson et al., 1988). Des études similaires réalisées sur des femmes ménopausées donnent des résultats identiques (Gavaler et al., 1993). L'augmentation du taux d'œstrogènes circulants s observe aussi chez les hommes alcooliques qui présentent des phénomènes de féminisation, d'hypogonadisme, mais aussi des anomalies vasculaires et des gynécomasties, anomalies relevant d une hyperœstrogénisation (Van Thiel et al., 1981). Chez des Cahiers de l Ireb n 19,

250 femmes ménopausées qui suivent un traitement hormonal de substitution, un risque accru de cancer du sein est observé en association avec la consommation d alcool (Nielsen et Grønbaek, 2008). Le développement des tumeurs mammaires hormono-dépendantes étant fortement lié aux œstrogènes, l'alcool pourrait non seulement être à l'origine des cancers mammaires mais aussi jouer un rôle dans le développement et l'évolution des tumeurs. ETHANOL, SIGNALISATION DES ŒSTROGENES ET CELLULES CANCEREUSES MAMMAIRES Les premières études montrant une action de l'éthanol sur la tumorogenèse mammaire mettaient en évidence le fait que l'alcool pouvait diminuer la période de latence généralement observée avant la détection de la tumeur. Par exemple, chez des rats élevés pour développer des tumeurs mammaires, ceux consommant régulièrement de l'éthanol développent en moyenne une tumeur après huit mois alors que chez les témoins, 14,2 mois sont nécessaires (Schrauzer et al., 1979). Ces résultats furent à l'origine de nombreuses études in vitro réalisées sur diverses lignées de cellules cancéreuses mammaires (Przylipiak et al., 1996 ; Singletary et al., 2001 ; Izevbigie et al., 2002 ; Etique et al., 2004a,b). Dans la plupart de ces études, bien que les conditions de culture, les procédures expérimentales, les doses et la durée des traitements à l'éthanol divergent, la conclusion est identique : l'éthanol stimule la prolifération des cellules tumorales. Néanmoins, le caractère hormono-dépendant des cellules est essentiel. En effet, les lignées insensibles aux oestrogènes ne voient pas leur prolifération stimulée par l'éthanol (Singletary et al., 2001). Ces travaux semblent donc confirmer le lien entre les œstrogènes et suggèrent que l'erα joue un rôle majeur dans l'effet prolifératif de l'éthanol. Outre le fait de stimuler la prolifération des cellules cancéreuses mammaires, l'éthanol pourrait aussi augmenter leur potentiel invasif et migratoire (Luo et Miller, 2000 ; Meng et al., 2000). Une stimulation de 50 % de la croissance cellulaire dans des conditions de culture indépendantes de l'ancrage (croissance clonale) a aussi été décrite, après 15 jours de traitement à l éthanol (0,1 %) (Etique et al., 2004a). Ces propriétés de l'éthanol sont d'autant plus intéressantes que les cellules MCF-7 ont un potentiel invasif relativement faible. Plusieurs travaux indiquent que l éthanol est capable de stimuler la sécrétion des métalloprotéases (MMP)-2 et -9 (Etique et al., 2006 ; Ke et al., 2006 ; Luo, 2006). Ces enzymes sont responsables de la dégradation des composants de la matrice extracellulaire et sont impliquées dans les processus invasifs des cellules cancéreuses mammaires (Nakajima et al., 1987 ; Egeblad et Werb, 2002). La sécrétion de MMP-9 induite par l éthanol nécessite l activation du récepteur des œstrogènes (Etique et al., 2006). Comment les récepteurs des œstrogènes peuvent-ils être activés par l éthanol? Après une exposition à l'éthanol (0,1 % pendant six jours), les taux d'arnm et protéiques de l'aromatase de cellules MCF-7 augmentent respectivement de 2,4 et 10 fois (Etique et al., 2004a). Cette surexpression pourrait permettre une augmentation rapide de la concentration locale en œstrogènes en utilisant, in vitro, les androgènes présents dans le sérum de veau fœtal et in vivo les androgènes circulants. Une comparaison entre éthanol et autres alcools à courte chaîne aliphatique (méthanol, butanol) montre que l'éthanol est le seul à stimuler la croissance des cellules et qu il est aussi le seul à stimuler l'expression de l'aromatase (Etique et al., 2004b). En outre, après six ou sept jours de traitement à l'éthanol (0,1 %), la quantité d ERα est augmentée (de 2,1 à 3,3 fois) non seulement dans les cellules MCF-7 mais aussi dans les cellules ZR-75 (Singletary et al., 2001 ; Etique et al., 2004a). Certains auteurs observent également une augmentation du taux de ce récepteur après seulement deux jours de traitement à l éthanol (Singletary et al., 2001). Cette augmentation du taux d ERα pourrait être une première explication à la prolifération cellulaire accrue observée en présence d'éthanol. Cela pourrait favoriser l'action des œstrogènes qui sont capables de stimuler l expression de gènes impliqués dans la croissance cellulaire. Dans des cellules MCF-7 traitées à l'éthanol, l'activité transcriptionnelle de l'erα semble d'ailleurs augmentée (Fan et al., 2000). Il semble par ailleurs que dans les cellules MCF-7 exposées à l éthanol, le récepteur ERα puisse être activé en l absence d œstrogènes. Ce mode d action est dit ligand-indépendant. Ceci a pu être montré 250 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

251 «Vulnérabilité : impacts biologiques» par l étude du gène codant le récepteur de la progestérone qui est un gène cible des œstrogènes ainsi que par l étude de cellules transfectées avec un vecteur exprimant un gène rapporteur, la luciférase, sous le contrôle d un élément de réponse aux œstrogènes (Etique et al., 2007). Cette activation ligandindépendante est médiée par une voie de signalisation impliquant l AMPc et la protéine kinase A (PKA) (Etique et al., 2007). Ceci est en accord avec l augmentation d AMPc décrite précédemment dans les cellules MCF-7 exposées à l éthanol (Singletary et al., 2001). Il est intéressant de rappeler qu une telle augmentation de la concentration en AMPc pourrait également expliquer la surexpression d aromatase observée dans les cellules MCF-7 exposées à l'éthanol. En effet, son promoteur contient un élément de réponse à l'ampc (CRE) (Michael et al., 1997 ; Zhou et Chen, 1999). ETHANOL, RECEPTEUR DE L ADENOSINE ET SIGNALISATION DES ŒSTROGENES L'augmentation du taux d'ampc en réponse à l éthanol est observée non seulement dans les cellules cancéreuses mammaires, mais aussi dans d'autres types cellulaires comme les neurones. Dans ces cellules, de nombreuses étapes de la voie de signalisation de l'ampc (adénylate cyclase, protéine G, PKA et CREB) ont été décrites comme des cibles majeures de l'éthanol lors d'une exposition de courte ou de longue durée (Pandey 2004). L éthanol stimule la production d AMPc à la fois dans les cellules NG et dans des cellules de lymphomes par le biais d un récepteur membranaire : le récepteur A 2A de l adénosine (Nagy et al., 1990). Nous avons récemment montré que ce récepteur était également impliqué dans la réponse à l éthanol des cellules cancéreuses mammaires (Etique et al., 2009). Nous ne rappellerons ci-dessous que les résultats majeurs. Grâce à des analyses par RT-PCR, nous avons pu montrer la présence des ARN messagers codant l A 2A AR dans les cellules MCF-7. Le produit de PCR a une taille de 244 pb, comme attendu, et son séquençage a confirmé qu il s agissait bien de l A 2A AR. Dans des cellules MCF-7 transfectées avec un vecteur possédant une construction pcre-seap (séquence consensus «camp Response Element» (CRE) contrôlant l expression de la phosphatase alcaline sécrétée), l exposition au CGS21680 (1 µm), agoniste sélectif de l A 2A AR, induit une stimulation de l expression de SEAP (1,95 fois). Cet effet est inhibé par l antagoniste MSX-3. Les cellules MCF-7 exprimant donc un A 2A AR fonctionnel, nous avons testé l hypothèse d un crosstalk entre ce récepteur et l ERα. Pour ce faire, nous avons étudié le gène codant le récepteur de la Progestérone (PR), gène cible des œstrogènes (Etique et al., 2007). Lorsque les cellules MCF-7 sont cultivées pendant 24 heures dans un milieu renfermant 1 µm de CGS21680, le taux de messagers codant le PR est plus élevé que dans les cellules témoins, indiquant la stimulation de l expression du PR. Cet effet est aboli en présence de H89, inhibiteur de la PKA. Afin de confirmer l activation de l expression de gènes cibles de l ERα dans les cultures réalisées en présence de l agoniste A 2A AR, les cellules MCF-7 furent transfectées avec un vecteur comportant le gène de la luciférase placé sous le contrôle d un élément de réponse aux œstrogènes (peretkluc). Ces cellules furent ensuite traitées par différents composés. De façon similaire à l E 2 (1 nm) utilisé comme témoin positif, l agoniste de l A 2A AR CGS21680 (1 µm) induit une augmentation significative de l activité luciférase (trois fois). Cet effet est médié par l activation de l ERα puisqu une inhibition est observée avec l anti-œstrogène ICI 182,780 (100 nm) lequel inhibe aussi la réponse à l E 2. De plus, la stimulation de l expression habituellement observée en réponse au CGS21680 est inhibée en présence de H89, inhibiteur de PKA. Nous avons aussi montré qu après 96 heures d exposition au CGS21680 (1 µm) le nombre de cellules MCF-7 était significativement supérieur au témoin (20203 ± 329 vs ± 632). Une augmentation similaire du nombre de cellules est observée dans les cultures réalisées en présence d E 2 (1 nm) (21233 ± 481). Ces résultats démontrant l existence d un cross-talk entre A 2A AR and ERα, il nous restait à tester l implication de l A 2A AR dans l activation de la signalisation ERα induite par l'ethanol. Dans cette optique, l expression du gène codant le PR fut étudiée après une exposition des cellules MCF-7 à l éthanol pendant 24 heures, en présence ou non de MSX-3 (30 µm). L éthanol fut utilisé à 0,3 % puisque c est la dose la plus efficace in vitro (Etique et al., 2007). L antagoniste MSX-3 induit une inhibition dose-dépendante de l augmentation de l expression du PR induite par l éthanol. De plus, les Cahiers de l Ireb n 19,

252 cellules MCF-7 transfectées avec un vecteur contenant une construction peretkluc montrent aussi une inhibition de l action de l éthanol en présence de l antagoniste MSX-3 (30 µm). CONCLUSION De nombreuses études indiquent un lien entre signalisation des œstrogènes et éthanol, lien qui pourrait expliquer les résultats des études épidémiologiques associant un risque accru de cancer du sein en relation avec la consommation d alcool. Les données les plus récentes indiquent que le récepteur de l adénosine (isoforme A 2A ) est activé lors d une exposition à l éthanol de cellules cancéreuses mammaires de la lignée MCF-7. Cette activation engendre une augmentation d AMPc qui pourrait non seulement activer le récepteur ERα indépendamment de la présence d œstrogènes mais aussi activer l expression de l aromatase, enzyme à l origine de la synthèse des œstrogènes (Figure 1). Il reste à découvrir le mécanisme permettant l activation de l A 2A AR. Une perturbation du transport de l adénosine pourrait être en cause (Nagy et al., 1990). Néanmoins la plupart de ces travaux ont été réalisés in vitro et il n est pas toujours facile d'évaluer le réel potentiel de ce composé sur le développement tumoral in vivo. Il serait intéressant de confirmer ces résultats par des études réalisées à l aide d un modèle animal. 252 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

253 Ethanol «Vulnérabilité : impacts biologiques» Membrane plasmique A 2A AR AC AMPc ATP Enveloppe nucléaire PKA CREB P?? P ERα CREB CRE P P Gènes inductibles par l AMPc Aromatase ERα ERα ERE P Gènes cibles des œstrogènes Cycline D1 MMP-9 Synthèse d œstrogènes Prolifération Migration Figure 1 : schéma du mécanisme d action de l éthanol sur les cellules cancéreuses mammaires. Abréviations utilisées : A 2A AR : récepteur A 2A de l adénosine ; AC : adénylate cyclase ; AMPc : adénosine monophosphate cyclique ; ATP : adénosine triphosphate ; CREB : élément de réponse à l AMPc ; ERα : récepteur alpha des œstrogènes ; ERE : élément de réponse aux œstrogènes ; MMP : métalloprotéase ; PKA : protéine kinase A. Cahiers de l Ireb n 19,

254 Remerciements : les résultats de l'équipe du Professeur Flament qui sont décrits dans cet article ont été obtenus grâce aux subventions de l'ireb, de l'arc, de la Ligue contre le cancer, du Cancéropôle Grand Est, de l'université Henri Poincaré, et du Conseil Régional de Lorraine. Références Dumitrescu R.G., Shields P.G. The etiology of alcohol-induced breast cancer. Alcohol 2005, vol. 35, n 3, p Egeblad M., Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat Rev Cancer 2002, vol. 2, n 3, p Etique N., Chardard D., Chesnel A., Flament S., Grillier-Vuissoz I. Analysis of the effects of different alcohols on MCF-7 human breast cancer cells. Ann N Y Acad Sci 2004a, vol. 1030, p Etique N., Chardard D., Chesnel A., Merlin J.L., Flament S., Grillier-Vuissoz I. Ethanol stimulates proliferation, ERalpha and aromatase expression in MCF-7 human breast cancer cells. Int J Mol Med 2004b, vol. 13, n 1, p Etique N., Flament S., Lecomte J., Grillier-Vuissoz I. Ethanol-induced ligand-independent activation of ERα mediated by cyclic AMP/PKA pathway: an in vitro study on MCF-7 breast cancer cells. Int J Oncol 2007, vol. 31, n 6, p Etique N., Grillier-Vuissoz I., Flament S. Ethanol stimulates the secretion of matrix metalloproteinases 2 and 9 in MCF-7 human breast cancer cells. Oncol Rep 2006, vol. 15, n 15, p Etique N., Grillier-Vuissoz I., Lecomte J., Flament S. A Cross-talk between Adenosine receptor (A 2A isoform) and ERα mediates ethanol action in MCF-7 Breast Cancer Cells. Oncol Rep 2009, vol. 21, n 4, p Fan S., Meng Q., Gao B., Grossman J., Yadegari M., Goldberg I.D., Rosen E.M. Alcohol stimulates estrogen receptor signaling in human breast cancer cell lines. Cancer Res 2000, vol. 60, n 20, p Gavaler J.S., Deal S.R., Van Thiel D.H., Arria A., Allan M.J. Alcohol and estrogen levels in postmenopausal women: the spectrum of effect. Alcohol Clin Exp Res 1993, vol. 17, n 4, p Hamajima N., Hirose K., Tajima K., Rohan T., et al. Alcohol, tobacco and breast cancer - collaborative reanalysis of individual data from 53 epidemiological studies, including 58,515 women with breast cancer and 95,067 women without the disease. Br J Cancer 2002, vol. 87, n 11, p Izevbigie E.B., Ekunwe S.I., Jordan J., Howard C.B. Ethanol modulates the growth of human breast cancer cells in vitro. Exp Biol Med (Maywood) 2002, vol. 227, n 4, p Ke Z., Lin H., Fan Z., Cai T.Q., Kaplan R.A., Ma C., Bower K.A., Shi X., Luo J. MMP-2 mediates ethanolinduced invasion of mammary epithelial cells over-expressing ErbB2. Int J Cancer 2006, vol. 119, n 1, p Luo J. et Miller M.W. Ethanol enhances erbb-mediated migration of human breast cancer cells in culture. Breast Cancer Res Treat 2000, vol. 63, n 1, p Luo J. Role of matrix metalloproteinase-2 in ethanol-induced invasion by breast cancer cells. J Gastroenterol Hepatol 2006, vol. 21, n 3, p. S65-S68. Mendelson J.H., Lukas S.E., Mello N.K., Amass L., Ellingboe J., Skupny A. Acute alcohol effects on plasma estradiol levels in women. Psychopharmacology (Berl) 1988, vol. 94, n 4, p Meng Q., Gao B., Goldberg I.D., Rosen E.M., Fan S. Stimulation of cell invasion and migration by alcohol in breast cancer cells. Biochem Biophys Res Commun 2000, vol. 273, n 2, p Michael M.D., Michael L.F., Simpson E.R. A CRE-like sequence that binds CREB and contributes to campdependent regulation of the proximal promoter of the human aromatase P450 (CYP19) gene. Mol Cell Endocrinol 1997, vol. 134, n 2, p Nagy L.E., Diamond I., Casso D.J., Franklin C., Gordon AS. Ethanol increases extracellular adenosine by inhibiting adenosine uptake via the nucleoside transporter. J Biol Chem 1990, vol. 265, n 4, p Nakajima M., Welch D.R., Belloni P.N., Nicolson G.L. Degradation of basement membrane type IV collagen and lung subendothelial matrix by rat mammary adenocarcinoma cell clones of differing metastatic potentials. Cancer Res 1987, vol. 47, n 18, p Nielsen N.R., Grønbaek M. Interactions between intakes of alcohol and postmenopausal hormones on risk of breast cancer. Int J Cancer 2008, vol. 122, n 5, p Pandey S.C. The gene transcription factor cyclic AMP-responsive element binding protein: role in positive and negative affective states of alcohol addiction. Pharmacol Ther 2004, vol. 104, n 1, p Przylipiak A., Rabe T., Hafner J., Przylipiak M., Runnebaum R. Influence of ethanol on in vitro growth of human mammary carcinoma cell line MCF-7. Arch Gynecol Obstet 1996, vol. 258, n 3, p Schrauzer G.N., McGinness J.E., Ishmael D., Bell L.J. Alcoholism and cancer. I. Effects of long-term exposure to alcohol on spontaneous mammary adenocarcinoma and prolactin levels in C3H/St mice. J Stud Alcohol 1979, vol. 40, n 3, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

255 «Vulnérabilité : impacts biologiques» Simpson E.R., Mahendroo M.S., Means G.D., Kilgore M.W., Hinshelwood M.M., Graham-Lorence S., Amarneh B., Ito Y., Fisher C.R., Michael M.D. Aromatase cytochrome P450, the enzyme responsible for estrogen biosynthesis. Endocr Rev 1994, vol. 15, n 3, p Singletary K.W., Frey R.S., Yan W. Effect of ethanol on proliferation and estrogen receptor-alpha expression in human breast cancer cells. Cancer Lett 2001, vol. 165, n 2, p Singletary K.W., McNary M.Q., Odoms A.M., Nelshoppen J., Wallig M.A. Ethanol consumption and DMBA-induced mammary carcinogenesis in rats. Nutr Cancer 1991, vol. 16, n 1, p Suzuki R., Orsini N., Mignone L., Saji S., Wolk A. Alcohol intake and risk of breast cancer defined by estrogen and progesterone receptor status - a meta-analysis of epidemiological studies. Int J Cancer 2008, vol. 122, n 8, p Suzuki R., Ye W., Rylander-Rudqvist T., Saji S., Colditz G.A., Wolk A. Alcohol and postmenopausal breast cancer risk defined by estrogen and progesterone receptor status: a prospective cohort study. J Natl Cancer Inst 2005, vol. 97, n 21, p Van Thiel D.H., Gavaler J.S., Eagon P.K., Chiao Y.B., Lester R. Hypogonadism and feminization in alcoholic men: the past, present and future. Curr Alcohol 1981, vol. 8, p Zhang S.M., Lee I.M., Manson J.E., Cook N.R., Willett W.C., Buring J.E. Alcohol consumption and breast cancer risk in the Women's Health Study. Am J Epidemiol 2007, vol. 165, n 6, p Zhou D., Chen S. Identification and characterization of a camp-responsive element in the region upstream from promoter 1.3 of the human aromatase gene. Arch Biochem Biophys 1999, vol. 371, n 2, p Cahiers de l Ireb n 19,

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257 «Vulnérabilité : impacts biologiques» ETABLIR LA PREVALENCE DE LA CONSOMMATION D ALCOOL CHEZ LA FEMME ENCEINTE EN SEINE-MARITIME EN UTILISANT DES DOSAGES BIOLOGIQUES COUPLES A L ADDICTION SEVERITY INDEX SANDRINE LAMY¹, JACQUES BENICHOU¹, MARC VASSE¹, JACQUES WEBER¹, JEAN-PIERRE GOULLE², MARTINE DAOUST³, NICOLE HOUDRET 4, MICHEL LHERMITTE 4, STEPHANE MARRET¹ET FLORENCE THIBAUT¹ ¹CHU Charles Nicolle, 1 rue de Germont, Rouen Cedex - France ²Service pharmaceutique et toxicologie cliniques, Hôpital Jacques Monod-Groupe hospitalier, BP Le Havre - France ³CHRU d Amiens, 2 place Victor Pauchet, Amiens - France 4 CHRU de Lille, Hôpital cardiologique, boulevard du Professeur Jules Leclerc, Lille Cedex - France Summary The prevalence of alcohol or substance use during pregnancy is unknown or under-estimated in France. Some studies have reported the prevalence of substance use in different countries but most of them were based on maternal self report and, in most cases, the mother did not report the exact amount of drugs used. Further studies measuring alcohol or substance use are needed. Alcohol consumption by pregnant women is a major public health problem because the fetal alcohol syndrome is the leading cause of preventable mental retardation. Studies have shown an incidence of 1.6 in Sweden, 0.2 to 1 in the USA and between 1 to 3 in France; the effects of alcohol on the fetus represent 1% of births. Our prevalence study will combine The Addiction Severity Index (ASI) and biological markers. This study will be conducted in 11 maternity hospitals. Mots clefs Epidémiologie, grossesse, alcool, tabac, cannabis INTRODUCTION Les chiffres de prévalence de la consommation de substances psychoactives durant la grossesse sont mal connus et probablement sous évalués en France. Ils sont évalués par extrapolation des données des études épidémiologiques réalisées sur l ensemble de la population française et sur la base des études internationales (en gardant à l esprit que les consommations de substances psychoactives diffèrent parfois beaucoup d un pays à l autre et que l'extrapolation de ces données à la France doit donc être prudente). La grossesse chez une femme consommant une ou plusieurs substances psychoactives (quelle que soit la substance en cause) constitue une grossesse à risque. Une des principales causes de la survenue de complications obstétricales est le manque, voire même parfois, l absence de suivi médical au cours de ces grossesses. Les données issues de la littérature montrent que lors de la réalisation de simples audits sur la consommation de substances psychoactives chez la femme enceinte, la fréquence de la consommation avouée est largement inférieure à celle que l on retrouve si l on effectue un dosage des différentes drogues chez le nouveau-né ou chez la mère (Ostrea et al., 2001). Il apparaît ainsi nécessaire d'utiliser des méthodes biologiques objectives d'évaluation de la consommation de substances psychoactives si l'on veut évaluer la prévalence de l'usage de ces substances au cours de la grossesse couplées aux données des questionnaires. Aussi, il nous a semblé pertinent de faire une étude épidémiologique sur la prévalence de la consommation d alcool et de toxiques (tabac et cannabis), à grande échelle, multicentrique et exhaustive au niveau de l inter région Nord Ouest. Cahiers de l Ireb n 19,

258 La consommation d alcool et de substances psychoactives (SPA) durant la grossesse est un problème de santé publique et cette étude épidémiologique réalisée en Seine-Maritime servira de point de départ dans l évaluation disparate de ce problème en France, surtout en ce qui concerne la consommation de cannabis pour lequel nous disposons de très peu de données. Les consommations de tabac seront évaluées à partir du dosage dans le méconium du nouveau-né de la cotinine (reflet de la consommation de tabac), du THC-COOH (métabolite du cannabis). Le dosage du Carbohydrate-Deficient Transferrin (CDT) réalisé dans le sang de la mère permet de détecter une consommation d alcool dans les quelques jours qui précèdent le dosage (demi-vie de 14 jours). Il n'existe pas de marqueur biologique spécifique d'une consommation excessive et chronique d alcool, aussi nous devrons utiliser des moyens indirects comme les dosages précités couplés aux données de l interrogatoire (Addiction Severity Index (ASI)). Ce sera la première étude de ce type en France. Consommation de tabac chez la femme enceinte en France Selon les auteurs, on estime que 20 à 30 % des femmes enceintes, en France, consomment du tabac. Une étude de Lelong et al. (2001) retrouve 37 % de femmes consommant du tabac avant la grossesse, 34 % stoppent durant la grossesse et 48 % d'entre elles reprennent le tabac cinq à six mois après l'accouchement. Le statut tabagique du conjoint est ici déterminant non seulement pour l arrêt du tabac durant la grossesse mais également pour le maintien de l'abstinence tabagique après la naissance de l enfant. Consommation d alcool chez la femme enceinte en France La prévalence de la consommation d alcool par la femme enceinte (estimée à environ 15 %) n est probablement pas le meilleur indicateur pour évaluer le danger qu encourt le fœtus pour au moins deux raisons : on ne connaît pas la quantité d alcool que la mère doit consommer pour que le fœtus soit en danger et on sait que la toxicité de l'alcool dépend en particulier du moment de gestation et des capacités métaboliques de la mère pour l'alcool. Le syndrome d alcoolisation fœtale (SAF) est la première cause de retard mental évitable. L incidence est de 1 à 3 naissances en France. A noter que l incidence des Effets de l Alcool sur le Fœtus (EAF) représente 1 % des naissances en France. Consommation de cannabis chez la femme enceinte en France Nous ne connaissons pas, à l heure actuelle, la prévalence de la consommation de cannabis par la femme enceinte en France. On remarque que la prévalence de la consommation de cannabis augmente chez les jeunes en population générale en France d autant que le rapport ci-dessous montre une augmentation de la consommation du cannabis chez les moins de 25 ans. On peut donc s attendre à une augmentation de cette consommation chez la femme enceinte d autant que les jeunes ne pensent pas que le cannabis soit une substance dangereuse (rapport TREND 2005). Revue de littérature internationale sur la consommation d alcool par la femme enceinte Les études évaluant la prévalence de la consommation de substances psychoactives sont nombreuses mais extrêmement disparates, ceci étant largement dû aux méthodologies utilisées (simples questionnaires ou dosages biologiques), aux biais liés au recrutement (recueil des données dans un seul hôpital), biais de recrutement des femmes (disparités socio-économiques, comorbidités psychiatriques ). Néanmoins, on note une augmentation croissante de l utilisation de substances psychoactives durant la grossesse dans de nombreux pays. Le pourcentage de femmes enceintes qui consomment de l alcool est compris entre quelques pourcents et 50 % selon le moment de la grossesse et l importance de la consommation considérée comme 258 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

259 «Vulnérabilité : impacts biologiques» dangereuse pour le fœtus (Alvik et al., 2006 ; Aros et al., 2006 ; Colvin et al., 2007 ; Floyd et al., 2005 ; Kristjanson et al., 2007). Ainsi, aux USA, la prévalence de la consommation d alcool par les femmes dans la population générale est d une pour cinq (cinq verres voire plus lors d occasions particulières) et une femme sur 25 consomme de l alcool durant la grossesse (Floyd et al., 2005). L étude de Kristjanson et al. (2007) qui questionne des femmes enceintes et non enceintes, montre que 95,6 % (dont 7,6 % sont dépendantes et 18,4 % consomment plus de cinq verres d alcool lors d une occasion) des femmes en Russie ont consommé de l alcool dans les douze derniers mois et que 60 % disent poursuivre leur consommation lorsqu elles se savent enceintes. 34,9 % consomment encore de l'alcool après 30 jours de grossesse et 7,4 % consomment plus de cinq verres à la moindre occasion. Au Chili, Aros et al. (2006) ont estimé (par questionnaire) le nombre de femmes consommant durant la grossesse plus de 48 g d alcool/j (dose clairement identifiée comme dangereuse pour le fœtus). Ainsi 1 % des femmes enceintes (sur les femmes interviewées) consomment plus de 48 g/j d alcool, 57,4 % consomment de l alcool et 3,7 % consomment plus que la moyenne (soit 15 ml d alcool pur/j). En Suède, femmes furent interrogées à l'aide de l autoquestionnaire AUDIT (Alcohol Use Disorders Identification Test) à la 30 ème semaine de grossesse : 30 % consomment de façon régulière de l alcool et 46 % disent consommer lors d une occasion (Goransson et al., 2003). Une autre étude suédoise faite par Alvik et al. (2006) retrouve 89 % de femmes consommant de l alcool avant la grossesse et 23 % après douze semaines de grossesse. Les chiffres de prévalence de la consommation de substances toxiques sont en augmentation croissante ou, au mieux, se stabilisent dans tous les pays, et ce, malgré les campagnes de prévention. Ces études sous-estiment d ailleurs probablement la consommation des femmes enceintes. En effet, pour avoir une idée précise de la prévalence de leur consommation de substances toxiques, il faudrait utiliser des marqueurs biologiques des SPA à différents moments de la grossesse. Cependant, la faisabilité d une telle étude demande une logistique trop importante. Il est possible d utiliser aussi, en complément d un dosage, un ou plusieurs questionnaires aidant à l'évaluation de la consommation comme l Addiction Severity Index (ASI), validé en français (Krenz et al., 2004), qui est l instrument le plus utilisé pour évaluer les sujets consommateurs de substances psychoactives dont l'usage peut donner lieu à une dépendance. Une étude menée par l équipe du Professeur Auriacombe ( non publiée) montre que la concordance (mesurée par le kappa) entre les réponses à l ASI de personnes consommatrices de substances et en demande de prise en charge et les dosages urinaires toxicologiques est bonne. Mais cette étude a été réalisée chez des personnes en demande de soins et non chez des femmes venant d accoucher. D'autres études ont montré, à l inverse, une mauvaise corrélation entre les interviews et les dosages biologiques (Klebanoff et al., 1998 ; Britton et al., 2004). La réalisation de dosages biologiques apparaît donc nécessaire. OBJECTIF L objectif de notre étude est d établir la prévalence de la consommation d alcool et de toxiques (tabac, cannabis) chez la femme enceinte en Seine-Maritime en couplant interrogatoire et dosages biologiques. Cahiers de l Ireb n 19,

260 JUSTIFICATION DU NOMBRE DE PATIENTS EN FONCTION DE LA PRÉCISION ET DE LA PUISSANCE STATISTIQUE La consommation dans la population générale, en Haute-Normandie, de tabac, cannabis et cocaïne se situe, d après les enquêtes, dans la moyenne nationale. La consommation d alcool dans la population générale est, par contre, un peu plus élevée. Afin d éviter les biais de recrutement, l étude doit se dérouler de façon exhaustive sur un territoire donné et sur un nombre de jours consécutifs. Ainsi, au vu du fait que le réseau périnatalité de Haute- Normandie regroupe la quasi-totalité des maternités de Seine-Maritime et que ce département contient des zones rurales (Fécamp, Lillebonne) et urbaines (Rouen, Le Havre), ce département a été retenu pour l inclusion des femmes enceintes. L étude sera proposée à toutes les jeunes accouchées des onze maternités durant les périodes d étude. Ne faire l étude que dans quelques maternités de grandes agglomérations entraînerait des biais de recrutement très importants, qui sont peut-être à l origine des chiffres parfois très élevés de consommation de cannabis durant la grossesse que l on retrouve dans la littérature (Williamson et al., 2006). De plus, le nombre d accouchements dans ce département nous permet de réaliser l étude sur 28 jours répartis durant l année. L effectif a été déterminé avec pour objectif principal d atteindre un degré de précision satisfaisant, mesuré par la largeur de l intervalle de confiance à 95 %, sur l estimation des prévalences de la consommation de tabac, d alcool et de cannabis par les femmes enceintes. Ainsi, cette grande étude épidémiologique permettra d avoir une idée plus précise sur la consommation d alcool et de substances psychoactives en France durant la grossesse. Nous constituerons également une collection biologique importante à partir de laquelle des études pourront être menées pour rechercher de nouveaux marqueurs biologiques par exemple. Références Alvik A., Heyerdahl S., Haldorsen T., Lindemann R. Alcohol use before and during pregnancy: a populationbased study. Acta Obstet Gynecol Scand 2006, vol. 85, n 11, p Aros S., Mills J.L., Torres C., Henriquez C., Fuentes A., Capurro T., Mena M., Conley M., Cox C., Signore C., Klebanoff M., Cassorla F. Prospective identification of pregnant women drinking four or more standard drinks (> or = 48 g) of alcohol per day. Subst Use Misuse 2006, vol. 41, n 2, p Britton G.R., Brinthaupt J., Stehle J.M., James G.D. Comparison of self-reported smoking and urinary cotinine levels in a rural pregnant population. J Obstet Gynecol Neonatal Nurs 2004, vol. 33, n 3, p Colvin L., Payne J., Parsons D., Kurinczuk J.J., Bower C. Alcohol consumption during pregnancy in nonindigenous west Australian women. Alcohol Clin Exp Res 2007, vol. 31, n 2, p Floyd D.R., O Connor M.J., Sokol R.J., Bertrand J., Cordero J.F. Recognition and prevention of fetal alcohol syndrome. Obstet Gynecol 2005, vol. 106, n 5, p Goransson M., Magnusson A., Bergman H., Rydberg U., Heilig M. Fetus at risk: prevalence of alcohol consumption during pregnancy estimated with a simple screening method in Swedish antenatal clinics. Addiction 2003, vol. 98, n 11, p Klebanoff M.A., Levine R.J., Clemens J.D., DerSimonian R., Wilkins D.G. Serum cotinine concentration and self-reported smoking during pregnancy. Am J Epidemiol 1998, vol. 148, n 3, p Krenz S., Dieckmann S., Favrat B., Spagnoli J., Leutwyler J., Schnyder C., Daeppen J.B., Besson J. French version of the Addiction Severity Index (5 th edition): validity and reliability among swiss opiate-dependent patients. Eur Addict Res 2004, vol. 10, n 4, p Kristjanson A.F., Wilsnack S.C., Zvartau E., Tsoy M., Novikov B. Alcohol use in pregnant and non pregnant Russian women. Alcohol Clin Exp Res 2007, vol. 31, n 2, p Lelong N., Kaminski M., Saurel-Cubizolles M.J., Bouvier-Colle M.H. Postpartum return to smoking among usual smokers who quit during pregnancy. Eur J Public Health 2001, vol. 11, n 3, p Ostrea E.M. Jr, Knapp D.K., Tannenbaum L., Ostrea A.R., Romero A., Salari V., Ager J. Estimates of illicit drug use during pregnancy by maternal interview, hair analysis, and meconium analysis. J Pediatr 2001, vol. 138, n 3, p Williamson S., Jackson L., Skeoch C., Azzim G., Anderson R. Determination of the prevalence of drug misuse by meconium analysis. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 2006, vol. 91, n 4, p. F291-F Cahiers de l Ireb n 19, 2009

261 9. «LA PERSONNE»

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263 «La personne» CREATION D'UNE ECHELLE DE QUALITE DE VIE CONCERNANT DES SUJETS SOUFFRANT D'ABUS OU DE DEPENDANCE A L'ALCOOL PATRICK MARTIN 1,2, JACQUES MASSOL 3, BERNARD LACHAUX 2, CHARLES SIEGFRIED PERETTI 1 ET GROUPE ALQOL 1 Département de Psychiatrie, Unité de Recherche, Hôpital St Antoine, 184, rue du Faubourg St Antoine, Paris - France 2 Collectif de Recherche En Santé publique et en Thérapeutique (CREST), Centre Hospitalier Paul Guiraud, 54 avenue de la République, Villejuif - France 3 CHU Jean Minjoz, 3, boulevard Alexandre Fleming, Besançon Cedex - France Summary In the context of research, public health and the therapeutic use evaluation of the quality of life (QOL) as a criterion for trial appears increasingly as an aid to medical decision. It is also important to distinguish an overall goal of QOL specificity in the binding individual alcohol at some point in its existence and its pathology, so that it can self-assess according to his state of Health Bites, contributing to an awareness of his condition. Our goal is to create, from the words of patients (verbatim) and validate a self-questionnaire to evaluate the QOL. This tool should provide insight on the one hand, data within steps of both public health and medicine, concerning the conditions of existence and perception of QOL of these topics. On the other hand to make patients aware of changes in their QOL depending on their state of health at different stages of their addiction and their care (biphasic effect). We will present the results from the second step regarding the development of a first version of the scale from work with a panel of nearly a hundred experts, as a participatory methodology. This first version that will be proposed for validation during a follow-up observation in daily practice (Step 3). Mots clefs Qualité de vie, échelle nouvelle, «verbatim», patient alcoolo-dépendant, abus d alcool, soutien, abstinence, INTRODUCTION La consommation excessive d alcool est un problème majeur de santé publique, au niveau mondial, elle aurait entraîné 1,8 millions de décès en 2000 (OMS, 2002). La zone européenne est, de toutes les régions du monde, celle où la consommation d alcool est la plus élevée. Environ Européens sont morts de causes liées à l alcool en 2002 (Rekve et Negru, 2005). La France est le pays européen ayant la plus forte surmortalité masculine liée à l'alcool, de 30 % supérieure à la moyenne européenne (Berr et al., 2001). L alcool contribue à hauteur de 14 % aux décès masculins et de 3 % aux décès féminins. C est la deuxième cause de mortalité évitable en France après le tabac. Les méfaits de l alcool sur la santé surviennent à un stade relativement précoce de l existence. Il s agit en effet du plus important facteur de risque de mortalité chez les jeunes âgés de 15 à 29 ans (OMS, 2002). Au total, 5 millions de Français connaissent aujourd'hui des problèmes médicaux et des difficultés psychologiques ou sociales liées à l alcool (Arvers et al., 2003). Parmi eux, 3 millions sont des consommateurs excessifs mais peuvent modérer leur consommation, alors que 2 millions ont perdu cette liberté et sont devenus dépendants à l alcool. Enfin, il est montré que l alcool est étroitement lié aux troubles mentaux et comportementaux (Petrakis et al., 2002 ; Babor et al., 2003). Cahiers de l Ireb n 19,

264 Pour lutter contre les méfaits de l alcool, les pouvoirs publics ont instauré des mesures législatives limitant l offre et l accès à l alcool à tous les publics, notamment aux jeunes. Une organisation des soins pour les patients alcoolo-dépendants s est mise en place progressivement. Mais la prévention secondaire afin d agir avant l installation de la dépendance a peu été prise en compte. L OMS s est penchée sur ce problème depuis une vingtaine d années afin de mettre en place une politique de santé publique au niveau mondial (Heather, 2004). L application de cette politique au niveau national est le programme «Boire Moins, C est Mieux», coordonné par l Association Nationale de Prévention en Alcoologie et Addictologie (ANPAA). Si, des outils facilitant, notamment, l action des médecins généralistes auprès des consommateurs excessifs ont été crées, il est cependant regrettable qu il y ait trop peu d intérêt pour l évaluation de la qualité de vie de ces sujets, voire de leur proche (Klingemann et Gmel, 2001), sachant également que l alcool représente l un des principaux facteurs de maladie, de traumatisme, d invalidité et de décès prématuré (Rehms, 2003). Dans le contexte de la recherche, en santé publique et celui de l'évaluation thérapeutique, l'utilisation de la qualité de vie comme critère de jugement apparaît de plus en plus nécessaire et s avère le plus souvent pertinente. Les critères habituels sur lesquels repose l'évaluation d'une thérapeutique, c'est-à-dire l'efficacité clinique et la tolérance, ne sont plus suffisants aujourd'hui. Il est nécessaire de prendre en compte l'appréciation du patient sur son vécu, que ce soit au travers de sa vie quotidienne ou de l influence de la prise en charge de sa pathologie lorsqu il est souffrant. Il apparaît essentiel que l'individu soit pris en compte dans sa globalité, au lieu d'être limité à l'aspect uniquement somatique (Martin, 1995). L appréciation de ce qui est appelé la qualité de vie (QDV) est donc un des éléments principaux qui doivent contribuer à la décision médicale. Des résultats thérapeutiques qui paraissent aux médecins très favorables ne sont pas toujours appréciés par le patient de la même manière. L expérience clinique montre que la recherche d un mieux être ne va pas forcément de pair avec l efficacité thérapeutique sur la symptomatologie, surtout chez le malade mental. D où l intérêt grandissant pour le concept de QDV et pour son évaluation, non seulement dans le cadre de l évaluation des thérapeutiques, mais également dans la prise en charge des malades et de leur famille. L autre question d importance est de savoir si les instruments qui existent à l heure actuelle, tant dans la conception que dans l application, sont vraiment adaptés à l évaluation de la QDV de ce type de patients (Martin, 1995 ; 2001). Il est important également de distinguer d un objectif global de QDV la spécificité dans la liaison individu-alcool, à un moment donné de sa vie et de sa pathologie, afin qu il puisse s auto-évaluer en fonction de son état de santé du moment, contribuant ainsi à une prise de conscience de son état. Notre objectif est donc de créer et valider un auto-questionnaire destiné à évaluer la QDV de sujets souffrant d'abus ou de dépendance à l'alcool, à partir de leur ressenti de leur existence. Cet outil devrait permettre la réalisation de deux démarches, l'une d'obtenir des données s'inscrivant dans un cadre de santé publique, concernant les conditions d'existence et de perception de la QDV de ces sujets ; l'autre serait de faire prendre conscience aux patients de l'évolution de la QDV en fonction de leur état de santé à différents moments de leur addiction et de leur prise en charge (effet biphasique). 264 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

265 «La personne» MATERIEL ET METHODES Pour mener à bien ce projet et répondre ainsi aux objectifs avancés, plusieurs étapes successives sont nécessaires : Etape 1 : réalisation d'un verbatim à partir du vécu de sujets concernés par la pathologie, voire de leur entourage ; Etape 2 : création d'une échelle de qualité de vie, à partir des données recueillies dans le verbatim et selon les objectifs proposés ; Etape 3 : phase de validation et d'étude des qualités métrologiques de l échelle dans une cohorte de sujets souffrant d'abus ou de dépendance à l'alcool ; Etape 4 : utilisation de l'échelle validée dans une démarche structurée, afin de répondre à certains objectifs que les premières étapes n'auraient pu mettre en évidence, c'est-à-dire mise en évidence de l'aspect pédagogique de l'échelle sur la prise en charge, la mise en évidence de certaines propriétés métrologiques, ainsi que l aspect fonctionnel et pragmatique du carnet de suivi. Cet article fait état de l avancée de la deuxième étape. Etape 2 : panel d experts et création de la première version de l échelle ALQOL Le but de la première étape a été de recueillir l'avis des patients sur ce qu'ils attendaient aussi bien face à la maladie, à leur prise en charge au quotidien, à leur situation professionnelle, sociale, qu'en termes de stratégies thérapeutiques. Cette démarche a ainsi permis d'obtenir les éléments nécessaires pour élaborer un instrument permettant d'évaluer leur perception de leur QDV. Aspects méthodologiques Pour répondre à cet objectif nous avons recours à une méthode participative. Les méthodes participatives sont multiples et variées (pour exemples : La conférence de consensus, Le jury de citoyens, L atelier de construction de scénarii [Scenario Workshop], La méthode Delphi, La consultation délibérative [Deliberative Polling], La recherche des désirs communs pour le futur [Future Search], Le Suivi et l évaluation participatifs [Interactive Technology Assessment], etc.). Elles ont chacune leurs particularités, leurs avantages et inconvénients. Il existe plusieurs méthodologies de quantification utilisées, dont les plus usuelles sont : la Méthode Delphi (ou Delphes), la Méthode «Groupe Nominal»(ou panel), la Méthode «Groupe Nominal adaptée de la RAND/UCLA». La Méthode Delphi : proposée dans les années 50 par la Rand Corporation en Californie, l'objectif est l'obtention d'un avis final unique et convergent d'un groupe d'experts. Il est obtenu en interrogeant individuellement et de manière itérative chaque expert à l aide d un questionnaire rédigé par le(s) organisateur(s) sur la base d'une synthèse préalable de la littérature. La Méthode «Groupe Nominal» (Constitution de panel) : cette méthode est surtout utilisée pour établir des priorités ou hiérarchiser des actions. L organisateur réunit un groupe de six à douze experts. Il n y a pas de travail préparatoire, pas de synthèse de la littérature fournie au groupe. Le travail est organisé par un coordinateur. Les interactions se font essentiellement entre le coordinateur et chaque membre du groupe pour éviter les phénomènes de dominance. La Méthode «Groupe Nominal» adaptée de la RAND-UCLA : il s'agit en fait d'une variante de la Méthode «Groupe Nominal», développée principalement par la Rand Corporation et l'université de Californie aux USA («RAND/UCLA appropriateness rating method»). Cahiers de l Ireb n 19,

266 Elle associe des éléments des deux méthodes précédentes et a l'avantage d'être bien codifiée. Le rôle des experts est par ailleurs renforcé puisque l'analyse, la synthèse de la littérature et la rédaction des items issus du verbatim pour chaque champ d'application défini sont confiées aux experts et non plus en amont à l'organisateur. Enfin, pour garantir l'objectivité et l'homogénéité du classement des propositions, le même score d'évaluation (cotation) est utilisé par tous les experts. Par ailleurs, la cotation individuelle des propositions de recommandations a l'avantage de permettre aux avis minoritaires de s'exprimer, de favoriser la communication et l'interactivité au sein du groupe, et d'éviter ainsi l'effet de dominance d'un expert. Chaque expert répond à chaque question à l'aide d'une échelle graduée de 1 à 9 (1 signifie l'existence «d'un désaccord complet» ou d'une «absence totale de preuve» ou «d'une contre-indication formelle» et 9 celle «d'un accord complet» ou «d'une preuve formelle» ou «d'une indication formelle»). RESULTATS ET DISCUSSION Lors de l élaboration d une échelle de QDV, un certain nombre de points majeurs, indépendant du choix des items et de leur formulation, sont à prendre en compte. De manière synthétique, ils sont décrits ci-dessous et les réponses sont donc issues de l avis du panel d experts : Quelles sont les situations «d état de santé» du patient concerné par l évaluation de la QDV? En fait, l ambition est que cette échelle serve à tous les stades, notamment d alcoolisation, de sevrage, d abstinence et dans une démarche pédagogique et informative pour le patient, plus précisément lors du changement de comportement (Figure 1). Les six étapes d'un changement de comportement peuvent être décrites : 1. La pré-intention : le sujet n'envisage pas de changer son comportement dans les six prochains mois. 2. L'intention : il envisage de modifier ses habitudes dans un avenir relativement proche. Il pèse le pour et le contre. 3. La préparation : la décision est prise et il se prépare au changement. 4. L'action : c'est une période d'environ six mois au cours de laquelle il modifie ses habitudes. 5. Le maintien : il s'agit alors d'éviter les rechutes. L'effort à fournir est moins intense, il a davantage confiance en ses capacités. 6. La résolution : c'est le moment où il n'a plus jamais la tentation de revenir à un comportement antérieur, même quand il est stressé, anxieux, déprimé ou en colère. De plus, il est tout à fait convaincu qu'il ne rechutera pas. Tout passage d'une étape à la suivante est considéré comme une réussite. Pour faire avancer le patient dans ce processus. 266 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

267 «La personne» Figure 1 : étapes d un changement de comportement. Qui doit évaluer? Le patient lui-même et uniquement lui. L évaluation doit se faire en dehors de toute présence d un tiers, notamment des proches, voire des soignants. L appréciation de leur QDV ne s inscrit pas forcément dans une démarche médicalisée du point de vue du médecin par exemple. Qualité de vie et déterminisme, quel vocable? Le concept de QDV se distingue des échelles de psychopathologie par le fait qu il n est pas demandé à un individu le degré éventuel de gène ou de handicap qu entraîne la présence d un symptôme, dont la réponse se verra interpréter par le médecin et ce probablement à tord. En effet, ce n est pas parce qu un sujet est anxieux ou jugé comme tel qu il a une mauvaise QDV. En revanche, il doit être sousentendu que la présence d un symptôme peut altérer ou non une ou des dimensions de sa QDV selon sa seule appréciation. Il est donc proposé en préhambule des items ces phrases : vous souffrez ou vous avez souffert pendant une période plus ou moins longue, d abus ou de dépendance à l alcool. cette situation, quelle qu en soit la cause, a probablement modifié votre appréciation de votre qualité de vie telle que vous la concevez au quotidien dans différents domaines. Actuellement, à cause de votre abus d alcool comment appréciez-vous votre Actuellement, grâce à votre consommation d alcool Quand évaluer? En psychopathologie, souvent l interrogation renvoie précisément aux derniers mois ou lors des trois derniers mois. En termes d évaluation de la QDV, la temporalité ne semble pas réellement bien établie. En effet, la QDV étant une appréciation personnelle et probablement différente selon les individus, il apparaît difficile de déterminer un référentiel temporel. Il est donc souvent utilisé «ces derniers temps». Dans la situation présente, il semble que les sujets soient dans une dynamique «du présent» tourné vers l avenir, le passé influençant le présent. Il est proposé d utiliser actuellement. Cahiers de l Ireb n 19,

268 Comment évaluer? Il a été proposé que cette échelle comporte à la fois des items dits génériques et des items dits spécifiques. Quelle structure de l échelle? Il a été proposé que cette échelle de QDV : comporte un nombre d items de 40 à 60 in fine soit une échelle pluridimensionnelle comportant environ 6 à 8 dimensions ait deux grand axes thématiques qui pourraient être abordés dans cet outil selon les objectifs fixés : une approche dimensionnelle «QDV habituelles» à partir du verbatim une approche complémentaire (Aspect pédagogique, informatif ) axée sur : comparaison entre ce que l on a et ce que l on veut avoir, ce que l on a et ce que et ce que d autres personnes «signifiantes» ont, ce que l on a et ce que l on a besoin, ce que l on est et ce que l on voudrait être A titre d exemple, les thématiques dimensionnelles de l échelle et leurs impacts sur la qualité de vie peuvent être déclinées ainsi : vécu de la maladie (des troubles, la gêne les symptômes ) : altération de la mémoire, attention, vigilance capacité à faire face à la maladie (alcool) différents pôles d intérêts du quotidien : vie intellectuelle : capacité à penser, à réfléchir capacité à prendre des décisions capacité à faire face à la vie de tous les jours, à maîtriser la situation vie affective : capacité à éprouver des émotions, sentiment de culpabilité vie relationnelle, sociale et familiale : Sentiment d être entouré / solitude, capacité ou non à communiquer, sexualité la gestion du quotidien : autonomie etc. CONCLUSION Le concept de QDV, c est : un enjeu majeur en santé publique, comme en santé mentale, une approche plus spécifique pour la prise en charge du patient, la possibilité d une écoute plus grande du sujet alcoolique, élargir ce concept à la famille, un apport de nouveaux outils d évaluation qui ne peut que contribuer à remplir ces objectifs. Références Arvers P., Assailly J.P., Batel P., Choquet M., Danel T., Daoust M., De Witte P., Facy F., Favre J.D., Hispard E., Lebrun T., Lehr-Drylewicz A.M., Lejoyeux M., Mormède P., Nahoum-Grappe V., Pérez-Diaz C., Tsikounas M. Alcool. Dommages sociaux, abus et dépendance. INSERM, coll. Expertise collective 2003, 536 p. Babor T., Caetano R., Casswell S., Edwards G., Giesbrecht N., Graham K., Grube J., Gruenewald P., Hill L., Holder H., Homel R., Österberg E., Rehm J., Room R., Rossow I. Alcohol: no ordinary commodity. Research and public policy. Oxford University Press, 2003, 290 p. 268 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

269 «La personne» Berr C., Clavel-Chapelon F., Dally S., Daval J.L., Fumeron F., Girre C., Larroque B., Lucas D., Marques- Vidal P., Mathurin P., Nalpas B., Rouach H. Alcool. Effets sur la santé. INSERM, coll. Expertise collective 2001, p Heather N. Repérage et prise en charge des problèmes d'alcool en médecine de premier recours. Le projet de l'oms. Alcoologie et Addictologie 2004, vol. 26, n 3 Suppl., p. 34S-40S. Klingemann H., Gmel G. Mapping the social consequences of alcohol consumption. Kluwer Academic Publishers 2001, 170 p. Martin P. Qualité de vie. In, Senon J.L., Sechter D., Richard D. Thérapeutique Psychiatrique, Science et Pratique médicales. Hermann Ed. 1995, p Martin P. Evaluation de la qualité de vie ou de l'existence? Une perspective à reconsidérer chez le patient schizophrène. In, Olié J.P., Dalery J., Azorin J.M. (eds). Médicaments antipsychotiques : évolution ou révolution? Acanthe 2001, p Organisation mondiale de la Santé. Rapport sur la santé dans le monde, 2002 : Réduire les risques et promouvoir une vie saine. OMS 2002, 262 p. Petrakis I.L., Gonzales G., Rosenheck R., Krystal J.H. Comorbidity of alcoholism and psychiatric disorders, Alcohol Res Health 2002, vol. 26, n 2, p Rehm J. The global distribution of average volume of alcohol consumption and patterns of drinking. Eur Addict Res 2003, vol. 9, n 4, p Rekve D., Negru L. Politique de la Région européenne de l OMS en matière d alcool : situation actuelle et perspectives. OMS, Aide-mémoire EURO 2005/10/05, 8 p. Cahiers de l Ireb n 19,

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271 «La personne» DIMENSIONS DE PERSONNALITE COMME PREDICTEURS DE L EVOLUTION DE L ALCOOLODEPENDANCE : COMPARAISON DE DEUX INSTRUMENTS D EVALUATION : L INVENTAIRE DE TEMPERAMENT DE CLONINGER (TCI) ET L INVENTAIRE DES CINQ GRANDS FACTEURS DE COSTA ET MCCRAE (NEO PI-R) LUCIA ROMO, STEPHANIE MILLE, CINDY LEGAUFFRE, SONIA MARQUEZ, SAMANTHA LELEU, ANGELIQUE EXCOFFIER, CAROLINE GERARD ET JEAN ADES Université Paris Ouest Nanterre La Défense, Laboratoire Evaclipsy, UFR SPSE, 200, avenue de la république Nanterre Cedex - France CHU Louis Mourier, Service de psychiatrie, 178 rue des Renouillers, Colombes Cedex - France Summary We have studied personality dimensions with two instruments: the Revised Neuroticism Extraversion Openness Personality Inventory NEO PI-R (Costa et McCrae, 1992) and the Temperament and Character Inventory (TCI) (Cloniger et al., 1993). We included 128 patients, but only 107 answered the whole questionnaire. 66.2% are male and 33.8% female, and the average age is 44 years. Regarding the results, personality dimensions of NEO PI-R show a high Neuroticism in all subscales, essentially for women. Extraversion, Conscientiousness and Openness (except openness for aesthetic in woman) are low. Agreeableness is higher than in general population. Regarding the Novelty seeking in TCI, exploratory excitability is low and impulsiveness is significantly higher. All subscales of Harm Avoidance are low but more significantly for fatigability and asthenia. Self-Directedness is low, essentially for Resourcefulness and Congruent second nature. Selftranscendence is low essentially in Self-forgetful and high in transpersonal identification. The correlations between NEO PI-R and TCI are generally significant (p<0.05), essentially in Extraversion and Openness and lower with others dimensions. The dimension N3 (Depressiveness) is negatively correlated with Self-determination and Cooperativeness. Vulnerability (N6) is negatively correlated with Self-determination and Cooperativeness. The Openness is significantly negatively correlated with Harm Avoidance and Agreeableness is positively correlated with Cooperativeness and Reward dependence. The correlations with depression, anxiety and impulsiveness can determine the compliance during therapy. Results highlight the need for further research on the evaluation of personality dimensions in treatment of alcoholic patients. Mots clefs Alcoolodépendance, personnalité, Tempérament and Caracter Inventory (TCI), Inventaire de personnalité NEO PI-R INTRODUCTION De nombreuses études se sont intéressées aux dimensions de personnalité particulières des individus présentant un abus ou une dépendance aux substances par rapport à une population contrôle. Certaines dimensions, comme la recherche de sensations, ont été généralement évoquées. Des recherches se sont également intéressées au rôle de ces dimensions de personnalité dans le «choix» de la substance addictive, par exemple les alcooliques seraient moins impulsifs, tandis que les personnes plus impulsives s orienteraient plus vers la cocaïne ou l héroïne (Borman et al., 2006 ;Conway et al., 2003). Cahiers de l Ireb n 19,

272 La recherche de sensations a été évoquée par certains auteurs comme étant associée à une pauvre autorégulation et à des difficultés d'inhibition. Différentes variables ont été évoquées par exemple dans la définition des groupes cliniques (abuseurs ou dépendants), dans la polyaddiction, dans les comorbidités psychopathologiques, dans la présence d une personnalité antisociale (Conway et al., 2003). Cloninger indiquait par exemple que la détermination pouvait être prédictive de la présence de trouble de la personnalité, avec un score inférieur à 20 (Cloninger et al., 1993). Utilisant le NEO PI-R, Coton et al. (2007) ont trouvé des liens entre les dimensions de personnalité comme facteur prédictif de l intensité du sevrage alcoolique et comment l intensité du sevrage est plus ou moins importante selon la diminution ou l élévation des dimensions : évitement du danger, dépendance à la récompense ou persistance. Néanmoins les hypothèses neurobiologiques sousjacentes sont seulement partiellement confirmées avec, entre autres, l absence de corrélation avec la recherche de nouveauté. Mais plusieurs études se sont intéressées à la relation entre dimension de personnalité et typologies de l'alcoolisme (Basiaux et al., 2001). Des études montrent comment les comportements parentaux de maternage ont une grande importance sur les dimensions de personnalité, plus que ceux du père d ailleurs, et qu il existe des liens entre le névrosisme et la conscience du NEO PI-R et la détermination et l évitement du danger du TCI (Reti et al., 2002). Il y a un intérêt de plus en plus grand pour une approche de la personnalité sur le modèle des cinq facteurs (De Fruyt et al., 2008). Le modèle de Cloniger du TCI a comme originalité de différencier deux concepts complémentaires : le tempérament et le caractère, dont l interprétation permet de définir, pour un individu donné, un profil qualitatif et un risque pathologique (Pelissolo, 1996). Le modèle de recherche de sensations est également un facteur de vulnérabilité pour l abus des substances ; il pourrait être associé au craving, surtout pour les femmes, ou comme un prédicteur de la dépendance chez les jeunes. L autre dimension très impliquée dans l alcoolodépendance est la détermination. Pour Evren et al. (2007), d autres dimensions de personnalité sont en lien avec les troubles de la personnalité et sont susceptibles de perturber la prise en charge. Par exemple, chez les individus du cluster A, il s agit de la faible dépendance à la récompense, pour les individus du cluster B, c est le niveau élevé de recherche de sensations et pour les personnes du cluster C, le niveau élevé d évitement du danger. L évitement du danger n est pas différent entre les consommateurs d alcool et ceux d autres substances, mais cette dimension est très importante pour les patients alcoolodépendants pour le lien avec la gestion des émotions négatives. Une autre étude sur le Neo PI-R et le TCI est celui de Rozsa et al. (2008) avec un autre test d évaluation du tempérament le TEMPS (Temperament Evaluation of Memphis Pisa Paris and San Diego), il s agit d une auto-évaluation du tempérament affectif selon le modèle d Akiskal. MATERIEL ET METHODES La recherche s est déroulée au CHU Louis Mourier à Colombes (service de Psychiatrie). Les critères d inclusion sont les suivants : des hommes et des femmes de plus de 18 ans, soit hospitalisés, soit consultants en ambulatoire pour leur problématique alcoolique et donnant leur consentement éclairé pour la participation à cette étude. Les critères d exclusion sont les suivants : des patients atteints de troubles cognitifs et neurologiques graves, schizophrénies ou parlant et comprenant mal la langue française. 272 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

273 «La personne» Matériel Afin de répondre à nos objectifs et hypothèses, nous avons retenu les outils méthodologiques suivants : pour les renseignements sociodémographiques : un questionnaire a été élaboré pour la recherche. Il se compose de plusieurs items concernant le sexe, l âge, l origine géographique, la situation familiale, le nombre d enfants, la situation professionnelle, le niveau d études et d éventuels événements de vie marquants. Des échelles d auto- évaluations dont : un questionnaire de personnalité, le NEO PI-R (Inventaire de Personnalité Révisé de Costa et Marie Choquet Crae, 1985) et traduit par Rolland et Petot (1994). Le NEO PI-R permet une mesure des cinq dimensions principales (ou domaines) de personnalité et de quelques-uns des traits (ou facettes) les plus importants qui constituent chaque domaine. Les cinq domaines et les 30 facettes du NEO PI-R fournissent une évaluation large de la personnalité adulte, (Costa et Marie Choquet Crae, 2005). Pour chaque sujet, le NEO PI-R nous renseigne sur des profils qui rendent compte des traits saillants de la personnalité. Le questionnaire est construit en référence à une théorie sous-jacente concernant la personnalité en cinq facteurs : le «Big Five». Ce modèle postule qu il est possible de donner une représentation relativement exhaustive, complète des différences de conduites, d attitudes, de réactions, qui existent entre les individus en les regroupant en cinq rubriques principales qui sont : l instabilité émotionnelle (ou le névrosisme), l extraversion, l introversion, l ouverture à l expérience, l agréabilité et la conscience. Le questionnaire TCI est un auto-questionnaire d évaluation de la personnalité de Cloninger et al. (1993), traduit en français par Pelissolo en Il est composé de 226 items à choix forcé vrai/faux, regroupés en sept dimensions. Il y a deux composantes : le tempérament avec quatre dimensions : la recherche de nouveauté, l évitement du danger, la dépendance à la récompense et la persistance (ces dimensions sont transmises génétiquement, stables et déterminées par des structures neurobiologiques). Pour le caractère, les dimensions sont : la détermination, la transcendance et la coopération. Ces dimensions sont soumises aux effets de l apprentissage, du développement et de la maturation. Les autres échelles utilisées sont les suivantes : la WURS (Wender Utah Rating Scale) (Ward et al., 1993) en cours de validation en français par notre équipe, évalue en 25 items, selon quatre facteurs, les déficits de l attention- enfant chez des adultes : les problèmes émotionnels et affectifs, les troubles de conduites, l hyperactivité et les difficultés attentionnelles ; l échelle Attention Deficit Disorders (ADD) de Brown (1996) permet une mesure de l hyperactivité adulte (en 40 items) en dégageant cinq facettes : l énergie, l attention, la tenue à l effort, les affects et la mémoire ; la Barratt Impulsiveness Scale (BIS- 10) (Bayle et al., 2000) mesure les trois principales dimensions de l impulsivité : l impulsivité motrice (agir sans penser), la dimension cognitive (décisions rapides) et l absence de planification (orientation vers l instant présent) ; la Hospital Anxiety and Depression (HAD) (Zigmond et Snaith, 1983) comporte 14 items cotés de 0 à 3. Sur ces 14 items, sept se rapportent à l évaluation de l anxiété et les sept autres à l évaluation de la dimension dépressive ; le questionnaire de stratégies de coping de Paulhan et al. (1994) sur les «stratégies de faire face», constitué de 29 items, définit cinq dimensions : autoaccusation, résolution de problèmes, évitement avec pensée positive, recherche de soutien social et réévaluation positive. Mode d administration La recherche a été présentée au sujet et il lui a été mentionné le choix de participer ou non à l étude, en sachant que cela ne modifierait en aucun cas sa prise en charge. Cahiers de l Ireb n 19,

274 Après l accord du sujet, un formulaire de consentement lui a été fourni. Les sujets sollicités ont été assurés du caractère confidentiel et anonyme de la recherche. A la suite d un entretien nous avons remis aux patients les auto-questionnaires à remplir. Ces derniers ont été récupérés, pour les patients hospitalisés dans la journée et pour les patients suivis, en ambulatoire lors de leur consultation suivante, soit une semaine après la remise. Il a été demandé au sujet d y répondre seul. La confidentialité des données recueillies a été garantie par l attribution d un numéro pour chaque sujet, rendant ainsi complètement anonyme la saisie et l analyse des données. RESULTATS ET DISCUSSION Les données ont été analysées à partir du logiciel Statistica V7. Au total 107 patients ont été inclus. En majorité les femmes sont mariées et en concubinage. Un quart de la population est en arrêt maladie, ce qui prouve l impact social et personnel de l alcoolodépendance. L âge du premier verre est significativement plus précoce chez les hommes que chez les femmes et également le nombre d hospitalisations précédentes, plus élevé chez les hommes. Homme Femme Effectif Age 43,56 (8,75) 46,9 (10,36) marié/concubinage (35,29 %) (46,15 %) en activité (36,76 %) (48,71 %) arrêt maladie (20,05 %) (25,64 %) âge 1er verre 15,63 (3,65) 20,76 (8,99) hospitalisation antérieure 3,95 (12,27) 1,46 (1,71) Pourcentages et moyennes et écart-types. Tableau 1 : données sociodémographiques. Moyenne écart-type HAD-A 11,37 4,62 HAD-D 8,54 4,41 RP 22,49 5,91 stratégies EP+ 20,04 4,27 de coping RSS 14,11 3,07 R+ 14,58 2,91 A 13,68 2,45 WURS Tot 35,32 20,89 ADD Tot 57,82 18,13 Barratt 1 21,60 6,17 Barratt 2 18,80 7,39 Barratt 3 20,81 6,86 Barratt Tot 61,15 16,25 Moyennes et écart-types Tableau 2 : moyennes et écart-types aux échelles de dépression et d anxiété, de stratégies de coping, d hyperactivité et d impulsivité. 274 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

275 «La personne» Les résultats montrent une anxiété significativement élevée et une dépression moyenne. Les stratégies de coping les plus utilisées sont la résolution de problèmes et la réévaluation positive de la situation. 23 % des patients présentent les critères d hyperactivité durant l enfance et à l âge adulte. L impulsivité est très élevée, particulièrement l hyperactivité motrice. N TOT E TOT O TOT A TOT C TOT NS TOT 0,15 0,30 0,35-0,23-0,39 HA TOT 0,47-0,63-0,22 0,06-0,29 RD TOT -0,09 0,24 0,21 0,21 0,02 P -0,07 0,21 0,20 0,12 0,53 S TOT -0,59 0,39 0,09 0,17 0,38 C TOT -0,17 0,13 0,24 0,45 0,12 ST TOT 0,31 0,14 0,30 0,01-0,03 En rouge les corrélations significatives à p < 0,05 Corrélation de Bravais-Pearson. Tableau 3 : corrélations NEO PI-R TCI. Les corrélations les plus importantes et négatives entre les deux questionnaires se situent entre la Détermination (la maturité et l autonomie individuelle et la régulation du comportement) et la dimension du NEO PI-R de névrosisme, et essentiellement dans les sous-dimensions : sens de la responsabilité et habitudes bénéfiques. Ceci est donc très important dans l alliance thérapeutique avec ces patients. Le névrosisme est aussi associé à la dimension du TCI de dépendance à la récompense, qui serait une dépendance affective et sociale et particulièrement avec sentimentalisme et vulnérabilité émotionnelle. Les deux dimensions correspondent à des difficultés dans la gestion des émotions. Plus l extraversion est élevée et moins la dépendance à la récompense est importante. Par ailleurs, la dimension d ouverture est corrélée positivement à presque toutes les dimensions du TCI, sauf à la dépendance à la récompense, ce qui implique que l individu a besoin des autres, du soutien des autres et de récompenses rapprochées. L agréabilité, quant à elle, est corrélée positivement avec la maturité et la conscience sociale de l individu et particulièrement avec le niveau de générosité, l intérêt de travailler pour la collectivité, de travailler en groupe et d aider les autres. Pour finir, la conscience est corrélée avec le besoin de soutien des autres et avec l indulgence : une attitude ouverte sans esprit de revanche. CONCLUSION Ce travail montre les liens entre ces deux questionnaires d évaluation de la personnalité basés sur des modèles différents mais complémentaires. Les dimensions explorées par ces deux questionnaires peuvent être d un grand intérêt dans le suivi clinique de nos patients, pour adapter les prises en charge par un travail sur les émotions, sur les difficultés dans les relations avec les autres, sur l intérêt des groupes de soutien, d entraide etc. L évaluation de la personnalité des patients ayant une dépendance aux substances peut être importante pour la prédiction, la prévention et le traitement de ces patients. References Basiaux P., Le Bon O., Dramaix M., Massat I., Souery D., Mendlewicz J., Pelc I., Verbank P. Temperament and Character Inventory (TCI) personality profile and sub-typing in alcoholic patients: a controlled study. Alcohol Alcohol 2001, vol. 36, n 6, p Cahiers de l Ireb n 19,

276 Bayle F.J., Bordel M.C., Caci H., Gorwood P., Chignon J.M., Adès J., Loo H. Structure factorielle de la traduction française de l échelle d impulsivité de Barratt (BIS-10). Can J Psychiatry 2000, vol. 45, n 2, p Borman P.D., Zilberman M.L., Tavares H., Suris A.M., El-Guebay N., Foster B. Personalty changes in women recovering from substance-related dependence. J Addict Dis 2006, vol. 25, n 4, p Brown T.E. Brown Attention-Deficit Disorders Scales for Adolescents and Adults. Psychological Corporation/Harcourt Assessment Compagny 1996, nombre de pages inconnu. Cloninger C.R., Svrakic D.M., Przybeck T.R. A psychobiological model of temperament and character. Arch Gen Psychiatry 1993, vol. 50, n 12, p Conway K.P., Kane R.J., Ball S.A., Poling J.C., Rousanville B.J. Personality, substance of choice and polysubstance involvement among substance dependent patients, Drug Alcohol Depend 2003, vol. 71, n 1, p Costa P.T., McCrae R.R. The NEO Personality Inventory Manual. Psychological Assessment Resources, Odessa, FL 1985, nombre de pages inconnu. Costa P.T., McCrae R.R. Professional manual: Revised NEO Personality Inventory (NEO PI-R) and NEO Five-Factor-Inventory (NEO-FFI). Odessa, FL: Psychological Assessment Resources 1992, nombre de pages inconnu. Costa P.T., McCrae R.R. NEOPI-R. Inventaire de Personnalité Révisé. Adaptation Rolland J.P., Petot J.M. ECPA 2005, nombre de pages inconnu. Coton X., Pinto E., Reggers J., Hansenne M., Parent M., Ansseau M. Impact de la personnalité sur l intensité du syndrome de sevrage alcoolique : une étude préliminaire avec le modèle de Cloninger. L Encéphale 2007, vol. 33, n 3, p De Fruyt F., De Clercq B., Miller J.D., Rolland J.P., Lynam D.R. Une approche des troubles de la personnalité par le modèle à cinq facteurs. Annales Médico-psychologiques 2008, vol. 166, n 6, p Evren C., Evren B., Yancar C., Erkiran M. Temperament and character model of personality profile of alcohol- and drug-dependent inpatients. Compr Psychiatry 2007, vol. 48, n 3, p Paulhan I., Nuissier J., Quintard B., Cousson F., Bourgeois M. La mesure du coping. Traduction et validation française de l échelle de Vitaliano. Ann Med-Psychol 1994, vol. 152, n 5, p Pelissolo A. Le modèle de Cloninger et le TCI. Mémoire de DES de Psychiatrie Document non publié. Reti I.M., Samuels J.F., Eaton W.W., Bienvenu O.J. 3rd, Costa P.T. Jr, Nestadt G. Influences of parenting on normal personality traits. Psychiatry Res 2002, vol. 111, n 1, p Rozsa S., Rihmer Z., Gonda X., Szili I., Rihmer A., Ko N., Németh A., Pestality P., Bagdy G., Alhassoon O., Akiskal K.K., Akiskal H.S. A study of affective temperaments in Hungary: Internal consistency and concurrent validity of the TEMPS-A against the TCI and NEO PI-R. J Affect Disord 2008, vol. 106, n 1, p Ward M.F., Wender P.H., Reimherr F.W. The Wender Utah Rating Scale: An aid in the retrospective diagnosis of childhood attention deficit hyperactivity disorders. Am J Psychiatry 1993, vol. 150, n 6, p Zigmond A.S., Snaith R.P. The Hospital Anxiety and Depression Scale. Acta Psych Scand 1983, vol. 67, n 6, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

277 «La personne» FACTEURS SOCIAUX DE REGULATION DES CONSOMMATIONS : ETHNOLOGIE DES SOIREES ETUDIANTES EN APPARTEMENT CHRISTOPHE MOREAU ET CHRISTOPHE PECQUEUR JEUDEVI - LAS, Université Européenne de Bretagne Rennes 2, ZAC Atalante Champeaux, 3, allée Adolphe Bobierre, Rennes - France Summary This research is based on a survey of five groups of students that we have observed and interviewed during festive evenings taking place in apartments. Data analysis allowed us to identify the various social factors structuring festive behaviors, and whose potential combinations may promote the regulation of festive excesses. However, these factors and the associated modes of regulation only make sense according to the life stories of revelers who will determine a greater or lesser sensitivity to peer pressure and a difference in capacity to control their consumption. To sort our observations and analysis, we distinguished four major figures in the partygoer. The "conformist" would tend to exhibit restraint, but he is seeking membership in the peer group and submits to the partying and drunkenness by conformism. His excesses are recurrent but controlled, festive behavior being temporary in his life. The "libertine" centers his behavior on the pursuit of pleasure, and the sharing of emotions that it brings. Strongly adhering to his peer group or the surrounding atmosphere, he promotes and celebrates the collective exhilaration which is a full-time lifestyle for him. Withdrawn on himself in a form of existential unease, the "daredevil" uses the feast and drink to forget himself. His course is marked by instability and compulsive search of inebriation that leads him to multiply the risks taken and can lead to isolation. The "uncomfortable" tends to restrict his consumption or to be very cautious. Rather inward-looking, drunkenness may temporarily help him to uninhibition, but he remains a good child strongly marked by his family. Mots clefs Sociologie, ethnologie, jeunesse, adolescence, fête, ivresse, identité, risque En 2007, neuf étudiants bretons sur dix déclarent qu ils consomment des boissons alcoolisées, ce qui fait de l alcool le produit le plus répandu dans cette population. 10 % d entre eux déclarent en consommer de façon régulière, l âge moyen d entrée dans la consommation mensuelle d alcool des étudiants se situant à 17 ans, comme c est le cas chez les jeunes en général. L ivresse demeure un comportement davantage masculin que féminin ; 51 % des garçons et 25 % des filles déclarent avoir été ivres au moins trois fois au cours des douze derniers mois. Un étudiant sur dix déclare rechercher exclusivement l ivresse lors de ses consommations d alcool. Enfin, il s avère que la consommation solitaire d alcool est un comportement marginal au sein de la population étudiante (3 % de garçons et 1 % de filles) (ORS Bretagne, 2008). Derrière ces chiffres se cache donc une réalité diverse et complexe que nous avons cherché à déconstruire pour en saisir certains des mécanismes sous-jacents (ceci dans un contexte où l alcoolisation des jeunes est de plus en plus stigmatisée en tant qu élément de déstructuration du lien social). À cet effet, nous avons réalisé une enquête qualitative auprès de cinq groupes d étudiants (à Rennes, mais aussi à Amiens) que nous avons suivis lors de soirées festives en appartement. Nous nous sommes également entretenus de façon individuelle avec quelques-uns d entre eux afin de mettre en relief des trajectoires singulières. Bien sûr, nos observations ne se sont pas cantonnées aux seuls étudiants ; ces derniers ne vivant pas repliés sur eux-mêmes, la plupart des groupes que nous avons rencontrés étaient mixtes. Leurs trajectoires festives s inscrivent dans des espaces urbains plus larges que leurs seuls appartements. Nos questionnements traversent ainsi l ensemble du spectre de la jeunesse. Cet article met en avant nos principaux constats. Cahiers de l Ireb n 19,

278 REPERES ANTHROPOLOGIQUES Notre questionnement anthropologique part d une réflexion sur la jeunesse, sa place dans la cité, ses modes de construction identitaire et ses relations avec les autres générations. On constate qu il s agit d une notion floue dont les contours sont difficiles à cerner. Période de transition entre l enfance et l âge adulte, l allongement de la jeunesse dans les sociétés modernes a pour conséquence l agrégation sous ce qualificatif d une population aux réalités extrêmement diverses et contrastées. Pour sortir de l impasse d un découpage des générations en fonction des âges, Galland (1991) propose donc de raisonner en termes de «cycle de vie». Cependant, l effacement des étapes qui marquaient socialement le passage d une génération à une autre, leur décalage dans le temps, voire leur possible réversibilité rendent la situation des jeunes de plus en plus inconfortable et incertaine. Le groupe de pairs constitue alors une zone de repli qui rassure et devient un champ privilégié pour l expérimentation de soi et de ses aptitudes sociales, dans un contexte d allongement de la jeunesse. La fête est également un objet de questionnement anthropologique. Si l on oppose souvent le temps festif au temps du quotidien, on constate dans les sociétés contemporaines une généralisation, voire une banalisation de l esprit festif (Gravari-Barbas, 2008), largement récupéré par les institutions de l économie marchande et de la société de consommation. Avec Nahoum-Grappe (2008), il est possible de distinguer au moins deux «moments» fondamentaux qui segmentent l espace festif : le temps cérémoniel qui s inscrit en prolongement du temps ordinaire dont il officialise les valeurs et les hiérarchies au travers de rituels, et le temps carnavalesque qui est celui de l inversion et du retournement des valeurs, marqué par la recherche du vertige et de la démesure où l on s autorise ce qui n est pas permis en temps normal, le désordre provisoire qui s installe n ayant d autre fonction que de consolider par contraste l ordre habituel. Si ces deux modalités continuent de structurer l être ensemble festif contemporain, la tendance est aujourd hui à une atomisation des pratiques festives qui ne prennent plus seulement sens au travers de la mise en scène du collectif et de son devenir par luimême, mais également dans un rapport autocentré du sujet (ou du groupe restreint) à lui-même, davantage tourné vers le présent, l immédiateté du ressenti, la quête du divertissement et de la jouissance intime (Dagnaud, 2006). On peut penser que la cérémonie (temps cérémoniel) s efface au profit de la liesse (temps carnavalesque) qui se généralise mais perd de son sens, faute de codes sociaux intergénérationnels et par déficit d apprentissage de «l auto contrôle» (Moreau et Sauvage, 2006). Troisième angle d attaque anthropologique, le «boire» (alcoolisé) est une activité essentielle pour l humain, qui se distingue cependant des autres modalités de l alimentation par son caractère nonvital, ainsi que par les effets psychotropes qu il génère sur l organisme (Obadia, 2004). L alcool apparaît en cela comme un puissant désinhibant, facilitant (en apparence) pour de nombreux jeunes la relation à autrui. À un boire convivial et encadré socialement, vecteur d intégration, associé à la commensalité et au partage (le «savoir boire» - Caro, 2006) on oppose un «boire anomique» (Nahoum-Grappe, 1989), désinséré des appartenances et des rythmes sociaux, générateur de conduites à risques échappant à la régulation du groupe et menaçant de ce fait le lien social. Entre ces deux extrêmes, les pratiques d alcoolisation des jeunes recouvrent certainement des significations diverses : de l apprentissage des codes sociaux du monde adulte à l exploration de ses limites corporelles, de la quête d une rencontre avec un partenaire sexuel à la volonté de s oublier dans l ivresse, d un désir de réappropriation de son cadre d existence dans un «temps à soi» à une forme d automédication pour lutter contre l angoisse d un devenir incertain (Le Garrec, 2002). LES MODES DE REGULATION Le premier constat qu il nous est possible de faire est celui de la persistance de modes de régulation au sein de la sphère privée que constitue l appartement. Bien que cet espace échappe largement au regard du monde adulte, l hypothèse selon laquelle les pratiques d alcoolisation qui s y déroulent sont potentiellement plus dangereuses car moins encadrées socialement se trouve invalidée. Certes, l intimité du domicile privé peut contribuer à accélérer les effets désinhibiteurs de l alcool, mais elle ne saurait expliquer en elle-même le développement de conduites excessives. Comme nous allons le 278 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

279 «La personne» voir, plus que les types d espaces fréquentés, ce sont bien les trajectoires de vie de chacun qui vont expliquer les différents modes de consommation des fêtards. À la suite de nos observations et au travers des entretiens que nous avons menés auprès des étudiants, nous avons pu mettre en lumière différents facteurs intervenant, de façon plus ou moins explicite, dans la régulation des comportements festifs et des types de consommation associés. Aucun de ces facteurs ne saurait constituer à lui seul un élément de protection absolu ; seule la conjugaison de plusieurs d entre eux, formant un faisceau d éléments favorables, et surtout l engagement spécifique de chacun dans les relations festives (en fonction de son parcours, de ses attentes), nous semble à même de minimiser de façon significative les excès possibles et les risques encourus. Voici les principaux facteurs de régulation que nous avons pu relever : L âge biologique : boire n est pas seulement un acte social, c est aussi une épreuve physique qui met en jeu le corps et ses limites. Après une première phase ascendante, lors de laquelle le fêtard s habitue progressivement aux effets de l alcool et apprend à les tolérer de mieux en mieux, un second stade apparaît aux alentours de ans où les capacités d endurance (surtout en ce qui concerne le temps de récupération suivant une ivresse excessive) s amenuisent et rendent les lendemains de fête particulièrement difficiles et rédhibitoires. Le cycle de vie («l âge social») : le passage d une étape de l existence à une autre (marqué par des événements comme l entrée dans le monde professionnel, la mise en couple, la parentalité, etc., fait basculer le jeune dans un nouvel univers de responsabilité qui influence ses attentes face aux relations sociales et entraîne un réaménagement de ses pratiques. Si le passage se fait souvent de façon progressive, on assiste dans bien des cas à une transformation radicale du type de pratique festive. Schématiquement, la séparation entre temps festif et temps ordinaire se fait plus nette, les consommations d alcool se font plus modérées, la recherche du plaisir gustatif et de l euphorie remplace celle de l ivresse, les fêtes se structurent davantage autour des repas, etc. Ce passage, autour de ans, est marqué par la fin de la deuxième ou troisième année d études, par la nécessité de plus en plus prégnante de «s orienter» professionnellement, et par l installation dans un appartement moins provisoire, plus confortable, plus spacieux, où l on peut recevoir ses amis plus aisément. Le cérémoniel : la ritualisation des comportements festifs au travers d une pratique collective codifiée implique un type d engagement dans la fête davantage tourné vers le groupe. La participation à ces rituels (le respect d un certain nombre de civilités, le repas pris en commun, la danse, le chant, etc.) entraîne une entrée en fête progressive. Les consommations de chacun se retrouvent coordonnées au travers d un boire collectif ayant pour effet de tempérer les ardeurs de certains gros buveurs. Ce temps liminaire n empêchera pas la fête de suivre son cours habituel et de basculer graduellement dans le carnavalesque, temps plus propice aux débridements et à la libération des pulsions individuelles. On suppose néanmoins que le préalable cérémoniel contribue, si ce n est à retarder le moment de l explosion festive, du moins à lui donner un sens (celui de l inversion) et d en atténuer les errements. L énonciation de règles explicites : comme tout rassemblement humain, la fête implique une division des rôles et des charges qui y sont associées. Dans le cadre spécifique du domicile privé, le rôle de celui qui reçoit peut avoir une influence déterminante dans la régulation des comportements des convives. Outre les possibles rappels à l ordre que l hôte peut formuler, la simple énonciation (orale ou écrite) de règles de conduites ou d interdictions (ne pas fumer dans telle pièce, faire attention à tel objet, etc.) participe à structurer la scène festive en tant que lieu habité, investi par l altérité. La dimension matérielle des objets et du mobilier, notamment, induit une partie de ces réglementations implicites ou explicites de même que l attention au voisinage. Bien sûr, le respect des contraintes aura tendance à s étioler avec l avancée dans la nuit et l ivresse. La réprobation du groupe : les écarts de conduites et les excès de celui qui boit trop ou qui maîtrise mal les effets de l alcool peuvent être tempérés par les rappels à l ordre des autres membres du groupe festif, manifestant une forme de réprobation qui stigmatise le contrevenant et exerce une pression sur lui pour qu il modifie son comportement. La drague : la quête d un partenaire sexuel constitue un enjeu spécifique qui oriente l attitude du fêtard face aux pratiques d alcoolisation. Certes, les effets désinhibants de l alcool peuvent être Cahiers de l Ireb n 19,

280 recherchés pour faciliter la rencontre et vaincre sa timidité, mais au-delà la drague nécessite de conserver une certaine maîtrise de ses attitudes et comportements, du moins elle rend encore plus sensible celui ou celle qui s y adonne au regard de l autre et à sa propre image. Le genre et la répartition sexuée des rôles : de façon générale, les jeunes filles assument un rôle de protection de leurs pairs, incitent à la réflexivité (attention à soi, photographies et vidéos) et à la projection dans l avenir. Elles incitent à s alimenter et supervisent le plus souvent le repas ou les amuse-gueules. L identification à un modèle de genre dans lequel l excès éthylique ne constitue pas un passage obligé pour l affirmation de soi expliquerait la moindre implication des filles dans les conduites d alcoolisation. De même, on note que dans les soirées entre filles, l alcool n occupe pas systématiquement une place centrale comme c est le cas chez les garçons. Les exceptions existent mais sont plutôt rares. L intergénération : on constate que les soirées «mixtes» dans lesquelles se mélangent différentes générations sont moins propices aux débordements éthyliques incontrôlés ; probablement en ce qu elles favorisent une prise de distance vis-à-vis de ses propres pratiques en considérant celles des autres. S exerce ainsi plus facilement une forme d autocontrôle dont la base tient précisément à cette mise à distance de soi. Plus généralement, l accompagnement des plus jeunes par des aînés lors des premières expériences d alcoolisation (que ce soit dans un cadre familial, associatif, de loisir, etc.) peut contribuer à former un cadre d apprentissage dans lequel la consommation d alcool prend sens autrement qu au travers de la simple recherche de l ivresse. Évidemment, l existence de ce cadre n empêchera pas le jeune d expérimenter avec son groupe de pairs l ivresse excessive et les pratiques transgressives en général, mais la référence à une culture positive du boire pourra être mobilisée en temps voulu comme une ressource possible dans la construction d un mode de consommation stabilisé. L intervention d un tiers : l irruption sur la scène festive d un tiers suite à un débordement quelconque (souvent lié au bruit) constitue généralement un événement qui influence le déroulement de la soirée et les comportements de chacun. En venant rappeler, de façon plus ou moins autoritaire, la présence d autrui aux alentours de l appartement, l intervention d un tiers (voisin, policier, parent, grand frère, etc.) rompt avec l étanchéité supposée de la scène festive. Le changement de représentation qui en résulte peut contribuer à modifier les conduites festives et les modes de consommation. Des expériences «traumatiques» : avoir été accidenté suite à une ivresse excessive, a fortiori avoir un proche décédé lors d un tel accident, ou dans une moindre mesure avoir été fortement malade à la suite d une trop grande alcoolisation, peut provoquer un choc suffisamment important pour que le fêtard modifie, plus ou moins durablement, ses pratiques d alcoolisation. LES TRAJECTOIRES DE FETARDS Les modes de régulation que nous avons énoncés ne prennent sens qu au regard des trajectoires de vie des fêtards. Un même facteur aura un impact différent selon qu il est perçu de tel ou tel point de vue, faisant ou non écho à la problématique personnelle de chacun. Pour illustrer schématiquement ces différents positionnements, nous avons distingué quatre figures majeures. Cette construction idéale - typique repose sur deux axes fondamentaux à partir desquels nous percevons les pratiques festives : l axe social de la négociation avec l altérité et l axe émotionnel de la régulation des désirs (Moreau et Sauvage ; 2006). On peut donc dire que, fondamentalement, l effet de ces facteurs de régulation dépend, d une part, de la capacité du jeune à construire sa personne et à poser l autre, et d autre part, de sa capacité d auto contrôle lui permettant de mettre à distance ses pulsions. Nous avons montré dans nos travaux que ces deux compétences rationnelles (sociale, et éthique) se développent à partir de l enfance mais s installent définitivement à partir de l adolescence, période expérimentale pouvant donner lieu à des comportements quasi pathologiques qui se résorbent généralement lors du passage à l âge adulte. 280 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

281 «La personne» Le fêtard représenterait l alternance idéale entre quant à soi et ouverture à l autre, entre plaisir et renoncement. Mais dans bien des cas, l un de ces axes se polarise révélant une difficulté à être ou à réguler ses désirs. Voici les quatre trajectoires que nous avons dissociées : Le conformiste segmente son rapport au temps en dissociant fortement temps productif (la semaine) et temps festif (le week-end). Il développe une mobilité de type pendulaire en s ajustant aux espaces et aux horaires de l offre festive existante (début de soirée en appartement, puis bar ou discothèque). Il recherche avant tout l adhésion au groupe de pairs, et entre dans la fête et l ivresse par mimétisme. Il y trouve l occasion de sortir de sa condition ordinaire et d oublier le quotidien. En cela, le temps festif est pour lui un moment où il se permet de dire et de faire des choses qu il n oserait pas en temps normal. S il a tendance à restreindre habituellement ses consommations, la prise d alcool a pour but d amplifier cette expérience de l altérité en permettant d éprouver son corps et son esprit comme n étant pas à soi. Cette extériorisation prend sens dans la perspective d une redéfinition de son image par inversion (rappelant la dimension carnavalesque de la fête), mais aussi au travers de l agrégation à un groupe de pairs dont il copie les usages et respecte les codes. C est à ce double titre (redéfinition et agrégation) que l épreuve festive recouvre pour lui une forte portée initiatique. S il recherche des modèles parmi ses pairs, le conformiste demeure en lien avec le monde adulte dont il attend, implicitement ou explicitement, une régulation. Ses excès sont donc maîtrisés et temporaires, la fête prenant une place épisodique dans son parcours. «Se retrouver dans un cadre nouveau te fait dire des trucs que tu dirais pas normalement. Qu il y ait une telle ébullition autour de la préparation d une fête c est bien qu on sent que les rapports vont changer». «Il y avait quand même un petit programme à respecter plus ou moins. C était début de soirée chez un particulier, apéro et puis ensuite on prolonge l apéro dans un bar et pour finir on va en club». «J essaie de bien me coiffer bien m habiller, touche de parfum machin. D avoir un paraître irréprochable. Je pense que je me prépare comme toute personne normalement constituée. J essaie de tout faire pour plaire un minimum aux personnes qui vont m entourer et que je vais côtoyer tout au long de la soirée». «Quand ça fait une bonne partie, un bon laps de temps que tu côtoies les mêmes personnes en soirée, tu sais comment ils réagissent et puis tu commences à connaître toutes tes limites donc après un certain âge tu te dis que c est bidon d aller jusqu à se rendre malade, de perdre totalement le contrôle de soi même». Le libertin vit au présent et ne pose pas frontière entre temps ordinaire et temps festif. La fête et l ivresse constituent pour lui un mode de vie à part entière qu il valorise et pour lequel il milite. Sa mobilité s ajuste aux espaces festifs institués (le centre-ville) mais il se différencie du conformiste en s affranchissant des rythmes programmés. La fête est une pratique improvisée qui peut surgir à tout moment, même s il apprécie particulièrement la liesse des grands rendez-vous (jeudis soirs, festivals, etc.). S il met au centre de ses pratiques la quête du plaisir, c est dans la perspective d un partage des émotions selon un jeu subtil de connivence et de distinction, voire de compétition avec autrui. L alcoolisation (comme la prise d autres psychotropes) est un moyen pour lui de s affirmer et de conforter son image au travers de la réalisation de ses envies, toujours dans le souci du regard de l autre dont il cherche la complémentarité. Son goût pour la transgression l amène à esquiver les relations frontales avec le monde adulte, et à n évoluer qu au milieu de ses pairs auxquels il attribue exclusivement le rôle de régulateur. «On se retrouve des fois à 30 ou 40 dans un appart et j en connais que dix ou quinze, tout le reste je les connais pas ( ) Moi je rencontre des gens que je connais pas, et ils me disent «Ah mais moi je suis venu parce que je connais un tel et qu il m a invité». C est comme ça que se rencontrent les gens, et puis que les réseaux se forment. Après on les invite à d autres soirées». «J ai plus besoin de voir mes amis que mes parents. C est vraiment très fort entre nous. Quand je suis parti à l étranger (pour deux mois) je les avais tous les jours au téléphone». «On est au-dessus de la moyenne, je compare par rapport aux gens qui sont dans ma classe ou d autres gens, c est sûr y-en a qui se mettront jamais minables comme nous Mais bon, j aime bien aussi ce style de vie». Cahiers de l Ireb n 19,

282 «Mes parents boivent beaucoup moins que moi, ils savent même pas la vérité sur ce que je bois parce que ils peuvent pas imaginer que je me bois toute seule un pack de 24 bières en une soirée ( ) On sait la limite, mais pourtant on a beau avoir 22 ans, des fois on la dépasse». Le casse-cou vit également au présent et confond volontiers temps festif et temps ordinaire, mais à la différence du libertin il cherche plutôt à fuir le regard de l autre. Sa pratique festive s oriente davantage vers des événements et des espaces en marge de l offre officielle (teknivals et free parties, fêtes dans les squats ou les friches urbaines). Le repli dans l intimité du domicile privé rentre également dans cette stratégie d évitement. Marqué par le mal-être et l angoisse que génère sa propre image, la fête et l alcoolisation excessive sont des moyens pour le casse-cou de s oublier, de s anesthésier face aux douleurs qu il ressent. Consommateur expérimenté, c est en toute connaissance de cause qu il se met en danger au travers de sa recherche compulsive du vertige ; ceci dans l espoir secret qu émerge de cette confrontation avec la mort des significations nouvelles qui donnent un sens à sa souffrance (Le Garrec, 2002). Le casse-cou éprouve des difficultés à négocier avec l altérité et à maîtriser ses émotions ; ses relations oscillent bien souvent entre mise à distance et conflit (voire rixe) sans qu il ne parvienne à trouver un juste milieu. Son parcours est aussi marqué par cette instabilité (ruptures familiales, scolaires, délinquance, etc.) qui peut le conduire à l isolement. Il reporte sans cesse son engagement dans la vie sociale et vis-à-vis du monde adulte, et préfère vivre au jour le jour entouré de ses copains de galère. «Faire des mélanges (d alcools forts), c est nocif mais j aime bien ça». «Des fois je suis trop bourré ça arrive que j ai des trous noirs ( ) J ai du mal à me gérer des fois ( ) Une fois j étais trop beurré, sous champi, j ai dormi dans un hall d immeuble dont la porte était fracturée. Les flics sont arrivés, ils m ont embarqué». «Je me suis jamais trop entendu avec mes parents. Quand je les vois pas ça va bien, si je les vois trop souvent ça devient prise de tête autour de ça (la fête, la défonce)». «Une fois j ai été impliqué dans une baston en bas de chez moi où j ai fini au poste parce que j avais fait des bêtises, j ai été un peu trop méchant. En fait, on s est fait tabasser, et puis trop bourré je suis arrivé chez moi et j ai pris la première chose qui me tombait sous la main pour aller faire justice moi-même. J ai pris deux couteaux, je suis allé revoir les mecs, je suis arrivé devant eux et je les ai insulté de tous les noms ( ) J ai touché un mec à la main, sans le vouloir en plus, vraiment sous le coup de la colère, je pense que c est l adrénaline qui est montée». Le mal à l aise distingue dans ses rythmes hebdomadaires temps festif et temps ordinaire, mais il vit le passage de l un à l autre comme un continuum n engendrant pas de ruptures spécifiques dans ses habitudes et ses comportements. Peu sensible à l exaltation festive, il préfère passer ses soirées dans la torpeur d un appartement entouré de quelques amis proches avec lesquels il se sent en confiance. Enfant sage, il a tendance à restreindre ses consommations et à minimiser les prises de risque, les excès divers (chez lui ou chez les autres) générant en lui un fort sentiment de gêne. Il met d ailleurs en place toute une série de précautions afin d encadrer et de maîtriser son alcoolisation. Éventuellement, il utilise l alcool dans le but de se désinhiber et de faciliter sa relation aux autres. Il investit beaucoup dans le cérémoniel (les civilités, le repas, etc.) et les activités cérébrales (discussions, débats, jeux de société, etc.), repoussant le moment carnavalesque de l exubérance et du relâchement des corps. Ce qu il cherche surtout dans la pratique festive c est à reproduire un univers policé et chaleureux, rappelant le cocon familial, qui le rassure face à sa peur de l autre. Cette quête quelque peu régressive du «même» est sans doute à mettre en rapport avec un parcours «sans histoires», marqué par la prégnance du milieu familial avec lequel le cordon n a pas vraiment été coupé. «Faire la tournée des rades pour moi c est je suis pas du tout dans ce truc là. Les bistrots je ne m y sens pas forcément très bien». «La fête de la musique je la vois en spectateur. Ma communion avec les autres elle se passe pas là-dedans. Parce qu il y a pas de liens de confiance. Tu y trouves quelqu un qui est sur le délire et pas du tout sur la confiance, sur une certaine sensibilité que tu pourrais transmettre, des choses, du vécu. J ai pas cette confiance, je me sens complètement en dehors». 282 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

283 «La personne» «(L appartement) c est pas un terrain neutre, c est un lieu qui n est pas public, qui signifie quelque chose pour la personne qui y habite au quotidien et aussi pour ses potes. T es dans le territoire de quelqu un, y-a quelque chose comme de l admission, tu rentres sur son terrain, tu rentres chez lui, tu vis avec lui, quoi ( ) Tu peux parler de ce qui va pas, tu peux dire des choses assez intime». «Je bois systématiquement, un verre d eau, un verre de vin, ça te permet d éviter de sérieuses gueules de bois. Systématiquement, vraiment systématiquement. Ça fait deux ans que je fais ça. Peut être que je m y suis contraint, mais sans vraiment m y contraindre». Il ne s agit pas pour nous de réduire l ensemble de la réalité des pratiques festives à ces figures idéales typiques, mais surtout d ordonner nos observations et nos analyses. Nos travaux consistent par ailleurs à identifier, pour chaque profil, des types de risques spécifiques, des modalités de prévention ou de réduction des risques plus adaptées, et des modalités de passage d un type à l autre. Références Caro G. De l alcoolisme au savoir-boire. L Harmattan 2006, 275 p. Dagnaud M. La fête jusqu à plus soif. Regards sur la génération montante (les ans). Rapport de recherche 2006, 3 p. Galland O. Sociologie de la jeunesse. L entrée dans la vie. Armand Colin 1991, 247 p. Gravari-Barbas M. L invasion de la fête dans les espaces urbains. In, Actes du colloque «Fête(s) et horaires nocturnes». Rennes 2008, 30 p. Le Garrec S. Ces ados qui «en prennent». Sociologie des consommations toxiques adolescentes. Presses Universitaires du Mirail 2002, 20 p. Moreau C., Sauvage A. La fête et les jeunes. Espaces publics incertains. Apogée 2006, 223 p. Nahoum-Grappe V. Histoire et anthropologie du boire en France du XVIe au XVIIIe siècle. In, De l ivresse à l alcoolisme. Etudes ethnopsychiatriques. Dunod 1989, 256 p. Nahoum-Grappe V. Le regard de l anthropologue. In, Actes du colloque «Fête(s) et horaires nocturnes». Rennes 2008, 30 p. Obadia L. Le «boire». Une anthropologie en quête d objet, un objet en quête d anthropologie. Socio- Anthropologie 2004, n 15, 17 p. ORS Bretagne. La santé des jeunes scolarisés en Bretagne en Principaux constats. Observatoire Régional de la Santé Bretagne 2008, 8 p. Cahiers de l Ireb n 19,

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285 «La personne» APPORT D UNE MESURE IMPLICITE POUR ETUDIER LA PERCEPTION DES JEUNES A L EGARD DES NOUVELLES BOISSONS ALCOOLISEES ET AROMATISEES STEPHANE PERRISSOL 1, YOAN FOS 2, VALERIE LE FLOCH 1, CHLOE LELOIR 1, DENIS HILTON 1 ET JACQUES PY 1 1 Université de Toulouse 2 Le Mirail, Laboratoire CLLE-LTC, UMR 5662 du CNRS, 5 allées Antonio Machado, Toulouse Cedex 9 - France 2 Université de Haute Bretagne, LAUREPS, place du Recteur Henri Le Moal, Rennes - France Summary The aim of this research is to measure implicit attitude towards alcopops. These beverages are ambiguous: they have characteristics of sodas (colours, taste, etc.) but contain alcohol. This ambiguity questions the attitude that people develop towards these specific alcoholic beverages compared to more traditional ones (wine, spirits ). In that way, 73 participants performed an Implicit Association Test (IAT, Greenwald et al., 1998) which opposed alcopops to sodas. Results are compared to other studies using Implicit Association Test on traditional alcoholic beverages. They reveal that attitude towards alcopops is different from other alcoholic beverages. These results allow us to suppose that these people do not attribute the same properties and effects that they attribute to other alcohols. Mots clefs Alcopop, attitude and implicit association test, nouvelle boisson alcoolisée, attitude et test d association implicite Les années 90 ont été marquées par l apparition des nouvelles boissons alcoolisées et aromatisées ou alcopops. En 2006, le chiffre d affaires en France concernant la vente de ces boissons en grande et moyenne surface s élevait à 426 millions d euros. Outre le fait qu elles soient alcoolisées, ces boissons se caractérisent par leur ressemblance avec les sodas : elles sont généralement très sucrées, pétillantes de couleur vives voire fluorescentes. En outre, la forme des bouteilles n est pas sans rappeler certaines grandes marques de soda et à l instar de ces dernières, les alcopops se consomment frais ou glacés. Autrement dit, ce type de boissons peut être considéré comme un soda alcoolisé dont la cible privilégiée est les jeunes. Dès lors, l ambiguïté de ce type de produit interroge sur la perception qu en ont les individus. Sont-ils considérés comme des boissons alcoolisées au même titre que le vin, la bière ou les spiritueux ou comme une boisson alcoolisée particulière susceptible d engendrer des attitudes spécifiques? L étude des attitudes est un champ majeur de la psychologie sociale. L un des intérêts majeurs de ce champ d étude est que l attitude et les comportements sont liés. En effet, si de nombreuses études montrent le pouvoir prédictif d une attitude dans l adoption d un comportement (Bagozzi, 1977, 1978 ; Breckler, 1984 ; Wittenbrink et al., 1997), d autres soulignent l effet d,e l adoption du comportement sur l attitude (Festinger, 1957 ; Kiesler, 1971 ; Beauvois et Joule, 1981, 1996). Si longtemps, l attitude des individus a été mesurée par le biais de questionnaires, de nouvelles méthodes se sont développées au cours des dix dernières années. En effet, le recours à des questionnaires était susceptible d engendrer la manifestation de biais de désirabilité de la part des répondants, surtout lorsqu il s agit de sujets tels que le racisme ou l alcool, ces derniers, répondant non pas en fonction de ce qu ils pensent, mais davantage pour être bien vus par l expérimentateur. Ces nouvelles méthodes reposent sur des mesures de temps de réaction. Elles partent du postulat que la simple présence d un objet active automatiquement une évaluation. L une des mesures les plus employées est l IAT (Implicit Association Test) élaboré par Greenwald, McGhee et Schwartz (1998). La tâche consiste à associer deux concepts-cibles opposés à des attributs évaluatifs plaisants et Cahiers de l Ireb n 19,

286 déplaisants. Cette mesure a déjà été utilisée pour mesurer l attitude implicite à l égard de l alcool (Fos et al., soumis à publication). Pour cela, on opposait des photos de boissons alcoolisées à des photos de boissons non alcoolisées. Cette mesure permet de mesurer si les boissons alcoolisées sont aussi rapidement associées à des attributs évaluatifs plaisants puis déplaisants que des boissons non alcoolisées. Cette recherche avait ainsi pour but de montrer que les individus ont généralement une attitude négative envers les boissons alcoolisées. De plus, si cette attitude est prédite par la consommation de différentes boissons alcoolisées (vin, bière, spiritueux), certains alcools plus ambigus, tels le cidre en Bretagne, ne permettent pas de prédire l attitude générale envers l alcool. Pour certains, le cidre possède davantage les caractéristiques d un jus de pomme que d un alcool (Perrissol et al., 2005). L objectif de cette recherche consistait à mesurer l attitude implicite de jeunes envers les alcopops étant donné l ambiguïté de ces produits. Ces boissons possèdent en effet par leur couleur, leur forme ou leur goût les propriétés des sodas tout en contenant un certain degré d alcool. Pour cela, nous reprendrons l expérience précédemment évoquée en remplaçant les boissons alcoolisées telles que le vin, la bière ou des spiritueux par des alcopops. Si les alcopopos sont perçus comme des boissons alcoolisées, on devrait alors retrouver le pattern de résultats précédents. En revanche, si les alcopops sont perçus comme des sodas, alors le score IAT ne devrait pas être prédit par les variables de consommation d alcool. METHODE Participants 73 participants (72,2 % de femmes pour 27,8 % d hommes) âgés en moyenne de 22,6 ans (sd = 4,4) ont pris part à l expérimentation. Procédure Dans un premier temps, l ensemble des participants remplissait en passation collective un questionnaire mesurant les habitudes de consommation d alcool. Plus précisément, ces derniers devaient répondre à des questions mesurant tant la fréquence hebdomadaire que le nombre de verres consommés de différents alcools (vin, cidre, bière, alcopops, apéritifs). En outre, le questionnaire mesurait également la fréquence d ivresses au cours des douze derniers mois. Dans un second temps, chacun des sujets réalisait un test d association implicite opposant des boissons non alcoolisées à des alcopops. Ce test est une tâche de catégorisation. Plus concrètement, des stimuli apparaissent successivement au centre d un écran d ordinateur et le sujet doit catégoriser chacun des stimuli à l aide de deux boutons (l un situé à gauche du clavier, l autre situé à droite). Voici les phases du test : Bouton de gauche Bouton de droite Phase 1 Non alcool Alcopop Phase 2 Plaisant Non plaisant Phase 3 Non alcool + Plaisant Alcopop + Non plaisant Phase 4 Alcopop Non alcool Phase 5 Alcopop + plaisant Non Alcool + Non plaisant Si les objets d attitude associés sur une même touche font l objet d une évaluation similaire, alors le temps de réaction pour répondre à la tâche proposée est faible. Le score IAT correspond à la différence de scores obtenus entre les deux phases combinées (phases 3 et 5). 286 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

287 «La personne» Ainsi, avec le mode de calcul retenu, un score IAT positif correspondra au fait que les individus ont une attitude plus positive envers les alcopops qu envers les boissons non alcoolisées alors qu un score négatif traduira une attitude plus positive envers les boissons non alcoolisées qu envers les alcopops. RESULTATS L échantillon de l étude se révèle être composé d un nombre de consommateurs très peu réguliers d alcopops. Une analyse corrélationnelle menée sur l ensemble des variables relatives au nombre de verres consommés et la mesure d ivresses révèle que seule la variable alcopops n est pas corrélée aux ivresses. Aucun effet n est obtenu avec les variables de consommation de bière, d apéritifs, d alcopops 1 ou de fréquence d ivresses. En revanche, plus les personnes consomment de vin, plus elles ont une attitude favorable envers les alcopops lorsqu on les oppose à des boissons non alcoolisées et ce aussi bien pour la fréquence hebdomadaire de consommation (ß = 0,29 ; t [70] = 2,54 ; p < 0,02) que pour le nombre de verres consommés par semaine (ß = 0,32 ; t [70] = 2,83 ; p = 0,006). De plus, l âge prédit négativement l attitude des individus à l égard des alcopops (ß = -0,22 ; t [70] = -1,89 ; p = 0,06). Ces résultats sont à considérer au regard de précédentes études dans lesquelles l IAT opposait les boissons non alcoolisées aux boissons alcoolisées. Le tableau suivant permet d effectuer les comparaisons entre les deux études. IAT Alcools IAT Alcopops Evaluation globale Evaluation négative Evaluation neutre Age Pas d effet Effet négatif Vin Les consommateurs ont une attitude plus favorable que les non consommateurs consommateurs Bière Apéritifs Ivresses Les consommateurs ont une attitude plus favorable que les non consommateurs Les consommateurs ont une attitude plus favorable que les non consommateurs Les consommateurs ont une attitude plus favorable que les non consommateurs Les consommateurs ont une attitude plus favorable que les non Pas de différence Pas de différence Pas de différence DISCUSSION Au terme de cette recherche, il apparaît que les alcopops se différencient des autres boissons alcoolisées. Ainsi, en premier lieu, contrairement aux résultats sur les alcools «classiques 2», ces boissons ne sont pas évaluées négativement par l échantillon interrogé. De notre point de vue, les personnes interrogées n attribuent pas à ces boissons les mêmes effets négatifs que l on peut attribuer aux autres alcools. L absence de corrélation entre le nombre de verres d alcopops et la fréquence des ivresses semble, tout comme l absence d effet de cette dernière sur le score IAT aller dans ce sens. Autrement dit, les alcopops, au même titre que le cidre en Bretagne (Fos et al., soumis à publication) ne seraient pas considérés comme des alcools ou au moins comme possédant les propriétés des boissons alcoolisées telles que les spiritueux, le vin ou la bière. En second lieu, nos résultats soulignent qu une telle boisson s adresse principalement aux plus jeunes. En effet, plus les sujets sont 1 Le faible nombre de consommateurs d alcopops nous a contraint à dichotomiser cette variable en opposant consommateurs et non consommateurs. 2 Le terme alcools classiques désigne les alcools tels le vin, la bière et les spiritueux. Cahiers de l Ireb n 19,

288 âgés, plus leur attitude est négative envers ces breuvages. En ce sens, il serait intéressant de connaître l attitude implicite des adolescents sur ce type de boissons dans la mesure où ces dernières possèdent des propriétés attractives pour les jeunes au même titre que les sodas (couleurs vives fluorescentes, boissons gazeuses ). Toutefois, exposer les plus jeunes à des photos de boissons alcoolisées est questionnant d un point de vue éthique et législatif. Enfin, les effets sur les différentes boissons alcoolisées sont très différents avec cette mesure d attitude implicite envers les alcopops qu avec celle envers les boissons alcoolisées. Ainsi, seules les variables de consommation concernant le vin prédisent le score IAT. Plus précisément, plus les gens consomment de vin, plus leur attitude implicite à l égard des alcopops est positive. Ce résultat est peut-être à mettre en lien avec la présence de sucre dans les deux breuvages. Toutefois, il conviendrait de tester expérimentalement cette hypothèse par exemple, par une technique de mots associés. Au final si ce travail laisse en suspens un certain nombre de questions, il n en demeure pas moins qu il démontre que les alcopops ne sont pas assimilés aux autres alcools. Il semblerait néanmoins qu on leur attribue moins les effets néfastes que l on attribue traditionnellement à l alcool. Ainsi, contrairement aux autres types de boissons alcoolisées, l évaluation globale de ces boissons est neutre. En termes de prévention, nous préconisons la mise en place de campagnes spécifiques à ces boissons, campagnes rendues nécessaires du fait que ces produits ne sont pas considérés comme possédant les propriétés des autres alcools tels que le vin, la bière ou les spiritueux. Il convient donc, selon nous, de développer les connaissances des individus, et notamment des plus jeunes, à l égard de ces produits et d insister sur le fait que les effets liés à leur consommation sont les mêmes que ceux liés à une consommation de bière, de vin ou de spiritueux. Références Bagozzi R.P. Convergent and discriminant validity by analysis of covariance structures: The case of the affective, behavioral, and cognitive components of attitude. In, Perreault W.D. Jr. (Eds.) Advances in consumer research. Association for Consumer Research 1977, vol. 4, p Bagozzi R.P. The construct validity of the affective, behavioral, and cognitive components of attitude by analysis of covariance structures. Multivariate Behavioral Research 1978, vol. 13, p Beauvois J.L., Joule R.V. Soumission et idéologies. Psychosociologie de la rationalisation. Presses Universitaires de France 1981, 205p. Beauvois J.L., Joule R.V. A radical dissonance theory. Taylor & Francis 1996, 168 p. Breckler S.J. Empirical validation of affect, behavior, and cognition as distinct components of attitude. Journal of personality and social psychology 1984, vol. 47, n 6, p Festinger L. A Theory of Cognitive Dissonance. Stanford University Press 1957, 291 p. Fos Y., Perrissol S., Somat A., Darnon C. What drinkers really think about Alcohol: Implicit measures of attitude and alcohol consumption. Soumis à publication. Greenwald A.G., McGhee E., Schwartz L.K. Measuring individual differences in implicit cognition: the implicit association test. Journal of Personality and Social Psychology 1998, vol. 74, n 6, p Kiesler C.A. The psychology of commitment. Experiments linking behavior to belief. Academic Press 1971, 190 p. Perrissol S., Boscher G., Cerclé A., Somat A. Consommation d alcool, capacité de résistance à la consommation et exposition sélective aux publicités pro alcool. European Review of Applied Psychology 2005, vol. 55, n 4, p Wittenbrink B., Judd C.M., Park B. Evidence for racial prejudice at the implicit level and its relationship with questionnaire measures. Journal of Personality and Social Psychology 1997, vol. 72, n 2, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

289 «La personne» LES MICRO-RITUELS DE L ABSTINENCE : QUAND LES ALCOOLIQUES ANONYMES PRENNENT LA PAROLE HUGUES PENTECOUTEAU ET OMAR ZANNA Département de sciences de l éducation SFC, Université Rennes 2, Campus la Harpe, avenue Charles Tillon, CS 24414, Rennes Cedex - France Summary According to Everett C. Hugues, a sociologist is the ethnologist in his time. He has to enhance the least evident aspects of his culture. By applying this precept, we undertook an exploratory research in order to explain what occurs in a Alcoholics Anonymous (AA) talk group. Our thought process consist in taking a guileless look at a world totally strange to us as if we were both discovering a univers -a social world according to Schütz- entirely unfamiliar. Our conference first presents methodology observation of the AA world. Then we particulary emphasize group s rituals -participant «entering abstinence»- and personalized approval they are the object of (microrituals). Mots clefs Groupe de parole, abstinence, rituel, micro-rituel, alcooliques anonymes, sociologie INTRODUCTION Notre projet consiste à porter un regard sociologique, compréhensif, sur des processus de désalcoolisation envisagés comme des apprentissages socialement construits et transmis. Pour entrer dans cette réflexion, nous avons repris à notre compte l expression d Erving Goffman (1981) : «la vie sociale est une scène». C est-à-dire que des rôles sont joués dans une situation d interaction sociale, mais il demeure la possibilité à chacun d improviser et d agir sur son jeu. Nous nous sommes intéressés aux processus de ritualisation des groupes de parole des Alcooliques Anonymes (AA), en observant ce qui s y joue entre les acteurs, comme si nous assistions à une pièce de théâtre. Notre contribution propose de restituer quelques résultats de cette recherche qualitative c'est-à-dire les façons de faire des AA pour ritualiser l abstinence, dans un groupe de parole et dans leur quotidien. Au préalable, nous précisons les transformations de notre proposition initiale, ainsi que le cadre théorique et méthodologique. ALLER A LA RENCONTRE DES AA Lorsque nous avons déposé notre projet de recherche, il s agissait pour nous de traiter un nouveau terrain et un nouvel objet. Bien entendu, ce choix ne s est pas fait par hasard, car nous avons toujours travaillé sur les parcours de vie, les changements biographiques et sur ce que Goffman nomme «les moments critiques». L univers des AA nous étant tout à fait étranger, nous avons débuté notre recherche par une démarche exploratoire en mars Un projet de recherche en mouvement Le point de départ de ce travail a été de comprendre le fonctionnement d un groupe de parole et la manière dont le groupe peut devenir un point d étayage pour le devenir abstinent. Entre le projet annoncé et ce que nous avons fait sur le terrain, nous sommes passés d un «visage sociologique» (de Singly, 2002) à un autre. Cahiers de l Ireb n 19,

290 Une analyse dispositionnelle Il n était pas déplacé de raisonner en termes de dispositions pour analyser les formes de désalcoolisation, mais les dispositions sociales ne sont jamais directement observées. Le chercheur les reconstruit sur la base de la description ou de la reconstruction des pratiques et de la reconstruction des éléments jugés importants (Lahire, 1998). Le problème rencontré, dès les premières observations, a trait au fait que les éléments déclencheurs de la désalcoolisation ne peuvent être désignés comme de véritables déterminants, qu il s agisse de l événement (ou du contexte) qui conduit à arrêter de boire ou de la disposition incorporée. Lahire souligne que «le comportement d un acteur est bien sûr totalement déterminé socialement», mais il indique également qu il est impossible de pronostiquer, aussi facilement que dans le cas de l expérience chimique, l apparition de ce comportement. Le projet de la sociologie étant de définir des récurrences, externes ou internes à l individu, en vue de légitimer une action par rapport à ce qu il est possible de faire en société, cette démarche rationnelle et intellectualisée de l action des hommes n a pas pour autant vocation à devenir prédictive. Le fait de ne pas avoir de données chiffrées sur la désalcoolisation des AA nous a conduits à adopter une posture de prudence théorique et à privilégier -comme première étape de notre réflexionune approche compréhensive. L analyse de l appropriation de rituels Bien que l explication dispositionnelle semble être la plus complète, et d une certaine façon «idéale», nous pensons ne pouvoir y accéder que par étapes ou plutôt en effectuant un découpage de la réalité, comme le font Weber, avec les idéaux-types (Weber, 1965), ou Goffman (1991) lorsqu il hiérarchise pression sociale et pratiques des individus. Dans le cadre de cette recherche, nous retenons les points de vue, les pratiques et les représentations des individus (Goffman, 1988), composés à partir de leurs vécus (Goffman, 1991). C est tout cela qui constitue leur monde social de référence (Schütz, 1994). Un sociologue entre dans un groupe AA Pour nous immerger dans le «monde» social des AA nous avons opté pour une observation mêlant approche participative et ethnographique. Il nous a donc fallu trouver des groupes et négocier notre place pour y entrer. Le plus souvent, nous nous sommes présentés en début de séance, devant l ensemble des participants, afin d indiquer notre démarche. Le sociologue -agent du désenchantement (Weber, 1963)- était plutôt accueilli avec curiosité et intérêt. A plusieurs reprises nous avons été remerciés pour notre présence et pour l attention que nous leur portions. Parfois, nous avons fait le choix méthodologique d attendre la fin de la réunion pour nous présenter. C est précisément dans ces cas-là que nous avons rencontré des tensions. Ne pas se dévoiler d emblée s apparentait -objectivement et implicitement- à camoufler notre identité et, point non négligeable, à déposséder le groupe de ses prérogatives d intégrer ou non le nouveau venu. Faire ce test méthodologique nous a permis de noter à quel point l ouverture du groupe ne va pas de soi. Au cours de cette recherche, nous avons effectué 33 observations ethnographiques (de 1 h 30 à 5 h 00) : 20 d entre elles ont été volontairement réalisées au sein du même groupe. Participer à un groupe auquel nous nous sommes «attachés» (nous reprenons ici la notion, issue du vocabulaire des AA, de «groupe d attache») s est révélé par la suite être un élément essentiel pour notre réflexion. En effet, le fait de retrouver les mêmes personnes d une réunion à l autre facilite l enquête dans la mesure où le travail qui consiste à estomper la méfiance propre à toutes les nouvelles situations de face à face n est pas à refaire. La banalisation des rencontres procure un confort psychologique ; il permet de dépasser les échanges convenus des premières entrevues. La régularité a fait de nous «des amis naturels» qui pouvaient diffuser la «bonne» parole des AA. Nous étions devenus d une certaine manière «l un des leurs» (Kessel, 1960). Des entretiens formels et informels ont été également effectués, mais uniquement à titre complémentaire. 290 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

291 «La personne» C est ce matériau qui nous permet d entrer dans une démarche interprétative «en exprimant le réel» (Durkheim, 1977) et en cherchant à porter un autre regard sur les AA. Nous avons appréhendé ces groupes en postulant que nous avions en face de nous des êtres sociaux qui construisent leur identité autour de la consommation d alcool et d une démarche d abstinence. Ce qui veut dire que nous ne les regardions pas comme des malades, des déviants ou des personnes qui seraient en dehors de la norme, mais comme des individus qui ont utilisé l alcool comme un mode singulier de régulation de leurs devenirs individuels et qui sont en phase de trouver un nouveau mode de régulation avec le groupe de parole. PAROLE RITUALISEE ET MICRO-RITUELS Le rite est un acte du jeu social collectif ou individuel qui peut comporter de l improvisation, mais reste fidèle, comme le souligne Jean Cazeneuve (1971), à certaines règles clairement exposées ou implicitement négociées. Une société organisée Les AA, c est groupes locaux dans 150 pays soit environ d individus. La France compte 630 groupes dont 53 se trouvent en Bretagne. Les groupes des AA sont organisés et hiérarchisés. Cela dit, chacun peut y entrer et sortir à sa guise. Si bien que tous les individus AA ne font pas le même usage des réunions. Certains sont assidus à leur groupe d attache, ce qui ne les empêche pas d assister aux séances des différents groupes. Il dit se rendre à une réunion des AA une fois par semaine, quel que soit le lieu où il se trouve. Quand il est à La Rochelle, à Brest ou à Paris, il sait où se trouvent les réunions des AA. Dès qu il se déplace, il se renseigne. C est une façon, pour lui, de tenir le coup. Même s il a arrêté depuis plusieurs années (7 ou 8 ans). Observation, 3 mai 2008 Il y a ceux qui viennent de manière plus ponctuelle, en fonction de leurs besoins ou de leurs possibilités. Aujourd hui, c est l anniversaire de Monique. 43 ans. C est la première fois que je la vois. Quand elle prend la parole, après avoir présenté le thème de la médiation, elle évoque sa situation de couple. Cela ne va pas bien avec son mari. Ils boivent tous les deux et ce qu ils vivent semble être assez violent. Elle essaie de s enfuir de ce qu elle vit comme étant un enfermement. Ce soir, c est son anniversaire et c est important pour elle de ne pas être chez elle. Elle préfère être là. Avec les AA. Et passer une soirée à ne pas boire. Quand elle parle, elle est au bord des larmes. Observation, 17 mai 2008 Les AA, ne constituent ni une famille ni un club ou une association et encore moins une secte. Les documents officiels, c est-à-dire «la littérature approuvée par la Conférence des Services Généraux» (CSG AA, 1991) présentent les AA comme «une association d hommes et de femmes qui partagent leur expérience, leur force et leur espoir dans le but de résoudre leur problème commun et d en aider d autres à se rétablir de l alcoolisme». Et «la seule condition requise pour en être membre est un désir d arrêter de boire. Chez les AA, il n y a ni cotisation, ni droit d inscription». Bien que les AA se défendent d être associés à une secte, une confession ou bien encore à un parti politique, force est de constater que la manière dont ils se reconnaissent idéologiquement s apparente à bien des égards à une organisation religieuse au sens ou le définit Emile Durkheim (1912) : ils ont une expérience collective du sacré. L utilisation de la notion de «force supérieure», qu ils évoquent parfois pour expliquer leur entrée en abstinence, en témoigne. Nous avons également pu observer que cette société d individus s'exprime sous la forme de croyances et de pratiques qui ne dictent pas seulement des actes, mais aussi, et surtout, des idées et des Cahiers de l Ireb n 19,

292 sentiments. Pour Durkheim, «la religion commence avec la foi» (Durkheim, 1886) et la foi -qui consiste à croire qu il est possible d arrêter de boire- est au cœur de l idéologie des AA. Le vocabulaire («révélations», «illuminations mystiques» (Kessel, 1960)), les rites et le religieux «administré» qui organisent cette croyance signent l existence d une véritable foi, commune et reconfortante. Les rituels AA Annoncer le caractère religieux des AA permet de mieux comprendre la visibilité ostentatoire des rites. Ces rites sont «une chose pratique» (Wittgenstein, 2005) et ils sont tout de suite accessibles dans le sens où ils ne sont pas à réinventer. Véritable viatique pour les nouveaux, ils rassurent et accompagnent le processus de désalcoolisation. Si le groupe imprime progressivement sa marque sur les individus et peut devenir un élément indispensable à son équilibre, les rites participent au même processus. En imposant un rythme, ils scandent les séances. S ils peuvent apparaître contraignants par moment, voire faire l objet de critiques, ils n en demeurent pas moins acceptés et respectés. Deux types de rituels sont observables : Des rituels déduits et identifiables Ces rituels se caractérisent par le fait que chacun peut aisément les identifier dès la première réunion. La «modération» en est un exemple. La parole est prise par le «modérateur», qui anime, qui ouvre la réunion, et la clôt. Il prépare la séance notamment en définissant un thème (par exemple en choisissant une étape ou une tradition des AA). Un autre rituel induit est la lecture en début de chaque réunion des douze traditions ou des douze étapes. La position d écoute fait partie de ces rituels en ce sens où elle est toujours respectée. Et c est en cela peut être que les AA ne sont pas des alcooliques comme les autres. Ils viennent pour parler et pour être écoutés, dans une relation de don / contre-don structurée autour de l expérience («je parle donc je suis» / «donc tu es, puisque je te parle» (Javeau, 1998)). La parole n est jamais coupée, chacun s exprime comme il le souhaite, sans jugement et en prenant le temps dont il a besoin pour s exprimer devant les autres. Quand la parole est rendue, un remerciement s ensuit systématiquement : «merci de m avoir écouté» auquel le modérateur répond par «merci Marc, pour ce témoignage. Qui veut prendre la parole?». Les rituels déduits sont explicitement présentés dans la documentation des AA. On y trouve le rituel de communion (se tenir par la main en récitant la prière de la Sérénité), comme celui du chapeau -la septième tradition- (qui prend la forme d une quête). Des rituels induits, implicites, reconnus et pratiqués par des AA engagés dans la carrière de l abstinence Ces rituels découlent de l expérience de l AA au sein du groupe. En offrant une «place à prendre» ils apparaissent comme des conséquences du rythme de la réunion et de la dynamique en jeu entre les différents participants. Mais pour ces rites, les rôles ne sont pas prédéfinis et ne font l objet d aucune prescription. Ici et à la différence des rituels déduits, l individu y est un acteur à part entière. Il s inscrit personnellement dans une démarche active d occupation. Il organise, range la salle, s occupe de l affichage, sort les documents AA, accroche au mur les portraits des fondateurs Bill et Bob, met les bonbons sur la table, sort les bouteilles d eau, etc. Ce sont, dans le vocabulaire des AA, des façons de «prendre du service». Cela consiste à occuper un rôle actif -signe symbolique d une détermination à demeurer en abstinence- dans l organisation des réunions. On le voit, le rite remplit une fonction qui a des conséquences dans la réalité (Jean Cazeneuve), Structurant, il devient un outil que chacun peut utiliser, s approprier ou non, pour «faire» sa vie ou «trouver son chemin» (Brochure Vivre sans alcool). 292 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

293 «La personne» Les micro-rituels Quand la parole est donnée par le modérateur, elle est prise par quelqu un et, dès lors, jamais interrompue. Le temps de parole est variable. Il peut être bref ou très long (jusqu à 20 minutes). L observation révèle des usages différents de la prise de parole. Lorsque l orateur prend la parole, il peut, à sa convenance, aborder soit le thème de la modération (le thème «du jour» proposé par le modérateur) soit un autre thème : raconter une histoire personnelle (les relations dans le couple, dans la famille), évoquer un souci (la difficulté de gérer son stress, son abstinence, un état dépressif, la crainte de passer d une dépendance alcoolique à une autre (sexuelle, affective)), un beau moment («j ai su dire non à cette invitation à boire un apéritif»), etc. Certains sont dans le «parler vrai». Ils prennent soin d illustrer leurs propos en racontant leurs histoires avec crudité, de manière clinique. D autres sont plutôt dans ce que les AA nomment le «parler philosophique», ou l art de parler de soi sans vraiment dire aux autres, clairement, avec limpidité, ce qu ils tentent de dévoiler. Parler, c est toujours dire quelque chose (Bourdieu, 1980). Même si, en apparence, il n y a pas toujours grandchose à dire. La parole fait l objet d une appropriation, d une individualisation. Les micro-rituels font aussi l objet d un processus d appropriation, à ceci près qu ils se déroulent ailleurs, sur d autres scènes. Ils sont des pratiques construites dans le cadre de cette vie partagée avec le groupe et qui font l objet d une déclinaison individuelle. Nous avons tous des rituels dans notre vie. Cela permet de la rythmer, de la structurer. Cela permet également de rassurer, parfois, en établissant des repères, des balises, un ordre de tâches à effectuer. Les AA font la même chose quand ils investissent les rituels AA dans leur quotidien. Cela leur permet de maintenir en l état «le système de sécurité de base» (Javeau, 1998). Les micro-rituels sont les rituels transférés, adaptés, ou inventés, qui passent du groupe à la sphère privée et domestique. Le processus d éducation à la désalcoolisation peut transcender le temps de la réunion, pour agir dans la sphère domestique. L exemple de Chris illustre parfaitement le caractère transférentiel du rituel. C est Chris qui prend la parole, longuement. Personne ne l interrompt. Elle est touchante, j ai l impression qu elle se dévoile de plus en plus : «le jour où j abandonnerai ma peur à une force supérieure, je serai libre». Elle nous raconte les problèmes qu elle a eus avec son appartement. Un mur est très humide et elle a mis du temps avant d avertir le propriétaire. Car écrire, pour lui indiquer qu il y avait un problème, lui faisait peur. Elle craignait sa réaction. Elle appréhendait également de devoir encore gérer quelque chose de nouveau. Elle ne se sentait pas la force d assumer cela. Ecrire une lettre lui demande de l énergie, du temps. Presque une journée. En fait, tout s est bien passé avec le propriétaire, avec le syndic. Mais elle a angoissé à chaque étape de cette démarche : quand le propriétaire est venu constater le problème ; quand elle a reçu une lettre qui lui signifiait qu un nouveau logement lui était accordé. Pour cette lettre reçue, par exemple, elle dit avoir attendu une journée entière avant de l ouvrir. Elle était là, posée elle savait qu elle était là, mais ne pas l ouvrir ; c était une façon de laisser à distance ce qu elle pouvait contenir, comme si cela n avait jamais existé. Tout ce qui vient perturber son rythme l angoisse, comme les horaires des transports en commun qui vont être modifiés d ici la fin de la semaine. Elle sait que c est quelque chose qu elle va avoir du mal à gérer. Quand elle a peur, elle nous dit se réciter à elle-même la prière de la Sérénité. Cela la soulage, cela lui fait du bien. Observation, 28 juin. Ce qui est fait avec le groupe, Chris s en sert pour se conforter et réaffirmer qui elle est en dehors du groupe. C est comme si, dans son quotidien, le groupe était là, présent, pour l écouter et la conseiller. Le cas de Chris, n est pas une exception. Marc réinvestit à sa manière les rituels acquis au cours des réunions. Il nous a confié toujours avoir sur lui le petit dépliant jaune «Rien qu aujourd hui», dans son portefeuille. C est un aide mémoire, un dépliant en dix volets, très synthétique, qui devient un talisman, présentant les douze étapes de l abstinence, les douze traditions des AA, un test pour savoir si on est alcoolique et un texte sur la nécessité d envisager l abstinence «un seul jour à la fois, juste aujourd hui». Le fait d ouvrir son portefeuille, et de ritualiser parfois cette action, c est se ramener, en Cahiers de l Ireb n 19,

294 toute circonstance, à qui il est. Avec cette fragilité qui est la sienne et cette attention qu il doit porter, de manière régulière, à l alcoolique qu il a été et à celui qu il est devenu en entrant en abstinence. CONCLUSION Les rituels et les micro-rituels deviennent, dans ces cas, combinés ensemble, un mode de régulation de l abstinence et de la gestion de soi dans un processus de désalcoolisation. Ce sont des règles que les alcooliques se donnent pour se maintenir en situation d abstinence et/ou pour appréhender leur vie de manière plus sereine. Ainsi approprié, transformé (Chris) ou même inventé (Marc) le rituel devient un opérateur structurant. Cependant, il ne suffit pas de ritualiser une réunion des AA pour produire de l abstinence. Un mystère plane autour des AA. Certains sont dans la conviction de l efficacité «du programme», mais nous n avons aucun chiffre, aucune donnée qui permettrait d évaluer cela. Les témoignages recueillis et les observations que nous avons faites nous conduisent à dire que nous ne savons pas si ce programme est efficace. Mais nous ne pouvons pas dire non plus qu il ne l est pas. La présentation de micro-rituels montre que les AA occupent une place dans l éducation à la désalcoolisation. Une place non exclusive mais une place qui répond à une demande sociale et à un investissement militant qui devient par conséquent complémentaire -un possible parmi d autres- des autres dispositifs (médicaux, psychologiques ou d écoute) permettant de sortir de l alcool. Références Bourdieu P. Questions de sociologie. Minuit 1980, 277 p. Cazeneuve J. Sociologie du rite. PUF 1971, 334 p. CSG AA. Les Deux fondateurs des alcooliques anonymes. Notes biographiques et extraits de leurs dernières conférences. Services mondiaux AA inc de Singly F. La Sociologie, forme particulière de conscience. In, Lahire B. (Dir.). A quoi sert la sociologie? La Découverte 2002, 193 p. Durkheim E. Les études de sciences sociales. Revue philosophique 1886, vol. 22, p Durkheim E. Education et sociologie. PUF 1977, 130 p. Durkheim E. Les formes élémentaires de la vie religieuse. Librairie générale française, coll. Le Livre de poche 1991, 758 p. Goffman E. Forms of talk. Basil Blackwell 1981, 335 p. Goffman E. Les moments et leurs hommes. Seuil 1988, 252 p. Goffman E. Les Cadres de l expérience. Minuit 1991, 573 p. Javeau C. Prendre le futile au sérieux. Les éditions du Cerf 1998, 121 p. Kessel J. Avec les alcooliques anonymes. Gallimard 1960, 361 p. Lahire B. L Homme pluriel, les ressorts de l action. Nathan 1998, 271 p. Schütz A. Le Chercheur et le quotidien. Méridiens Klincksieck 1994, 286 p. Weber M. Le Savant et le politique. Union générale d éditions 1963, 185 p. Weber M. Essais sur la théorie de la science. Plon 1965, 539 p. Wittgenstrein L. Recherches philosophiques. Gallimard 2005, 367 p. 294 Cahiers de l Ireb n 19, 2009