TECHNIQUE INSTRUMENTALE
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- Marie-Christine Gravel
- il y a 8 ans
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1 Jérôme WENGER 1*, Heykel AOUANI 1, Milena MILUTINOVIC 2, Frédérique DEISS 2, Patrick FERRAND 1, Neso SOJIC 2 et Hervé RIGNEAULT 1 Sonde à fibre optique pour la spectroscopie de corrélation de fluorescence : l analyse des dynamiques de fluorescence devient portable Miniaturisation RÉSUMÉ La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est une technique puissante et polyvalente pour l analyse biochimique. Elle permet notamment de déterminer différents paramètres comme les concentrations locales, les modes de diffusion, ou les cinétiques de réaction. Si sa mise en œuvre est à présent aisée en laboratoire, la forte sensibilité requise du niveau d une molécule fluorescente individuelle a jusqu à présent empêché le développement de la FCS comme outil d analyse in situ hors du laboratoire. Nous détaillons ici un dispositif combinant une fibre optique avec une microbille de verre, et montrons que ce montage étend l analyse FCS au domaine des capteurs à fibres. Ce dispositif constitue à notre connaissance le plus petit système d analyse FCS au monde, et le seul dispositif fibré permettant une sensibilité suffisante pour résoudre une molécule individuelle fluorescente. Cette avancée technique ouvre le domaine du diagnostic biomédical comme le domaine environnemental aux techniques d analyses in situ de molécules fluorescentes individuelles, in vitro ou in vivo. MOTS-CLÉS Spectroscopie de corrélation de fluorescence FCS, capteur à fibre optique, fluorescence, optique intégrée Optical fi ber probe for fl uorescence correlation spectroscopy : the dynamic analysis of fl uorescence goes out of the lab SUMMARY Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a versatile method that would greatly benefi t to remote opticalfi ber fl uorescence sensors. However, the current state-of-the-art struggles with low detection sensitivities that prevent the extension of fi ber-based FCS down to the single-molecule level. Here we describe a novel probe based on an optical fi ber combined with a dielectric microsphere to perform FCS analysis down to the single fl uorescent molecule level. This offers new opportunities for reducing the bulky microscope setup and extends FCS to remote or in vivo applications. KEYWORDS Fluorescence correlation spectroscopy FCS, optical fi ber sensors, fl uorescence, integrated optics I- Introduction : la spectroscopie de corrélation de fluorescence Dans toute mesure, on souhaite obtenir le maximum d informations utiles en un minimum de temps. Or, bien souvent, les mesures se focalisent sur la valeur moyenne du signal, passant sous silence les fluctuations dynamiques. Bien sûr, mesurer la valeur moyenne est nécessaire, mais il serait dommage d en oublier pour autant toute la richesse d informations présente dans les évolutions dynamiques. Ceci est particulièrement vrai pour la spectroscopie de fluorescence, qui est devenue une technique essentielle pour l analyse biochimique grâce à sa forte efficacité optique et à sa grande librairie de sondes différentes. En mesurant seulement l intensité moyenne de fluorescence, on obtient certes une information sur la concentration globale en émetteurs et sur leur brillance, mais on perd la capacité de suivre des réactions plus fines intervenant à l échelle moléculaire. La spectroscopie de corrélation de fluorescence, ou FCS (fluorescence correlation spectroscopy), 1 Institut Fresnel, CNRS, Université Aix-Marseille, Domaine Universitaire de St Jérôme, Marseille Cedex 20, France 2 Institut des Sciences Moléculaires, Université Bordeaux 1, ENSCPB, CNRS, 16 Avenue Pey-Berland, Pessac, France * jerome.wenger@fresnel.fr, Web : 43
2 permet de répondre à cette question en effectuant une analyse directe des évolutions temporelles du signal de fluorescence (1-3). Cette technique, qui est développée depuis le milieu des années 1970, repose sur le calcul des corrélations temporelles de l intensité de fluorescence. La Figure 1 illustre le principe général de fonctionnement de la FCS. L intensité de fluorescence provenant d un volume d analyse limité est mesurée au cours du temps. Du fait par exemple de la diffusion de molécules dans et hors de ce volume, l intensité de fluorescence détectée fluctue naturellement au cours du temps. L analyse FCS porte sur le calcul de la fonction mathématique de corrélation temporelle de l intensité de fluorescence détectée. Aux temps courts (inférieurs à une dizaine de microsecondes), cette fonction de corrélation permet d avoir accès aux paramètres photophysiques des émetteurs ainsi qu au nombre moyen de molécules détectées. Aux temps longs (supérieurs à quelques dizaines de microsecondes), elle renseigne Figure 1 Schéma de principe de la spectroscopie par corrélation de fluorescence. Les mouvements de diffusion spatiale (Brownienne ou non) de molécules fluorescentes dans le volume d analyse indiqué en pointillés (a) induisent des fluctuations temporelles dans l intensité de fluorescence détectée (b). La FCS analyse ces fluctuations en calculant la fonction mathématique de corrélation temporelle de l intensité de fluorescence (c). L encart (d) indique les principaux domaines d application de la corrélation de fluorescence. L amplitude de la courbe de FCS est inversement proportionnelle au nombre N d émetteurs analysés. L analyse de l évolution temporelle de la courbe de corrélation renseigne sur le temps de diffusion td des émetteurs au travers du volume d analyse. sur le temps de séjour moyen (temps de diffusion) des molécules et sur leur mode de diffusion au travers du volume d analyse. Pour les lecteurs plus familiers de l analyse dynamique de diffusion laser DLS (dynamic light scattering), on peut dire que la FCS est l analogue de la DLS pour la fluorescence. Elle permet généralement un meilleur rapport signal-à-bruit, et peut atteindre la résolution d une molécule individuelle fluorescente sans que celle-ci soit nécessairement purifiée du reste. II- Les défis de la FCS portable Le paramètre essentiel en FCS est l amplitude des fluctuations de fluorescence, et non plus seulement l intensité moyenne détectée. Des corrélations non-nulles en FCS seront présentes seulement si une fraction du signal provient du même émetteur, l émission de deux émetteurs indépendants ne présentant pas de corrélations. Il faut donc que le dispositif de FCS soit à même d atteindre une sensibilité suffisante pour résoudre le signal d un émetteur individuel avec un bon rapport signalà-bruit (l émetteur pouvant correspondre soit à une molécule fluorescente individuelle, soit à un agrégat de molécules fluorescentes, soit à une microparticule portant un marquage fluorescent). Ainsi, les systèmes commerciaux de FCS reposent sur des montages de microscopes confocaux équipés de photodiodes à avalanche de forte sensibilité. En particulier, pour assurer la détection de molécules fluorescentes individuelles, les systèmes existants utilisent des objectifs de microscope de forte ouverture numérique, valant typiquement autour de Des systèmes complets de FCS sont proposés par les principaux constructeurs de microscopes optiques, avec des prix autour de 200 k. Ces systèmes sont donc complexes, chers et encombrants, et il n est pas possible en l état de l art de transporter la FCS hors du laboratoire. Des systèmes de spectroscopie utilisant des cuvettes sont également disponibles, dont le coût est sensiblement réduit puisqu ils économisent l emploi d un microscope. Cependant, leur mode de fonctionnement est identique, et nécessite un objectif complexe de forte ouverture numérique pour fournir une sensibilité suffisante pour la FCS. Pour proposer des systèmes de FCS compacts et permettant un fonctionnement en mode endoscopie, il faut introduire une fibre optique allant vers l échantillon. Or, les fibres optiques conventionnelles ne permettent pas d atteindre une sensibilité suffisante pour détecter des molécules individuelles. L efficacité de couplage de la fluorescence dans la fibre est bien trop faible pour garantir un signal FCS viable. Pour améliorer ce couplage dans la fibre, on peut imaginer utiliser une lentille en sortie de fibre. Cependant, l ouverture numérique limitée de ces lentilles (typiquement en-dessous de 0,5) ne suffit pas pour atteindre une efficacité de collection suffisante de la fluorescence. 44
3 Technique instrumentale Sonde à fibre optique pour la spectroscopie de corrélation de fluorescence : l analyse des dynamiques de fluorescence devient portable III- Une fibre optique microstructurée pour remplacer le microscope Notre équipe vient de démontrer qu il est possible de détecter des molécules fluorescentes individuelles en sortie d une fibre optique modifiée (4). Ce système original comporte à l extrémité de la fibre optique une microbille de verre qui agit comme un minuscule objectif de microscope pour concentrer la lumière. L ensemble microbille et fibre est également utilisé pour collecter le signal de fluorescence émis par les molécules. De cette façon, l encombrant microscope est remplacé par une sonde de mesure fibrée, le reste de l appareillage étant miniaturisé, comme le représente la Figure 2. Cette invention repose sur le principe physique de «nanojet photonique», qui est le nom donné au faisceau lumineux émergeant d une microbille (5). La microbille agit comme une lentille pour focaliser la lumière ; le phénomène intéressant est que cette focalisation est très particulière : la tache de focalisation est à la limite de diffraction (diamètre de la demi longueur d onde) et s étend sur une distance optique de plusieurs longueurs d onde, comme on peut le voir sur les modélisations présentées dans la Figure 3. Cette focalisation particulièrement efficace de la lumière est utilisée ici pour concentrer la lumière d excitation laser et également pour collecter l émission de fluorescence. La procédure de fabrication de l interface microstructurée est très simple. Elle repose sur une attaque chimique d une face de la fibre optique : le cœur de la fibre est davantage attaqué que la gaine, ce qui résulte dans la formation d une micro-cuvette. Cette cuvette servira de réceptacle pour une microbille de verre déposée par simple dispersion de microbilles dans une solution acqueuse. L alignement avec la microbille est particulièrement aisé du fait du centrage obtenu lors de l auto-assemblage de fabrication. De manière surprenante, l adhésion de la microbille dans le puits formé par la fibre optique est très efficace. Aucune préparation ou greffage chimique n est nécessaire, et une excellente tenue au temps a été vérifiée. IV- Le premier endoscope portable pour observer des molécules uniques Nous avons mis en œuvre le dispositif schématisé en Figure 2, et caractérisé la fluorescence de molécules d Alexa Fluor 647 diffusant librement en solution aqueuse. La Figure 4 présente une fonction de corrélation FCS typique, mesurée sur une solution concentrée à 200 nm. L analyse FCS indique que 530 molécules sont détectées, avec un temps de diffusion moyen de 114 µs et un signal de fluorescence par molécule de coups par Figure 2 Schéma de principe du dispositif fibré pour la FCS. Le laser d excitation et la lumière de fluorescence se propagent tous deux dans le cœur de la fibre optique. La photographie montre le premier prototype réalisé à l Institut Fresnel. seconde. Ceci correspond à un volume d analyse de 4 femtolitres et à une gamme de concentrations accessibles en FCS de 1 nm à 2 µm. Ces chiffres sont tout à fait standard pour la FCS, et démontrent un fonctionnement du système FCS fibré proche de ce que l on peut attendre d un microscope confocal à l état de l art. On note qu en l absence de microbille, aucun signal de corrélation n est détecté, la FCS est inopérante du fait du large volume d observation et du faible signal détecté par molécule. V- Conclusion : avantages et domaines d application La spectroscopie de corrélation de fluorescence FCS est une technique puissante et polyvalente pour l analyse biochimique. Elle donne accès à une grande variété de données telles que notamment la concentration, la structure ou la mobilité des molécules. 45
4 Figure 3 (a) Vue 3D de la microbille insérée en embout de fibre optique. (b) Sa réalisation expérimentale vue au microscope électronique. (c) Simulation numérique de la focalisation par une microbille de polystyrène placée sur une fibre optique attaquée chimiquement. (d) Référence sans microbille. Les zones rouges sont les endroits de forte intensité lumineuse. Figure 4 Fonction de corrélation de fluorescence pour des molécules d Alexa Fluor 647 telle que mesurée par notre prototype, en prenant en compte le bruit de fond. Pour faire profiter le domaine des capteurs à fibres de l analyse FCS et pour extraire la FCS du seul usage en laboratoire, nous proposons un dispositif combinant une fibre optique avec une microbille de verre, et nous montrons que ce montage dispose d une sensibilité suffisante pour effectuer une analyse FCS sur des molécules fluorescentes conventionnelles. Le dispositif décrit ici réalise à notre connaissance le plus petit système d analyse FCS au monde, et le seul dispositif FCS fibré permettant une sensibilité suffisante pour résoudre une molécule fluorescente individuelle. Grâce à la microbille, il est possible : 1) de focaliser la source lumineuse d excitation pour obtenir une intensité de fluorescence émergeant du bruit; 2) d isoler des zones de détection de très faible volume (de l ordre du femtolitre) dans le milieu d analyse; 3) de collecter efficacement le flux de lumière émis par les particules à analyser pour le rediriger via la fibre vers les détecteurs. Grâce à la fibre optique, l alignement est simplifié. Des mesures in situ sont possibles (mode endoscopie). Le capteur est jetable du fait du faible coût de réalisation. De plus, grâce à la compacité du montage, des dispositifs hautement parallèles peuvent être envisagés. Cette avancée technique, qui a donné lieu au dépôt d un brevet, ouvre aux techniques de molécule individuelle le domaine du diagnostic biomédical comme le domaine environnemental. Comme exemple d application, on peut citer le diagnostic précoce de la maladie d Alzheimer. Il a en effet été démontré que l agglomération de certaines protéines en plaques était un phénomène précurseur à l apparition des signes cliniques de la maladie (6). Or, la FCS est toute indiquée pour détecter et surtout quantifier la présence de ces agrégats de protéines dans un mélange inhomogène. Des premières mesures ont été réalisées dans le fluide cérébro-spinal de patients atteints par la maladie d Alzheimer (6). Elles montrent que la FCS peut détecter les signes précurseurs de la maladie pour des personnes ne présentant pas de signes cliniques flagrants. Or, il est évident qu un diagnostic précoce permet 46
5 LA REVUE DE L INSTRUMENTATION PHYSICO-CHIMIQUE Technique instrumentale Sonde à fibre optique pour la spectroscopie de corrélation de fluorescence : l analyse des dynamiques de fluorescence devient portable température (8). De manière plus générale, ce sont toutes les techniques de capteurs fibrés de fluorescence qui s ouvrent aux analyses des dynamiques temporelles des molécules. ainsi : vous faire gagner du temps Toutes BIBLIOGRAPHIE les informations sur les équipements et instruments indispensables (1) RIGLER R. ET aux ELSON professionnels EL (Eds.), Fluorescence des Correlation Spectroscopy : Theory and Applications, 2001, Sprinprotein aggregates in the cerebrospinal fluid of Alzhei- laboratoires (6) PITSCHKE d analyse M. et al., Detection of single amyloid beta- sont dans ger-verlag, Spectra Berlin. Analyse mer s patients by fluorescence correlation spectroscopy, (2) MAITI S., HAUPTS U., WEBB WW, Fluorescence correlation spectroscopy: diagnostics for sparse molecules, Proc. (7) OPITZ N. et al., Single molecule FCS-based oxygen Nature Medicine, 1998, 4, Actualité de l analyse physico-chimique, de l optique et des Natl. biotechnologies Acad. Sci. U.S.A., 1997, 94, sensor (O2-FCSensor): a new intrinsically calibrated oxygen sensor utilizing fluorescence correlation spectros- (3) WEBB WW, Fluorescence correlation spectroscopy: inception, biophysical experimentations, and prospectus, copy (FCS) with single fluorescent molecule detection Evolutions instrumentales et innovations technologiques Tableaux Appl. Opt., de synthèse 2001, 40, sensitivity, Sensors and Actuators B, 2003, 96, (4) AOUANI H. et al., Optical-fiber-microsphere for remote (8) WONG FHC et al., A Molecular Thermometer Based on 6 Numéros fluorescence correlation par spectroscopy, an Opt. Express, 2009, Fluorescent Protein Blinking, J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 17, (5) WENGER J. et al., Disposable microscope objective Visitez lenses notre for fluorescence nouveau correlation spectroscopy site using latex microspheres, Anal. Chem., 2008, 80, Bulletin d abonnement Des revues spécialisées aux services des professionnels une meilleure prise en charge du patient et un ralentissement de la dégénérescence neuronale. Notre Parmi les vocation autres applications, pourrait on peut citer la se résumer détection d oxygène (7) et la mesure locale de et découvrez nos revues électroniques Bulletin d abonnement 85 par an au lieu de 96 par chèque 73,20 par an au lieu de 96 grâce au paiement mensualisé 73,20 par an au lieu de 96 grâce au paiement mensualisé 85 par an au lieu de 96 grâce au paiement par chèque Proche IR et PAT N SEPTEMBRE - OCTOBRE MANIFESTATION Après Pittcon 2009, les nouveautés en spectrométrie atomique et spectrométrie de masse Labautomation 2009, l automatisation fait son show TECHNOLOGIE APPLIQUÉE Techniques proche infrarouge, contrôle des procédés de l industrie pharmaceutique et PAT LIMS pour la gestion des données de spectrométrie de masse Nouvelles approches métabolomiques en nutrition et spectrométrie de masse Nom :... Prénom :... Société :... Fonction :... Adresse :... Tél. :... Fax : Code Postal : Ville :... 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NOM, PRÉNOM ET ADRESSE DU DÉBITEUR COMPTE À DÉBITER Etab t Guichet n compte clé Date : Signature obligatoire : NOM ET ADRESSE DU CRÉANCIER SARL PCI 176, rue du Temple PARIS RCS Paris B ,20 N NATIONAL D ÉMETTEUR NOM ET ADRESSE DE L ÉTABLISSEMENT TENEUR DU COMPTE À DÉBITER Merci de renvoyer cette autorisation de prélèvement en y joignant un relevé d identité bancaire (RIB) ou postal (RIP). Les montants des prélèvements indiqués ci-dessus sont valables pour une durée d un an. Ils sont susceptibles d être revus à la hausse au terme de chaque année d abonnement. Sauf notification de votre part, votre abonnement sera reconduit. 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