1. Dénombrement de levures

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1 1. Dénombrement de levures Les microbes qui nous entourent ne sont pas toujours des pathogènes. Bien au contraire! Les petits pains ou la tresse du dimanche matin sont des exemples bienfaisants d utilisation de micro-organismes! Les levures peuvent se garder facilement Taille des microbes Travail dans des conditions stériles Nombre de micro-organismes Une levure donne lieu à une colonie 0.7 g de levure dans 10 ml Etalement de 0.1 ml, facteur de dilution de 10x A partir de ce résultat, vos élèves peuvent estimer le nombre de levures vivantes dans un cube de levure 2.9 x levures!! Pipettes stériles Propipette Pipettes automatiques p200 (avec embouts) Tubes à essai (stériles) Erlenmeyer stérile Chambre Thoma ou Kova Pipettes pasteurs pour étalement Sacs pour déchets H2O stérile (pour dilution) Boîtes de Petri YPD Ethanol Matériel non fourni: Bec bunsen Balance Cubes de levure Cuvettes pour spectrophotomètre (option) Spectrophotomètre (option) Béchers pour étalement

2 2. Les enzymes de restriction Les enzymes de restriction ont comme peu d autres découvertes en biologie révolutionné nos approches expérimentales. La découverte des enzymes de restriction a permis l essor du génie génétique et de ses applications qui influencent notre vie au quotidien. Il n y a pas si longtemps, nous avons voté sur le génie génétique, et nous serons certainement de nouveau amener à réfléchir sur d autres questions similaires. Enzymes de restriction Fréquence de coupure Séparation et visualisation des fragments Cartes de restriction des plasmides utilisés Le résultat Dans le gel il est possible de voir que l enzyme MspI, qui reconnaît une séquence de 4 paires de bases, coupe beaucoup plus souvent que BamHI, qui coupe une séquence de 6 paires de bases. Dans le plasmide puc19-tif1, un fragment d environ 5000 paires de bases a été cloné dans le plasmide d origine, puc19. Coupé par BamHI, il est possible de voir deux fragments: le plasmide d origine et l insert. Pipettes automatiques (p20) et embouts Pipettes automatiques (p200) et embouts Tubes de réaction, type Eppendorf Appareils d électrophorèse (source et cuve) Bloc chauffant (37 C) Tampon d électrophorèse (TBE 1x) Agarose Solution de SYBR-safe Enzyme de restriction BamHI Enzyme de restriction MspI Tampon de restriction Tampon de charge ADN puc19 ADN puc19-tif1 Marqueur de taille H20 stérile Propipettes

3 3. Clonage d'un gène dans un plasmide Le fait de cloner un gène consiste à l insérer dans un vecteur (plasmide) et de le multiplier de façon identique à volonté. Cette technique utilise les outils de génie génétique. Elle permet de transférer des gènes d autres espèces dans les bactéries et de les faire produire, par exemple des facteurs humains à des fins thérapeutiques. Clonage moléculaire restriction, ligation transformation bactérienne P20, P200 et pointes jaunes Blocs chauffant Tubes Eppendorf stériles H2O stérile Boîtes LA-X-Gal: (ampicilline, ampicilline+ chloramphénicol, chloramphénicol) ADN puc19 ADN php45-cmr Enzyme de restriction BamH Tampon de digestion (10x) ADN ligase Tampon de ligation (10x) Cellules compétentes Escherichia coli (dh5α) Bloc réfrigérant pour les enzymes Ethanol et râteau pour les étalements

4 4. Transformation de bactéries La transformation est un processus naturel qui contribue à l évolution des microbes et au transfert de facteurs de virulences entre bactéries pathogènes transformation sélection bioluminescence résistance aux antibiotiques Cette expérience fait partie de l expérience 3, mais peut très bien être utilisée toute seule pour démontrer la puissance de sélection. Cette expérience est appropriée pour des discussions autour des antibiotiques et de l évolution. Dans cette expérience il y a deux messages importants: 1) la puissance de la sélection 2) l apport d un nouveau phénotype. Ici la sélection est énorme. Il est possible de trouver une bactérie dans 100 millions. Ceci reflète la sélection dans l environnement ou lors d une infection. Cette sélection peut être la résistance à une substance toxique, l utilisation d une substance nondégradable et nocive pour l environnement ou, hélas, l apparition d une bactérie résistante à un antibiotique. Si vous regardez les boîtes dans le noir, vous verrez de la lumière Pipettes p20 et embouts stériles Pipettes p200 et embouts stériles Pipettes p1000 et embouts stériles Pipettes pasteur pour étalement Bechers pour ethanol Microcentrifugeuse Bain-Marie 37 C Bain-Marie 42 C Tubes à réaction (Eppendorf 1.5ml) Ethanol pour étalement H2O stérile plasmide lux117 2 Boîtes de Petri LA 2 Boîtes de Petri LA+Amp 0.5M CaCl2 (solution 10x, à diluer dans de l'h2o stérile) Bec bunsen Spectrophotomètre (en option) Cuvettes (en option)

5 5. La coloration de Gram Les bactéries peuvent être groupées en 2 catégories selon la méthode de coloration de Gram. Cette technique a été mise au point en 1884 par Hans Christian Gram, un bactériologiste danois. Après coloration, les bactéries Gram+ deviennent violettes alors que les bactéries Gram- apparaissent en rose. La coloration de Gram permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi bactérienne, et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier. L avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme. Coloration de Gram Analyses médicales Visualisation des bactéries Étaler et fixer le prélèvement à la chaleur 1) Coloration par le violet de gentiane. Laisser agir 1 minute. Rincer 2) Etaler le lugol et laisser agir 1 minute. Rincer 3) Décoloration (rapide) à l'alcool ~ 5 à 10 secondes. Rincer 4) Recoloration à la safranine. Laisser agir 30 secondes. Rincer. Sécher Observer avec une goutte d'huile à immersion (grossissement x1000) Boîtes de Petri contenant diverses bactéries Réactifs pour la coloration de Gram Frottis de bouche Matériel non fourni: Pissette d H2O pour les rinçages Bec bunsen Lames huile à immersion microscope (grossissement 40 à 1000 x)

6 6. La rétroinhibition Chaque cellule essaye d économiser un maximum ses ressources. Si un produit synthétisé par la cellule est déjà présent en abondance sa production sera bloquée. Souvent ce phénomène est dû à l'interaction du produit final avec un une molécule servant comme répresseur de l'expression des gènes de biosynthèse. Ce phénomène est dénommé la rétroinhibition. l expression des gène est régulée Dans cette expérience, nous utilisons le fait qu une levure, avec une déficience dans la production de l adénine, a un phénotype visible, elle devient rouge. phénotype/génotype Le Résultat Le résultat se décompose en trois parties: Au centre autour de la pastille qui contient beaucoup d adénine, la levure pousse aisément et reste blanche Dans le cercle suivant, la levure a encore assez d adénine pour pousser, mais le milieu est limité en adénine et la levure essaye de produire de l adénine. Un produit intermédiaire s accumule et s oxyde en pigment rouge Vers l extérieur, il n y a plus assez d adénine pour permettre à la levure de pousser. Dans l expérience à droite, une partie des levures ont été recouvertes et mises en anaérobiose. En absence d oxygène le pigment rouge n est pas produit. Souche de levure ade2 (CW04) Boîtes SD sans adénine Solution stock d'adénine (2g/l) Filtre rond P200 et pointes jaunes Matériel non fourni: Spatule ou scalpel Pincette Etuve 30 C Pipettes pasteur pour étalement Ethanol Béchers pour éthanol

7 7. Mutagenèse par l UV L'irradiation par les rayons ultraviolets (UV) provoque la formation de nombreuses modifications de l'adn et est responsable de la majorité des cancers de la peau. En utilisant le phénomène de la biosynthèse de l adénine décrit dans l expérience 6, cette expérience met en évidence l effet mutagène des UV. En allant plus loin, cette expérience permet d analyser les courbes de survies, de visualiser le phénomène de photoréversion, de tester l efficacité des crèmes solaires et d aborder les questions de révertants. Mutations Ultraviolets Photoréversion Courbes de survie Les levures sont étalées sur une boîte de pétri puis soumises à différentes durées d irradiation aux UV lampe UV (254 nm) tubes pour les dilutions pipettes en verre 10 ml propipettes pipettes automatique (P200) et embouts pipettes Pasteur pour faire des râteaux d'étalement béchers et alcool pour l'étalement lunettes de protection gants souche de levure ade2 H2O stérile pour les dilutions 5 boîtes YPD sans adénine Facultatif : boîtes SD sans adénine Cure-dents stériles Matériel non fourni: pipettes Pasteur pour faire des râteaux d'étalement

8 8. Détection de micro-organismes Cette expérience simple permet de se rendre compte de la multitude de microorganismes avec lesquels nous vivons et sans lesquels nous ne pourrions pas vivre. Nous avons environs bactéries sur notre peau, dans notre bouche et dans notre tractus digestif soit 10 fois plus que le nombre de nos cellules! Microbiologie Environnement Culture sur boîtes de Petri Colonies Moisissures Sur notre planète, il y aurait plus de (1 quintillion) de bactéries et nous sommes quelques (6.5 milliards) d êtres humains!!! Il suffit simplement de contaminer (ensemencer) un boîte de Petri contenant un milieu nutritif pour micro-organismes. Pour cela on touche directement le milieux avec les doigts par exemple, ou avec un coton-tige que l on a frotté quelque part. En quelques jours de jolies colonies apparaissent. Les élèves d une classe du Cycle d orientation ont effectué l expérience. Voici les résultats des microbes présents sur leurs doigts. Doigts dans le Pétri coton-tige frotté sur la peau. coton-tige frotté dans la terre. Boîtes de pétri contenant le milieu de culture Cotons-tiges stériles Boite de parafilm Sac jaune pour les déchets

9 9. Extraction et visualisation d ADN L ADN est une molécule qui fascine. A juste titre d ailleurs puisqu elle porte l information génétique faisant d un organisme (ou d une cellule) ce qu il est. Cette molécule peut-être facilement isolée et visualisée sous forme de filaments visqueux ou de précipités. Extraction d ADN L ADN en chiffres Génome humain: Bactérie E. coli: 6.4 milliards de paires de nucléotides 23 paires de chromosomes. Plus de 2 mètres d ADN par cellule! 3'500'000 paires de nucléotides 1 chromosome 1.4 mm d ADN (E. coli mesure mm de long!). Structure et dimension de l ADN Purification d ADN Au total, l information contenue dans le génome humain correspond à 200 annuaires téléphoniques, celle contenue dans le génome d une bactérie correspond à un livre de poche! Il existe de nombreux protocoles pour extraire simplement de l ADN de différents organismes vivants. Les plus utilisés sont l oignon, l épithélium buccale, la banane, le kiwi Voici un exemple d extraction d ADN de bactéries. Détergent Chaleur Ce protocole à l avantage d être très simple et très rapide. Des bactéries (quelques milliards) sont prélevées et transférées dans un tube. La lyse des cellules est visible par un éclaircissement de la culture. L ADN est alors libéré des bactéries et donne un aspect visqueux et filamenteux à la solution. De l alcool est alors ajouté délicatement. L ADN étant insoluble dans l alcool, il va former une pelote, visible à l œil nu. Pour l extraction à partir de culture de bactéries: 1 culture d E.coli P1000 et pointes bleues Ethanol SDS 2% Bloc chauffant tubes Matériel non fourni: L extraction d ADN sur les tissus peut être effectuée à l aide de produits vendus dans le commerce: Alcool à bruler Liquide vaisselle Sel de cuisine Filtres à café

10 10. La PCR La PCR (ou réaction de polymérisation en chaine) est devenu un outils précieux dans bien des domaines touchant la biologie. Que ce soit dans la recherche, les analyses médicales, la systématique ou la criminologie. Cette technique permet d amplifier des millions de fois un unique fragment d ADN. Polymérisation de nucléotides Génotypage Criminologie Electrophorèse Vérifiez que le cheveu possède bien son bulbe M : marqueur de taille. Lignes 1 à 5 : génotype de 5 individus. Noter que l individu 1 est homozygote pour l allèle D1S80.C- : contrôle négatif (sans ADN), ce contrôle permet de vérifier l absence de contaminations d ADN. P : primers. Pipettes p20 et embouts stériles Pipettes p200 et embouts stériles Gants Microcentrifugeuse (option) Bloc chauffant 95 C Tubes à réaction (Eppendorf 1.5ml) Tubes PCR (0.2 ml) Machine PCR H2O stérile NaOH (200 mm) HCl (200 mm) Tris-HCL ph 8.5 (200 mm) 2x mix PCR (comprenant la Taq DNA polymérase, les dntps et le tampon) Primers Agarose Cuve d'électrophorèse Tampon de migration TBE 1x SYBR-Safe Lampe de détection d'adn (lumière bleue) Marqueur de poids moléculaire