HISTOLOGIE TOPOGRAPHIQUE On est capable grâce aux techniques vues dans les ED

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1 HISTOLOGIE TOPOGRAPHIQUE On est capable grâce aux techniques vues dans les ED HISTOLOGIE TOPOGRAPHIQUE MORPHOLOGIQUE (MO-MET) Utilisation du tétrachrome. Dans l adénohypophyse en relation avec la post hypophyse et dans l adénohypophyse on peut colorer les cellules grace à Orange B, Erythrosine, Bleu d aniline hématoxilline, Repérage des cellules somatotrope jaunes / orange, Les rouges (prolactine) et les cellules bleues (gonadotrope, tyréotropes et corticotropes). Au MET, visualisation des organites en dégradé de gris, en 2D On ne parle plus de coloration mais de contrastants. A la différence de la MO, les lipides sont maintenus dans l échantillon. ex. contrastants : tetraoxyde d osmium citrate de plomb, platine, acide phosphotungstique.

2 HISTOLOGIE ORIENTEE ou SPECIALE Permet de déterminer la nature des constituants du vivant. Désavantage : Perte de la topographie et morphologie intérieure des tissus Avantage : met en évidence des composants spécifiques. Ici : on voit la tyroïde 1 par immunofluorescence Un anticorps dirigé contre les cellules calcitonines les rèvèle sous l aspect d évènements fluorescents. 2 par immunocytochimie L anticorps n est cette fois pas greffé à un fluorochrome mais à une enzyme (peroxydase) et qui génère un précipité (trace noire) qui révèle elle aussi les cellules à calcitonine. ATTENTION : on a bien fixé les tissus pour les observer. Dans la plupart des cas on est capable de démasquer la fixation grâce à des solutions de démasquage (citrate de sodium à ph 6) Dans une certaine mesure le citrate de sodium à Ph6 va être incubé avec l échantillon va permettre de déponter le formaldéhyde pour permettre cette reconnaissance en immunofluorescence et immunocytochimie. Le démasquage est TRES difficile à obtenir en MET. Seulement en MO.

3 OUTILS DE L OBSERVATION DES TISSUS MICROSCOPIE OPTIQUE CLASSIQUE OU PHOTONIQUE : SONDE = PHOTON SONDE = Le PHOTON. Transmis à travers l échantillon pour permettre son observation. - absence de charge - masse non négligeable, - longueur d onde invariable (390 à 760 nm = gamme du spectre visible - Résolution max de 0,2 micromètres. On ne peut pas visualiser deux points distants de moins de 0,2 micromètres. 2 LENTILLES : Premier grandissement : lentille de l objectif Deuxième grandissement : lentille occulaire. Grossissement maximum 1500x. C est pourquoi on adapte ce microscope optique à différents types de microscopie. Un microscope a souvent plusieurs fonctions. = un microscope optique classique peut changer de mode.

4 MICROSCOPE OPTIQUE A CONTRASTE DE PHASES ET INTERFERENTIEL. Ajout de lentilles et de condenseurs spéciaux qui permettent de générer une réfringence, un contraste optique en fonction de la composition aqueuse de l échantillon. Ce microscope est très utilisé pour : - étudier les cellules vivantes en culture, - étudier la mobilité au sein d un échantillon (vitalité spz) - faire micromanipulations : faire se rencontrer un ovocyte et un spz grâce à un micro injecteur MICROSCOPE A FOND NOIR (TYNDALL) Effet tyndall : Utilisation de l effet de dispersion de la lumière incidente sur des particules de matière dont les dimensions sont comparables aux longueurs d onde associées à la sonde utilisée. Cet effet est visible dans les systèmes colloïdaux càd particules en suspension, solubilisation qui caractérisent le vivant. Mais également les émulsions. Il est affuté d un condenseur spécial qui permet d orienter la sonde de façon tangentielle par rapport à l échantillon. Cela fait apparaître des évènements lumineux sur fond noir Si l objet est caractérisé par une émulsion il paraît brillant sur fond noir. LE MICROSCOPE A LUMIERE POLARISEE = étude des structures pseudo cristallines à cristallines. Détection des structures anisotropes (particules minérales poussières, syllicates, étude de la minéralisation osseuse) Ces particules diffractent la lumière de part leur répartition extrêmement ordonnée dans le vivant. Exemple : disque A du sarcomères dans le muscle / les structures cristallines qui peuvent être détectées comme étant des particules en surcharges dans les cellules mais aussi les tissus. 2 FILTRES : Filtre polariseur entre la source et l objet Filtre analyseur croisé ou décroisé, après l objet, qui permet de sélectionner la raie (?) lumineuse qui a été polarisée. MICROSCOPE A ULTRAVIOLETS Utilise une partie du spectre où la longueur d onde est la plus courte (300 / 350 nm) Amélioration du pouvoir de résolution : 0,1 micromètre. Peu utilisé car coûteux, et nécessite lentilles et lentes spéciales, et en plus il engendre énormément de mutations au niveau des cellules et tissus observés donc peu utilisé pour des structures vivantes. Plutôt utilisé pour structures fixées, et encore, les structures fixées gênent le microscope à ultraviolets (artefacts)

5 MICROSCOPIE A FLUORESCENCE CONFOCALE Considère la totalité de l échantillon dans son épaisseur OU une tranche particulière de l échantillon dans le cas où elle est confocale. Basée sur la fluorescence qui est une propriété de certaines molécules qui soumises à un rayonnement de longueur d onde spécifique (lambda 1) réémettent un rayonnement secondaire (lambda 2) Ces rayonnements lambda 1 et 2 caractérisés par un spectre étroit dans la gamme des longueurs d onde. Plus la différence entre les deux rayonnements est grande et plus la spécificité d observation est grande. Bonne résolution à cause du contraste provoqué par le fond noir. La fluorescence confocale peut être associée à la microscopie photonique => Superposition des images où sont associées la réfringence et la fluorescence => Localisation d éléments des cellules. INTERET : => Par tranchage et confocalité on va pouvoir réassocier les images en 3D (observer l épaisseur) => On est capables de faire de la construction 3D pour localiser les protéines dans la cellule. Visualisation de fluorescence naturelle par exemple la vitamine A : On peut repérer sa localisation dans les tissus qui l utilisent. Y a aussi des fluorescences dépendantes de cations comme des protéines FURA 2 qui deviennent fluo quand elles sont additionnées avec le calcium. Visualisation de fluorescence générée après traitement chimique : amines biogènes (adrénaline noradrénaline sérotonine) => Localisation neurones, sécrétions neuroendocrines, au sein de l échantillon. Visualisation de fluorescences provoquées par l utilisation de marqueurs. => Rhodamine (rouge) => Fluorescéine (vert) + de 100 marqueurs => painting (au moins 4 fluorochromes) pour visualiser une topographie qui peut être dynamique. Permettre au vivant d exprimer une protéine fluorescente la GFP en adossant le gène de la GFP au gène d intérêt qui va coder pour notre protéine cible au sein de la cellule et permettre ainsi son expression associée et ainsi étudier sa localisation cellulaire, tissulaire, organique et systématique.

6 MICROSCOPIE ELECTRONIQUE : SONDE = ELECTRON. MICROSCOPE ELECTRONIQUE A TRANSMISSION Mis au point dans les années 30, par physiciens comme RUSKA (prix nobel) la microscopie électronique utilise l électron comme sonde, on utilise sa charge pour le faire accélérer, sa vitesse génère une longueur d onde associée beaucoup plus courte que celle obtenue grâce au photon. Un filament de tungstène chauffé délivre des électrons qui vont être condensés dans un fin faisceau au niveau du cylindre de Wehlnet. Ce cylindre de WEHLNET est associé à un générateur haute tension, avec une anode pour créer une DDP de l ordre de 20 à 120 kev qui vont permettre d attirer l électron et permettre de l accélerer entre cylindre, catode et anode. Le faisceau électronique va passer par des lentilles électromagnétiques dans un tube caractérisé par le fait qu il contient le moins possible de particules et dans lequel on a créé un vide très poussé (10-5 TORR grâce à des pompes. 1torr = 1mmHg = 133,32 Pa) La colonne qui protège le microscope électronique permet le maintien de ce vide poussé mais aussi protège l utilisateur des rayons X qui sont générés dans la colonne quand le faisceau rentre l échantillon. Grossissement jusqu à x (pour des DDP de 3000 kev pas plus) Préparation très importante pour blinder l échantillon de l intérieur et de l extérieur (voir ED) Le MET est encombrant, coûteux, la préparation est délicate => Etude des organites, les microfilaments, les virus

7 MICROSCOPE ELECTRONIQUE A BALAYAGE Utilisation de l interaction électron / matière Réémission de plusieurs types de particules (voir schéma) Ce sont ces différents types de particules réémises qui sont captées pour étudier la surface de l échantillon. Etude de certaines substances à l intérieur de la matière, grâce à la réémission de rayons X. Lorsque la surface est composée de molécules comme l arsenic ou le plomb, l étude du rayon X réémis permet d identifier les constituants dans le tissu, mais aussi de les quantifier. => Etude qualitative et quantitative. C est ce microscope qui est utilisé pour détecter des toxiques en médecine légale ou anthropologique (intoxications, meurtres...) C est comme ça qu on a su que Napoléon avait été empoisonné à l arsenic. Grossissement moins important = x Applications : Études de surfaces : différenciation cellulaire, forme cellulaire au sein d un tissu, microorganismes, Cryodécapage : observation de la structure tridimensionnelle d un échantillon de façon interne, dans une certaine mesure préparation délicate, on casse un tissu, on le métallise, et on étudie à l intérieur la répartition en 3D de l échantillon. Le type de préparation est beaucoup plus simple => Déssication : chauffage à haute T et sous vide précédant une métallisation de l échantillon pour le consolider (platine, or ) => Etude des structures 3D Les structures blanches = électrons largement rétrotransmis Les structures noires : électrons perdus au recaptage ;

8 MICROSCOPE A EFFET DE PROXIMITE OU A CHAMP PROCHE Pas de lentille, ni en verre ni électromagnétique Utilise une pointe qui tape une surface où repose l échantillon. La pointe est une catode qui balaye l échantillon en x et en y A l intérieur de cette catode on fait passer un courant qui sera relayé par la surface qui soutient l échantillon et qui est une anode. La pointe est microscopique : de l ordre de l atome, de l angström. Cette catode va tapoter l échantillon, et le courant qui va passer vers cette anode va subir une résistance du fait de l échantillon et permettra l analyse de la surface atomique de l échantillon par balayage de la pointe sur la surface. La DDP est maintenue constante, et l échantillon va être reconnu et enregistré sur l axe Z et permettre une cartographie de l échantillon sur le support. Applications : Limitées Etude moléculaire (macromolécules déjà isolées au préalable : exemple : conformation de l(hélice d ADN dans différentes solutions. Chimie biologique : étude d alliages utilisés pour les greffes (nanobiotechnologies) Gravures permettant de faire de la biocybernétique alliant les métaux et les cellules. On ne peut pas étudier l épaisseur d une cellule grâce à cette technique.