Suivi Immuno-Hématologique de la femme enceinte

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1 Suivi Immuno-Hématologique de la femme enceinte Dr Agnès Mailloux UF de biologie du CNRHP Centre National de Référence en Hémobiologie Périnatale Pôle de Biologie médicale et Pathologie HUEP AP-HP

2 INTRODUCTION But du suivi Immuno-hématolique : Intérêt Fœtal diagnostic des IFM érythrocytaire IFM érythrocytaire : situation obstétricale rare = fixation Ac maternels circulants sur les Ag fœtaux érythrocytaires correspondants Gravité : Immuno-hémolyse fœtale et néonatale Survenue d une anémie Hyper-production de bilirubine avec accumulation post-natale et risque d ictère nucléaire dès la première semaine de vie Incidence clinique 4/1000 naissances

3 PHYSIOPATHOLOGIE 1-Traversée trans-placentaire des anticorps maternels IgG via les récepteurs FcgRn dès le premier trimestre de la grossesse. Taux fœtal IgG à 20 SA : 10 % du taux maternel 2-Formation des immun-complexes Antigène-Anticorps sur le globule rouge foetal 3-Immuno-adhérence et érythrophagocytose par les macrophages spléniques 4- Survenue d une anémie 5-Hyper-production de bilirubine avec accumulation post-nataleet risque d ictère nucléaire dès la première semaine de vie

4 OUTILS BIOLOGIQUES POUR LE DIAGNOSTIC ET LE SUIVI DES INCOMPATIBILTES FOETO-MATERNELLES

5 SUIVI DE GROSSESSE : Les RAI RAI D INTERET FŒTAL: Femme RH:1 : au 1 er trimestre Femme RH:-1 ou RH:1 avec ATCD transfusionnels: au 1 er, 2 ème et 3 ème trimestre (sauf si injt d IgRH) RAI D INTERET MATERNEL(transfusionnel) : en fin de grossesse

6 DIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUE ALLO-ANTICORPS COURANTS ET RISQUE DE MALADIE HEMOLYTIQUE Spécificité (nomenclature traditionnelle) Spécificité (nomenclature numérique) Risque d anémie fœtale Maladie hémolytique néonatale Anti-D Anti-RH1 OUI après 15 SA OUI Anti-Kell Anti-KEL1 OUI après 15SA OUI Anti-c Anti-RH4 OUI après 20 SA OUI Anti-E Anti-RH3 RARE (3ème trimestre) OUI Anti-e Anti-RH5 Exceptionnel OUI Anti-Fya Anti-FY1 Exceptionnel OUI Anti-Jka Anti-JK1 Exceptionnel OUI Anti-Kpa Anti-KEL3 Exceptionnel OUI Anti-M Anti-MNS1 Exceptionnel OUI

7 DIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUE ALLO-ANTICORPS COURANTS ET RISQUE DE MALADIE HEMOLYTIQUE Spécificité (nomenclature traditionnelle) Spécificité (nomenclature numérique) Risque d anémie fœtale Maladie hémolytique néonatale Anti-A Anti-ABO1 NON OUI Anti-B Anti-ABO2 NON OUI Anti-C Anti-RH2 NON OUI Anti-Fyb Anti-FY2 NON OUI Anti-Jkb Anti-JK2 NON OUI Anti-S Anti-MNS3 NON OUI Anti-G Anti-RH12 NON OUI

8 DIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUE Paramètres de l Ac influençant le risque hémolytique Sa spécificité : déterminée par la RAI + IAI Affinité: différente selon la spécificité donnée par le titrage en Coombs indirect sur hématies tests natives Pouvoir d activation des récepteurs Fc: fonction de la sous-classe IgG 1 ou IgG 3 et de la glycosylation Fcg déterminée par des tests fonctionnels (type ADCC) Concentration: très grande variation (de 1 ng à 100 µg/ml) déterminée / dosage pondéral ou approchée / titrage

9 I-LA TECHNIQUE DE DOSAGE PONDERAL

10 DIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUE Dosage pondéral des anticorps anti-rh1, anti-rh4, Anti-RH5, anti-rh3, Anti-RH2 Dosage précis de la concentration en anticorps Technique lourde CV de la technique : 5 % à 20 % Variante 2 temps: hématies tests traitées au préalable par broméline : haut rendement de fixation (résultat proche de la concentration réelle) Variante 1 temps: broméline introduite directement dans le circuit, destruction des IgG3 (dosage des IgG1 de haute affinité)

11 II-LA TECHNIQUE DE TITRAGE

12 DIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUE Titrage des anticorps Pour les autres anticorps : Titrage en technique de Coombs indirect en tube (test indirect à l antiglobuline-hématies tests normaleslecture macroscopique des agglutinats) Lecture directe : IgM Addition de l anti-igg : lecture en test indirect à l antiglobuline Réalisation en parallèle d un témoin titrage Titrage comparatif / sérum précédent

13 Spécificité des anticorps Titrage tube et titrage en support solide : Difficultés de corrélation Nombre de spécimens Nombre de dilution d écart pour la technique gel par rapport à la technique tube Minimum Maximum Moyenne Anti-RH Anti-RH1+RH Anti-RH1+RH2+RH Anti-RH Anti-RH Anti-RH Anti-RH Anti-KEL1 7 (titre < 1/64) (titre > 1/64) Anti-FY Anti-JK Anti-MNS Anti-MNS Anti-MNS Grande dispersion des résultats quelque soit le titre. Utilisation du support gel augmente de façon peu reproductible le titre des Ac. SAUF Anti-KEL1, anti-mns1, anti-jk1: titres en support gel < titrage tube. Etude CNRHP, SFTS 2011

14 III- LA TECHNIQUE DE MICROTITRAGE DES ANTI-RH1

15 1-ANTICORPS TROUVE DANS LE SERUM UNIQUEMENT EXPLICABLE PAR ANTI-RH1 PASSIF (± ANTI-RH1 immun?) INTERET DU MICROTITRAGE 3 QUESTIONS 2-EST-CE QUE LA QUANTITE D ANTICORPS EST SUFFISANTE POUR PROTEGER? Apport IgG anti-d à 20 µg/ml GR RH:1 efficacité 100% 3- EST-CE QU UN DOSAGE PONDERAL EST NECESSAIRE? µt 24ng/ml

16 TECHNIQUE DE MICROTITRAGE Technique simple d hémagglutination en support gel 6 ng/ml STANDARD Pur 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 PATIENT Concentration approchée = 8 x 1.5= 12 ng/ml Concentration en anti-d = Inverse de la dernière dilution réactive de l échantillon X Concentration de la dilution du standard avec la même intensité de réaction

17 INTERPRETATION DU MICROTITRAGE Concentration en anti-d comparée à la concentration théorique ½ VIE 3 SEMAINES DIMINUTION DE MOITIE TOUTES LES 3 SEMAINES ng/ml ng/ml ANTICORPS TROUVE DANS LE SERUM UNIQUEMENT EXPLICABLE PAR ANTI-D PASSIF (ALLO-IMMUNISATION EN PLUS)? ng/ml 6 ng/ml 50 3 ng/ml Terme SA

18 IV- LES TECHNIQUES DE GENOTYPAGE FOETAL

19 INVASIF DIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUES le génotypage fœtal par PCR Liquide amniotique ou villosités choriales : RHD, RHc, RHE, KEL1 Méthodes validées Indications : immunisations sévères anti-kel1 ou anti-rhc avec géniteur hétérozygote NON INVASIF Sang maternel (ADN plasmatique) : RHD(2004), KEL1(2010), RH4 (2015) Méthode validée, accréditée pour le RHD et le KEL1 Indications : toutes immunisations anti-d ou anti-kell avec géniteur RHD ou KEL1 positif

20 LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL NON INVASIF FreeDNA Fetal Kit RhD Kit de génotypage foetal RHDà partir d ADN fœtal libre du sang maternel (Technique PCR Temps réel) Amplification par PCR des séquences spécifiques du gène RHD et ADN Maïs : - EXON 10(plus sensible mais moins spécifique) - EXON 7 (plus spécifique mais moins sensible) -EXON 5 (permet de génotyper le fœtus chez une mère possédant un variant silencieux Dpsi) Amplification positive FŒTUS RHESUS D POSITIF Car : Absence de séquence du gène RHD chez la mère RH1 négatif PERMET DE LEGITIMER UNE SURVEILLANCE ANTENATALE Amplification négative FŒTUS RHESUS D NEGATIF (diagnostic par défaut) Ou amplification défectueuse Ou concent très faible d ADN fœtal

21 GENOTYPAGE RHD FOETAL INDICATIONS Femme immunisée anti-rh1 Femme RH1 négatif non-immunisée Avant amniocentèse Prophylaxie systématique de la 28 ème semaine Réalisation à partir de 12 SA Réalisation 8-15 jours avant le geste Réalisation avant 26 SA Foetus RHD+ Incompatibilité fœto-maternelle légitime surveillance lourde Fœtus RHDexemption de surveillance Fœtus RHD+ Fœtus RHDinjection IgRH aussitôt après amniocentèse évite injection d IgRH Fœtus RHD+ Fœtus RHDinjection IgRH à 28 SA exemption de prévention et surveillance (40%) Besoins: - certitude des positifs - certitude des négatifs - diagnostic précoce Besoins: - certitude des négatifs - diagnostic avant 26SA

22 GENOTYPAGE KEL1 FŒTAL NON INVASIF KEL2(Thr) AAC CGA ACG CTG AGA TTG GCT TGC GAC TCT Mutation de substitution (transversion) KEL1(Met) AAC CGA ATG CTG AGA TTG GCT TAC GAC TCT Examen basé sur 1-PCR allèle KEL1spécifique en temps réel (SyberGreen) réalisé en triplicate (91 pb) mise en évidence d ADN foetal KEL1 2-PCRde l exon 7 du gène ABOen temps réel (SyberGreen) réalisé en simplicate(128 pb) représentation de la quantité d ADN maternelle 3-PCR d un ADN traceur (Maïs) en temps réel (TaqMan) Validation de l étape d extraction Tous les résultats doivent être confirmés sur un 2 ème prélèvement réalisé plus tard au cours de la grossesse.

23 GENOTYPAGE KEL1 FOETAL INDICATION Femme immunisée anti-kel1 -Réalisation à partir de 13 SA -Proposé lorsque titre en anti-kel1 > au 1/32 - Conjoint hétérozygote KEL1/KEL2 -Risque d anémie fœtale sévère fonction du titre de l anticorps anti-kel1 maternel et l âge gestationnel : risque d anémie fœtale sévère dès 16 SA -Surveillance clinique spécifique démarrée à partir d un titre supérieur au 1/32 (50% des patientes) Fœtus KEL1 + Fœtus KEL1 - Incompatibilité fœtomaternelle exemption de légitime surveillance surveillance lourde Besoins: - certitude des positifs - certitude des négatifs - diagnostic précoce

24 DIAGNOSTIC ET SUIVI BIOLOGIQUE EN PRATIQUE

25 Détection ANTICORPS DANS LES CAS D ANEMIE FŒTALE SEVERE GR test enzymatique Pièges Anti-D (RH1) Anti-c (RH4) Anti-Kell (KEL1) 1 er trimestre. parfois limite de détection Détection facilité Confusion anti-d passif Réactivation fréquente Tjs au 1 er trimestre Détection très facilité Titre en TIA souvent faible non prédictif d une atteinte sévère Tjs au 1 er trimestre Titre en TIA d emblée très élevé Aucun intérêt Agglutination parfois faible Grande variabilité du titrage interlaboratoire

26 DIAGNOSTIC-SUIVI BIOLOGIQUE Schéma de Titrage- Dosage Dosage / Titrage de référence Dosage pondéral Réactivat Fréquence dosages Anti-RH1 Anti-RH4 Anti-Kell Anti-RH3 Autres + sur GR natifs + sur GR natifs + sur GR natifs NON 1/8 1/4 NON 1/8 NON Fréquente ts trim Fréquente ts trim Rare 3 ème trim 2 sem 2 à 4 sem Tous les mois Rare 3 ème trim 6 è, 7 è et 8 è mois sauf public RH2 RH5 Rare 3 ème trim 3 è et 8 è mois Taux critiques 250 UCHP 500 UCHP titre 1/4 1/ UCHP titre 1/8

27 Dépistage et surveillance des incompatibilités foetomaternelles au cours de la grossesse RAI positive Identification Anti-RH1, anti-rh4, anti-rh3, Anti-KEL1 Anti-FY1, FY2, Anti-JK1, Anti-JK2, Anti-MNS3, Anti- MNS4, Anti-MNS1, Anti-RH2 Anti-LE1, LE2, Anti-P1, Anti-H, Anti-HI, autoanticorps froid, auto- papaïne Risque d anémie fœtale sévère in utéro Risque de maladie hémolytique postnatale Pas de risque de maladie hémolytique 1- Phénotyper procréateur Si phéno-incompatible : 2- Génotypage fœtal 3-Titrage et dosage pondéral toutes les 2 à 3 semaines 1- Phénotyper procréateur Si phéno-incompatible : 2-Titrage et dosage pondéral à 3 et 8 mois Pas d examen complémentaire

28 Grossesse avec allo-immunisation anti-rh1 Schéma de prise en charge RAI positive au premier trimestre Identification = Anti-RH1 Génotypage RHDfœtal sur sang maternel à partir de 12 SA Titrage ET Dosage Si fœtus RHDnégatif sur 2 prélèvements Surveillance levée Si fœtus RHD positif Anti-RH1 < 1 µg/ml (250 UCHP/ml) Anti-RH1 > 1 µg/ml - Surveillance échographique standard -Dosage + titrage anti-rh1 tous les 15 jours à partir de 18 SA -Surveillance hebdomadairedès 18 SA écho + vélocimétrie doppler -Dosage + titrage anti-rh1 tous les 15 jours à partir de 18 SA

29 Grossesse avec allo-immunisation anti-kel1 Schéma de prise en charge RAI positive au premier trimestre Identification = Anti-KEL1 Génotypage KEL fœtal sur sang maternel à partir de 13 SA Titrage Si fœtus KEL1 négatif sur 2 prélèvements Si fœtus KEL1 positif sur 2 prélèvements Surveillance levée Anti-KEL1<1/32 Anti-KEL 1/32 - Surveillance échographique standard -Titrage anti-kel1 tous les mois à partir de 18 SA -Surveillance hebdomadairedès 18 SA écho + vélocimétrie doppler -Titrage anti-kel1 tous les mois à partir de 18 SA

30 CAS CLINIQUES PROBLEME DE SUIVI DES PATIENTES RH:-1

31 Mme L. RH1 négatif, 2 ème geste Un accouchement à terme 8 ans auparavant. A reçu sa prophylaxie rhésus du post-partum 8 SA: Première RAI dans un laboratoire privé RAI positive laboratoire centralisateur: identification anti-rh1 et titrage au CNRHP biologique:titrage <1/2; microtitrage: 6 ng/ml «femme faiblement immunisée en début de grossesse; prévoir un génotypagerhd du fœtus non invasif pour confirmer incompatibilité; titrage et dosage pondéral tous les 3 semaines au CNRHP» 15 SA: génotypage RHD fœtal sur plasma maternel «fœtus RHD positif; Grossesse en situation incompatible ; titrage et dosage /15 jours» 27 SA: anti-rh1 titrant au 1/16 et dosé à 0,4µg/ml «activation de l immunisation sans risque actuel d anémie fœtale; titrage et dosage/15j» 29 SA: anti-rh1 titrant à 1/32 et dosé à 1µg/ml «Immunisation anti-rh1 s aggravant à risque d anémie fœtale: suivi obstétrical spécialisé hebdomadaire et biologique spécialisée tous les 15 jours» Contact direct avec l obstétricien et orientation vers un centre de compétence (vélocimétrie doppler et transfusion fœtale)

32 Mme L. RH1 négatif, 2 ème geste 37 SA:consultation hebdomadaire systématique anomalies du RCF accélération de la vitesse cérébrale Extraction par césarienne en urgence 40 d un petit garçon 30 Bonne adaptation mais pâle et jaune 20 avec hépatosplénomégalie; Au cordon: Bili: 84 µmoles/l ; Hb: 9 g/dl avec réticulocytes/mm3 PSC (cm/s) âge gestationnel (SA) Transfusion CGR à J0 et photothérapie intensive

33 Mme M. RH1 négatif, 3 ème geste Une grossesse 14 ans auparavant, et une fausse couche 7 SA: RAI négatives mais métrorragies injection Rhophylac SA: métrorragies RAI + injection N 2 de Rhophylac 200 RAI positives CNRHP: identification anti-rh1 et microtitrage :6-12ng/ml; µtitrage compatible avec l injection à 7 SA 13 SA et 18 SA: RAI positives EFS X: anti-rh1 «résiduel» 25 SA: RAI positives Laboratoire centralisateur: anti-rh1 identifié de titre <1 : «anti-rh1 passif résiduel»

34 Mme M. RH1 négatif, 3 ème geste 32 SA: Consultation à la maternité pour «Cholestase gravidique» Anomalies du RCF sur J1 Anasarque sur J1 avec accélération des vitesses cérébrales Extraction en urgence Deux jumelles anémiques et ictèriques avec mauvaise adaptation et détresse respiratoire J1 Hb:2,9g/dl et bili:100µmoles/l TNN+EST J2 Hb:7,9g/dl et bili:120 µmoles/l EST

35 ECHEC DE LA PRISE EN CHARGE D UNE FEMME ENCEINTE IMMUNISEE Obstétricien n avait aucun moyen de mettre en doute le résultat donné par le laboratoire, pas de connaissance sur : techniques à réaliser sensibilité des techniques transmission des examens à laboratoire de référence RAI positive dans un contexte d injection d IgRHD Erreur d interprétation : anti-dfaussement étiqueté comme passif résiduel Seul le dosage des anti-rh1 permet de se prononcer ROLE DU BIOLOGISTE EST ESSENTIEL INTERET DU MICROTITRAGE

36 CAS CLINIQUES PROBLEME DE SUIVI DES PATIENTES RH:1

37 Mme A. RH1 positif DDG: fin juin 2013 Pas de RAI au 1 er trimestre 37 SA ½ : 12/03/14 RAI positive, identification d un Anti-RH4 (Labo CH) 1 er titrage/dosage envoyé au CNRHP Titrage: saline 1/16 TCI 1/32 Dosage pondéral: 2 temps : 8360 UCHP/ml 1 temps : 2680 UCHP/ml Alerte le 18/03/14 par le CNRHP biologique 17H00 Césarienne en urgence le 18/03/14 A Mailloux,, CNRHP, Hôpital St Antoine Région Ile de France

38 Naissance en urgence sans information pédiatrique ni anticipation transfusionnelle d un enfant avec une anémie hémolytique sévère 3100g Groupe: O DCcee Kell neg TCD 4+ (QI pour l élution avant la transfusion) Au cordon: bilirubine totale 69 µmol/l, Hb 5,5g/dL - -J0 Transfusion ( 14,5 g/dl) - J0 Photothérapie intensive dès H6 -J1 Perfusion d albumine -J2 IgIV pour éviter EST -J3 Photothérapie en discontinu Immunisation connue en 2007 anti-rh4 Dosage pondéral : 2 temps : 60 1 temps : <40

39 Mme G. RH1 positif DDG:enaoût2013 Pas de RAI pendant la grossesse 35SAfinmars2014:MFIU RAI positive: identification d un anti-rh4 + anti-rh3(efs X) 31/03/14: prélèvement envoyé au CNRHP: Titrages: Anti-RH4: saline <1/2 TCI 1/128 Anti-RH3: saline <1/2 TCI <1/2 Dosage pondéral: 2 temps: 8720 UCHP/ml 1temps:5175UCHP/ml MAIS anti-rh4 connu en /07/14 Foetopathologie : anémie profonde + erythroblastose très importante. Anti-RH4 à l origine de la MFIU Région Limousin

40 Réception des sérothèques de Toxoplasmose pour dosages pondéraux rétrospectifs: 7prélèvements 22 SA Début de réactivation non vue avec le titrage Date Titre saline Titre TCI 2 temps 1 temps 21/08/13 <1/2 <1/2 40 <40 24/09/13 <1/2 <1/2 40 <40 22/10/13 <1/2 <1/2 <40 <40 21/11/13 <1/2 <1/2 40 <40 27/12/13 <1/2 <1/2 85 <40 30/01/14 <1/2 <1/ /03/14 <1/2 1/

41 DDG: mi-octobre 2012 Mme M. RH1 positif 28 SA: RAI positives 24/04/13 laboratoire privé Laboratoire centralisateur Identification: anti- RH4, Titrage <1/1 Pas de dosage pondéral : «Quantité insuffisante pour transmettre le prélèvement au CHP pour dosage pondéral. Prévoir 10mL de sang total et 5mL de sérum lors du prochain prélèvement.» paragraphe sur la dangerosité de l anti-rh4 dans un contexte de grossesse et les recommandations de suivi. AUCUN AUTRE PRELEVEMENT 37 SA : 09/07/13 (Clinique) extraction en urgence pour souffrance fœtale d un garçon Groupe: ADCceeKellneg TCD 4+ élution positive anti-rh4

42 Mauvaise adaptation initiale transfert Hôpital X Anémie à 5g/dL et détresse respiratoire sévère transfert en réanimation dans nouvel Hôpital Y J0:TransfusionenurgencevitaleimmédiateenORhDnegcar la mèren apaslemêmenomquel enfantetabsencedenotion de RAI chez la mère. RAI de l accouchement du 09/07/13: anti-rh4 identifié à l EFS X prévient l HôpitalYmaisla1 ère transfusionadéjàeulieu. 11/07/13: 1 er prélèvementcnrhp:anti-c(rh4) Anti-RH4: Titrage 1/16 Dosagepondéral:2temps:1650UCHP/ml 1temps:1000UCHP/ml Absence de surveillance adaptée d une immunisation anti-rh4. Retard à la prise en charge adaptée à la maladie hémolytique. Absence de connaissance de cette femme au niveau des EFS régionaux délivrant les produits : conséquences transfusionnelles pour l enfant.

43 SUVI IMMUNO-HEMATOLOGIQUE DE LA FEMME ENCEINTE Diagnostic des IFM : purement biologique Pathologie rare dépistable si respect du calendrier des RAI Diagnostic biologique spécialisée : Existence d un Centre de Référenceavec une biologie et une clinique périnatale de référence -Biologie donne l alertepour le déclenchement d un suivi spécifique -Interactions étroitesentre biologiste / biologiste de référence / clinicien