ANÉMIE INFECTIEUSE DES ÉQUIDES

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1 CHAPITRE ANÉMIE INFECTIEUSE DES ÉQUIDES RÉSUMÉ L anémie infectieuse des Equidés (AIE) est due à un lentivirus. Elle peut être diagnostiquée sur la base des signes cliniques, des lésions et de la sérologie. Les chevaux infectés demeurent porteurs du virus pendant toute leur vie et fournissent une réponse sérologique positive. Habituellement, les anticorps demeurent présents et les animaux à réponse positive, de plus de 6 mois, sont des porteurs de virus (chez les animaux plus jeunes, une réponse sérologique positive peut être due à des anticorps d origine maternelle). Ils sont potentiellement capables de transmettre le virus à d autres chevaux. Identification de l agent pathogène : à partir d un cheval, le virus peut être isolé par inoculation de sang suspect à un cheval indemne ou à une culture de leucocytes préparée à partir d un cheval indemne. La reconnaissance de l infection chez des chevaux ayant reçu une inoculation expérimentale peut être faite sur la base des signes cliniques, des modifications hématologiques et d une réponse sérologique positive à l épreuve d immunodiffusion en gélose (IDG) ou au dosage immuno-enzymatique (ELISA). L isolement du virus en culture de leucocytes de cheval peut être confirmée par la mise en évidence d antigène spécifique de l AIE par immunofluorescence, par réaction d amplification en chaîne par polymérase (PCR), par essai de transcriptase inverse ou par inoculation du liquide de culture à des chevaux indemnes. La mise en évidence du virus est rarement faite à cause du temps nécessaire, des difficultés et du coût. Épreuves sérologiques : les épreuves d IDG et ELISA sont simples et fiables pour l identification de l infection par le virus de l AIE. Une réponse sérologique positive en ELISA doit être confirmée par l épreuve d IDG. L antigène précipitant peut être préparé à partir de cultures tissulaires infectées ou en utilisant de l ADN recombinant. Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : aucun produit biologique n est actuellement disponible. A. INTRODUCTION L anémie infectieuse des Equidés (AIE) sévit dans le monde entier. L infection est limitée aux équidés. La maladie est caractérisée par des crises fébriles récurrentes, une thrombocytopénie, de l anémie, une perte rapide de poids et un œdème des parties déclives ; elle a tendance à devenir inapparente si la mort ne résulte pas d une crise. La période d incubation est normalement de 1 à 3 semaines, mais peut atteindre 3 mois. Dans les cas aigus, les nœuds lymphatiques, la rate et le foie sont congestionnés et hypertrophiés. L hypertrophie de la rate peut être perçue par exploration rectale. A l examen microscopique, ces organes sont infiltrés par des groupes de lymphocytes immatures et de plasmocytes. Dans le foie, les cellules de Kupffer contiennent des hématies ou de l hémosidérine. Le sang d un cheval infecté par le virus de l AIE demeure infectieux pendant toute sa vie. Ceci signifie que le cheval est porteur virémique et peut en principe transmettre l infection à d autres chevaux (4). La transmission se fait par transfert de sang à partir d un cheval infecté. Dans les conditions naturelles, elle se fait, le plus souvent, à l occasion de repas sanguin interrompu de Tabanidés sur un cheval cliniquement atteint, poursuivi sur un cheval indemne, ou par l intermédiaire d aiguilles souillées. Le titre de la virémie est beaucoup plus élevé chez les chevaux cliniquement atteints et, par suite, le risque de transmission est beaucoup plus important à partir de ces animaux qu à partir des porteurs de virus en état d infection latente dont le titre virémique est plus faible. L infection du fœtus in utero peut également survenir (8). 754 Manuel terrestre de l OIE 2005

2 B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC Les épreuves d immunodiffusion en gélose (IDG) (7) et immuno-enzymatiques (ELISA) (15) sont fiables pour l identification de l AIE chez les chevaux, sauf au début de l infection d un animal et chez les poulains nés de mère infectée. Dans de rares autres circonstances, une réponse faussement négative peut survenir, par exemple lorsque le titre de la virémie au cours d une crise est suffisant pour se combiner aux anticorps circulants ou lorsque le titre des anticorps demeure insuffisant pour être détecté pendant une longue période (16). L ELISA permet de détecter des titres en anticorps plus faibles que l IDG et fournit un résultat positif plus précocement, mais tout résultat positif en ELISA doit être confirmé par IDG, à cause de résultats faussement positifs qui sont parfois rencontrés avec l ELISA. L IDG a également l avantage de permettre la distinction entre les lignes de précipité spécifique d AIE et celles d autres antigènes. Le virus de l AIE est un lentivirus, une sous famille des Retroviridae qui comprend également les virus visna-maedi, de l arthrite encéphalite caprine, de l immunodéficience bovine et de l immunodéficience humaine. La comparaison des séquences des acides nucléiques a montré l existence d une grande analogie entre ces virus. 1. Identification de l agent pathogène L isolement du virus n est habituellement pas nécessaire pour faire le diagnostic. L isolement du virus à partir d un cheval suspect peut se faire par inoculation du sang à des cultures de leucocytes préparées à partir de chevaux indemnes. La présence du virus en culture peut être confirmée par détection de l antigène AIE par ELISA (14), par immunofluorescence (18) ou par inoculation à des chevaux indemnes. L isolement viral est rarement employé à cause des difficultés d obtention de cultures de leucocytes équins. Un dosage par une réaction d amplification en chaîne par polymérase (PCR) nichée pour détecter le pro virus de l AIE dans le sang périphérique de chevaux a été décrit (12). Lorsque le statut infectieux d un cheval ne peut pas être déterminé clairement, on peut avoir recours à l inoculation du sang de l animal suspect à un cheval indemne. Dans ce cas, on utilise un cheval fournissant une réponse sérologique négative et après l injection, on suit son statut sérologique et son état clinique pendant au moins 45 jours. Habituellement, 1 à 25 ml de sang injectés immédiatement par voie veineuse sont suffisants pour révéler l infection, mais dans de rares cas il peut être nécessaire d utiliser un volume supérieur de sang (250 ml) ou de leucocytes lavés provenant d un tel volume (5). 2. Épreuves sérologiques En raison de la persistance du virus de l AIE chez les équidés infectés, une réponse sérologique positive confirme l infection d un sujet par le virus de l AIE. a) Épreuve d immunodiffusion en gélose (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) Lors d infection par le virus de l AIE, des anticorps précipitants sont rapidement produits et peuvent être détectés par l épreuve d IDG. Une réaction spécifique est attestée par la formation d une ligne de précipité entre l antigène AIE et le sérum testé et elle est confirmée par son identité avec la ligne de précipité apparaissant entre l antigène et le sérum positif de référence. Au cours des 2 à 3 semaines suivant l infection, les chevaux fournissent habituellement une réponse sérologique négative. Dans de rares cas, le délai d apparition des anticorps après l infection peut aller jusqu à 60 jours. Plusieurs compagnies fournissent les réactifs pour l épreuve d IDG. Par ailleurs, l antigène pour IDG et le sérum de référence peuvent être préparés comme décrit ci-dessous. Préparation de l antigène L antigène spécifique de l AIE peut être préparé à partir de la rate d un cheval infecté de façon aiguë (6), de culture cellulaire équine infectée (10), d une lignée cellulaire de thymus canin infectée de façon persistante (3) ou des protéines exprimées par des bactéries ou des baculovirus en utilisant la technique de l ADN recombinant (2, 9). La préparation à partir de cultures infectées ou par une technique d ADN recombinant donne un résultat plus régulier que les rates infectées et permet une meilleure standardisation des réactifs. Pour obtenir un antigène satisfaisant à partir de la rate, un cheval doit être infecté avec une souche très virulente du virus de l AIE La période d incubation doit être de 5 à 7 jours et la rate doit être prélevée au 9 e jour, quand le titre viral est maximal et avant l apparition des anticorps précipitants. La pulpe splénique Manuel terrestre de l OIE

3 non diluée est utilisée comme antigène (6). L extraction d antigène à partir de la rate avec une solution saline et la concentration avec du sulfate d ammonium ne fournissent pas un antigène aussi bon que la sélection d une rate ayant un très haut titre en antigène AIE Autrement, on peut infecter des cellules rénales de fœtus de cheval, des cellules dermiques ou des cellules de thymus de chien avec une souche de virus de l AIE adaptée à la culture cellulaire (American Type Culture Collection). Le virus est récolté des cellules par précipitation avec une solution de 8 p. cent de polyéthylène glycol ou par ultracentrifugation. L antigène de diagnostic, p26, est récupéré du virus par traitement avec un détergent ou l éther (10). Les protéines virales de l AIE exprimées par des bactéries ou un baculovirus sont disponibles dans le commerce et sont utilisables comme antigène de grande qualité pour le diagnostic sérologique. La p26 est une protéine structurale interne du virus codée par le gène gag. Au sein des souches de virus de l AIE, la p26 est plus stable que les glycoprotéines gp45 et gp90 (11). On a décrit des variations mineures dans la séquence des acides aminés de p26 en fonction de la souche ; cependant, ceci ne gène pas les épreuves de diagnostic (19). Préparation du sérum positif de référence Un sérum positif peut être récolté chez un cheval infecté par le virus de l AIE Ce sérum doit fournir une ligne dense de précipité spécifique de l AIE, comme le démontre une réaction d identité avec un sérum de référence connu. Il est important d équilibrer les concentrations de l antigène et de l anticorps afin d obtenir une sensibilité optimale de l épreuve. Ces concentrations doivent être ajustées de façon à obtenir une ligne étroite de précipité située approximativement à égale distance des puits contenant l antigène et le sérum. Protocole (1, 6, 13) i) Les réactions d immunodiffusion sont effectuées dans de la gélose en boîtes de Petri. Pour des boîtes de Petri de 100 mm de diamètre, on utilise 15 à 17 ml de gélose Noble à 1 %. Six puits de même diamètre sont creusés dans la couche de gélose, 1 central et 6 périphériques. Les puits ont 5,3 mm de diamètre et sont distants de 2,4 mm. Chaque puits doit contenir le même volume de réactif. ii) iii) iv) L antigène est placé dans le puits central et le sérum positif de référence en alternance dans les puits périphériques. Les sérums à tester sont placés dans les 3 puits restants. Les boîtes sont conservées à température du laboratoire en atmosphère humide. Après 24 à 48 h, les réactions de précipitation sont examinées à l aide d un éclairage donnant un faisceau étroit de lumière intense oblique, sur un fond noir. Les lignes de précipité de référence doivent être clairement visibles à 24 h, et à ce moment tout sérum fortement positif peut également avoir produit une ligne de précipité montrant une réaction d identité avec celle située devant les réactifs de référence. Une réaction faiblement positive peut demander 48 h pour être visible et ne se traduit que par une légère inflexion de la ligne de précipité de référence du puits voisin. Un sérum contenant beaucoup d anticorps précipitants peut former une ligne large et floue. Une telle réaction peut être confirmée comme spécifique de l AIE en retestant le sérum après dilution au 1/2 et au 1/4 ; ces dilutions donnent une ligne de précipité mieux visible dans la réaction d identité. Les sérums dépourvus d anticorps de l AIE ne forment pas de ligne de précipité et n ont pas d effet sur les lignes de précipité de référence des puits voisins. v) Interprétation des résultats. Des chevaux en début d infection peuvent fournir une réponse négative à l épreuve d IDG. Le sérum de tels animaux devra être testé de nouveau 3 à 4 semaines plus tard. Pour effectuer un diagnostic chez un poulain, il est nécessaire de déterminer le statut sérologique de sa mère. Si la mère transmet des anticorps de l AIE à son poulain par le colostrum, une période de 6 mois après la naissance, voire davantage, peut être nécessaire pour l élimination des anticorps maternels. Un contrôle sérologique mensuel du poulain peut être utile pour constater une diminution des anticorps maternels. Pour conclure que le poulain n est pas infecté, il faut obtenir un résultat négatif (après la réponse positive initiale) au moins 2 mois après la séparation du poulain d avec sa mère infectée ou de tout autre cheval infecté. b) Épreuve immuno-enzymatique Trois ELISA ont été agréés par le Département de l agriculture des États-Unis d Amérique pour le diagnostic de l AIE et sont disponibles au plan international : un ELISA de compétition et 2 autres ELISA (sans compétition). L ELISA de compétition et un autre ELISA détectent les anticorps produits par la protéine p26. Le troisième ELISA utilise à la fois l antigène p26 et l antigène gp45 (protéine virale transmembranaire). Les protocoles classiques ELISA sont utilisés pour ces 3 tests. Lorsque le matériel ELISA commercial n est pas disponible, on peut utiliser de l antigène p26 provenant de culture cellulaire (14). 756 Manuel terrestre de l OIE 2005

4 Tout sérum ayant fourni une réponse ELISA positive doit être étudié par IDG afin de confirmer le diagnostic, car quelques réponses faussement positives ont été obtenues en ELISA. Le résultat positif peut également être confirmé par immunoblot. Un sérum étalon international, qui contient la quantité minimale d anticorps devant être détectée par les laboratoires, est disponible auprès de Laboratoires de référence de l OIE (se reporter à la liste dans la partie 3 de ce Manuel terrestre). Des méthodes uniformes de lutte contre l AIE ont été publiées (17). C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE Aucun produit biologique n est actuellement disponible pour l AIE. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. ASSOCIATION FRANÇAISE DE NORMALISATION (AFNOR) (2000). Animal Health Analysis Methods. Detection of Antibodies against Equine Infectious Anaemia by the Agar Gel Immunodiffusion Test. NF U AFNOR, 11 avenue Francis de Pressensé, Saint-Denis La Plaine Cedex, France. 2. ARCHAMBAULT D., WANG Z., LACAL J.C., GAZIT A., YANIV A., DAHLBERG J.E. & TRONICK S.R. (1989). Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for equine infectious anaemia virus detection using recombinant Pr55gag. J. Clin. Microbiol., 27, BOUILLANT A.M.P., NELSON K., RUCKERBAUER C.M., SAMAGH B.S. & HARE W.C.D. (1986). The persistent infection of a canine thymus cell line by equine infectious anaemia virus and preliminary data on the production of viral antigens. J. Virol. Methods, 13, CHEEVERS W.M. & MCGUIRE T.C. (1985). Equine infectious anaemia virus; immunopathogenesis and persistence. Rev. Infect. Dis., 7, COGGINS L. & KEMEN M.J. (1976). Inapparent carriers of equine infectious anaemia (EIA) virus. In: Proceedings of the IVth International Conference on Equine Infectious Diseases. University of Kentucky, Lexington, Kentucky, USA, COGGINS L., NORCROSS N.L. & KEMEN M.J. (1973). The technique and application of the immunodiffusion test for equine infectious anaemia. Equine Infect. Dis., III, COGGINS L., NORCROSS N.L. & NUSBAUM S.R. (1972). Diagnosis of equine infectious anaemia by immunodiffusion test. Am. J. Vet. Res., 33, KEMEN M.J. & COGGINS L. (1972). Equine infectious anaemia: transmission from infected mares to foals. J. Am. Vet. Med. Assoc., 161, KONG X. K., PANG H., SUGIURA T., SENTSUI H., ONODERA T., MATSUMOTO Y. & AKASHI H. (1997). Application of equine infectious anaemia virus core proteins produced in a Baculovirus expression system, to serological diagnosis. Microbiol. Immunol., 41, MALMQUIST W.A., BARNETT D. & BECVAR C.S. (1973). Production of equine infectious anaemia antigen in a persistently infected cell line. Arch. Gesamte Virusforsch., 42, MONTELARO R.C., PAREKH B., ORREGO A. & ISSEL C.J. (1984). Antigenic variation during persistent infection by equine infectious anaemia, a retrovirus. J. Biol. Chem., 16, NAGARAJAN M.M. & SIMARD C. (2001). Detection of horses infected naturally with equine infectious anemia virus by nested polymerase chain reaction. J. Virol. Methods, 94, PEARSON J.E. & COGGINS L. (1979). Protocol for the immunodiffusion (Coggins) test for equine infectious anaemia. Proc. Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians, 22, SHANE B.S., ISSEL C.J. & MONTELARO R.C. (1984). Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of equine infectious anemia virus p26 antigen and antibody. J. Clin. Microbiol., 19, Manuel terrestre de l OIE

5 15. SUZUKI T., UEDA S. & SAMEJINA T. (1982). Enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of equine infectious anaemia. Vet. Microbiol., 7, TOMA B. (1980). Réponse sérologique négative persistante chez une jument infectée. Rec. Med. Vet., 156, UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE ANIMAL AND PLANT HEALTH INSPECTION SERVICE (2002). Equine Infectious Anemia Uniform Methods and Rules WEILAND F., MATHEKA H.D. & BOHM H.O. (1982). Equine infectious anaemia: detection of antibodies using an immunofluorescence test. Res. Vet. Sci., 33, ZHANG W., AUYONG D.B., OAKS J.L. & MCGUIRE T.C. (1999). Natural variation of equine infectious anemia virus Gag-protein cytotoxic T lymphocyte epitopes. Virology, 261, * * * NB : Il existe plusieurs Laboratoires de référence de l OIE pour l anémie infectieuse des équidés (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre ou consulter le site internet de l OIE pour une liste actualisée : Manuel terrestre de l OIE 2005