Stratégie de management des ressources microbiennes : application au suivi des stations d épuration industrielle du groupe Sanofi

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1 Stratégie de management des ressources microbiennes : application au suivi des stations d épuration industrielle du groupe Sanofi Mise en place d outils de biologie moléculaire Céline Martinez, Pierre Jeannin et Paul Cruciani Narbonne MANAGEMENT DES RESSOURCES MICROBIENNES

2 Plan Présentation du groupe Sanofi Pourquoi la Biologie Moléculaire? Etude de faisabilité Implantation de l outil Conclusion et perspective 2

3 Sanofi Groupe pharmaceutique présent dans plus de 100 pays collaborateurs dans le monde 112 sites industriels 82 sites Pharmacie 12 sites Vaccin 18 sites Santé animale 3

4 Engagement fort pour l environnement Préserver la santé des populations en minimisant les impacts environnementaux de nos activités Un des objectifs est «l amélioration des systèmes de traitement des rejets» Cet objectif est sous la responsabilité de chaque site avec l aide des fonctions supports HSE 4

5 Politique reconnue par les marchés Présent depuis 8 ans dans le World Dow Jones Sustainability Indices, l indice RSE le plus reconnu internationalement par les investisseurs. Placé ainsi parmi les 8 entreprises pharmaceutiques sur 57 sélectionnées dans les DJSI World. 5

6 Plateforme centrale HSE Décision des Affaires Industrielles Pour aider les sites Intégrée dans le réseau Développement Localisée à Aramon France Partenaire stratégique pour implémenter la politique HSE du groupe et anticiper les évolutions de la réglementation HSE 6

7 Plan Présentation du groupe Sanofi Pourquoi la Biologie Moléculaire? Etude de faisabilité Implantation de l outil Conclusion et perspective 7

8 Etat de l art L amélioration du fonctionnement des stations passe par l analyse des populations microbiennes des boues Classiquement réalisé Par microscopie Culture sur boite de Pétri Long et difficile à améliorer 10% Microorganismes cultivable Durée : 15 jours 8

9 9 Disfonctionnement : moussage

10 10 Microscope présence de Nocardia

11 11 Viabilité des boues par fluorescence

12 Biologie Moléculaire Nouvelles techniques pour Étude des organismes cultivables et non cultivables l étude des populations Durée : 1 semaine pour 20 échantillons opportunité pour un suivi systématique Nombreuses techniques RISA Ribosomal Intergenic Spacer Analysis DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis CE-SSCP Capillary Electrophoresis Single-Strand Conformation Polymorphism. Puces à ADN Séquençage 12

13 Plan Présentation du groupe Sanofi Pourquoi la Biologie Moléculaire? Etude de faisabilité Implantation de l outil Conclusion et perspective 13

14 CE SSCP (Lee, 1996) Méthode «simple» gène ARNr 16S : très utilisé Analyse de nombreux échantillons Ne pas couler de gel Acquisition facile des données (pas de photos) Testée avec INRA Narbonne Extraction ADN Analyse Traitement de données 14

15 Principe de la méthode Extraction de l ADN des organismes dans les boues ADN double brin Amplification par PCR Dénaturation par chauffage (monobrin) Repliement par refroidissement rapide à 0 C Extrait de la thèse Rory MICHELLAND 15 Séparation par électrophorèse et détection

16 Biodiversité d une STEP Aramon biological basin 1 Population majoritaire 6 mois Mise en évidence de variation dans le temps Comment caractériser cette variation/flux traité? 16

17 Comparaison avec la culture sur boite 1,20E-02 1,00E-02 8,00E-03 Boite bassin nord sisteron prelevement A sisteron Pics : 16 ISimpson : 2.04 IShannon: ,50E-02 4,00E-02 3,50E-02 3,00E-02 6,00E-03 4,00E-03 Usine Pics : 31 ISimpson : 4.58 IShannon: ,50E-02 2,00E-02 1,50E-02 2,00E-03 1,00E-02 5,00E ,00E+00 0,00E Boite de Petri : biais de sélection

18 Mais À la fin de cette étude préliminaire, les appareils de CE SSP ne sont plus fabriqués! Une équipe de Sanofi Pasteur de Marcy l Etoile nous propose d utiliser le séquençage car il génère deux informations : La séquence L abondance 18

19 Plan Présentation du groupe Sanofi Pourquoi la Biologie Moléculaire? Etude de faisabilité Implantation de l outil Conclusion et perspective 19

20 Schéma général échantillon extraction ADN Amplification gene ARN 16S ADN ADN purifié + ajouts de séquences Metagenomic Sequencing Analyse bioinformatique Sequences Identification et quantification des populations 20

21 Mise en place au laboratoire Appel d offre Choix du matériel (avec l informatique site) 454 de Roche PGM de Life Installation Il faut plusieurs salles répartition dans d autres laboratoires Connexion entres serveurs Linux et Windows Formations des collaborateurs 21

22 Bioinformatique Volume de données important Equivalent à 5000 pages par échantillon Paramétrage du logiciel de traitement de données Essais à partir des premiers jeux de données Base de donnée utilisée comme référence très peu de résultats 22

23 Premier résultat Profil similaire à celui de la CE SSP Mais comment suivre dans le temps les variations? 23

24 24 A partir de la littérature

25 Traitement des données Séquenceur PGM Life Bassin station d épuration jour J Répartition des espèces prépondérantes au jour J Base de données Interne à séquences Pipeline 1 ère partie Alignement / identification Pipeline 2 ème partie Construction Phylogénie Assemblage / Clustering Interne Pre-filtering 16 S / 18 S Métagénomique Métatranscriptomique Reconstruction de séquences BLAST NCBI RDB SILVA Autres Bases de données 25

26 Après plusieurs essais Evolution des procaryotes : 07/05 15/05 17/05 22/05 24/05 27/05 29/05 31/06 05/06 07/06 10/06 18/07 un suivi est possible OTUs majoritaires 26

27 Identification /Ribosomal Database Project 22/05/ % des OTU sont identifiées au niveau du phylum 27

28 Comparaison entre différentes stations OTU 16 S OTU 18 S Usine Usine 2 36 / Usine Remarque : la résolution de la CE SSCP est de 45 pics Résultats similaires à ceux de la CE SSCP Comparaisons des séquences possibles entre les stations 28

29 Plan Présentation du groupe Sanofi Pourquoi la Biologie Moléculaire? Etude de faisabilité Implantation de l outil Conclusion et perspectives 29

30 Conclusion Les objectifs sont atteints Stockage d extrait ADN pour analyses ultérieures Analyse simultanée de 10 échantillons Suivi de 500 espèces pro- et eu-caryotes Acquisition de nouvelles compétences 2 ans pour passer de la boite de Petri au séquençage 30

31 Perspectives 31 Simplification de la préparation de l ADN Améliorer et simplifier le traitement informatique Couplage avec la qpcr Etude des ARNm : approcher la fonctionnalité des populations microbiennes Étude d autres milieux Milieu naturel Méthaniseur Suivi fermentation

32 Remerciements Sanofi L équipe du LCSE : J. Calas, M; Carbon G. Sawka C. Vidal, J. Cazaubon et C. Malosse Sanofi Recherche (Vitry) L. Eckenberg-Friedlander et B. Lamy Sanofi Pasteur : Toronto et Marcy l Etoile La direction du C&BD INRA Narbonne LECA (Alpine Ecological Laboratory) IRSTEA 32

33 Merci de votre attention 33 Pont du Gard