Instrument LightCycler 480 Manuel Opérateur Abrégé. Logiciel Version 1.5

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1 Instrument LightCycler 480 Manuel Opérateur Abrégé Logiciel Version 1.5

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3 Présentation du Logiciel LightCycler Les fonctionnalités de base du logiciel 1 Le logiciel LightCycler 480 Le Logiciel LightCycler 480 contrôle l instrument LightCycler 480 en fonctions des informations renseignées dans le protocole expérimental. Les données brutes recueillies en temps réel et en ligne par le logiciel au cours de la PCR sont ensuite analysées en utilisant les différents modules d'analyses du logiciel, par exemple, Le calcul du Crossing Point (Cp) pour la quantification absolue ou relative en utilisant les modules correspondants L analyse des courbes de fusion pour les études de mutations en utilisant les modules Tm Calling ou Génotypage. Le Logiciel LightCycler 480 comprends une application, une base de données, et un objet de base de données (appelé «Exor 4»), qui communique avec cette base de données. Le logiciel à besoin d une installation locale. Dans cette configuration toutes les composantes logicielles sont préinstallés sur l unité de contrôle du LightCycler 480 connecté au système. Chaque configuration (Instruments et contrôles) sont indépendantes de leur base de données et des comptes utilisateurs. L emplacement du répertoire de destination de la base de données peut être défini au cours de l installation. Le logiciel LightCycler 480 permet une connexion à une base de données se situant sur un poste de travail déporté ou sur une base serveur. Dans ce cas doit être configuré un Réseau Client/Serveur. Toutes les données produites par l instrument LightCycler 480 sont stockées dans la base de données pour garantir leur sécurité et leur intégrité. La manipulation des données stockées et l accès aux données brutes peut être sécurisé et fermé. Le Logiciel LightCycler 480 utilise une base de donnée avec piste de vérification (Base de données traçable) ou base de données sans piste de vérification (pour les applications de recherche). Dans une base de donnée traçable tous les changements doivent être confirmés par l utilisateur en indiquant les raisons du changement. Une base de données traçable ne permet pas une suppression ou de renommer les données d une expérience. Dans une base de donnée recherche, les changements ne sont pas trac és et vous pouvez renommer, copier ou supprimer des expériences ou des objets associés à ces expériences.

4 Présentation du Logiciel LightCycler Cette section fournit une introduction générale au Logiciel LightCycler 480. Il est décrit ensuite tous les éléments de l'interface utilisateur et des modules logiciels disponibles sur tous les modules. Cette section comprend les rubriques suivantes: Démarrage du logiciel LightCycler 480 Définition de la fenêtre menu Interface utilisateur Export et import des objets 1.1 Interface utilisateur logiciel LightCycler 480 L interface utilisateur du logiciel LightCycler 480 dispose d éléments communs (boutons) avec une fonctionnalité définie : En outre, des conventions de design sur chaque bouton permet de renseigner de leur fonction. Le tableau ci-dessous explique les conventions de ces indicateurs : En plaçant le pointeur de la souris au dessus du bouton, apparaît une description de la fonction de celui-ci

5 Présentation du Logiciel LightCycler Démarrer le logiciel LightCycler 480 Suivre les étapes ci-dessous pour démarrer et se connecter au logiciel - Pour démarrer le logiciel double-cliquez sur l icône situé sur le bureau - L utilisateur initial est : admin le mot de passe : LightCycler 480 La dernière base de données est sélectionnée par défaut, il peut en être sélectionné une différente. Dans la fenêtre de présentation, vous pouvez créer une nouvelle expérience, créer une nopuvelle expérience à partir d un modèle ou d une macro, ouvrir un objet, partir vers d autres éléments du logiciel par le Navigateur ou la section Outils. Barre de statut Création d expérience Tâches Barre globale d action Espace de messages

6 Présentation du Logiciel LightCycler Définition de la fenêtre menu du logiciel LightCycler 480 La figure ci-dessous illustre la fenêtre type du logiciel (Comme par example dans le module quantification absolue) Barre de modules Barre de statut Barre globale d action Cadre d édition Boutons d actions Zone de messages Barre de statut Cette zone donne les informations sur la fenêtre en cours et permet de basculer vers les autres fenêtres ouvertes dans le logiciel Barre globale d action La barre globale d action rassemble toutes les fonctions globales associées au logiciel. Leur activation dépend du type de fenêtre ouverte en cours.

7 Présentation du Logiciel LightCycler Sortie : ferme le logiciel Ferme la connexion de l utilisateur à cette base de données, permet de changer d utilisateur et de base. Permet de changer vers la fenêtre de présentation Ouvre la fenêtre de navigation. Elle est décrite dans la section Sélection et navigation Enregistrement des changements appliqué à l objet ouvert en cours Export des données de la fenêtre en cours Fermeture de l objet Impression de la page écran Outils : permet d ouvrir la fenêtre outil pour changer les mots de passe, créer et éditer des utilisateurs, groupes, fonctions,édition des paramètres du système, vue de statut de la base de donnée, fichier d erreurs, autotest. Barre de Module La barre de module sur le coté gauche du logiciel rassemble toutes les fonctions associées à une expérience donnée. Cette icône permet d ouvrir le module de run, lequel détaille le protocole expérimental, les données graphiques et les commentaires associées à l expérience. Cette icône permet de définir différents groupes au niveau de la plaque de travail. Ces groupes pourront être analysés indépendamment. Cette icône permet de renseigner l ensemble des éléments associés à la feuille échantillon. Cette icône permet d ouvrir la fenêtre des modules d analyses. Chaque analyse nouvellement créée va s ajouter à la liste des analyses associés à l expérience et pourra alors être sélectionnée dans la liste déroulante correspondante dans des analyses Cette icône permet d editer et d imprimer le rapport de l expérience Cette icône permet d ouvrir le module d informations associés à l expérience, comme le nom la date, la combinaison de filtres, le journal de changements

8 Présentation du Logiciel LightCycler Zone de boutons d action Cette zone rassemble les actions propres à la fenêtre en cours. (par exemple la zone de bouton d action cidessous est uniquement présente dans la fenêtre de navigation) Zone de message La zone de message indique les messages de types statuts, alertes ou erreurs. La couleur indique de l importance du message Gris = information normale Jaune = message d alerte Rouge = message d erreur 1.4 Caractéristiques de sélection et navigation Cette section indique les capacités de sélection, de navigation et de requête du Logiciel Le Navigateur Le navigateur permet de gérer et d accéder à l arborescence de la base de données Onglet Navigation Onglet Requête Panneau d arborescence panneau d information

9 Présentation du Logiciel LightCycler Arborescence : Le panneau d arborescence permet de gérer par l utilisateur tous les objets crées par le logiciel. Boutons de contrôles Cliquer sur ce bouton ouvre une boîte de dialogue qui permettra d enregistrer un objet d expérience avec le fichier trace d évènement ainsi que la possibilité d inscrire des commentaires dans un fichier de rapport de problème. (*.ipr) Cliquer sur ce bouton permet d ouvrir le navigateur de windows pour importer les fichiers de type ATF, abréviation des fichiers.abt,.flo et.tem du logiciel LightCycler version ainsi que les fichiers XML (par exemple.ixo) Cliquer sur ce bouton permet d ouvrir le navigateur de windows pour exporter les fichiers au format.ixo ou XML. Cliquer sur ce bouton permet d importer une liste de fichiers comme par exemples des expériences au format.ixo. Cliquer sur ce bouton permet d exporter une liste de fichiers comme par exemples des expériences au format.ixo. Cliquer sur ce bouton permet d ouvrir un assistant qui permettra d exporter tous les résultats d analyses dans un goupe de dossier et de sous-dossiers. Cliquer sur ce bouton ouvre une boite de dialogue permettant la création d un nouvel objet. Les icones présentes dépendes du niveau de fonction défini pour l utilisateur. Crée un nouveau répertoire Ouvre un objet dans le cadre d édition Renomme un objet

10 Présentation du Logiciel LightCycler Supprime un objet Crée une copie de l objet sélectionné. Il peut être copié un item d un répertoire d un autre utilisateur dans son répertoire ou sous-répertoire. Cependant votre profil utilisateur vous permettra de ne voir que les fichiers possibles définit dans ce rôle La table de requête Le logiciel LightCycler 480 inclus un outil de requête qui peut être utilisé pour retrouver une expérience ou tout autre objet stoqué dans la base de données du Logiciel. Pour créer et exécuter une requête : Sélectionner l onglet «Query» dans la fenêtre du navigateur Dans la boite d objet sélectionner le type d objet à rechercher (facultatif) Entrer le nom de l objet à retrouver. Le symbole suivant «*» peut être utilisé pour rechercher n importe quel caractère. Sélectionner la date ou période de création

11 Présentation du Logiciel LightCycler Pour n importe quel objet il est aussi possible de définir un répertoire cible de recherche et d inclure ou non les sous-dossiers associés. Pour certains types d objet, des option de recherche supplémentaires peuvent être sélectionnés dans «Options Tab» Cliquer sur le bouton «Search». Les résultats apparaissent dans le panneau suivant.

12 Présentation du Logiciel LightCycler Le sélecteur échantillons Le sélecteur échantillons et la table d échantillons sont accessibles dans plusieurs fenêtres. Le sélecteur échantillons comprends une image de la plaque multi-puits (MWP) avec des puits sélectionnables L image MWP peut être utilisé pour sélectionner des échantillons Nom des subsets Tête de ligne Echantillons selectionnés Tête de colonne Echantillons non utilisés Image de la plaque MWP Echantillons déselectionnés Groupes d échantillons Légende La table échantillons Seulement les échantillons sélectionnés dans le sélecteur échantillons apparaissent dans la table échantillon. D autres informations peuvent être ajoutés à la table selon le contexte (Résultats en Cp et concentration pour les analyses quantitatives. Echantillons sélectionnés Echantillons désélectionnés La table échantillon peut être exportée et utilisée par exemple par d autres programmes ( Excel )

13 Programmer et démarrer une expérience 2 2 Programmer et Démarrer une Expérience Cette section explique les points suivant : Programmer une expérience Démarrer une expérience Entrer les informations concernant les échantillons 2.1 Programmer une expérience Programmer une expérience consiste à définir les cycles de chauffage et de refroidissement qui doivent être appliqués au niveau du block thermique. Pour pouvoir créer une expérience l utilisateur doit être «Expert User» ou «Local Administrator» Programmation : 1. Cliquer sur «new expériment» ou «new experiement from Macro» si vous souhaitez créer une expérience à partir d une macro existante. 2. Dans la zone de «Setup» dans le tableau de programmation de Run les informations suivantes apparaissent ou sont à définir : - Le format de détection - Le type de block (détecté automatiquement) - Numéro de Plaque (facultatif) - Volume réactionnel. Entre 10 et 100 μl pour le block 96, entre 5 et 20 μl pour le block Numéro de Color Comp (facultatif) - Numéro de lot (facultatif) - Numéro de test (facultatif) 3. Dans la section programme et température cible, cliquer sur pour ajouter autant de segment nécessaires dans la création du protocole de PCR

14 Programmer et démarrer une expérience 2 4. Pour utiliser un protocole existant, cliquer sur apply Template. Selectionner un modèle de protocole à partir de la liste. Modifier les paramètres ou les températures cibles si besoin. 5. (Optionnel) Dans la barre de modules, cliquer sur Subset Editor pour définir les groupes échantillons 6. (Optionnel) Dans la barre de modules cliquer sur Sample Editor pour définir les informations relatives aux échantillons. 7. Préparer la plaque et la disposer dans le LightCycler. 8. Cliquer sur Start Run 9. La boite de dialogue Save Experiment apparaît. Entrer un nom pour cette expérience et sélectionner un répertoire de destination pour la sauvegarde Réglage des formats de détection Le réglage des formats de détections consiste à choisir la combinaison de filtre correcte pour l expérience Attention, il n est pas possible de changer de format une fois que l expérience a démarrée. Pour fixer les formats de détection : - Dans la zone Setup sélectionner le format de détection adéquat. - Pour modifier les formats de détection disponibles, cliquer sur Customize et procéder aux modificationx en choisissant les canaux de mesures désirés pour l expérience Définition des programmes et des températures cibles Chaque protocole expérimental est constitué de un ou plusieurs programmes. Dans un programmes plusieurs segments de températures peuvent être définis. L exemple ci-dessous comprends 4 programmes : Denat, PCR, Melt et Cooling.

15 Programmer et démarrer une expérience 2 Sélectionner le mode d analyse : None, Quantification, Melting Curves ou Color Comp selon l application désirée. Au moment du choix de l acquisition de fluorescence : sélectionner Single ou Continuous. L acquisition single est choisie pour l analyse durant la PCR du niveau de fluorescence correspondant à la quantité d ADN produite dans chaque puits. L acquisition Continuous est utilisée en fin de PCR pour effectuer une courbe de fusion. Celle-ci est nécessaire pour analyser la spécificité des PCR en Sybr Green, pour différencier les mutations en sondes d hybridations ou pour faire une expérience de criblage en fusion haute résolution (HRM). Ramp Rate ( C/s) correspond à la vitesse de chauffage et de refroidissement Block 96 : chauffage de 1.0 à 4.4 C/s, refroidissement de 1.0 à 2.2 C/s Block 384 : chauffage de 1.0 à 4.8 C/s, refroidissement de 1.0 à 2.5 C/s Acquisitions (per C) correspond au nombre de mesures de données de fluorescence prises par degré? Uniquement possible lors de l acquisition en continue lors des courbes de fusion. Sec Target ( C) correspond à une deuxième température cible lorsqu il est souhaité la programmation d une PCR touch-down. Step Size ( C) correspond au pas de changement de degré à chaque cycle pour atteindre la deuxième température cible. Step Delay (Cycles) Correspond au nombre de cycles ou s applique la première température cible. La visualisation de la programmation peut se faire par observation de sa représentation graphique 2.2 Démarrer une expérience Après avoir défini l ensemble des paramètres (Programmes et températures cibles), vous êtes prêts à démarrer une expérience. Pour démarrer un run expérimental : - Préparer le protocole expérimental - Charger la plaque - Cliquer sur Start Run

16 Programmer et démarrer une expérience 2 - Sauvegarder l expérience - Une barre de statut indique la progression de l expérience - La feuille échantillon est accessible pendant la réaction de PCR. - (Facultatif) Une compensation colorimétrique est applicable avant, pendant ou après la réaction. - (Facultatif) il est possible d intervenir sur la durée de l expérience. o End program met fin au programme en cours et passe au suivant o +10 Cycles, ajoutes 10 cycles à la réaction de PCR. o Abort Run stoppe l expérience et remplace la touche Start Run pendant le run. - Quand l expérience est terminée un message indique «Run Complete» 2.3 Entrer les informations échantillon Fenêtre éditeur des échantillons Ouvrir la fenêtre en cliquant sur Sample Editor dans la barre de modules. Par défaut est affichée la vue Tableau. Zone de filtres Tableau échantillons Zone de workflow Sélection subset Image MWP Légende Groupes échantillons Panneau accélérateur Barre d actions

17 Programmer et démarrer une expérience 2 Cliquer sur Toggle view pour accéder à la vue par plaque. Zone de filtres éditeur de puit Zone de workflow Sélection subset Image MWP Barre d actions Barre d actions de l éditeur échantillon La barre d actions comprends les boutons ci-dessous : Cliquer pour appliquer ou créer un modèle de feuille échantillon Cliquer pour configurer les champs des vues tableau et plaques Cliquer pour basculer de type de vue entre format tableau et format plaque Cliquer efface la feuille échantillon Cliquer ouvre une fenêtre d exploration de windows pour importer la feuille échantillons. Cliquer permet d exporter la feuille échantillon en cours Cliquer permet de définir les échantillons réplicats

18 Programmer et démarrer une expérience Configurer les propriétés de l éditeur d échantillons Sélectionner l ensembles des champs en fonction de ce qu il est souhaité dans les vues Tableau ou plaque. Catégories définis dans la feuille échantillon. Sélectionner les différents champs selon l application :

19 Présentation des analyses 3 3 Présentation des analyses Le logiciel LightCycler 480 comprends les modules d analyse qui peuvent être utilisés pour exploiter les résultats dans de nombreuses applications. Pour analyser une expérience il peut être ajouté un ou plusieurs modules d analyses, après que le run soit terminé. : Les programmes d analyses suivant sont disponibles Quantification o o Quantification absolue : pour déterminer une quantité de la sequance cible en fonction d une gamme étalon de calibrage Quantification relative : l expression de la quantité est un rapport entre deux cibles ADN ou ARN. Cette analyse est utilisé pour l analyse de l expression de gènes ou le dosage de gènes Génotypage o o Génotypage en point final : est l analyse de mutations ponctuelles connues en fonction d un rapport de fluorescence spécifique entre un allèle muté et un allèle sauvage Génotypage par courbe de fusion. est l analyse de mutations ponctuelles connues en fonction de la mesure du Tm d une sonde sur une région mutée ou sauvage. Tm Calling Calcule les température de fusion et pics de fusion des cibles ADN. Color Compensation Génère des données de compensation colorimètrique lors de l utilisation de plusieurs fluorochromes simultanément. (PCR multiplex) Gene scanning Le module optionnel Gene Scanning permet d analyser les fusions de très hautes résolutions pour détecter des variations de séquences inconnues en présence d un fluorochrome intercalant : le résolight. 3.1 Présentation des étapes d analyses Pour effectuer une analyse : 1. Ouvrir l expérience à analyser dans la fenêtre de menu du logiciel LightCycler Dans la barre de module, cliquer sur Sample Editor si vous n avez pas renseignés toutes les informations relatives aux échantillons.

20 Présentation des analyses 3 3. Entrer les informations spécifiques à l analyse. Le type de renseignement dépend de cette analyse 4. Cliquer sur analysis. La fenêtre des analyses apparaît. 5. Sélectionner l analyse dans la liste Create New analysis, sélectionner le subset si besoin et donner un nom à l analyse si vous ne souhaitez par garder le nom par défaut. 6. Ajuster les paramètres dans la fenêtre d analyse. Il peut être appliquer ou sauvegarder un modèle d analyse par la fonction Apply Template ou Save as Template 7. Vous pouvez ajouter le nombre d analyses que vous souhaitez en cliquant sur le bouton 8. Cliquer sur dans la barre d action globale pour sauvegarder l analyse. 3.2 Utilisation de la fenêtre d analyses La figure suivante illustre une fenêtre type d analyse, dans ce cas une analyse de quantification absolue.. La barre d outils analyses et en haut, la zone de bouton d actions en dessous, la liste des échantillons sur la gauche, et les zones de graphiques d analyses sur la droite.

21 3 Présentation des analyses

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23 Quantification 4 Applications du logiciel 4 Quantification 4.1 Présentation Il existe plusieurs types de méthodes pour quantifier l expression des gènes par PCR temps réel ou pour quantifier la séquence cible. La quantification absolue permet de quantifier une séquence cible et exprime le résultat final avec valeur définie (par exemple charge virale, nombre de copies par ml d échantillon ). Ce type d analyse est couramment utilisé dans les laboratoires d analyses en virologie ou microbiologie par exemple. La quantification relative est une comparaison de niveau entre deux cibles différentes dans un seul et même échantillon. Le résultat exprime alors le ratio de ces cibles. 4.2 L analyse quantification absolue Le crossing Point La quantification absolue peut se faire en analysant la phase d amplification de la PCR. Chacune des courbes va former une cinétique d amplification. Le point de sortie du bruit de fond sera caractérisé soit par l utilisateur soit calculé par le logiciel et se nomme Crossing Point (Cp). Ce point permet de caractériser une échantillon par son cycle de sortie du bruit de fond. Cette donnée est caractéristique de la qualité et de la quantité d un échantillon et est parfaitement reproductible.

24 Quantification Rôle des courbes standard Dans une quantification absolue, l échantillon est quantifier par rapport à une gamme standard. Cette gamme est constituées d échantillons dont la quantité en cible a préalablement été établie et est don connue. En général cette gamme est une dilution sérielle d un seul échantillon. Le facteur de dilution est donc reporter dans la feuille échantillon pour indiquer la valeur théorique de chacun des points de la gamme. La gamme standard permet d établir une droite standard de quantification qui est la représentation linéaire de régression entre les points de la gamme. Cette droite de régression servira à quantifier les échantillons inconnu par report du Cp et calcul de la quantité selon l unité des différents points de gamme. L efficacité (E) de la PCR peut être calculée à partir de la pente (slope) de la droite de régression : E = 10-1/slope (exemple, slope = -3.3 E = 2)

25 Quantification 4 Le logiciel calcule automatiquement la pente et le taux d erreur. Le taux d erreur acceptable doit être inférieur à 0.2. Les données de CP de la gamme standard va permettre de quantifier les échantillons inconnus. Les efficacités de PCR des échantillons standards et des échantillons inconnus doivent être identiques. La gamme standard peut être enregistrée et utilisée si la reproductibilité de la PCR le permet. Il suffit de cliquer sur le bouton correspondant Quantification absolue en utilisant la méthode de seconde dérivée Cette méthode permet de calculer automatiquement le point de sortie de la phase exponentielle (Cp). 1. Cliquer sur Analysis dans la barre de modules 2. Sélectionner Abs Quant/2 nd Derivative Max 3. Dans le cas d une PCR multiplex utiliser le bouton Filter Comb pour ouvrir la boîte de dialogue concernant la sélection des combinaisons de filtres. 4. par défaut tous les échantillons participent au calcul. Cliquer sur Calculate. Pour regarder les courbes d amplification d un ou plusieurs échantillons, les sélectionner dans le tableau résultat.

26 Quantification Quantification absolue en utilisant la méthode Fit Points Cette méthode demande à l utilisateur de définir la ligne de bruit de fond manuellement. Les intersections entre la ligne horizontale et les phase exponentielle d amplification déterminent les Cp. La ligne doit se situer au plus bas des parties linéaires d amplification. 1. Cliquer sur Analysis dans la barre de modules 2. Sélectionner Abs Quant/Fit Points 3. Dans le cas d une PCR multiplex utiliser le bouton Filter Comb pour ouvrir la boîte de dialogue concernant la sélection des combinaisons de filtres. 4. Dans l onglet Cycle Range, la ligne de base est soustraite de toutes les courbes 5. Dans l onglet Noise Band doit être placé la ligne horizontale définissant la limite entre le bruit de fond et la partie amplification exponentielle.

27 Quantification 4 6. Dans l onglet analysis sont reportés sur la ligne de croisement (Crossing Line) l intersection avec les points d amplification définissant ainsi les Cp Observation des résultats La vue ci-dessous permet de regarder les résultats. Les échantillons sont automatiquement définis comme positifs, négatifs, incertains ou standard. Le Cp mesuré ainsi que la concentration calculée apparaissent dans le tableau de résultat. Le Cp moyen et médian est calculé quand des échantillons réplicas sont préalablement définis dans l éditeur d échantillon.

28 Quantification L analyse quantification relative Présentation La quantification relative permet de mesurer l expression comparative entre un gène d intérêt et un gène de référence dont l expression est stables dans les conditions de l échantillons. Le gène de référence va permettre de normaliser la quantité d échantillon entre un état 1 et un état 2. (Entre échantillon traité et non-traité par exemple). Comme un rapport est effectué entre ces deux expression de gène, le résultats est présenter par un taux sans unité de valeur. Les échantillons seront comparés les uns les autres. Un échantillon de référence peut être utilisé comme Calibrateur. Cet échantillon aura une valeur arbitraire de 1. Les échantillons seront alors normalisés par rapport à ce calibrateur. Cette opération est utile quand il est souhaité des comparaisons inter essais. Il existe deux méthodes de quantification relative. Sans correction d efficacité et avec prise en compte de l efficacité de PCR (E-Method)

29 Quantification 4 Roche Applied Science offre la possibilité de tenir compte de l efficacité de PCR en utilisant cette méthode utilisée dans l analyse avancée. La prise en compte de cette efficacité se fait en établissant préalablement des gammes de dilutions d un l échantillon de référence. Sera alors établi une droite de régression qui permettra uniquement de prendre en compte l efficacité mesurée. La quantification ne se fera pas à partir de la gamme standard contrairement à la quantification absolue Principe de la quantification relative Le ratio normalisé suivant est établi : Effectuer une quantification relative basique La quantification relative basique est basée sur la méthode des ΔΔCT. Suivre les étapes suivantes : - Calcul des Cp selon la méthode Fit Points - Efficacité prédéfinie (Pas de standards nécessaires) - Les points de références doivent être sur la même plaque. - Plaque entière. Les subsets ne sont pas utilisés dans cette méthode. Une quantification relative Basique est une expérience d amplification qui comprends : - échantillons inconnus cibles - échantillons inconnus références - échantillons calibrateurs (facultatif) - Témoins négatifs (facultatif) 1. Effectuer une amplification PCR 2. Cliquer sur Sample Editor dans la barre de module et sélectionner le workflow Rel Quant

30 Quantification 4 3. Définir les caractéristiques des échantillons 4. Comme la quantification relative basique fait appel à l ensemble de la plaque, il doit être vérifié que les Cible des échantillons non utilisés sont à la position Unassigned 5. Cliquer sur Analysis dans la barre de modules et sélectionner Basic Relative Quantification 6. Le panneau d analyse de quantification relative s ouvre. Les résultats sont calculés automatiquement.

31 Quantification Effectuer une quantification relative avancée La quantification relative avancée permet : - Définition des Cp par méthode Fit Points ou Seconde dérivative - Analyse des échantillons référence dans le run ou autre run. - Utilisation de point standard possible - Utilisation des subsets La quantification relative avancée contient : - Les échantillons cibles et références inconnus - Les standards cibles et références (facultatif) - Les calibrateurs cibles et références (facultatif) - Les témoins négatifs cibles et références (facultatif) Les références peuvent être mesurées dans un run séparé. 1. Effectuer une amplification PCR 2. Definir le ou les subsets (facultatif) 3. Cliquer sur Sample Editor dans la barre de module et sélectionner le workflow Rel Quant 4. Définir les caractéristiques des échantillons 5. Cliquer sur Analysis dans la barre de modules et sélectionner Advanced Relative Quantification

32 Quantification 4 6. La boite de dialogue Create new analysis s ouvre. Renseigner le subset et éventuellement changer le nom de l analyse. 7. Sélectionner les options appropriées Association gènes de référence / gènes d intérêt One to One : Une cible est comparée à une référence. Ex : T1/R1, T2/R2 All to All : Chaque cible est comparée à chaque référence. Ex : T1/R1, T1/R2, T2/R1, T2/R2

33 Quantification 4 All to mean : Chaque cible est comparée à la moyenne des références Ex : T1/R(all) = (T1/R1 x T1/R2)1/2 et T2/R(all) = (T2/R1 x T2/R2)1/2 Mean to all : Chaque moyenne des cibles est comparée à chaque référence Ex : T(all)/R1 = (T1/R1 x T2/R1)1/2 et T(all)/R2 = (T1/R2 x T2/R2)1/2 En cliquant sur l ecran Relative Quantification Analysis s ouvre Il est aussi possible de revenir sur les écrans de cible et de référence pour changer les options. Ainsi que l association des cibles avec les références : Manual Pairing

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