LICENCE 2 ème ANNEE BIOLOGIE-BIOCHIMIE MODULE BONNES PRATIQUES DE LABORATOIRE

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1 Université des Sciences et Techniques de Nantes LICENCE 2 ème ANNEE BILGIE-BICIMIE MDULE BNNES PRATIQUES DE LABRATIRE Protocoles de travaux pratiques

2 Mardi 09 Septembre TP I : Informations hygiène et sécurité, notions primaires, exercices d application et expérimentations 1. Les objectifs pédagogiques de l UE 2. Informations ygiène et Sécurité 2.1. Etiquetage réglementaire et fiche de données de sécurité 2.2. Les différents dangers liés à la manipulation des produits chimiques et leur prévention 2.3. Informations diverses 3. Les notions primaires 4. Exercices d application 5. Expérimentations 5.1. bjectifs pédagogiques A partir des consignes et des objectifs de résultats : - savoir écrire un protocole en tenant compte des caractéristiques des produits à manipuler, du matériel de mesure (disponibilité, degré de précision ) et des consignes d hygiène et de sécurité. Ce protocole devra être rédigé sur le cahier de manipulation et présenté au responsable pédagogique avant d être exécuté, - Prendre conscience de l obligation de reproductibilité des manipulations liée à une bonne utilisation du matériel de mesure (pipettes, balance,.) et au respect du protocole, - maîtriser des calculs élémentaires de concentrations massiques, molaires, % - savoir présenter les résultats de manière synthétique Consignes à suivre avant de manipuler pour atteindre ces objectifs - bien comprendre la demande (objectif du protocole, consignes) - lister les produits à utiliser et prendre connaissance de leurs caractéristiques (caractéristiques physicochimiques, risques liés à leur utilisation, consignes de rejet en fin de manipulation ), - bien identifier le matériel de mesure à utiliser (pipette, pipetman automatique, éprouvette, fiole, balance,.) Rédaction d un protocole détaillé Ce protocole devra : - respecter l ordre chronologique des manipulations - être scindé en différentes parties (par objectifs : préparation de solutions mères, dilution, mesures ) - préciser les consignes de manipulation des produits à respecter, - en dernière partie : préciser les calculs intermédiaires si nécessaire 5.4. Consignes - Préparer 10 ml d une solution aqueuse de sulfate de cuivre à 2,5 % (= solution mère 5X), - Dans des cuves spectrophotométriques distinctes, préparer 5 fois 1 ml d une solution X, 1

3 - évaluer la reproductibilité de votre travail en mesurant l absorbance (λ = 625 nm ) des cuves spectrophotométriques (mesures effectuées sur le même spectrophotomètre). Quel témoin allez vous utiliser? - Recommencer la préparation des cuves spectrophotométriques si nécessaire. - Etiqueter correctement la solution mère. A conserver (utiliser pour le TP4) Calculs, présentation des résultats et exercice - Exprimer la concentration de la solution mère en g L -1 et en mmoles L -1. Présenter clairement votre raisonnement et vos calculs sur le cahier de manipulation. - Dans un tableau synthétique, indiquer pour chacune des solutions préparées leurs concentrations en g.l -1, en mm, ainsi que leur D respective. - Problème à résoudre Vous êtes responsables de la mise en place des TP. n vous demande de préparer une solution mère de sulfate de cuivre 100 mm pour l ensemble des étudiants (effectif : 220 étudiants), sachant que chaque binôme utilisera au plus 4 ml de cette solution diluée au dizième. Quel est le volume de la solution mère que vous allez préparer et en conséquence quelle masse de ce produit allez-vous peser? Prendre en compte le matériel de mesure disponible (volume des fioles, des éprouvettes ). 2

4 Mercredi 10 Septembre TP II : Préparation de solutions, dilutions, calculs de concentration, conversions d unités I - Introduction/But du TP Dans un laboratoire, on utilise un grand nombre de solutions de compositions diverses. Ces solutions peuvent être simples ou complexes. - Une solution simple est composée d un produit pur ou d un nombre limité de produits en solution dans un solvant ; le solvant le plus utilisé en biologie est l eau, mais on peut avoir à y ajouter des co-solvants ou des détergents pour faciliter la solubilisation de produits hydrophobes - Une solution complexe contient plusieurs composés et a un p défini, une force ionique et une osmolarité contrôlées etc. Parmi ces solutions, certaines sont utilisées de façon récurrente et parfois même quotidiennement. En conséquence, on est amené à préparer des «solutions stocks» de concentrations relativement élevées à partir desquelles on peut préparer les solutions de travail, par dilution et au fur et à mesure des besoins. D autres solutions peuvent être nécessaires de façon ponctuelle pour un nombre très limité d expériences. Les expériences en biologie nécessitent la préparation de solutions de concentrations parfois très faibles. Plusieurs problèmes se posent : - comment préparer une solution simple ou une solution complexe (voir TP VI)? - comment préparer une solution à partir d un produit liquide ou d un produit solide? - comment réaliser les dilutions? - comment préparer des solutions faibles concentrations? Les objectifs de cette séance de TP sont les suivants : - connaître les notions de solutions stocks et solutions de travail - étiqueter correctement les solutions préparées - savoir réaliser une solution simple à partir d un produit liquide ou d un produit solide - savoir réaliser une dilution ou une série de dilutions à partir d une solution mère - calculer les volumes finaux en fonction des besoins - convertir les unités de concentration (massique vers molaire et inversement) - adapter les ordres de grandeur des unités en fonction des concentrations II Préparation de solutions simples Les produits à diluer/solubiliser peuvent être liquides ou solides Ces produits peuvent être conservés à température ambiante, à 4 C, à 20 C ou à 80 C (voire pour certains produits biologiques dans l azote liquide à 180 C) 3

5 Les méthodes et précautions à prendre pour la préparation de ces solutions sont adaptées à ces différentes situations. 1 Etiquettes Dans tous les cas, les solutions doivent être parfaitement identifiées Les indications suivantes doivent apparaître clairement : - nom du produit - concentration (et le cas échéant 10x, 5x, 2x etc) - date de préparation - nom de la personne qui a préparé la solution - pictogramme tiré des FDS (Fiches de Données de Sécurité) Toxique T Très Toxique T+ Nocif Xn Irritant Xi Facilement inflammable F Extrêmement inflammable F+ Comburant Corrosif C Explosif E Dangereux pour l'environnement N 2 Solutions stocks et solutions de travail Les solutions utilisées fréquemment peuvent être préparées à des concentrations supérieures à «la concentration de travail» pour éviter au chercheur d avoir à en préparer trop souvent. n peut ainsi préparer des solutions 20x, 10x, 5x, 2x Exemples : Pour de nombreux tests en biologie cellulaire, on utilise un tampon phosphate salin concentré : 10X PBS (Phosphate Buffered Saline) : g dibasic sodium phosphate Na 2 P 4 ( g/mol) g monobasic potassium phosphate K 2 P 4, ( g/mol) - 2 g KCl (74.5 g/mol) - 80 g NaCl (58 g/mol) - QSP 1 L with high purity 2, p 7.4. Dilute to 1X with high purity d 2 Calculer la concentration finale en phosphates de la solution de travail 1x en mm. n utilise souvent un tampon Tris glycine-sds pour faire des électrophorèses de protéines sur polyacrylamide. (SDS-PAGE) 10X Tris-Glycine-SDS (TGS) Buffer, M Tris ( g/mol) M glycine (75.07 g/mol) - 1.0% SDS ( g/mol) - QSP 1 L with high purity 2, p 7.4. Dilute to 1X with high purity d 2. Calculer les masses de chacun des produits pour préparer 1 litre de cette solution stock 10x 4

6 Par ailleurs, on peut avoir à travailler avec des solutions de concentrations différentes d un même composé. n prépare dans ce cas une solution mère. Les solutions de travail sont préparées par dilutions de cette solution mère. 3 Préparation de solutions 3.1 Préparation de solutions à partir d un produit pur à l état liquide conservé à température ambiante Acide acétique 50 mm Vous aurez à travailler avec une solution pure d acide acétique 50 mm dans le TP V (tampons, p-métrie) - recherchez les caractéristiques de ce produit - proposer une méthode pour la préparation d une solution 50 mm d acide acétique pour le groupe de TP sachant qu il en faut environ 50 ml par binôme ; prenez en compte les questions de sécurité. - réalisez la solution 3.2 Préparation de solutions à partir d un produit pur à l état solide (poudre amorphe ou produit cristallisé) Les produits solides doivent être pesés et solubilisés dans un solvant adapté. Les produits biologiques sont le plus souvent hydrosolubles mais certains sont plus ou moins hydrophobes : - lipides (acides gras, triglycérides, stéroïdes etc) - acides aminés aromatiques et aliphatiques - vitamines liposolubles : vitamine A (Rétinol), vitamine D (Calciférol), vitamine E (Tocophérol), vitamines K1 et K2 (Phylloquinone et Ménaquinone) - certaines protéines - certains glucides (cellulose) Il faudra donc dans ces cas là ajouter des produits facilitant la solubilisation : o détergents (TRITN par exemple) o co-solvants miscibles à l eau (éthanol, méthanol, TF, DMF, DMS) Vous devez connaître les fonctions principalement présentes sur les molécules biologiques et qui leur confèrent leurs propriétés hydrophile, hydrophobe ou amphiphile. Notion de précision de pesée La précision de la pesée dépend essentiellement de deux éléments : - (1) précision de la balance : une balance est caractérisée : o par sa portée : masse maximale pouvant être déposée sur le plateau o par sa précision : masse minimale pouvant être pesée o exemples : balance de laboratoire : portée 210 g précision 10 mg 777 TTC portée 4200 g précision 10 mg TTC 5

7 balance de précision : portée 60g précision 0,1 mg TTC portée 320g précision 0,1 mg TTC - (2) ordre de grandeur de la masse à peser o Calculez le pourcentage d erreur que l on fait lorsque l imprécision de la pesée est de 0,1 mg dans les deux cas suivants : pesée de l ordre du mg : par exemple 2 mg désiré quand on pèse en réalité 2,1 mg pesée de l ordre de la dizaine de mg : par exemple 25 mg désiré quand on pèse en réalité 25,1 mg o Conclure Notez bien qu il est plus simple de prélever un volume juste que d arriver à peser précisément une petite masse de produit. Ainsi, lorsqu on doit préparer 10 ml d une solution à 250 µg/ml : - on pèse une masse proche de 2,5 mg (par exemple 2,3 mg) - on solubilise le produit dans un volume tel que la concentration finale soit bien de 250 µg/ml (ici 9,2 ml). Précautions particulières pour les produits conservés au froid Avant d ouvrir le flacon d un produit conservé au froid, il est impératif de laisser le produit se réchauffer à température du laboratoire. Expliquez pourquoi a) Préparation d une solution de 4-nitrophénol 5x pour le groupe de TP Données - concentration de travail = 50 µm - volume nécessaire = 1 ml de solution 5x / binôme - solvant = soude 10 mm - solution mère de soude = Na 100 mm Calculs - rechercher la structure moléculaire et les caractéristiques du produit - calculer la masse à peser - calculer le volume de Na 10 mm à préparer - ajuster la démarche en fonction des résultats de vos calculs b) Préparation d une solution étalon de protéines pour le groupe de TP (préparation du TP IV) Données - sérum albumine bovine (4 C) ; MM ; protéine la plus abondante du plasma (0,6 mm) - préparation d une solution 1x à 2,5 mg/ml - 5 ml de solution 5x / binôme Calculs - calculer la masse à peser - préparer la solution (solvant = eau distillée) - étiquetez le flacon 6

8 c) Préparation d un réactif de dosage des protéines pour le groupe de TP (préparation du TP IV) Données Na2C3 2g - Tartrate double de Na et K 0,02g Bien dissoudre dans 100mL de Na 0,1M (solution mère de soude à 1M) 4 Dilutions La manipulation de petits volumes, la préparation de solutions de concentrations définies, l ajustement de concentrations par dilutions sont autant de gestes techniques simples qui doivent être parfaitement maîtrisés. Vous allez préparer des dilutions d une solution de 4-nitrophénol et tester la précision de vos gestes. Réflexion : comment tester la validité des dilutions effectuées? - solution à diluer : solution de 4-nitrophénol 5x - proposer une méthode simple de contrôle de vos dilutions 4.1 Dilution ponctuelle Préparer (triplicate) 1 ml de solution 1x Vérifier la validité de vos dilutions Conclure 4.2 Dilutions en cascade Réunir les trois solutions 1x de 1 ml A partir de cette solution 1x, préparer (duplicate) une série de dilutions en cascade au ½ dans un volume final permettant de réaliser des mesures de D dans des cuves de 1,5 ml. Vérifier la validité de vos dilutions Conclure 7

9 Jeudi 11 Septembre TP III : Spectrophotométrie I Spectrophotométrie : spectre d'absorption d'une molécule 1 bjectifs A partir de notions vues en cours et TD de biologie-biochimie et chimie (loi de Beer Lambert etc), proposer un protocole expérimental pour déterminer les caractéristiques spectrales d'un produit pur. Il s'agit ici de se poser les bonnes questions, de faire preuve d'imagination, de veiller à ce que les résultats soient significatifs, d'imaginer un protocole expérimental puis de le mettre en œuvre. Savoir : - utiliser un spectrophotomètre (Précautions d'utilisation. Limites d'utilisation. Réglages) - appliquer la loi de Beer Lambert - associer une couleur à une longueur d'ondes 2 Matériels et méthodes Spectrophotomètre et cuves de 1 ml (l = 1 cm) - zéro électrique : selon l appareil utilisé, ce réglage est à effectuer au moment de sa mise en marche. - longueur d'onde : réglez la longueur d'onde avant de régler le zéro d'absorbance et d'effectuer vos mesures. - zéro de D : en mode absorbance avec le tube témoin en place dans le porte-cuve, appuyer sur le bouton "0 ABS" ou "Auto zéro". L'affichage doit alors se stabiliser sur la valeur D =. Une fois ces réglages réalisés, vous pouvez faire vos mesures. Attention : il faut régler le zéro de D à chaque changement de longueur d'onde! Conserver la cuve témoin ("blanc" ; ici eau distillée) tout au long de la séance pour pouvoir réaliser des réglages de D dans les mêmes conditions sur l'appareil. Rappel : loi de Beer Lambert Les mesures spectrophotométriques s'appuient sur la loi de Beer-Lambert qui indique que la densité optique (D) ou absorbance d'un produit en solution est proportionnelle à sa concentration molaire D = ε. c. l ε : coefficient d'extinction molaire du produit coloré unité: M -1. cm -1 c : concentration molaire du produit coloré unité: M (mol/l ; on dit "molaire") l : longueur du trajet optique (ici l =1cm) unité: cm Vortex (agitation des tubes pour homogénéisation des solutions diluées) : tenir fermement le tube! 8

10 Solutions Les produits à étudier sont en solution dans l eau. Caractéristiques des produits : voir tableau page suivante 3 Résultats Présentez vos résultats graphiquement (deux graphes) Donner directement sur les graphes les résultats recherchés (λmax et ε) Solutions Produits purs en solution dans l'eau distillée : Masse moléculaire Concentration de la solution mère α1 6 α1 3 Bleu Dextran Dextran : polymère de glucose de structure proche de celle de l amidon. La couleur est due à un pigment lié au dextran de façon covalente Molécule de dextran mg/ml Pigment bleu lié au Dextran colonie de Leuconostoc mesenteroides Cette bactérie produit du dextran Vitamine B12 (cyanocobalamine) La vitamine B12 est un coenzyme important du métabolisme ,5 mg/ml Rhodamine B Colorant fluorescent très utilisé en biologie (marquage de molécules) Utilisé aussi comme traceur pour cartographier les cours d eau N C C N ,1 mg/ml 9

11 II Spectrophotométrie : dosage spectrophotométrique/colorimétrique 1 bjectifs Les dosages colorimétriques sont très utilisés dans tous les laboratoires de biologie, biochimie, physiologie etc. Il s agit de déterminer la concentration d un produit en solution. Voici deux méthodes utilisées couramment pour déterminer la concentration d un produit en solution : Méthode 1 : n réalise une mesure de D de la solution inconnue (diluée le cas échéant) puis on applique la loi de Beer-Lambert. Cela suppose que la valeur du coefficient d'extinction molaire ε maximal du produit soit connue. La concentration est donc calculée très simplement Cette approche est appliquée à la détermination de la concentration d une solution de bétanine. La bétanine est le colorant rouge naturel de la betterave Il est utilisé dans l industrie agroalimentaire comme colorant : E162 Méthode 2 : n réalise une gamme d étalonnage (série de solutions de concentrations différentes du produit). Si le produit d intérêt n est disponible (non commercialisé par exemple), on utilise un produit similaire. n prépare des dilutions de la solution de concentration inconnue. Un réactif permettant de colorer spécifiquement le produit d intérêt est ajouté dans tous les tubes ; tous les tubes sont préparés de la même façon (même volume final, même quantité de colorant, même volume de solution à doser etc) n mesure la D de chaque tube et la concentration du produit d intérêt dans la solution inconnue est déterminée par référence à la gamme étalon (graphe D = f(quantité de produit)). 2 Matériels et méthodes Spectrophotomètre et cuves de 1 ml (l = 1 cm) Méthode 1 : dosage du colorant E162 Bétanine (Formule brute : C 24 N ) en solution dans l eau pure ε λ530nm = M -1.cm -1 Ecrivez un protocole expérimental pour déterminez la concentration en Bétanine de la solution inconnue en M et en g/l Méthode 2 : dosage du phosphore Réactif : 3 ml de molybdate d'ammonium à 10% ; 21 ml d' 2 0 ; 1,5 g de sulfate ferreux ; Attendre la dissolution complète et compléter à 30 ml avec 2 0. Nous utiliserons la méthode de Fiske et Subarow modifiée selon Tausky et Shorr selon le protocole établi ci-dessous : a - Préparation de la gamme étalon: Le dosage du phosphore est très sensible. La courbe d étalonnage est établie en utilisant une solution de phosphate (K 2 P 4 1, M ; MM phosphore = 31, Solution prête à l emploi). 10

12 Etablir une gamme de 8 tubes de 0 à 21 µg de phosphore /tube. Compléter à 5 ml avec de l eau distillée. Ajouter 2 ml du réactif. omogénéiser. Attendre 10 min et lire à 660 nm chaque tube au spectrophotomètre. b - Dosage du phosphore dans le foie Le dosage du phosphore sera réalisé sur un surnageant cellulaire. Pour cela, prélever 5 ml de surnageant. Ajouter 2 ml de réactif. Agiter. Attendre 10 min et lire la D à 660 nm. Préparer un témoin pour faire le zéro de D. 4 Résultats Méthode 1 : Déterminer la concentration massique et molaire de la solution de Bétanine ; adaptez l unité à la grandeur de la concentration. Méthode 2 : Présenter les résultats sous la forme d'un graphe (droite d'étalonnage du dosage). Calculer la valeur de la concentration en phosphore de la solution inconnue en µg/ml et en µmol de phosphate/ml. 11

13 Vendredi 12 Septembre TP IV : Dosage spectrophotométrique des protéines I Précipitation des protéines sans dénaturation par les sels neutres But et principe : à température ambiante, de faibles concentrations en sels neutres facilite la solubilisation des protéines. Ce phénomène est lié à l association des fonctions ionisées des protéines avec les contre-ions apportés par les sels. A l inverse, des concentrations plus fortes en sels neutres peuvent provoquer la précipitation des protéines sans les dénaturer: c'est le relargage des protéines. Les sels les plus utilisés sont le sulfate de magnésium, de potassium ou d'ammonium. La précipitation dépend de la nature et de la concentration du sel, de la nature de la protéine (notamment de sa richesse en résidus ionisables acides et basiques et en résidus hydrophiles de surface) et du p de la solution. Ce phénomène est lié essentiellement à une compétition entre les protéines et les ions ajoutés à la solution pour leur solvatation. Plus la concentration en sels (ions) augmente et plus la proportion de molécules d eau établissant avec ces ions des liaisons faibles est grande. Ces interactions se font au détriment de celles entre l eau et les protéines. Les protéines se désolvatent (d autant plus facilement si elles sont peu hydrophiles) et finissent par s aggrèger et précipiter. n précipite donc d abord les protéines les plus hydrophobes puis les protéines plus hydrophiles au fur et à mesure que l on ajoute des sels. Manipulation: Séparation des albumines et globulines sériques par le sulfate d'ammonium. A 3 ml de sérum, ajouter 3 ml d'une solution saturée de sulfate d'ammonium (N4 + )2S4 2-. bserver un floculat de globulines. Après une centrifugation de 10 minutes à tours/min, un précipité (P1) est récupéré et resuspendu dans 1 ml de tampon. - le dosage protéique de P1 ainsi que du sérum sera réalisé selon le protocole ci-dessus. II Dosage colorimétrique des protéines par la méthode de Folin-Lowry But et principe : La méthode de Folin-Lowry est une des méthodes les plus utilisées pour le dosage colorimétrique des protéines. Elle est basée sur la formation d'un complexe de coloration bleue obtenu par réduction du réactif phosphotungstomolybdique de Folin et Ciocalteu par les protéines en présence d'ions cuivriques. Ce sont les résidus Y, W, C et dans une moindre mesure qui sont responsables de l'apparition de cette coloration bleue. Le mécanisme réactionnel complexe reste assez mal connu. n utilise le plus souvent la sérum albumine bovine (SAB) pour réaliser une gamme étalon qui sert de référence pour doser des protéines diverses dans des solutions de concentration inconnue. 12

14 Manipulation Préparation des réactifs Solution A: Na2C3 2g - Tartrate double de Na et K 0,02g Bien dissoudre dans 100mL de Na 0,1M Solution B: CuS4 0,5g Bien dissoudre dans 100mL d'eau Solution C: Mélanger extemporanément 2mL de B et 100mL de A dans un becher. Réactif de Folin: Faire une dilution (10mL) au quart de la solution commerciale avec de l'eau distillée. Dosage 1. Préparation de la gamme étalon A partir d'une solution aqueuse de sérum albumine bovine (SAB) de concentration connue (2,5 mg/ml), préparer une gamme étalon (en double) de 6 tubes contenant de 0 à 0,5 mg de SAB. Compléter chaque tube à un volume final de 0,2 ml avec de l'eau distillée. 2. Préparation des échantillons a. Lait Deux tubes contenant 200 µl d'une dilution (dans l'eau distillée) respectivement au 1/5 ème et au 1/10 ème de lait seront préparés dans les mêmes conditions. Le protocole est ensuite le même pour tous les tubes: Ajouter 1 ml de solution C dans chaque tube. Vortexer tous les tubes puis attendre 10 minutes. Ajouter 100 µl de réactif de Folin dilué dans chaque tube Incuber 15 minutes à l'obscurité à température ambiante. Lire l'absorbance à 650nm de longueur d'onde en prenant le tube 0 comme témoin. b. P1 et sérum Ecrire un protocole expérimental pour déterminer la concentration en protéines du précipité P1 et du sérum en g/l. 13

15 Mardi 16 Septembre TP V : Solutions tampons 1 bjectifs et principe De la théorie à la pratique : réalisation de solutions tamponnées et contrôle de leur pouvoir tampon. utilisation de l équation de enderson-asselbach. Préparer un tampon est un geste quotidien dans les laboratoires de biologie. Les erreurs peuvent être fatales pour les manipulations envisagées avec des protéines ou des cellules vivantes par exemple!! Expliquer pourquoi. Cette préparation doit être bien comprise et bien maîtrisée et nécessite de savoir utiliser les masses molaires, les concentrations massiques et molaires, les pkas, les dilutions etc Vous disposez en salle de TP de différents sels et solutions acides et basiques que vous utiliserez de façon rationnelle pour réaliser une solution tampon. 2 Matériel : p-mètre Agitateurs magnétiques Balance de précision Fiole jaugée100ml Béchers 100mL, 50 ml Flacons 30 ml Produits et solutions Produits disponibles K 2 P 4 cristallisé K 2 P 4 cristallisé Acétate de sodium Acide acétique Na 100 mm Cl dilué (100 mm) Masses molaires (g/mol) 174,18 136,09 82,03 60,05 40,00 36,16 commentaires pkas Acide phosphorique : pka s Ac à déterminer P 3 C ACIDE PSPRIQUE ACIDE ACETIQUE 3 Manipulations a- Détermination du pka du couple acide acétique/acétate par une méthode empirique Solutions disponibles : acétate de sodium : (82,03 g/mol) solution de concentration 4,101 g/l acide acétique glacial ultra pur : (d = 1,05g/mL ; MM : 60,05 g/mol) 14

16 Etapes de la manipulation 1- Calculs préliminaires - déterminer le volume d Cl fumant nécessaire pour préparer 100 ml d Cl à 100 mm. Pour information : on utilise de l Cl fumant : pureté 37% ; d=1,19. - calculer la concentration de la solution d'acétate de sodium en M 2- Un peu de réflexion - proposez une méthode simple pour déterminer le pka de l'acide acétique - proposez une méthode simple pour tester le pouvoir tampon de votre tampon acétate 3- Mise en œuvre - après avoir proposé votre méthode à l'enseignant, préparez 50 ml d'une solution tampon acétate de concentration 25mM qui vous permettra de déterminer expérimentalement le pka de l acide acétique - Testez son pouvoir tampon, quel protocole allez vous utiliser? b- Préparation d un tampon phosphate Utilisez l'équation de enderson-asselbach pour préparer 100mL d un tampon phosphate 10mM, p (défini en cours de séance) à partir des sels de phosphate cristallisés K 2 P 4 et K 2 P 4 Préparez vos calculs et faites les vérifier par l enseignant avant de faire la manipulation 15

17 Mercredi 17 Septembre TP VI : Préparation d'une solution physiologique complexe I Introduction/But du TP Une solution physiologique est un liquide isotonique au sang, c'est à dire présentant la même osmolarité que les principaux fluides corporels, en particulier le sang, soit environ 300 milliosmoles par litre (mosm/l). Cette solution est nommée liquide physiologique. Définition de la pression osmotique : La pression osmotique se définit comme la pression minimum qu'il faut exercer pour empêcher le passage d'un solvant d'une solution moins concentrée vers une solution plus concentrée au travers d'une membrane semi-perméable. La pression osmotique est proportionnelle aux concentrations de solutés de part et d'autre de la membrane et de la température. Lorsqu'il y a plusieurs solutés, il faut prendre en compte la totalité des solutés. La solution la plus concentrée en soluté est dite hypertonique par rapport à l'autre. La solution la moins concentrée en soluté (la plus diluée) est dite hypotonique par rapport à l'autre.si les 2 solutions ont la même concentration, on les dit isotoniques l'une par rapport à l'autre. L'osmolarité est une mesure de la concentration qui s'exprime en nombre de particules dissoutes par unité de volume (sm ou msm/l). L'osmolarité est calculée par la formule : sm = C[1+α(n-1)] C = concentration molaire (mol/l) α = coefficient de dissociation du soluté qui varie de 0 (pas de dissolution) à 1 (dissolution totale) n = nombre de particules obtenues par la dissociation du soluté. Pour le glucose =1 pour le NaCl = 2 La solution physiologique basique est composée d'eau stérile et de chlorure de sodium (NaCl) dilué à 9 pour Elle est improprement appelée sérum physiologique bien qu'il ne s'agisse pas d'un sérum. Pour l'étude de certains organes ou préparations cellulaires, le liquide physiologique doit être beaucoup plus complexe et reproduire au mieux la composition du milieu extracellulaire naturel. En plus du chlorure de sodium, le liquide physiologique pourra contenir des chlorures de potassium, de magnésium et de calcium, du glucose, des sels tampon (phosphates, Tris, EPES). L'origine de ce liquide physiologique complexe revient à Sydney Ringer, premier scientifique à avoir utilisé une telle solution pour l'étude des mécanismes physiologiques reliant le nerf au muscle squelettique de grenouille. Utilisations : La solution physiologique est utilisée en médecine et en science pour : - nettoyer le nez, les yeux, les plaies - y plonger provisoirement certains organes isolés du corps pour les maintenir en vie ou en bon état à des fins d'observations, d'analyses physiologiques, de réimplantation. - maintenir des cellules isolées en conditions de vie et/ou d'activité optimales à des fins d'observations, d'analyses et de réimplantation. 16

18 - composer des solutions de réhydratation injectées en perfusions intraveineuses suite à une déshydratation, une hémorragie, une baisse de pression artérielle ou pour des patients ne pouvant pas boire ou s'alimenter. - remplir certaines prothèses (par exemple mammaires), afin qu'en cas de perforation, le liquide de remplissage soit sans danger pour le corps. II Préparation de la solution physiologique complexe Composition de la solution physiologique complexe : NaCl KCl MgCl 2 Glucose EPES CaCl 2 0,26 M 11,2 mm 2 mm 24 mm 16 mm 4 mm Ajuster le p à 7,4 avec du Na 5M. Cette solution est considérée comme étant 2X. 1) Définir cette appellation de "2X". 2) Rechercher les masses moléculaires de tous les composants. 3) Estimer quel volume de solution vous devez préparer selon les besoins de la manipulation. Faites valider ce résultat par l'enseignant avant de poursuivre. 4) Calculer le poids à peser de chacun des composants selon la concentration finale voulue et le volume précédemment défini. Faites valider tous vos calculs par l'enseignant avant de poursuivre. 5) Déterminer l osmolarité de cette solution 5) Définissez le protocole de réalisation de cette solution : récipients/instruments de mesure à utiliser, ordre de pesée des composants, ajustement du p, volume d'eau à ajouter etc Faites valider cette démarche par l'enseignant avant de poursuivre. 6) Réalisez cette solution. III Test de la solution physiologique réalisée 1 bjectifs Les objectifs de cette étape sont multiples : 1) Tester la validité de votre solution, 2) Etudier le principe d'osmolarité d'une solution sur une cellule vivante (globule rouge), 3) Améliorer votre aisance à réaliser des dilutions de solution, 4) Utiliser un microscope optique, 5) Faire des mesures de diamètre de cellules à l'aide d'une échelle de graduations micrométriques, 6) Présenter les différentes mesures sous la forme d'un tableau, répertoriant les moyennes de n mesures et les écartypes associés. 7) Appréhender ainsi les notions de reproductibilité des mesures et de recherche des problèmes expérimentaux potentiels. 17

19 Le test que vous allez réaliser permet d'étudier le comportement des hématies en présence de la solution physiologique complexe utilisée à différentes dilutions, donc à différentes concentrations, donc à différentes osmolarités. 2 Matériels et Méthodes Modèle cellulaire : Globules rouges ou hématies ou érythrocytes de sang de bœuf frais additionné d'un anticoagulant (héparine) récupéré dans un abattoir. Matériels : Tubes à essai de 5 ml Portoir Lame de microscope et lamelle Microscope optique avec un objectif x100 Lentille oculaire/ou oculaire gravé(e) avec une échelle à graduations micrométriques Solution physiologique complexe 2X, préparée précédemment Méthode : Préparer des dilutions de la solution physiologique complexe à 1X, 0,5X, 0,1X 1) Définir le volume final de solution nécessaire pour l'expérimentation. Faites valider ce volume par l'enseignant avant de poursuivre 2) Faire les calculs de dilution nécessaire pour la réalisation de chaque solution. Faites valider ce volume par l'enseignant avant de poursuivre 3) Réaliser ces solutions. 4) Préparer des tubes à essai avec 5 ml des solutions suivantes : 2X ; 1X ; 0,5X ; 0,1X ; Une solution inconnue fournie par l'enseignant Noter la concentration des solutions sur chaque tube. 6) Mettre 2 gouttes de suspension d'hématie dans chaque tube, homogénéiser doucement. 3 bservations et résultats 1) bservations macroscopiques Comparer immédiatement l'aspect des 5 tubes et noter les différences éventuelles : coloration, limpidité, suspension, présence de phase etc Faire un tableau récapitulatif des caractéristiques observées. Ensuite, prendre soin de ne plus remuer les tubes et observer l'évolution de la préparation avec le temps. 2) observations microscopiques Prendre un petit volume (50 µl-100 µl) de suspension cellulaire dans chacun des tubes. Déposer ce volume sur une lame de microscope et recouvrir la préparation d'une lamelle. bserver les hématies au microscope, avec l'objectif x100, sans mettre d'huile à immersion. L'utilisation de l'objectif X100 sans huile à immersion ne correspond pas à une utilisation correcte du microscope. L'objectif 100 s'utilise toujours avec de l'huile à immersion. Exceptionnellement pour cette observation, afin éviter d'avoir à fixer de façon étanche la lamelle sur la lame et afin d'éviter un mélange eau/huile, vous utiliserez 18

20 cet objectif sans huile. Veiller à faire une mise au point progressive, à l'objectif x20, puis x60 et enfin x100. Suivez rigoureusement les conseils d'utilisation donnés par l'enseignant. L'observation microscopique est basée sur évaluation de : 1) la forme des hématies : rondes, biconcaves = normale crénelées ou flétries = plasmolyse gonflées = turgescence éclatées = hémolyse milieu ypertonique : Plasmolyse, GR crénelés milieu isotonique milieu ypotonique : gonflement et hémolyse 2) la taille : mesurer le diamètre de 10 à 15 hématies (même 20 si possible). Calculer le diamètre moyenne des hématies et l'écart type correspondant pour chaque solution, grâce à l'échelle à graduation micrométrique positionnée dans un des oculaire. 3) Expression des résultats : 1) Récapituler sous la forme d'un tableau, les observations macroscopiques et microscopiques ainsi que le diamètre cellulaire moyen pour chaque condition. 2) Calculer l'osmolarité des solutions physiologiques utilisées. 3) Comparer les résultats obtenus. 4) Expliquer les résultats obtenus et conclure sur l'importance du processus d'osmolarité sur la survie et le fonctionnement des cellules. 19

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