Rapport de biologie : mutagenèse par l UV

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1 Rapport de biologie : mutagenèse par l UV But : Ce laboratoire a pour but de mettre en évidence l effet néfaste des rayons ultraviolets sur l ADN. Nous utilisons pour cela des levures modifiées génétiquement dans le gène ADE2 impliqué dans la biosynthèse de l adénine. Ces mutants seront introduit dans un milieu sans adénine pour les obliger à vouloir en synthétiser. Ils n obtiendront qu un produit rouge que l on pourra observer. Théorie : L ADN d une cellule permet la formation de protéine grâce à un code formé d une succession précise de 3 bases. Ces trio de bases produiront des enzymes spécifiques qui modifieront tour à tour un produit précurseur en une protéine (ex : Adénine) de la même façon qu une chaîne de montage. On appelle ce travail la biosynthèse. Une fois que la protéine est en quantité suffisante dans la cellule, elle stoppe sa propre production en interférant avec le gène créant la première enzyme de la chaîne. Ceci permet d éviter un gaspillage d énergie et s appelle la rétroinhibition. Lorsqu une cellule est exposée à des rayons ultraviolets, il peut y avoir mutation dans l ADN de la cellule. En effet les UV atteignant l ADN cassent les faibles liaisons hydrogènes des bases azotées de l ADN et apportent assez d énergie pour qu une liaison entre deux bases voisines se crée. Cette liaison a pour conséquence une sorte de «trou» dans la lecture d un des brins du code génétique de la cellule l empêchant ainsi de synthétiser correctement une certaine enzyme et donc une certaine protéine. Ce sont sur ces mutations que s appuie notre expérience. Nos levures de départs sont toutes sujettes à une même mutation ciblée sur le gêne ADE2. Ce gène permet normalement la synthèse d une enzyme qui joue un rôle dans la biosynthèse de l adénine. Sans ce gène, les levures arrêteront leur «chaîne de montage» à un produit intermédiaire. Etant donné que seule l adénine peut inhiber sa production, le produit intermédiaire va s accumuler dans les levures et deviendra rouge en s oxydant. Grâce à ce pigment, nous pourront facilement observer si l exposition aux UVC (rayons UV à haute énergie) entraînera de nouvelles mutations dans les générations de levure suivantes. Accumulation du pigment rouge

2 Résultats Attendus : Suite à l irradiation des levures, nous nous attendons à plusieurs cas de figures possibles : - La levure peut réussir à réparer sa mutation du gène ADE2 grâce à une enzyme se nommant la photoliase qui s active en présence de photon. Ce sera un révertant et les générations suivantes ne seront plus rouge. => Colonie blanche - La levure peut devenir aussi un pseudo-révertant, ceci peut se produire lorsque la levure possède un autre code génétique lui permettant de synthétiser de l adénine. => Colonie blanche - Une levure peut perdre sa couleur rouge si les UV mutent un gène en amont de l ADE2 dans la chaîne de synthèse de l adénine ce qui n entraîne pas l accumulation du même produit intermédiaire. => Colonie blanche - Il ne faut pas oublier que le produit intermédiaire suite à la mutation du gène ADE2 a besoin d oxygène pour prendre sa couleur rouge. Des levures peuvent ne pas être rouge parce qu elles ne sont pas en contact avec de l oxygène. => Colonie blanche ou bicolore - Il existe aussi une très petite probabilité que les UV «démutent» la paire de bases d ADN voisines et rétablissent ainsi une liaison normale dans le code génétique de la levure mais nous négligeront cette hypothèse dans l analyse de nos résultat. - Dans tout les autres cas, les levures garderont leur mutation ADE2 de départ et subiront sûrement d autres mutations qui ne seront pas mesurables dans ce laboratoire. => Colonie rouge - Des colonies bicolores peuvent aussi apparaître à cause du mode de reproduction des levures. En effet, étant donnée que les levures n ont qu un seul brin d ADN muté, la duplication de l ADN lors de la reproduction crée un ADN sain et un ADN muté donnant naissance ainsi dans la même colonie des levures blanches et des levures rouges. Déroulement de l expérience : Matériel : Lampe UV (254 nm) Tubes pour les dilutions Micropipettes (200ul et 50ul) Râteau et crosse faites à partir de pipettes pasteur Eau stérile Boîtes de culture avec milieu nutritif Souches de levure ade2 Gants et lunettes de protection anti-uv

3 Manipulations : 1) Préparation de la suspension de levure : on prélève une colonie de levure ade2 que l on dilue 1000x afin d obtenir environ 1000 levures par ml. Nous vérifierons cette concentration plus tard grâce au microscope. 2) Étalement des levures sur 6 boîtes YPD : pour chaque boîte, on vortexe la solution afin d avoir une concentration homogène, on pipette 100ul qu on étale grâce au râteau stérilisé. 3) Mutagénèse : On expose 5 boîtes à 0,10,20,30 et 40 secondes sous une lampe à UV (254nm). Puis une 6 e boîte 30 secondes que l on protégera immédiatement de la lumière du jour pour empêcher la photoréversion, l activité de la photoliase chez la levure. 4) Incubation : On laisse ensuite reposer les boîtes pendant environ une semaine, dans un four à 30 degrés. La température est optimale pour le fonctionnement des enzymes chez nos levures, cette étape permet de donner le temps aux colonies de se reproduire. 5) Résultats : On compte le nombre de colonies que l on classe en fonction de leur taille (grande, moyenne, petite) et de leur couleur (blanche, rouge, bicolore). Une grande colonie sera issue d une levure avec peu de problèmes génétiques alors qu une petite sera constituée de levures se reproduisant plus difficilement. Ces difficultés sont dues à la santé génétique de la cellule. Résultats : 1) Après 0sec : Grande Moyenne Petite Total Rouge Blanche Bicolore ) Après 10sec : Grande Moyenne Petite Total Rouge Blanche Bicolore ) Après 20sec : Grande Moyenne Petite Total Rouge Blanche Bicolore

4 4) Après 30sec Grande Moyenne Petite Total Rouge Blanche Bicolore b) Après 30sec : sans photo réversion : Grande Moyenne Petite Total Rouge Blanche Bicolore ) Après 40sec : Grande Moyenne Petite Total Rouge Blanche Bicolore Analyse des résultats : La première boîte, n ayant pas été exposée aux UV, ne peut contenir que des révertants, des pseudorévertant ou des levures en manque d oxygène. L absence de colonies totalement rouges nous permet tout d abord de déduire que le milieu manquait d oxygène. En effet cette boîte était la première à être placée au fond du sac en plastique dans l étuve. Les colonies blanches sont donc soit des levures en manque d oxygène soit des levures ayant effectué la photoréversion ou les deux mélangées. On pourrait les différencier en les laissant un moment à l air libre, ainsi le produit intermédiaire de l adénine aurait pu s oxyder et se colorer. La taille nous donne aussi un indice sur les individus présents dans les colonies. En effet, les 5 grandes colonies sont sûrement issues de levures réparées car leur grande capacité de reproduction est une preuve de leur bonne santé. Les plus petites sont donc des pseudo-révertants ou des mutées ADE2 sans oxygène. La colonie bicolore est une colonie qui a eu accès à de l oxygène. On ne peut déterminer ses «habitants» qu en observant la forme de la répartition des couleurs. Si le rouge forme un anneau autour du blanc c est que l oxygène n était accessible qu aux bords de la colonie, elle sera donc constituée uniquement de levures mutées ADE2. Si le rouge et le blanc partagent clairement la colonie en deux zones côte à côte, c est un mélange de levures saines et mutées ADE2 du à la duplication d un brin d ADN sain et d un brin d ADN muté. La deuxième boîte contient un grand nombre de colonies rouges, elle a du donc être plus exposée à l oxygène que la première. Elle contient cependant deux colonies totalement blanches. Etant donné la présence d oxygène dans le milieu, l hypothèse de levures mutées ADE2 blanches dues à un manque d oxydation est écartée. Ces colonies sont des levures soit révertantes, soit pseudo-

5 révertantes, soit victimes d une mutation à un gène en amont de l ADE2 à cause des 10 secondes d exposition aux UV. Pour séparer ces cas de figures il faudrait pouvoir détecter si il y a de l adénine dans les levures ou non. Les bicolores sont analysées de la même manière que la boîte 1. Pour l instant, le nombre total de levure est en diminution ce qui est logique étant donnée que l irradiation peut directement tuer les levures. La 3e boîte est analysée de la même sort que la deuxième boîte, cependant, elle a été plus longtemps exposée aux UV. On devrait donc s attendre à un nombre de colonies moins élevé, ce qui n est pas le cas. Etant donné que cette boîte contient un nombre de colonies bien plus grand que les autres, nous pensons qu une erreur de concentration est la cause de l incohérence. En effet, si la solution contenant les levures n a pas été vortexée juste avant le pipetage, il est possible d avoir eu une concentration plus élevée que la moyenne du tube car les levures sédimentent rapidement. Après 30 secondes, les 4e boîtes contiennent nettement moins de colonies que les autres boîtes. Elles sont donc cohérentes par rapport à la nocivité des rayons ultraviolets sur les levures. Il y a aussi cohérence entre les deux boîtes. Le nombre de colonies rouges est plus petit chez la boîte avec photoréversion et le nombre de colonie blanche est plus grand. Cela prouve l action de la photoliase chez les levures exposées à la lumières contrairement aux autres, cachées immédiatement après l irradiation. La dernière boîte est moins évidente à décrire. On peut supposer déjà qu il y a eu une erreur de concentration du même type que l erreur de la boîte 3 car il est très peu probables qu après 40 secondes, il y ait plus de colonies survivantes qu après 30 secondes. La quantité de colonies rouges est aussi démesurée. Il est étonnant qu après 40secondes d irradiation il reste autant de levures conservant leur capacité à synthétiser le produit intermédiaire rouge. Les mutations engendrées pas les UV n ont donc pas du toucher la chaîne de synthèse de l adénine. Normalement le nombre de colonies blanches devrait être plus élevé que celui de rouge et le nombre de colonies total devrait être le plus bas. Exemple de graphique cohérent Les deux graphiques ci-joint mettent bien en évidences nos résultats aberrants. Les courbes de colonies blanches et bicolores ne sont pas encore si imprévues que ça étant donné qu il y a d abord une augmentation de mutants suite aux rayonnements puis une diminution générale du nombre de colonie due à l effet néfaste des UV tuant ainsi de nombreuses levures. Cependant, l augmentation générale de la population de levures et surtout celle des rouges après 30 secondes est juste impossible. Il y a forcément une concentration de levures différentes entre la boîte des 30 secondes et celle des 40 secondes. De plus même si erreur de concentration il y avait, le nombre de colonies blanches et bicolores serait lui aussi plus élevé que celui des autres boîtes ce qui n est pas le cas... En tant que lot de consolation, la vérification de nos dilution au microscope nous à donné une concentration moyenne de 5000 levures par millilitre dans le tube de prélèvement ce qui n est pas très éloigné de l ordre de grandeur demandé dans le protocole.

6 Rapport de biologie : La mutagenèse par UV Coline Waller et Antoine Hoffmann Collège Calvin Novembre 2012

7 Rapport de biologie : La mutagenèse par UV Coline Waller et Antoine Hoffmann Collège Calvin Novembre 2012