Microscopie photonique

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1 Plan Lumière et interactions avec la matière Formation de l image Microscopies en fond clair / fond noir Microscopies de phase et interférentielle Microscopie de fluorescence Microscopie confocale Capteurs d images

2 Nature de la lumière L élément constituant de la lumière est le photon Le photon est de nature duale : onde / corpuscule onde électromagnétique lors de son trajet corpuscule lors d une interaction avec la matière Un rayon lumineux est un flux parallèle de photons

3 Le photon : onde électromagnétique E longueur d onde (λ) M Sens de propagation

4 Le photon : longueur d onde = couleur bleu λ 450 nm vert λ 520 nm rouge λ 680 nm

5 Monochromatisme - Lumière blanche Faisceau monochromatique bleu ( λ 450±10 nm) Faisceau monochromatique rouge ( λ 650±10 nm) Faisceau polychromatique blanc ( λ [ ] nm)

6 Lumière : spectre visible 400nm 500nm 600nm 700nm Ultraviolets Infrarouges

7 Lumière - polarisation E E M Faisceau polarisé M Faisceau non-polarisé axe de vibration

8 Absorption Microscopie photonique Interactions lumière-matières atténuation, réduction du nombre de photons filtrage, sélection de longueurs d onde Réfraction retard, déphasage déviation, séparation de longueurs d onde biréfringence Réflection Diffraction interférences, filtrage Fluorescence - Transfert d énergie

9 Absorption de la lumière - Atténuation I 0 I I < I 0 Absorbance : I 0 / I Matériau absorbant

10 Absorption sélective (filtrage) grandes longueurs d onde Lumière blanche Lumière filtrée Matériau absorbant sélectif

11 Réfraction - vitesse de propagation n n n n Indice de réfraction : = c / ν i i n i varie en légèrement fonction de λ n 1 2,25 n 2

12 Réfraction - Déphasage n 2 n 1

13 Réfraction - Déviation (monochromatique) n sin α 1 1 = n sin α 2 2 α 1 α 1 n1 n1 n 2 n 2 α 2 α 2 n 1 > n 2 n 1 < n 2

14 Réfraction - Déviation (monochromatique) α 1 n 1 α c n 1 n 2 n 2 α 2 n 1 > n 2 angle critique réflection

15 Réfraction - Déviation (polychromatique) α 1 n 1 > n 2 α 1 n 1 n 1 n 2 n 2 Dispersion des couleurs Séparateur de longueurs d onde

16 Biréfringence Rayons parallèles polarisés orthogonalement Lumière monochromatique non-polarisée Milieu anisotrope (Calcite CaCO 3 )

17 Diffraction - Dispersion de la lumière Rayons diffractés Rayon incident

18 Diffraction et interférences x I franges d interférence Ecran

19 Fluorescence - principe e 1 = hνh 1 Absorption e 1 > e 2 λ 1 < λ 2 Emission e 2 = hνh 2 noyau noyau orbitale haute (état excité) orbitale basse (état de repos)

20 Formation de l image Définition d une lentille convergente Chemins optiques Optique limitée par la diffraction Disque de Airy Pouvoir séparateur Ouverture numérique Abérrations

21 Lentille objectif Foyer objet Foyer image Fronts d onde

22 Optique limitée par la diffraction Source ponctuelle rayons diffractés Plan image

23 Formation de l image - Diffraction Image idéale d un point Image obtenue (disque de Airy) intensité intensité distribution idéale fonction d étalement (PSF)

24 Pouvoir séparateur intensité intensité points résolus points non-résolus

25 Effet de l ouverture numérique α D iris α iris α Ouverture numérique NA = n sin α,, D: distance de travail

26 Résolution - Pouvoir séparateur d un objectif Résolution latérale Rx = 1,22 λ 2 NA = 1,22 λ 2 n sin α intensité R points résolus Résolution axiale Rz = 4 λ NA 2 4 λ = 2 (n sin α) Profondeur de champ λ Z = ( ) 2 ] 4 n [ NA n

27 Objectifs à air ou à immersion liquide d immersion B A C B A C n 2 n 3 n 1 n 1 n 2 n 1 Objectif à sec n 3 n 1 Objectif à immersion

28 Abérration chromatique Sans correction angles de réfraction : rouge < vert < magenta Avec correction Lentille divergente

29 Fond clair : illumination critique objet source lentille collectrice plan objet objectif image de la source

30 Illumination critique : diaphragme de champ source condenseur plan objet objectif MAUVAIS REGLAGE BON REGLAGE diaphragme d ouverture MAUVAIS REGLAGE

31 Illumination optimale de Köhler source condenseur plan objet objectif diaphragme de champ

32 Microscope en transmission source condenseur objet objectif oculaire

33 Microscope en fond noir condenseur fond noir objet objectif oculaire Miroirs courbes cône de lumière diffractée

34 Microscope à contraste de phase Anneau de phase (dans condenseur) Plaque de phase (dans objectif)

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