TRANSGENESE ET ARCHIVAGE D ANIMAUX MODELES PHENOMIN CATALOGUE DES PRESTATIONS

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2 Page 2 / 7 Toute fourniture sera accompagnée d une fiche de renseignement à compléter. Les microinjections ne débuteront qu à réception de l ensemble des documents dûment complétés et signés. A.3. Engagements du service Le service s engage à mettre tous les moyens en œuvre qui devraient permettre de parvenir à la création de modèles de souris transgéniques ; obligation de moyens et non de résultats. A.4. Tarifs Les prestations proposées font l objet d une tarification validée par la Direction du CNRS en date du 28 juin 2005; les tarifs ne peuvent en aucun cas être modifiés sans son accord. Ils varient en fonction du statut du laboratoire demandeur (voir tarification en annexe). La Délégation du CNRS adressera au demandeur, une première facturation concernant la production de fondateurs, puis, dans le cas où il aurait été demandé le développement de lignée, les factures seront envoyées trimestriellement. A.5. Publications Les clients s engagent à citer le service dans le paragraphe «remerciements» ou «matériel et méthodes» des publications émanant de résultats obtenus avec les modèles générés au SEAT ou bien lors des communications orales. Nous demandons à nos partenaires de faire apparaître obligatoirement les mots clés suivant : SEAT, UPS44, CNRS, Villejuif B. PRESTATIONS DE SERVICE B.1. Prestations de transgénèse B.1.1. Transgénèse classique Réalisation d une prestation de transgénèse classique par injection d un fragment d ADN ou d un BAC. Engagements du client sur les fournitures : La qualité de la solution d ADN est un facteur primordial à la réussite de la transgénèse, le client s engage donc à fournir : un fragment d ADN pour la microinjection : -purifié selon le protocole recommandé par le SEAT -dilué dans le tampon approprié à la concentration demandée.

3 Page 3 / 7 ADN Plasmide classique BAC Quantité 1-3µg 1-3µg Tampon Tris 10mM EDTA 0.1mM Tris 10mM EDTA 0.1mM NaCl 100mM Concentration 50ng/µl 50 à 200ng/µl un couple d amorces nécessaire à l identification des fondateurs accompagnés du protocole de détection par PCR du transgène testé par vos soins. Ces fournitures devront être accompagnées de la «fiche de renseignement transgènegénotypage. Contrôle qualité A réception du transgène, il sera quantifié et seul l ADN issu de plasmide classique sera vérifié par migration sur gel d électrophorèse afin d évaluer la qualité de la purification. Une nouvelle préparation d ADN pourra être demandée si : 1) la concentration est insuffisante, 2) la purification n est pas satisfaisante : rapport densité optique DO260nm/DO2080 supérieur à 2, présence de bandes parasites correspondantes aux séquences du vecteur de clonage sur le gel de migration. Si le client souhaite réaliser la prestation avec une préparation d ADN non optimale, le SEAT ne pourra en aucun cas être tenu responsable de la non obtention de fondateurs. Après les premières injections de l ADN dans les embryons, une nouvelle préparation d ADN pourra être demandée si : 1) elle s avère trop difficile à injecter (pipettes bouchées) 2) la préparation apparaît toxique pour la viabilité des embryons (mort rapide des embryons in vitro, pas de naissance, ). Réalisation : Les fondateurs sont obtenus après microinjection d ADN à la concentration comprise entre 1 et 2ng/µl dans le pronucléus d un embryon au stade 1 cellule. La prestation de transgénèse comprend 15 femelles réimplantées avec 18 à 25 embryons microinjectés. le génotypage des fondateurs réalisé sur deux biopsies de queues prélevées entre le 8 ème jour et le 12 ème jour après la naissance des animaux. Une prestation de transgénèse prend fin dès l obtention de 5 fondateurs transgéniques. Résultats : Le résultat du génotypage des fondateurs sera transmis par mail 3 à 4 semaines après la naissance des animaux. A l issu des séances d injection et en absence de consignes spécifiques, tous les animaux négatifs seront SACRIFIES.

4 Page 4 / 7 Livraison A la fin de la prestation, les fondateurs seront mis à votre disposition. Un certificat sanitaire de moins de trois mois vous sera envoyé avant la sortie des animaux. Vous vous engagez à prendre en charge le transfert de ces animaux dès leur sevrage, c'està-dire 21 jours après la date de naissance, sinon leur hébergement vous sera facturé au tarif en vigueur, toute quinzaine commencée étant due. B.1.2. Transgénèse ciblée Génération de souris chimériques par injection de cellules ES recombinées dans des embryons au stade blastocyste: Engagements du client sur les fournitures : L étape d injection des cellules ES dans les blastocystes doit être précédée d une vérification afin de s assurer du bon profil des clones à injecter : -Vérifications des régions importantes spécialement pour les clones fournis par les banques de KO -le caryotype -l état de différenciation du/des clones qui s évalue selon l aspect visuel des cellules -la présence de mycoplasmes Fournitures : Si possible au moins deux ampoules par clone de cellules ES recombinées congelées Ou Culture du clone de cellules ES recombinées à injecter (minimum un puits 48) qui doit être mis à disposition la veille du jour d injection. Ou Cellules fraîchement dissociées et débarrassées des fibroblastes (cf protocole fourni par le service) doivent être apportées dans de la glace fondante à 13h le jour de l injection. Toute fourniture de cellules ES doit être accompagnée de la fiche de renseignement ES_génotypage, avant l injection. Pour les cellules congelées, le SEAT décongèle et amplifie les cellules ES pour fournir le matériel nécessaire pour réaliser les vérifications du profil des clones. Le client transmettra les résultats par mail pour valider le ou les profils des clones de cellules ES qui seront injectées. Réalisation : Les souris chimériques sont générées à partir de cellules ES recombinées injectées dans des embryons au stade blastocystes. La souche utilisée pour produire les blastocystes sera fonction de la souche dont dérive les cellules ES recombinées. Le SEAT s engage à injecter le ou les clones sur une période de deux mois (2 injections successives puis la/les suivantes un mois plus tard au vu des premiers résultats.

5 Page 5 / 7 En théorie, après l injection de 50 blastocystes par clone, le service devrait si tous les contrôles sont bons, obtenir au moins 3 chimères mâles. En pratique, le SEAT garantit la génération des animaux chimériques à partir des cellules ES recombinées produites au SEAT mais ne garantit pas la génération des animaux chimériques à partir des cellules ES recombinées provenant de l extérieur. Le SEAT ne garantit pas la transmission germinale. Résultats : Vous serez informé de l obtention d animaux chimèriques 4 semaines après la naissance des animaux, avec un pourcentage indicatif de chimérisme. A l issu des séances d injection et en absence de consignes spécifiques, tous les animaux non chimériques seront SACRIFIES Livraison A la fin de la prestation, les fondateurs seront mis à votre disposition. Un certificat sanitaire de moins de trois mois vous sera envoyé avant la sortie des animaux. Vous vous engagez à prendre en charge le transfert de ces animaux dès leur sevrage, c'està-dire 21 jours après la date de naissance, sinon leur hébergement vous sera facturé au tarif en vigueur, toute quinzaine commencée étant due. B.2. Production de cellules «ES» recombinées Réalisation de la production des cellules ES recombinées : Engagement du client sur les fournitures : Vous devez nous fournir : 20-25µg d ADN purifié accompagné de la «fiche de renseignements ESgénotypage» ADN ADN linéarisé BAC circulaire Quantité 20-25µg 20-25µg Tampon PBS1X ou H2O PBS1X ou H2O Concentration 1µg/µl 1µg/µl Contrôle quantitatif : A réception du transgène, il sera quantifié et une nouvelle préparation d ADN pourra être demandée si la concentration est insuffisante.

6 Page 6 / 7 Réalisation : Les clones de cellules ES recombinées sont obtenus après électroporation du vecteur de ciblage dans les cellules ES parentales CK35 dérivées du fonds 129/SvPas. Les cellules ES électroporées sont cultivées sous sélection pendant le temps approprié à l antibiotique utilisé. Un maximum de 500 clones résistants sont piqués et cryoconservés en plaque 96 puits. Une réplique des plaques de clones résistants cryoconservés est réalisée pour mettre à disposition, un mois maximum après la date d électroporation, des lysats cellulaires réalisés a partir d une culture confluente d un puits 48, conditionnés dans des tubes de 1.5ml. Sélection : Les clones recombinés sont identifiés par le client. Résultats : Le SEAT ne peut s engager sur le délai d obtention des chimères si le résultat d identification des clones recombinés dépasse 3mois. A réception des résultats d identification des clones recombinés, ils seront décongelés, amplifiés et recongelés. Entre deux et trois semaines après réception des résultats, de nouveaux lysats cellulaires des clones recombinés décongelés, réalisés à partir d une boite de culture de 60mm de diamètre, seront mis à disposition pour une nouvelle vérification des clones recombinés. La dernière étape étant le caryotypage des clones identifiés pour l injection. Les résultats de ces vérifications ainsi que ceux du caryotypage réalisé au SEAT seront confrontés pour faire le choix du/des clone(s) à injecter. B.3. hébergement des animaux en zone EOPS Notre animalerie n accepte que les OGM de groupe I (Classe1). Nous nous engageons à mettre en œuvre tous les moyens matériels et humains nécessaires pour réaliser dans les règles de l art toute prestation d hébergement : Entretien et suivi des animaux : -Abreuvement, alimentation, observation des souris (1 fois/jour) -change des litières et nettoyage des cages (1 fois/semaine) -relevé des naissances, réalisation des sevrages, identification, prélèvement(queue, sang, ) -maintien des lignées (accouplements) et renouvellement des accouplements en duo (1 x1 ) ou trio (1 x2 ). -Sélection des animaux en fonction des résultats de génotypages réalisés au SEAT -réalisation de contrôles sanitaires tous les trois mois (à la charge du SEAT) conformément aux recommandations FELASA du 09/06/2001 Information et communication Pour le suivi des lignées en hébergement au SEAT, un accès sécurisé sur un site dédié (identifiant et mot de passe) permet d accéder à tout moment à deux fichiers de suivi des animaux et des accouplements (format pdf).

7 Page 7 / 7 Cet outil permet une gestion à distance des animaux. Toute demande concernant la gestion des lignées doit être transmise obligatoirement par écrit : fax ( ) ou mail à l adresse générique du service, seat@vjf.cnrs.fr L application des consignes est réalisée sous 8 jours. B.4. Prestations sur demande Le service propose différentes prestations supplémentaires qui sont facturées par rapport au temps passé pour les réaliser. Prélèvement de tissus Différents tissus peuvent être prélevés par les personnels du SEAT. Exemples : le rein, la rate, le foie, le poumon, le cœur, le cerveau, les muscles Les prélèvements sont proposés sous forme de tissus frais, fixés (fixation au paraformaldéhyde 4%), ou congelés (congélation rapide en azote liquide). Prélèvement de sang Les prélevements de sang s effectuent à différents sites (sinus ou jugulaire) sur héparine ou non. Accouplements contrôlés Les accouplements contrôlés sont réalisés selon les directives du client pour la mise à disposition de femelles présentant un bouchon vaginal. L organisation du transport pour le rapatriement des animaux est à la charge du client. Nous ne garantissons pas que les femelles fournies seront gestantes si les embryons sont prélevés avant E13.5jours.