LES CAHIERS DE L IREB N

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1 LES CAHIERS DE L IREB N Institut de Recherches Scientifiques sur les Boissons (Association loi de 1901) 19, avenue Trudaine PARIS Tél. : +33 (0) Fax : +33 (0) courriel : ireb@ireb.com.

2 Les Cahiers de l Ireb n 19, 2009 Directeur de la publication : Georges de Saint Blanquat

3 AVANT-PROPOS Le 19 ème colloque scientifique de l Ireb s est tenu à Paris les 3 et 4 décembre 2008, accueilli par la société Diagéo, société adhérente à l Ireb. Ce colloque a rassemblé les 41 équipes de recherches subventionnées par l Ireb en 2007 et/ou 2008, équipes qui ont présenté l essentiel de leurs résultats. La caractéristique de ces colloques de l Ireb réside dans le fait que tout le panel scientifique est susceptible d être couvert, des sciences humaines, historiques et sociales aux sciences biologiques, expérimentales et médicales. Le lien de tous ces travaux reposent sur la molécule «alcool» dont la consommation peut entrainer des effets sociaux, psychologiques, physiologiques, pathologiques. Cette revue des «Cahiers de l Ireb» (sous forme électronique pour la 3 ème fois) contient les articles écrits par les auteurs des communications présentées lors de ce colloque ; l ordre de présentation des textes reprend l ordre et l organisation des sessions de travail, à savoir : inflammation, infection alcoolisation précoce histoire vulnérabilité : impacts psycho-sociaux métabolisme et comportement foie sport vulnérabilité : impacts biochimiques la personne Par ailleurs, lors de ce colloque, Alain Ehrenberg (Cesames, Université Paris 5) a présenté une conférence plénière intitulée «Les neurosciences peuvent-elles permettre de comprendre la vie sociale?»

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5 COMITÉ SCIENTIFIQUE DE L IREB (au 1 er janvier 2009) Présidents d Honneur Jacques WEILL Georges de SAINT BLANQUAT Présidente Marie CHOQUET Vice-président Michel HAMON Membres Laure COM-RUELLE Patrice COUZIGOU Patrick COZZONE Philip GORWOOD Véronique NAHOUM-GRAPPE Didier NOURRISSON

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7 SOMMAIRE 1. «INLAMMATION - INFECTION» PHILIPPE PODEVIN, ARNAUD CARPENTIER, CELINE HERNANDEZ, LYNDA AOUDJEHANE, JEAN-FRANÇOIS MERITET, OLIVIER SCATTON, FILOMENA CONTI, YVON CALMUS ET ARIELLE R. ROSENBERG Effet de l éthanol sur la production de particules infectieuses du virus de l hépatite C en culture primaire d hépatocytes humains adultes...15 ROBERTA J. WARD, RACHEL ALLEN, FREDERIC LALLEMAND, FRANÇOIS SCHOL, MATHIEU ANCEAU, PHILIPPE DE WITTE, LAURA DELLA CORTE ET DAVID DEXTER Identification des changements inflammatoires cellulaires provoqués par le «binge drinking»...21 HAIFA HAMDI, AMELIE BIGORGNE, AXEL BALIAN, LAURENCE BOUCHET-DELBOS, INGRID DURAND-GASSELIN, SOPHIE PREVOT, JOCELYNE DELAVEAUCOUPET, SYLVIE NAVEAU, DOMINIQUE EMILIE, GABRIEL PERLEMUTER Glucocorticoid-induced leucine zipper : une protéine clé dans la sensibilisation des monocytes au lipopolysaccharide au cours de l hépatite alcoolique aiguë «ALCOOLISATION PRECOCE» BRUNO GONZALEZ, PAMELA KWETIEU DE LENDEU, FAIZA EL GHAZI, STEPHANE MARRET, VINCENT LAUDENBACH ET SYLVIE JEGOU Effets de l exposition périnatale à l alcool sur le développement de l endothélium vasculaire cérébral...35 RACHID EL FATIMY, ANNE LE MOUEL, RYMA ABANE, LESLIE SCHWENDIMAN, PIERRE GRESSENS ET VALERIE MEZGER Les facteurs de stress HSF (Heat Shock Factors), médiateurs potentiels des effets de l alcool sur la migration neuronale caractéristiques du SAF dans le cortex cérébral...43 ISABELLE BUISSON, JEAN-FRANÇOIS RIOU ET MURIEL UMBHAUER Les effets de l éthanol sur les mouvements de la gastrulation : une cause à la microcéphalie?...49 BEATRICE BOTIA, PASCAL COSETTE, PHILIPPE CHAN, VADIM LE JONCOUR, ANTHONY FALLUEL, THIERRY JOUENNE, HUBERT VAUDRY ET DAVID VAUDRY Caractérisation de protéines dont l expression est régulée par l éthanol dans les neurones en grain du cervelet de rat...57 MURIEL DARNAUDERY, VINCENT VAN WAES, MIHAELA ENACHE, ANNARITA ZUENA, JEROME MAIRESSE, FERDINANDO NICOLETTI, ELISABETH VINNER, MICHEL LHERMITTE ET STEFANIA MACCARI Stress prénatal et mémoire : effets paradoxaux de la consommation chronique d alcool chez le rat...63 Cahiers de l Ireb n 19,

8 JOHAN LE FEL, PIERRE CHAPILLON ET VINCENT ROY Effets d une alcoolisation prénatale sur les capacités d apprentissage et de mémorisation chez le rat DA/Han : comparaison des effets d une alcoolisation aiguë ou chronique au cours des périodes de neurulation et de neurogénèse hippocampique...71 JENNY MOLET, MICHEL HAMON ET LAURENCE LANFUMEY Conséquences comportementales et neurobiologiques de l exposition précoce à l alcool et/ou à un agoniste des récepteurs cannabinoïdes chez des souris consanguines «HISTOIRE» FABIENNE OLMER La soif celtique et l'impérialisme de Rome. L'économie du vin et ses consommations en Gaule au moment de la conquête de César...85 DIDIER NOURRISSON ET JACQUELINE FREYSSINET-DOMINJON L enseignement antialcoolique à l école former les futurs citoyens ( )...89 THIERRY FILLAUT Les jeunes et le boire en Bretagne pendant le second XXème siècle : un défi pour l'historien...95 ARNAUD MORANGE Ethnographie du trafic de «calva» en Basse-Normandie...99 SEBASTIEN LE PAJOLEC ET MYRIAM TSIKOUNAS L'alcool dans les émissions médicales et les fictions à la télévision : convergences et influences (de 1949 à nos jours) «VULNERATIBILITE : IMPACTS PSYCHO-SOCIAUX» HELENE BEAUNIEUX, ANNE-PASCALE LE BERRE, KARINE PINON, FRANÇOIS VABRET, ANNE-LISE PITEL, PHILIPPE ALLAIN, BEATRICE DESGRANGES ET FRANCIS EUSTACHE Etude de la métamémoire dans l alcoolodépendance au moyen de la mesure «Feeling-Of-Knowing» (FOK) en mémoire épisodique OLIVIA BOEUF-CAZOU, LAURE POURCEL ET MARYSE LAPEYRE-MESTRE Impact de la consommation d alcool sur les fonctions cognitives chez des sujets actifs : résultat de l étude VISAT (vieillissement, santé, travail) MARILYN SKINNER, LAURENT MICHEL ET HENRI-JEAN AUBIN La menace d une réaction aversive réduit-elle le craving d alcool? Etude de la réaction à l exposition au stimulus alcool chez des patients alcoolodépendants Cahiers de l Ireb n 19, 2009

9 AUDREY SCHMITT, MELANIE LOUBEYRE, JULIETTE. RICHETIN, NATHALIE DALLE, JEAN-CHRISTOPHE GIGER, MICHAEL DAMBRUN ET PIERRE-MICHEL LLORCA Etude des représentations sociales qu ont les soignants des patients en difficultés avec l alcool au CHU de Clermont-Ferrand «METABOLISME ET COMPORTEMENT» MICHEL DE LORGERIL, PATRICIA SALEN, MARIE-CLAIRE TOUFEKSTIAN, FRANÇOIS LAPORTE ET LES INVESTIGATEURS DU CONSORTIUM EUROPÉEN IMMIDIET DU 5 ÈME PCRD Alcools, polyphénols et acides gras Oméga XAVIER COMBAZ, MYRIAM CAYRE, YANN LE FUR, PATRICK J. COZZONE ET ANGELE VIOLA Effet du scyllo-inositol sur le métabolisme, l osmorégulation et la plasticité cérébrales LEANDRO F. VENDRUSCOLO, ALIOU B. GUEYE, JANAÍNA C.M. VENDRUSCOLO, PIERRE MORMEDE, MURIEL DARNAUDERY ET MARTINE CADOR Prolonged access to sucrose, but not alcohol, during adolescence alters motivation for sweet and alcohol solutions in adult rats HAKIM HOUCHI, VINCENT WARNAULT, CATHERINE VILPOUX, OLIVIER PIERREFICHE, MARTINE DAOUST ET MICKAEL NAASSILA Vulnérabilité à la dépendance à l alcool après une exposition pendant l adolescence : implication des récepteurs A2A de l adénosine et CB1 des endocannabinoïdes «FOIE» MARIE-CHRISTINE BEAUVIEUX, NIZAR SERHAN, PATRICE COUZIGOU, HENRI GIN ET JEAN-LOUIS GALLIS Effets conjoints et/ou séparés de l éthanol et du resvératrol sur les métabolismes hépatiques et cérébraux chez le rat FATIHA DJOUDI, MARIE-THERESE DIMANCHE-BOITREL, MARTINE CHEVANNE, XAVIER TEKPLI, MARY RISSEL, DOMINIQUE LAGADIC-GOSSMANN ET ODILE SERGENT Implication des caractéristiques membranaires dans la toxicité (stress oxydant et mort cellulaire) induite par l'éthanol : influence d'une surcharge en acides gras THI HONG TUOI DO, FRANÇOIS GABORIAU, ROMAIN MOIRAND, CAROLINE LE LAN, ISABELLE CANNIE, LUCIE GOUFFIER, PIERRE BRISSOT ET GERARD LESCOAT Effet de l éthanol sur la prolifération cellulaire dans la lignée d hépatome humain HepARG : mise en évidence d interrelations avec les métabolismes du fer et des polyamines ETIENNE BLANC, BEATRICE LEGRAND, HELENE ROUACH ET MICHELE GARLATTI Le CYP2E1 et l alcool induisent ATF4, un facteur de transcription central de la réponse aux stress dans les cellules hépatocytaires Cahiers de l Ireb n 19,

10 ISABELLE LAROSCHE, BERNARD FROMENTY, PHILIPPE LETTERON, AMAL CHOUMAR, HOLLY VAN REMMEN, CHARLES J. EPSTEIN, ARLAN RICHARDSON, GERARD FELDMANN, DOMINIQUE PESSAYRE ET ABDELLAH MANSOURI L administration chronique d alcool altère l ADN mitochondrial et la fonction mitochondriale chez des souris transgéniques surexprimant la MnSOD LAETITIA KNOCKAERT, BERNARD FROMENTY ET MARIE-ANNE ROBIN Impact de la localisation mitochondriale du cytochrome P4502E1 sur le stress oxydant induit par l'alcool «SPORT» STEPHANE HEAS, DOMINIQUE BODIN, LUC ROBENE, GAELLE SEMPE, FLORIAN LEBRETON, YANNICK LE HENAFF, DAMIEN PHILIPPE ET GUILLAUME ROUTIER Alcools, sports et études universitaires : des relations étroites DELPHINE MAUREL, NATHALIE BOISSEAU, CLAUDE-LAURENT BENHAMOU ET CHRISTELLE JAFFRE Effets combinés d une consommation chronique d alcool et de l exercice physique sur le contenu, la densité minérale osseuse, l architecture osseuse et le remodelage osseux chez le rat «VULNERABILITE : IMPACTS BIOLOGIQUES» YANN LE STRAT, SABAH KELAI, FLORENCE NOBLE, GILLES MAUSSION, JEAN-MARIE MOALIC, MICHEL SIMONNEAU, PHILIP GORWOOD ET NICOLAS RAMOZ Génétique des comportements addictifs : analyse de gènes candidats de l animal à l homme NICOLAS ETIQUE, ISABELLE GRILLIER-VUISSOZ, JULIE LECOMTE ET STEPHANE FLAMENT Effets de l éthanol sur les cellules cancéreuses mammaires : implication d un cross-talk entre récepteur A 2A de l adénosine et récepteur des œstrogènes SANDRINE LAMY, JACQUES BENICHOU, MARC VASSE, JACQUES WEBER, JEAN-PIERRE GOULLE, MARTINE DAOUST, NICOLE HOUDRET, MICHEL LHERMITTE, STEPHANE MARRET ET FLORENCE THIBAUT Etablir la prévalence de la consommation d alcool chez la femme enceinte en Seine-Maritime en utilisant des dosages biologiques couplés à l Addiction Severity Index «LA PERSONNE» PATRICK MARTIN, JACQUES MASSOL, BERNARD LACHAUX, CHARLES SIEGFRIED PERETT ET LE GROUPE ALQOL Création d une échelle de qualité de vie concernant des sujets souffrant d abus ou de dépendance à l alcool Cahiers de l Ireb n 19, 2009

11 LUCIA ROMO, STEPHANIE MILLE, CINDY LEGAUFFRE, SONIA MARQUEZ, SAMANTHA LELEU, ANGELIQUE EXCOFFIER, CAROLINE GERARD ET JEAN ADES Dimensions de personnalité comme prédicteurs de l évolution de l alcoolodépendance. Comparaison de deux instruments d évaluation : l Inventaire de tempérament de Cloninger (TCI) et l Inventaire de cinq grands facteurs de personnalité de Costa et McCrae (NEO PI-R) CHRISTOPHE MOREAU ET CHRISTOPHE PECQUEUR Facteurs sociaux de régulation des consommations : ethnologie des soirées étudiantes en appartement STEPHANE PERRISSOL, YOAN FOSE, VALERIE LE FLOCH, CHLOE LELOIR, DENIS HILTON ET JACQUES PY Apport d une mesure implicite pour étudier la perception des jeunes à l égard des nouvelles boissons alcoolisées et aromatisées HUGUES PENTECOUTEAU ET OMAR ZANNA Les micro-rituels de l abstinence : quand les alcooliques anonymes prennent la parole Cahiers de l Ireb n 19,

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13 1. «INFLAMMATION - INFECTION»

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15 «Inflammation infection» EFFET DE L ETHANOL SUR LA PRODUCTION DE PARTICULES INFECTIEUSES DU VIRUS DE L HEPATITE C EN CULTURE PRIMAIRE D HEPATOCYTES HUMAINS ADULTES PHILIPPE PODEVIN 1, ARNAUD CARPENTIER 1,2, CÉLINE HERNANDEZ 1, LYNDA AOUDJÉHANE 2, JEAN-FRANÇOIS MÉRITET 1,3, OLIVIER SCATTON 4, FILOMÉNA CONTI 2,4, YVON CALMUS 2,4 ET ARIELLE R. ROSENBERG 1,3 1 Equipe «Virologie de l hépatite C», Institut Cochin, INSERM U567 CNRS UMR 8104, 22, rue Méchain, Paris - France 2 UPRES 1833, Groupe Hospitalier Cochin, 27, rue du Faubourg Saint-Jacques, Paris - France 3 Laboratoire de Virologie, Groupe Hospitalier Cochin - Saint Vincent de Paul, 27, rue du Faubourg Saint-Jacques, Paris - France 4 Pôle médico-chirurgical d Hépato-Gastro-Entérologie, Groupe Hospitalier Cochin, 27, rue du Faubourg Saint-Jacques, Paris - France Summary Clinical studies, including one published by our laboratory, have established that excessive alcohol consumption by patients with hepatitis C increases the viral load and aggravates liver disease. Studies in vitro using subgenomic replicons of hepatitis C virus (HCV) in hepatoma-derived cell lines were undertaken to define the mechanisms underlying this frequent co-morbidity, but have given contradictory results. This questions the relevance of the experimental system used, since (i) it does not allow production of infectious viral particles, and (ii) hepatoma-derived cell lines are only a poor reflection of liver physiology in particular, these transformed cells do not retain the metabolic pathways of ethanol. Our group has now developed a novel experimental system that for the first time enables HCV to be propagated in primary culture of human adult hepatocytes. We verified that hepatocytes retain a differentiated phenotype in these culture conditions, including expression of cytochrome P450 2E1. Addition of ethanol to the culture medium was shown to increase the production of infectious viral particles, mimicking the increased viral load observed in HCV-infected patients with excessive alcohol consumption. Our system thus provides a relevant cell culture-based model for studying the mechanisms of aggravation of HCV infection by alcohol. Mots clefs Culture primaire d hépatocytes humains adultes, métabolisme de l éthanol, virus de l hépatite C, infection productive, charge virale INTRODUCTION L infection par le virus de l hépatite C (VHC) et l alcoolisme sont les deux principales causes de maladies chroniques du foie, avec un risque global de cirrhose d environ 20 % (Alter et Seeff, 2000 ; Hines et Wheeler, 2004). Ces deux pathologies sont par ailleurs fréquemment associées. En effet, chez les patients alcoolo-dépendants, l infection par le VHC est 4 à 50 fois plus fréquente que dans la population de référence (pour une revue générale, voir Singal et Anand, 2007). De multiples études épidémiologiques ont également bien montré qu au cours de l hépatite C chronique, une consommation d alcool d au moins 50 g/j augmente la vitesse de progression de la fibrose hépatique, le risque de cirrhose et de carcinome hépatocellulaire, ainsi que le taux de mortalité (Peters et Terrault, 2002). Sur un plan analytique, la consommation d alcool augmente l activité inflammatoire de l hépatite C, ainsi que la charge virale sérique (Pessione et al., 1998) et intra-hépatique (Romero- Gomez et al., 2001). De manière intéressante, notre équipe a récemment montré que cette augmentation de la charge virale dans le foie corrèle avec une augmentation de l expression hépatique Cahiers de l Ireb n 19,

16 de l un des récepteurs cellulaires présomptifs du VHC, le récepteur des lipoprotéines de faible densité (Carriere et al., 2006). Différentes hypothèses ont été avancées pour rendre compte de ces faits cliniques, en particulier une diminution de la réponse lymphocytaire T (Szabo et al., 2001) et une majoration du stress oxydatif (Singal et Anand, 2007). Cependant, en l absence de modèle animal ou cellulaire pertinent pour rendre compte de la co-morbidité hépatite C/alcoolisme, les quelques rares études in vitro publiées sur ce thème ont utilisé le système du réplicon sous-génomique de VHC en lignée d hépatocarcinome Huh-7, mais ont conduit à des résultats contradictoires quant à l effet de l éthanol sur la réplication virale et discordants quant aux mécanismes impliqués (Zhang et al., 2003 ; Plumlee et al., 2005 ; Trujillo- Murillo et al., 2007 ; McCartney et al., 2008). Ces discordances sont probablement imputables au caractère peu physiologique du modèle expérimental utilisé (versant virus : absence de production de particules virales infectieuses ; versant alcool : cellules tumorales en prolifération, avec perte d expression des enzymes du métabolisme oxydatif de l éthanol). Dans ce contexte, le but de notre travail a été de mettre au point un modèle cellulaire pertinent pour étudier l effet de l éthanol sur l infection par le VHC. Ceci a été réalisé par infection in vitro d hépatocytes humains adultes maintenus en culture primaire, donc exprimant des fonctions différenciées. MATERIEL ET METHODES Isolement et culture primaire d hépatocytes humains Les hépatocytes ont été isolés à partir du tissu d aspect normal de pièces opératoires obtenues à l occasion d hépatectomies pour métastases ou tumeurs bénignes chez des sujets séronégatifs pour le VHC. La dissociation a été obtenue par cathétérisme des vaisseaux visibles, et perfusion d une solution d HEPES-EDTA, puis de collagénase à 0,05 % avec un débit de 10 ml/cathéter/min, selon un protocole publié (Aoudjehane et al., 2007). Les hépatocytes ont été purifiés par centrifugation en gradient de Percoll, puis remis en suspension en milieu L-15 de Leibovitz (Invitrogen) additionné de sérum de veau fœtal (10 %) et d insuline (100 unités/l), et enfin ensemencés à raison de 10 6 cellules viables par puits sur des plaques de six puits préalablement recouvertes de collagène de type I (Sigma). A la fin de la période d attachement des cellules, le milieu a été remplacé par du milieu frais contenant de l hydrocortisone (1 µm) et la culture poursuivie à 37 C en présence de 5 % de CO 2. L apoptose et la nécrose des hépatocytes ont été appréciées régulièrement en cytométrie de flux après marquage à l aide d annexine V couplée au FITC et d iodure de propidium (Aoudjehane et al., 2007). Préparation de stocks viraux et infection des hépatocytes humains primaires Des stocks viraux (VHCcc) ont été constitués par concentration de surnageants de culture de cellules Huh (Zhong et al., 2005) transfectées avec l ARN génomique de l isolat JFH1 du VHC (Wakita et al., 2005). Trois jours après ensemencement, les hépatocytes en culture primaire ont été inoculés avec les particules virales VHCcc à une multiplicité d infection de 0,1. Après adsorption, les cellules ont été rincées trois fois avec une solution saline de tampon phosphate, puis cultivées dans du milieu L-15 complet contenant ou non de l éthanol. Quantification des ARNs intracellulaires Les ARNs totaux des culots cellulaires ont été extraits avec le coffret RNeasy R mini kit (Qiagen). Les transcrits de différents gènes spécifiques des hépatocytes ont été quantifiés par transcription inverse suivie de PCR en temps réel (RT-qPCR) à l aide de la technologie du LightCycler R (Roche). Les ARNs du VHC de polarité positive et négative ont été quantifiés par une technique de RT-qPCR spécifique décrite par notre équipe (Carriere et al., 2007). 16 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

17 «Inflammation infection» Titrage des particules virales dans les surnageants de culture La production de particules de VHC dans les surnageants de culture a été mise en évidence par quantification de l ARN viral à l aide d un test standardisé (expression en unités internationales (UI) par ml) utilisé en routine clinique pour le suivi de la charge virale chez les patients atteints d hépatite C (Abbott HCV RealTime R ), et par mesure de l antigène de capside du VHC à l aide d un test de détection immuno-enzymatique (Ortho-Clinical Diagnostics, Tokyo, Japon). L infectiosité des particules virales produites a été estimée par une méthode classique de titrage (Zhong et al., 2005). Brièvement, des cellules Huh sont mises en présence de dilutions croissantes des surnageants à tester, et cultivées pendant 72 heures. Les foyers infectieux sont alors révélés par immunofluorescence et dénombrés. Le titre infectieux est exprimé en unités formant foyer (uff) par ml de surnageant de culture. RESULTATS ET DISCUSSION Caractérisation du modèle cellulaire Viabilité cellulaire En premier lieu, nous nous sommes attachés à vérifier la viabilité des hépatocytes dans nos conditions de culture primaire. Des observations itératives au microscope à contraste de phase ont montré que l intégrité de la monocouche cellulaire était effectivement préservée au cours de la culture (Figure 1A). De plus, le taux d apoptose et de nécrose apprécié en cytométrie de flux restait inférieur à 10 % tout au long de la culture. Figure 1 : maintien de la viabilité cellulaire et de l expression des fonctions hépatocytaires au cours de la culture primaire Les hépatocytes humains isolés d une pièce opératoire ont été maintenus en culture primaire pendant deux semaines. A) Visualisation de la monocouche au microscope à contraste de phase à différents temps de la culture. B) Expression relative des transcrits de gènes spécifiques des hépatocytes. Fonctions différenciées Dans le foie humain, l éthanol est métabolisé par l alcool déshydrogénase cytoplasmique et le cytochrome P450 (CYP) 2E1 microsomal. Compte tenu de la perte d expression des enzymes du Cahiers de l Ireb n 19,

18 métabolisme de l éthanol dans les lignées dérivées d hépatocarcinomes humains, il nous est apparu indispensable de vérifier que les fonctions différenciées propres aux hépatocytes humains étaient en revanche préservées dans nos conditions de culture primaire. De fait, l expression du CYP 2E1 dans les hépatocytes était maintenue tout au long de la culture (Figure 1B). Il en était de même pour les facteurs de transcription C/EBPβ, HNF-1β, HNF-3β et HNF-4, impliqués dans la différenciation morphologique et fonctionnelle des hépatocytes, pour l albumine, un marqueur de la fonction de synthèse du foie, ainsi que pour le CYP 3A4, impliqué dans le métabolisme de la majorité des xénobiotiques. De l ensemble de ces expériences, nous concluons que, dans nos conditions de culture, les hépatocytes humains conservent leur état de différenciation, incluant la capacité à métaboliser l éthanol. Infection productive par le VHC Réplication du génome viral Dans un premier temps, nous avons cherché à mettre en évidence la réplication du génome du VHC dans les hépatocytes humains primaires inoculés avec les particules VHCcc. Comme le montre la figure 2A, des niveaux croissants d ARN viral de polarité positive étaient détectés dans les extraits cellulaires au cours de la culture. De plus, l ARN viral de polarité négative, un intermédiaire de réplication, était également présent dans les hépatocytes, apportant la preuve définitive de l occurrence d une réplication de novo du génome viral. Production de particules virales infectieuses Dans un deuxième temps, nous avons recherché si de nouvelles particules virales (VHCpc) étaient produites par les hépatocytes humains primaires inoculés avec les particules VHCcc. De fait, l ARN viral et l antigène de capside du VHC étaient détectés en quantités croissantes dans les surnageants de culture (Figure 2B). De plus, les particules VHCpc étaient hautement infectieuses, avec des titres atteignant jusqu à 10 5 uff/ml au cours de la deuxième semaine de culture, comme observé dans l expérience représentative montrée en figure 2. Figure 2 : infection productive dans les hépatocytes humains primaires inoculés avec les particules VHCcc Des hépatocytes humains primaires ont été inoculés avec les particules VHCcc, puis les marqueurs d infection virale ont été suivis au cours des deux semaines de culture. A) Réplication intracellulaire du génome viral. Les cellules ont été lysées à différents temps pour quantification des ARNs viraux de polarité positive et négative. B) Production extracellulaire de particules virales. Les surnageants de culture ont été récoltés à différents temps pour quantification de l ARN viral et de l antigène de capside, et titrage de l infectiosité. 18 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

19 «Inflammation infection» Dans les tentatives d infection in vitro d hépatocytes humains adultes en culture primaire rapportées dans la littérature, seule la réplication intracellulaire du génome du VHC avait pu être démontrée, et ce de manière inconstante et faible (Fournier et al., 1998 ; Rumin et al., 1999). Des résultats présentés en figure 2, nous concluons que, dans nos conditions expérimentales, des hépatocytes humains différenciés non seulement peuvent répliquer activement le génome du VHC, mais en outre produisent des titres analysables de nouvelles particules virales infectieuses. Effet de l éthanol sur la production de particules virales infectieuses Compte tenu du caractère volatil de l éthanol et des temps de culture relativement longs, il nous est apparu important de vérifier la persistance de l éthanol dans le milieu de culture auquel il est additionné. En collaboration avec l équipe de Michèle Garlatti et Hélène Rouach (INSERM UMRS747, Paris), nous avons donc mesuré les concentrations d éthanol au cours du temps par une méthode enzymologique couplée à un dosage spectrophotométrique. Ces expériences ont montré qu environ la moitié de la quantité d éthanol est évaporée chaque jour, nécessitant une compensation quotidienne de la perte. Nous avons alors évalué l effet de l éthanol sur la production de particules virales infectieuses dans des conditions maintenant une concentration de 100 mm. Comme le montre la figure 3, les titres infectieux étaient augmentés de deux à cinq fois sous l effet de l éthanol. Il est intéressant de constater que cet incrément est comparable à celui de la charge virale in vivo chez les patients atteints d hépatite C lors d une consommation d alcool d au moins 30 g/j (Carriere et al., 2006). Figure 3 : augmentation de la production de particules virales infectieuses en présence d éthanol Des hépatocytes humains primaires ont été inoculés avec les particules VHCcc, et cultivés en absence ou en présence d éthanol maintenu à une concentration de 100 mm. Les surnageants de culture ont été titrés à différents temps. La figure présente le facteur d augmentation du titre infectieux en présence d éthanol. CONCLUSION Nous avons mis au point un système de culture cellulaire permettant pour la première fois de reproduire le cycle infectieux complet du VHC dans des hépatocytes humains différenciés. L éthanol augmente la production de particules virales infectieuses dans ce modèle in vitro, mimant ainsi l augmentation de la charge virale observée in vivo chez les malades ayant une consommation excessive d alcool. Nous disposons donc désormais d un modèle cellulaire pertinent pour disséquer les mécanismes physiopathologiques de la co-morbidité hépatite C/alcoolisme. Remerciements : nous souhaitons remercier Michèle Garlatti et Hélène Rouach de nous faire partager leur expérience. Cahiers de l Ireb n 19,

20 Références Alter H.J., Seeff L.B. Recovery, persistence, and sequelae in hepatitis C virus infection: a perspective on long-term outcome. Semin Liver Dis 2000, vol. 20, n 1, p Aoudjehane L., Podevin P., Scatton O., Jaffray P., Dusanter-Fourt I., Feldmann G., Massault P.P., Grira L., Bringuier A., Dousset B., Chouzenous S., Soubrane O., Calmus Y., Conti F. Interleukin-4 induces human hepatocyte apoptosis through a Fas-independent pathway. Faseb J 2007, vol. 21, n 7, p Carriere M., Pene V., Breiman A., Conti F., Chouzenoux S., Meurs E., Andrieu M., Jaffray P., Grira L., Soubrane O., Sogni P., Calmus Y., Chaussade S., Rosenberg A.R., Podevin P. A novel, sensitive, and specific RT-PCR technique for quantitation of hepatitis C virus replication. J Med Virol 2007, vol. 79, n 2, p Carriere M., Rosenberg A.R., Conti F., Chouzenoux S., Terris B., Sogni P., Soubrane O., Calmus Y., Podevin P. Low density lipoprotein receptor transcripts correlates with liver hepatitis C virus RNA in patients with alcohol consumption. J Viral Hepat 2006, vol. 13, n 9, p Fournier C., Sureau C., Coste J., Ducos J., Pageaux G., Larrey D., Domergue J., Maurel P. In vitro infection of adult normal human hepatocytes in primary culture by hepatitis C virus. J Gen Virol 1998, vol. 79, n 10, p Hines I.N., Wheeler M.D. Recent advances in alcoholic liver disease III. Role of the innate immune response in alcoholic hepatitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2004, vol. 287, n 2, p. G310-G314. McCartney E.M., Semendric L., Helbig K.J., Hinze S., Jones B., Weinman S.A., Beard M.R. Alcohol metabolism increases the replication of hepatitis C virus and attenuates the antiviral action of interferon. J Infect Dis 2008, vol. 198, n 12, p Pessione F., Degos F., Marcellin P., Duchatelle V., Njapoum C., Martinot-Peignoux M., Degott C., Valla D., Erlinger S., Rueff B. Effect of alcohol consumption on serum hepatitis C virus RNA and histological lesions in chronic hepatitis C. Hepatology 1998, vol. 27, n 6, p Peters M.G., Terrault N.A. Alcohol use and hepatitis C. Hepatology 2002, vol. 36, n 5 Suppl. 1, p. S220- S225. Plumlee C.R., Lazaro C.A., Fausto N., Polyak S.J. Effect of ethanol on innate antiviral pathways and HCV replication in human liver cells. Virol J 2005, vol. 2, p. 89. Romero-Gomez M., Grande L., Nogales M.C., Fernandez M., Chavez M., Castro M. Intrahepatic hepatitis C virus replication is increased in patients with regular alcohol consumption. Dig Liver Dis 2001, vol. 33, n 8, p Rumin S., Berthillon P., Tanaka E., Kiyosawa K., Trabaud M.A., Bizollon T., Gouillat C., Gripon P., Guguen-Guillouzo C., Inchauspe G., Trepo C. Dynamic analysis of hepatitis C virus replication and quasispecies selection in long-term cultures of adult human hepatocytes infected in vitro. J Gen Virol 1999, vol. 80, n 11, p Singal A.K., Anand B.S. Mechanisms of synergy between alcohol and hepatitis C virus. J Clin Gastroenterol 2007, vol. 41, n 8, p Szabo G., Mandrekar P., Dolganiuc A., Catalano D., Kodys K. Reduced alloreactive T-cell activation after alcohol intake is due to impaired monocyte accessory cell function and correlates with elevated IL-10, IL-13, and decreased IFNgamma levels. Alcohol Clin Exp Res 2001, vol. 25, n 12, p Trujillo-Murillo K., Alvarez-Martinez O., Garza-Rodriguez L., Martinez-Rodriguez H., Bosques-Padilla F., Ramos-Jimenez J., Barrera-Saldana H., Rincon-Sanchez A.R., Rivas-Estilla A.M. Additive effect of ethanol and HCV subgenomic replicon expression on COX-2 protein levels and activity. J Viral Hepat 2007, vol. 14, n 9, p Wakita T., Pietschmann T., Kato T., Date T., Miyamoto M., Zhao Z., Murthy K., Habermann A., Krausslich H.G., Mizokami M., Bartenschlager R., Liang T.J. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med 2005, vol. 11, n 7, p Zhang T., Li Y., Lai J.P., Douglas S.D., Metzger D.S., O'Brien C.P., Ho W.Z. Alcohol potentiates hepatitis C virus replicon expression. Hepatology 2003, vol. 38, n 1, p Zhong J., Gastaminza P., Cheng G., Kapadia S., Kato T., Burton D.R., Wieland S.F., Uprichard S.L., Wakita T., Chisari F.V. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 2005, vol. 102, n 26, p Cahiers de l Ireb n 19, 2009

21 «Inflammation infection» IDENTIFICATION DES CHANGEMENTS INFLAMMATOIRES CELLULAIRES PROVOQUES PAR LE «BINGE DRINKING» ROBERTA J. WARD 1, 2, 3, RACHEL ALLEN 3, FREDERIC LALLEMAND 1, FRANÇOIS SCHOL 1, MATHIEU ANCEAU 1, PHILIPPE DE WITTE 1, LAURA DELLA CORTE 2 ET DAVID DEXTER 3 1 Biologie du Comportement, Université Catholique de Louvain, Place Croix du Sud 1, 1348 Louvain-la-Neuve - Belgique 2 Department Preclinical and Clinical Pharmacology, Florence University, Florence - Italie 3 Department of Cellular and Molecular Neuroscience, Imperial College, Londres - Grande-Bretagne Summary In the present studies, the effect of binge drinking on the immune system has been evaluated in alveolar macrophages isolated from binge drinking rats which had received either 2 or 3g/kg ethanol in a 3 week binge drinking regime. A second in vitro study was performed on the immortalized glial cell line, C6, which has been subjected to «binge drinking» for 2 weeks. After binge drinking, both macrophage and glial cells showed an enhanced nitric oxide (NO) release before and after lipopolysaccharide (LPS) stimulation. This NO increase may be related to the increased release of the amino acid glutamate in the extracellular fluid of the hippocampus after the binge drinking procedure in rats. Mots clefs Cellules phagocytaires, microglie, macrophages, binge drinking, neuro-inflammation INTRODUCTION La prise excessive d éthanol, aussi bien de manière chronique qu épisodique, a de nombreux effets néfastes sur les fonctions biochimiques et physiologiques chez l homme. Au niveau du système nerveux central (SNC), l éthanol induit une toxicité via des modifications des systèmes de neurotransmetteurs spécifiques et des nombreuses voies complexes de signalisation (Ward et al., 2009). L éthanol peut aussi affecter négativement le système immunitaire en augmentant la susceptibilité à l infection du consommateur chronique d éthanol (Szabo, 1998 ; Nelson et Kolls, 2002), et ce particulièrement au niveau de la partie supérieure des voies respiratoires (Perlino et Rimland, 1985 ; Jong et al., 1995). Bien que les effets immunosuppresseurs de l abus chronique d éthanol aient été rapportés, ceux-ci n ont pas encore été étudiés chez des individus faisant du «binge drinking», plus particulièrement chez des adolescents. Le «binge drinking» est un sujet interpellant aussi bien la société que les média et le monde politique (Herring et al., 2008) ; il est aussi considéré comme un problème chez les jeunes. Au cours de l adolescence, le cerveau subit un développement qui implique des modifications dans la neurotransmission et la plasticité, associées à des modifications structurelles dans certaines régions cérébrales comme l hippocampe, le cortex préfrontal et les structures limbiques (Dahl, 2004). Une prise accrue d éthanol durant cette étape du développement cérébral pourrait conduire à une multitude de problèmes comme la perte de mémoire et des déficits cognitifs (Andreasson et Kaufmann, 2001 ; Li et al., 2004). L insuffisance des phagocytes mononucléaires (macrophages et microglie) pourrait jouer un rôle significatif dans la pathogenèse des dommages cérébraux induits par l éthanol. Au niveau du SNC, les cellules gliales sont considérées comme un médiateur de la neuro-inflammation en libérant des cytokines inflammatoires ainsi que de l oxyde nitrique (NO) qui pourraient influencer la survie des cellules neuronales. Cahiers de l Ireb n 19,

22 Dans la présente étude, nous avons analysé chez le rat les effets de l abus épisodique d éthanol sur la fonction des macrophages et de la microglie dans un modèle de «binge drinking». De plus, nous avons étudié par microdialyse intracérébrale les effets de ce même régime de «binge drinking» sur la concentration basale de neurotransmetteurs au niveau de l hippocampe, ainsi que les effets aigus d une dose supplémentaire d éthanol sur ces mêmes neurotransmetteurs. Finalement, nous avons développé un modèle de «binge drinking» in vitro sur une lignée de cellules astrocytaires immortalisées (C6) afin de déterminer l action de l éthanol sur la réponse immunologique de ces cellules à un stimulant ex vivo. MATERIELS ET METHODES Modèle animal de «binge drinking» Des rats femelles de la souche Wistar, d un poids moyen de g au début de l expérience, ont été mis en cage plastique standard et maintenus dans un environnement à température (22 C) et éclairage contrôlés (cycle de douze heures de lumière et douze heures d obscurité, la lumière s allumant à huit heures du matin). Les rattes avaient un accès libre à de la nourriture pour rongeurs vendue dans le commerce ainsi qu à de l eau de distribution. Toutes les procédures concernant les animaux ont été réalisées en strict accord avec les recommandations de la CEE (86/609/CEF) ainsi qu avec la loi belge sur les soins et l utilisation des animaux de laboratoire (Moniteur Belge , p. 3437). Les rattes ont reçu par gavage gastrique une dose d éthanol de 2 ou 3 g/kg d éthanol, trois fois par jour sur une période de six heures pendant deux jours consécutifs suivis de cinq jours d abstinence. Cette période de sept jours correspondait à un cycle. Ce cycle a été répété trois fois. Le jour suivant, le dernier jour de gavage du troisième cycle, une opération chirurgicale a été réalisée comme décrit plus loin. Une expérience de microdialyse a ensuite été réalisée le deuxième jour de gavage du quatrième cycle. Trois heures après le début de la microdialyse, les rattes ont reçu par gavage une dose d éthanol de 2 ou 3 g/kg. La microdialyse s est poursuivie pendant encore cinq heures. Procédure chirurgicale La procédure chirurgicale a été réalisée sur les rattes comme décrit précédemment (Lallemand et al., 2006). Les coordonnées pour atteindre la région hippocampale étaient les suivantes par rapport au point Bregma et à la surface de l os du crâne (Paxinos et Watson, 1982) : A/P = -3,8 mm ; L = -4,4 mm ; V =-5,6 mm, à l extrémité de la partie ventrale de la canule guide. La sonde dont l extrémité faisait 2 mm était perfusée à un flux de 2 ml/minute avec une solution de liquide cérébrospinal artificiel comme décrit précédemment (Lallemand et al., 2006). Les échantillons de microdialysat ont été collectés sur des périodes de 30 minutes pendant huit heures. La microdialyse a été réalisée cinq jours après l opération chirurgicale. Les tubes connectés aux sondes de microdialyse étaient maintenus dans des tubes métalliques à spirales pour permettre une liberté de mouvement aux animaux tout en les protégeant des dommages que ces derniers auraient pu leur infliger. Dosage des acides aminés Les concentrations de glutamate, taurine et GABA ont été estimées dans les microdialysats par HPLC combinée à la fluorométrie après dérivatisation par l OPA (ortho-phtaldialdéhyde) (Bianchi et al., 2003). La position des pics de glutamate, de taurine et de GABA dans les microdialysats a été comparée à celle obtenue avec une solution standard contenant ces acides aminés. Extraction et mise en culture des macrophages alvéolaires Les macrophages alvéolaires ont été isolés par lavage des poumons des rats ayant subi un régime de «binge drinking» à l éthanol ainsi que des rats contrôles. Les rats ont été anesthésiés avec du Nembutal, un cathéter a été inséré dans la trachée, et les poumons ont été lavés doucement avec une 22 Cahiers de l Ireb n 19, 2009

23 «Inflammation infection» solution saline tamponnée avec des phosphates (PBS) à un ph de 7,4. Les macrophages alvéolaires ont été récupérés après centrifugation à 1200 tours par minute durant dix minutes. Les cellules, à une densité de 1 x 10 5 ou 2 x 10 5, ont été mises dans des puits de plaques de culture avec du milieu Dulbecco supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal ainsi que de la pénicilline (100 µg/ml) et de la streptomycine (100 µg/ml). Les cellules ont été laissées ainsi toute la nuit pour permettre leur adhésion à la surface des puits, puis elles ont été rincées et resuspendues dans du milieu de culture. Les cellules ont ensuite été stimulées avec des lipopolysaccharides [(LPS) 2 µg/ml] et incubées 24 heures de plus. Le surnageant des cultures cellulaires a ensuite été récupéré et aliquoté par fractions de 100 µl. Chaque aliquote a été ensuite mélangée à un volume égal de réactif de Greiss (1 % sulphanilamide, 0,1 % naphtalène diamine dihydrochloride et 2,5 % acide phosphorique) afin de déterminer la concentration de nitrite. La densité optique a été mesurée à une longueur d onde de 540 nm après incubation à température ambiante pendant dix minutes. Une série de concentrations de 1 à 50 µm de nitrite de sodium a été utilisée pour établir la courbe de standard. Etudes de la microglie hippocampale activée Les cerveaux des rats contrôles ainsi que ceux des rats ayant subi le «binge drinking» ont rapidement été prélevés puis fixés à l aide de PBS à un ph de 7,4 contenant 4 % de paraformaldéhyde pendant sept jours. Les cerveaux ont ensuite été placés dans du PBS avec du sucrose à 30 % afin de les cryoprotéger. Puis des sections sérielles d une épaisseur de 30 µm ont été prélevées tout le long de l hippocampe à l aide d un cryostat et stockées à -80 C. Une coloration immunohistochimique spécifique de la microglie activée a été appliquée sur chaque 8 ème section incluant l hippocampe, à l aide de la technique standard utilisant l ovidine-biotine immunoperoxydase (ABC). Au moyen d un microscope Nikon Eclipse E800 équipé d une caméra, la microglie hippocampale activée immunopositive pour OX-6 a été visualisée et quantifiée par référence à une section adjacente colorée avec du crésyl violet. Le nombre moyen de cellules microgliales activées par section de 30 µm a ensuite été déterminé pour chaque animal. Etudes sur les cultures de cellules immortalisées Les cellules astrocytaires C6 ont été fournies par la collection européenne de cellules de cultures (ECCC). Ces cellules ont été cultivées dans des flacons stériles en plastique d une surface de 75 cm 2 avec du milieu de culture Ham F12 supplémenté avec du sérum de veau fœtal, de la pénicilline (1 %) et de la streptomycine (1 %). Les cellules ont ensuite été placées dans des puits de plaques de cultures à une densité de 1 x 10 5 avec le même milieu de culture. De l éthanol à une concentration de 25, 50 ou 100 mm a été rajouté pendant 48 heures (binge 1 x). Le surnageant a ensuite été éliminé et les cellules ont été stimulées avec des LPS (2 µg/ml) pendant 24 heures. Le surnageant a finalement été récupéré et son contenu en nitrite déterminé. Dans une autre série de puits, l éthanol a été ajouté en deux occasions, séparées par cinq jours en présence de milieu de culture normal (binge 2 x). Le contenu en nitrite du surnageant récupéré après stimulation par des LPS pendant 24 heures a ensuite été estimé. RESULTATS ET DISCUSSION Concentrations extracellulaires basales de glutamate, taurine et GABA dans l hippocampe Le régime de «binge drinking» avec 2 et 3 g/kg d éthanol a induit une augmentation significative du taux basal de glutamate mais pas de ceux de la taurine ni du GABA (Figure 1). Cette mesure a été effectuée avant l administration par gavage de la dernière dose d éthanol au cours de la microdialyse. L administration de cette dernière dose de 2 ou 3 g/kg d éthanol n a pas modifié de manière significative les concentrations d aucun de ces acides aminés après cinq heures de microdialyse. Il est donc à noter que trois semaines de «binge drinking» ont induit une augmentation de la concentration basale de glutamate au niveau de l hippocampe. Cahiers de l Ireb n 19,

24 Figure 1 : concentrations basales extracellulaires au niveau de l hippocampe de glutamate, taurine et GABA, après trois semaines de «binge drinking». Les résultats représentent la moyenne ± sem. ** représente une différence significative à P < 0,01. Une augmentation de la libération du glutamate a aussi été mise en évidence dans les cerveaux d autres modèles animaux de «binge drinking» (Szumlinski et al., 2007) ainsi que chez des jeunes alcooliques (Lee et al., 2007). Cependant l origine de cet acide aminé excitateur reste à déterminer. En effet, aucune modification de la concentration basale de glutamate n a été observée dans de nombreuses régions cérébrales suite à une période d intoxication chronique à l éthanol par voie pulmonaire (Dahchour et De Witte, 2003 a et b), bien que l alcoolémie ait atteint 2 g/l dans ces conditions expérimentales. Stimulation par des LPS des macrophages pulmonaires isolés de rats ayant subi un régime de «binge drinking» Les macrophages isolés à partir des poumons des rattes ayant subi un «binge drinking» ont montré, avant stimulation avec des LPS, une augmentation significative de la libération de nitrite dans le milieu de culture par rapport au groupe contrôle qui n a pas reçu d éthanol (Figure 2A). 6 5 a) Non-stimulated cells 200,000 cells ** ** Nitrite content (µm) Control 2g/kg 3g/kg Figure 2A : taux basaux de NO (déterminés à l aide des nitrites) dans les macrophages alvéolaires isolés à partir des rattes ayant subi le «binge drinking» avec 2 ou 3 g/kg d éthanol. Les résultats représentent la moyenne + sd. ** représente une signification de P < 0, Cahiers de l Ireb n 19, 2009

25 «Inflammation infection» b) Stimulated cells ,000 cells ** ** Nitrite content (µm) Controls Stim 2g/kg Stim 2g/kg 3g/kg Stim 3g/kg Figure 2B : effets de la stimulation par des LPS sur la libération de NO (déterminée à l aide des nitrites) par les macrophages alvéolaires isolés à partir des rattes ayant subi le «binge drinking» avec 2 ou 3 g/kg d éthanol pendant trois semaines. Les résultats représentent la moyenne + sd. ** représente une signification de P < 0,01. En outre, les deux doses d éthanol ont aussi induit, après stimulation par des LPS (2 µg/ml), une augmentation significative de la libération de nitrite dans le milieu de culture par rapport au groupe contrôle qui n a pas reçu d éthanol (Figure 2B). Identification de la microglie activée au niveau de l hippocampe des rats ayant subi un «binge drinking» Les deux doses d éthanol, 2 et 3 g/kg, ont induit une augmentation significative de l activation de la microglie au niveau de la région hippocampale par comparaison au groupe contrôle n ayant pas reçu d éthanol (Figure 3). Activated microglia *** * 0 VEH 2g/kg 3g/kg Figure 3 : quantification de la microglie activée par coloration de OX-6 au niveau de l hippocampe des cerveaux de rattes (n = 4 dans chaque groupe) ayant subi le «binge drinking» avec 2 ou 3g/kg. Les résultats représentent la moyenne + sd. * représente une signification de P < 0,05 et ** représente une signification de P < 0,01. Cahiers de l Ireb n 19,

26 Modèle de «binge drinking» sur culture cellulaire La figure 4 montre la libération de nitrite, avant et après stimulation par des LPS (2 µg/ml), par les cellules C6 après incubation avec les différentes doses d éthanol, 25, 50 et 100 mm, après une ou deux occasions (respectivement 1 x et 2 x). La plupart des doses d éthanol a induit une augmentation de la libération de nitrite par la cellule C6. La microglie activée produit de nombreux médiateurs de l inflammation ; parmi ceux-ci, l oxyde nitrique (NO) est largement considéré comme un représentant de l activation de l inflammation (Minghetti et Levi, 1998 ; Lee et al., 2004). Lors de nos études précédentes sur les macrophages isolés à partir de rats alcoolisés chroniquement par voie pulmonaire, nous avons clairement montré qu un tel traitement réduisait leur activation (Zhang et al., 1998). Il était dès lors intéressant qu aussi bien le modèle in vivo (au moyen des macrophages alvéolaires) que le modèle in vitro (au moyen des cellules C6) de «binge drinking», étudiés dans la présente étude, montrent une activation accrue de ces cellules. Cette augmentation survenait aussi in vivo (au moyen des cerveaux) au niveau de la microglie de la région hippocampale, comme observé après coloration immunohistochimique. Une explication possible pour l activation de la microglie in vivo serait l augmentation du taux basal en glutamate dans la région hippocampale. Le glutamate est au niveau du SNC le principal neurotransmetteur excitateur. Il est libéré par les vésicules neuronales glutamatergiques dans la fente synaptique via un mécanisme calcium-dépendant. Les récepteurs NMDA présents au niveau postsynaptique des neurones représentent la voie principale de la neurotoxicité au glutamate. De plus, la microglie, lorsqu elle est activée, libère aussi des quantités substantielles de glutamate, ce qui peut contribuer à la neuro-inflammation. Inversement, un des rôles importants de la microglie est de rapidement recapturer le glutamate pour prévenir cette neurotoxicité. Cette dernière fonction pourrait être compromise après que la microglie soit activée. Figure 4 : libération de NO par les cellules gliales C6 (déterminée par les nitrites). Après administration de 100 mm d éthanol à une (1 x) ou deux (2 x) occasions avant et après stimulation par des LPS. Les résultats représentent la moyenne + sd. ** représente une signification de P < 0, Cahiers de l Ireb n 19, 2009

27 «Inflammation infection» CONCLUSION Les présentes études ont montré que le «binge drinking» active les cellules phagocytiques, comme les macrophages alvéolaires, chez les rattes adolescentes. Cet effet est à l opposé de ce que l on observe lors de l abus chronique d éthanol où cette fonction immunitaire est diminuée. De plus, les études in vivo d un modèle de «binge drinking» ont identifié de la microglie activée au niveau de l hippocampe, après un temps relativement court d un tel abus d éthanol, de l ordre de trois semaines. La neuro-inflammation pourrait donc être un facteur important dans le déclin cognitif observé chez les personnes consommant de l éthanol selon un modèle de «binge drinking» et ce particulièrement chez les adolescentes. Références Andreasson K.I., Kaufmann W.E. Role of immediate early gene expression in cortical morphogenesis and plasticity. Results Prob Cell Differ 2001, vol. 39, p Bianchi L., Ballini C., Colivicchi M.A., Della Corte L., Giovannini M.G., Pepeu G. Investigations on aspartate, glutamate and GABA release from ventral hippocampus during repeated exploratory activity in the rat. Neurochem Res 2003, vol. 28, n 3-4, p Dahchour A., De Witte P. Effects of acamprosate on excitatory amino acids during multiple ethanol withdrawal periods. Alcohol Clin Exp Res 2003a, vol. 27, n 3, p Dahchour A., De Witte P. Excitatory and inhibitory amino acid changes during repeated episodes of ethanol withdrawal: an in vivo microdialysis study. Eur J Pharmacol 2003b, vol. 459, n 2-3, p Dahl R.E. Adolescent brain development: a period of vulnerabilities and opportunities. Keynote address. Ann N Y Acad Sci 2004, vol. 1021, p Herring R., Berridge V., Thom B. Binge drinking: an exploration of a confused concept. J Epidemiol Community Health 2008, vol. 62, n o 6, p Jong G.M., Hsiue T.R., Chen C.R., Chang H.Y., Chen C.W. Rapidly fatal outcome of bacteremic Klebsiella pneumoniae pneumonia in alcoholics. Chest 1995, vol. 107, n 1, p Lallemand F., Ward R.J., Dravolina O., De Witte P. Nicotine-induced changes of glutamate and arginine in naive and chronically alcoholized rats: An in vivo microdialysis study. Brain Res 2006, vol. 1111, n 1, p Lee H., Jeong J., Son E., Mosa A., Cho G.J., Choi W.S., Ha J.S., Kim I.K., Lee M.G., Kim C.Y., Suk K. Ethanol selectively modulates inflammatory activation signalling of brain microglia. J Neuroimmunol 2004, vol. 156, n 1-2, p Lee E., Jang D.P., Kim J.J., An S.K., Park S., Kim I.Y., Yoon K.J., Namkoong K. Alteration of brain metabolites in young alcoholics without structural changes. Neuroreport 2007, vol. 18, n 14, p Li R.C., Row B.W., Kheirandish L., Brittian K.R., Gozal E., Guo S.Z., Sachleben L.R. Jr, Gozal D. Nitric oxide synthase and intermittent hypoxia-induced spatial learning deficits in the rat. Neurobiol Dis 2004, vol. 17, n 1, p Minghetti L., Levi G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog Neurobiolog 1998, vol. 54, n 1, p Nelson S., Kolls J.K. Alcohol, host defence and society. Nat Rev Immunol 2002, vol. 2, n 3, p Paxinos G.,Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press, New York, 1982, 256 p. Perlino C.A., Rimland D. Alcoholism, leukopenia, and pneumococcal sepsis. Am Rev Respir Dis 1985, vol. 132, n 4, p Szabo G. Monocytes, alcohol use and altered immunity. Alcohol Clin Exp Res 1998, vol. 22, n 5 Suppl., p 216S-219S. Szumlinski K.K., Diab M.E., Friedman R., Henze L.M., Lominac K.D., Bowers M.S. Accumbens neurochemical adaptations produced by binge-like alcohol consumption. Psychopharmacology (Berl) 2007, vol. 190, n 4, p Ward R.J., Lallemand F., De Witte P. Biochemical and neurotransmitter changes implicated in alcohol induced brain damage in chronic or «binge drinking» alcohol abuse. Alcohol Alcohol 2009, in press. Zhang Y., Crichton R.R., Boelaert J.R., Jorens P.G., Herman A.G., Ward R.J., Lallemand F., de Witte P. Decreased release of nitric oxide by alveolar macrophages after in vivo loading with iron or ethanol. Biochem Pharmacol 1998, vol. 55, n 1, p Cahiers de l Ireb n 19,