Cours 3 - Cytométrie en flux - Tri cellulaire

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1 Biocell C. Alcaide 16/01/2012 Cours 3 - Cytométrie en flux - Tri cellulaire I - Cytometrie en flux Cytométrie en flux : Analyses quantitatives sur des cellules ou populations cellulaires C'est une technique qui est extrêmement utilisée pour plein de raisons car c'est le seul moyen pour l'instant d'avoir une analyse quantitative d'expression. Dans cette technique, on va marquer un récepteur, une protéine avec un anticorps fluorescent et cette technique va permettre d'évaluer le niveau d'expression d'une protéine soit en surface cellulaire soit en cellule, cela va permettre grâce a l'informatisation de pouvoir quantifier ces choses la et pouvoir les comparer entre plusieurs échantillons. Ca permet aussi d'identifier des populations cellulaires et des sous populations dans un mélange de cellules. Ca permet de quantifier les taux relatifs ou la représentation de chaque sous population dans une population cellulaire. L'appareillage est complexe avec une grosse informatisation car chaque donnée va être enregistrée. Principe : L'appareil va lire la fluorescence sue plusieurs types de fluorescence possibles. Auparavant on ne pouvait étudier que 3 types de fluorescence (rouge claire, rouge sombre et vert), maintenant on peut aller jusqu'à 5-6 types de fluorescence différents et il est probable qu'on passe encore au dessus de cette limite. Des cellules vont être marquées en rouge, rouge clair, rouge sombre et/ou vert et l'appareil va détecter l'intensité de fluorescence par cellule. On va analyser le niveau de fluorescence de chaque cellule. L'intérêt de cet genre d'appareillage est que les cellules qui vont être marquées avec un anticorps, le cytomètre va analyser le type et l'intensité de fluorescence de chaque cellule et surtout il va attribuer le nombre de cellules qui présentait chaque type de fluorescence. On a vraiment une analyse cellule par cellule par l'appareil. Il y a tout un circuit qui va faire en sorte que toutes les cellules passent dans un tout petit capillaire pour normalement passer une par une et l'appareillage va lire cellule par cellule la fluorescence qu'elle émet et l'intensité de fluorescence qu'elle émet. Il faut en moyenne une minute pour lire cellules, ça peut même passer en 10 secondes si les cellules ne sont pas trop grosses. La cytométrie en flux permet de : - Evaluer le niveau relatif d expression d une protéine dans différentes cellules (ou son niveau relatif en fonction de divers traitements d une même cellule) - Identifier des populations cellulaires (ou sous-populations) - Quantifier les taux relatifs de différentes sous-populations cellulaires

2 Protocole : Les cellules sont marquées avec des anticorps fluorescents Le cytomètre de flux analyse - le type de fluorescence (vert/rouge, etc...) émis par chaque cellule - l intensité de fluorescence de chaque cellule - le nombre de cellules présentant chaque type de fluorescence L analyse informatique : statistique On nettoie les cellules pour enlever le milieu, on se place a ph7 et si on veut regarder un marqueur de surface, on incube les cellules pendant 1h avec l'anticorps marqué par exemple a la fluorescine. Puis on lave les cellules pour rincer l'excès d'ac et on met de l'iodure de propidium. En gros en 2-3 heures les cellules sont prêtes puis en moins d'une heure on a passé les cellules dans l'appareil. Protocole de marquage direct des cellules Les cellules sont rincées dans un tampon phosphate ph 7.0 Les cellules sont incubées 1 heure soit avec l anticorps spécifique marqué (par exemple) à la fluorescéine (FITC), soit avec un contrôle isotypique (anticorps non-spécifique-fitc = de même isotype que l anticorps spécifique)). Les cellules sont lavées dans le tampon phosphate Le culot de cellules est resuspendu dans du tampon contenant de l iodure de propidium Le cytomètre évalue la lumière émise par chaque cellule et la quantité de lumière émise par chaque cellule. Après il faut analyser ces données, les cellules sont marquées et sont passées dans l'appareil, mais avant de passer dans l'appareil il va falloir faire un maximum de réglage car on va demander de sauvegarder uniquement les événements qui nous intéresse.

3 PREMIER RÉGLAGE : Granulosité et taille des cellules D'abord les événements qui ne nous intéressent pas sont tous les débris, donc il y a un premier réglage qui élimine les débris cellulaires. On peut alors évaluer la taille des cellules, leur granulosité. On fait donc une première mesure qui est simplement la taille des cellules et on va mettre ce qu'on appelle des fenêtres en disant à l'appareil que dorénavant il ne prend plus en compte les débris, et il ne prend en compte que ce qui est situé dans la fenêtre. Pourquoi doit-on éliminer les débris? Car ils vont fausser le nombre de cellules et sur les gros débris cellulaire on peut avoir un accrochage non spécifique de l'ac qui fausserait les résultats en donnant un gros bruit de fond et ça pourrait donner des aberrations d'interprétation. Le principe est donc de virer tous ces débris sur lesquels il va y avoir un fort marquage de l'ac et ne prendre que les cellules dans la fenêtre qui sont donc en bon état et entières et donc rendre le marquage spécifique. Question: Comment choisit-on les fenêtres? C'est une question d'habitude, on a d'avance une idée du résultat, du pourcentage, de la taille des cellules que l'on doit avoir mais les limites ne sont pas figées. DEUXIEME REGLAGE: Iodure de propidium

4 L'iodure de propidium est un colorant qui ne rentre que dans les cellules mortes car il faut que les membrane soient perméabilisées. Les cellules vivantes ne le capte pas. L'iodure de propidium fluoresce en rouge sombre et est un intercalant de l'adn. L'intérêt est qu'on va colorer en rouge sombre uniquement les cellules mortes car les cellules mortes comme elles sont perméables, elles peuvent fixer l'ac de manière non spécifique. On crée une nouvelle centre qui va éliminer les cellules qui sont colorées en rouge sombre qui ont donc intégré de l'iodure de propidium car elles sont perméabilisées et donc mortes et qui pourraient gêner les expériences. On distingue donc les cellules en bon état, ce sont celles qui ne sont pas colorées en rouge sombre. Le cytomètre de flux évalue : Le type de lumière (couleur) émise par chaque cellule L intensité de la lumière émise par chaque cellule Résultats: On obtient une représentation en histogramme avec le nombre de cellules en fonction de l'intensité de fluorescence. On voit un pic qui est très décalé par rapport a l'ordonnée ce qui signifie que les cellules sont relativement fluorescentes dans cet échantillon la. L'appareil va donner des courbes qui vont être plus ou moins décalées selon que les cellules sont fluorescentes ou pas. On peut lire les résultats pour les différents canaux de fluorescence.

5 En réalité le décalage ne veux pas dire grand chose sans contrôle. On réalise toujours un contrôle isotypique qui est un AC non relevant, mais qui est de la même spécificité que notre anticorps par exemple, si on prend une IgG2A spécifique de notre protéine on va prendre un contrôle isotypique avec une IgG2A aussi. Mais il ne reconnaitra pas notre protéine, c'est quelque chose de totalement générique, spécifique d'aucun marqueur dans la cellule. Il y a des cellules qui de façon non spécifique peuvent accrocher des anticorps, les Fc récepteurs sont des récepteurs des immunoglobulines C qui sont la région constante des anticorps. Les cellules qui possèdent ces récepteurs sont normalement des cellules immunitaires. Sauf que quand on travaille sur des cellules tumorales, beaucoup de cellules tumorales expriment de manière anormale des récepteurs aux Fc. Si on veux travailler sur une protéine Z, on met un AC anti protéine Z qui va s'accrocher et on a de la fluorescence. Sauf que la cellule exprime aussi des Fc récepteurs donc même pour des cellules qui n'expriment pas la protéine Z on va avoir de la fluorescence car l'ac anti protéine Z est venu se fixer sur le FC récepteur par sa partie constante du coup on a un bruit de fond qui n'est pas significatif de la présence de la protéine Z mais qui est juste une liaison totalement anormale sur un récepteur Fc. Le contrôle isotypique est qu'en fait on va prendre le même type d'anticorps mais totalement non spécifique et si on voit une liaison et un déplacement de la fluorescence, ça veut dire qu'on ne reconnaît pas le récepteur Z mais tout simplement quelque chose qui est en surface des cellules va accrocher les anticorps. Le contrôle isotypique sert donc de 0, de point de contrôle de la liaison des anticorps et prend en compte l'éventuelle liaison d'anticorps aux récepteurs Fc.

6 Généralement on superpose les histogrammes, avec le contrôle isotypique et les données obtenues avec l'anticorps qui nous intéresse, du coup s'il existe une décalage entre les 2 courbes, on voit bien si quelque chose est exprimé fortement etc. par simple superposition informatique. Des fibroblastes ont été traités à l'interféron, on a le contrôle isotypique en blanc et en grisé on voit l'expression d'une molécule du CMH2. On voit bien le décalage du CMH2 au fur et à mesure du temps, ça veut dire qu'au fur et à mesure du temps il y a de plus en plus de molécules du CMH/ sur ces cellules puisqu'on augmente à chaque fois le taux de fluorescence de ces cellules. Ça c'est une représentation moins travaillée, plus ou moins ce qu'on verra sous le microscope au sortir de la cytometrie. On peut de nouveau positionner des fenêtres pour savoir ce qu'il y a dedans, l'appareil va donner le nombre de cellules qu'il y a dans ces espaces la et leur moyenne de fluorescence. Dans cette fenêtre M², il y a 96% de cellules et leur moyenne de fluorescence est de 57 alors que le contrôle isotypique avait une moyenne de fluorescence à 20. L'appareil chiffre entièrement le nombre de cellules dans chaque endroit du graph et l'intensité de fluorescence moyenne dans chacune des zones sélectionnées. C'est extrêmement pratique quand on peut quantifier l'intensité de fluorescence de chaque pic pour regarder de façon cinétique son évolution.

7 Souvent on cherche des sous populations, des choses plus ou moins rares et on peut voir ici un mélange de population. L'appareillage le voit puisqu'il y a un mélange de fluorescence, donc il va repérer les cellules négatives et il va voir toutes les cellules qui sont plus ou moins positives en fluorescence. Donc on peut voir des populations hétérogènes dans ce genre de technique. En plus on peut voir qu'il y a 30% de cellules, avec une moyenne de fluorescence à 23. On peut aussi représenter ça en dots. La on voit la granulosité et l'intensité de fluorescence. On étudie des cellules de patients qui n'expriment pas le CMH2 et on voit ici les cellules qui ont restauré l'expression du CMH2 puisqu'elles ont de plus en plus de fluorescence verte. Il faut juste se méfier des axes pour comprendre ce qu'il se passe mais c'est exactement la même chose que l'histogramme.

8 La cytometrie peut se faire aussi sur des cellules fixées et perméabilisées pour étudier l'expression intracellulaire d'une protéine. L'intérêt de ce genre d'appareillage est d'étudier des sous populations plus complexes et de décrypter quelles sont les populations. On peut faire des marquages multiples, jusqu'à 5-6 marquages différents,on peut discriminer plein de sous populations. Par exemple dans un prélèvement de sang, on peut détecter la présence de monocytes fortement cd14 positif et moyennement cd45 positif, des granulométrie qui sont cd14 faible mais cd45 un peu marqué et des lymphocytes qui sont cd14 négatif mais cd45 un petit peu positif. Ça permet d'aller repérer différentes sous populations. Le gros intérêt aussi est que ça permet de déterminer les pourcentages de chaque population. Par exemple chez un patient qui a une leucémie, il peut être important de savoir qu'il a un taux anormal de lymphocytes. En routine dans les laboratoires d'analyse médicale on peut comptabiliser le nombre de cellules, de sous populations pour voir s'il y'a une anomalie dans la quantité d'une sous population. Ca permet des études cliniques de diagnostique pour effectivement voir si on a des populations sous-développées ou surdéveloppées chez un patient.

9 Ce type d analyse est utile pour l étude clinique ou diagnostique de différentes pathologies (infections, cancers) en permettant d évaluer très rapidement les taux de différentes sous populations cellulaires dans un prélèvement. Si on veut voir l'état d'une population, par exemple si elle est en mitose, la cytométrie de flux le permet aussi. Le colorant Hoescht colore l'adn et permet de voir les cellules qui ont une intensité normale de marquage Hoescht et celles qui ont un double marquage Hoescht ont déjà resynthetisé leur ADN ou elles sont en cours de mitose. Ça permet de voir les cellules qui sont en cours de division cellulaire. Cela s'utilise pour voir s'il y a des cellules à haut taux mitotique, ça peut être intéressant en cancérologie, si on travaille sur le cycle cellulaire, la prolifération cellulaire... La cytométrie devrait bientôt être supplantée par la microscopie quantitative car quand on travaille sur des tissus. Il y a plein de notions qu'on aimerait avoir type cellulaire par type cellulaire et on aimerait souvent pouvoir conserver les tissus pour voir ce qu'il se passe a un moment donné dans un organe. Donc de plus en plus les gens essayent de mettre au point cette microscopie quantitative pour pouvoir cellule par cellule déterminer l'intensité de fluorescence de chaque cellule dans leur contexte physiologique dans un tissu. Pour l'instant en microscopie on peut voir qu'il y a de la fluorescence mais on ne peut pas la quantifier.

10 II - Tri cellulaire C'est bien d'analyser mais il y a des moments ou on a besoin de récupérer les cellules et on fait donc du tri cellulaire. Le tri permet d'isoler certaines sous populations, généralement vivantes donc évidemment il ne faut pas les fixées et perméabilité es donc en général on va ses régir de marqueurs qui sont à la surface cellulaire. On va jouer sur des anticorps qui vont reconnaître les protéines de surface et qui vont permettre de sortir les CD4+ qui sont les lymphocytes T, les CD19 qui sont les lymphocytes... Pour avoir des cellules purifiées. Il y a pour l'instant 2 grosses méthodes de tri: 1) Tri avec des billes magnétique Comme les anticorps sont très malléables, on peut leur coller un peu n'importe quoi dessus du moment que c'est sur le région constante, tant qu'on n'affecte pas la région de liaison de l'antigène dont des billes magnétiques qui sont visualisables sous microscopie. On va on user nos cellules avec cet anticorps connecté à une bille et par conséquent la. Élue va devenir magnétique puisque du coup elle aura son récepteur de surface reconnu par l'anticorps lié à la bille magnétique donc la cellule devient aimantée par elle même. Ici on a 2 types de populations, on a les cellules qui expriment le récepteur qui vont devenir magnétiques et d'autres cellules qui ne vont pas exprimer le récepteur.

11 Il suffit simplement de les coller contre un aimant et les cellules qui sont aimantées vont venir se coller sur la paroi du tube et celles qui vont rester en suspension sont celles qui n'expriment pas le marqueur. Du coup on peut récupérer les cellules qui sont magnétisées collées a l'aimant et les cellules non aimantées qui restent en suspension. On a séparer ou tout du moins enrichi les deux sous populations. Le tri n'est jamais du 100%, c'est ce qu'on appelle de l'enrichissement et on aboutit à 80-90% de cellules qui portent le récepteur. Le marquage est relativement rapide, 1 à 2 heures, puis pour le tri il suffit de coller l'aimant et les cellules viennent des fixer tout de suite et les billes magnétiques sont tellement sombres qu'on voit immédiatement toutes les. Élues se coller sur le tube. Du coup les cellules qui sont dans le surnageant sont les cellules qui n'ont pas le récepteur globalement et celles qui étaient collées contre l'aimant, il suffit d'enlever l'aimant pour que les cellules se resuspendent tout de suite et on a séparer les deux sous populations. Pour le tri négatif, les cellules qui n'expriment pas le récepteur sont utilisables immédiatement. Pour les cellules marquées elles peuvent quand même souffrir car elles ont un AC en surface avec une énorme bille dessus qui peut les gêner pour pousser pour se diviser pour ne serait-ce qu'adhérer et ces cellules peuvent garder ces billes pendant plusieurs jours. Il existe des produits pour décoller les AC qui marchent moyennement bien et qui peuvent être toxiques. Il y a même des cellules qui posent un vrai soucis, des macrophages peuvent phagocyter les AC et la bille, cassaient la bille et du coup les morceaux de billes cassées dans la cellules étaient toxiques pour les macrophages. Cette technique pourrait être remplacée par une co-immunoprécipitation avec une bille magnétique, les deux techniques sont utilisées.

12 2) Tri avec FACS Quand on a besoin de trier les cellules sur la base de plusieurs marqueurs, on ne peut pas le faire avec les billes magnétiques. Il existe un appareillage FACS qui est un trieur de cellule. En fait ces exactement le même principe qu'un cytométrie de flux, c'est basé sur de la fluorescence et le fait que l'appareil tri les cellules qui par exemple sont marquées en rouge et vert et qui ont telle intensité de fluorescence et l'appareil récupère uniquement les cellules que l'on a choisit. L'intérêt est qu'on peut avoir des marquages multiples et sélectionner les intensités de fluorescence pour chaque type de marquage. Attention ce n'est qu'un enrichissement, ce n'est jamais du 100%. En règle général, comme ce sont des appareils qui sont relativement complexes à utiliser, ce sont des ingénieurs de plateforme qui vont s'occuper de ce genre d'appareil et va constamment effectuer des mises au point et des améliorations, ce sont des appareillages qui évoluent constamment. Le principe est simple, on a une population de cellules qui vont passer dans un capillaire, les lasers vont activer la fluorescence et un trieur va, cellule après cellule, récupérer uniquement les cellules demandées. L'intérêt est qu'on va pouvoir trier des populations extrêmement rares.

13 Question: Comment faire si les marquages se superposent? Il y a des fois des populations qui ne sont pas très claires et la c'est à nous de savoir ce qu'on fait. Avant de faire du tri il faut faire de son mieux pour avoir le meilleur marquage possible et les plus distincts possibles quand il y a des marqueurs qui se recouvrent il faut essayer de minimiser le nombre de marquage possible mais il peut aussi y avoir un problème de l'appareillage. Il se peut même que les fluorescence se recouvrent et dans ce cas il faut faire les bons réglages sur l'appareil, même la lumière verte peut réemettre un peu dans le rouge et inversement la lumière rouge aux spectre démission qui va réemettre un peu dans le vert. Par exemple si on regarde la fluorescéine, il y a un peu de cellules qui vont réemettre dans le rouge. Il faut donc régler l'appareil pour que ça se compense et que la fluorescence verte soit vraiment verte et la rouge soit vraiment rouge en réduisant les émissions. Tout ça demande de l'expertise mais aussi un peu de bidouillages. Bilan: Le tri par bille ne coûte pas cher mais ne permet d'analyser qu'un seul et unique marqueur et les billes peuvent être très difficiles à éliminer et parfois elles peuvent être toxiques pour les cellules. Mais on s'en sert quand même car c'est beaucoup moins cher qu'un trieur de cellule. L'appareillage de FACS est très couteux mais c'est le seul moyen de faire le tri sur plusieurs marqueurs, d'isoler des populations parfois très rares et surtout seul l'ac est accroché sur la cellule, il n'y a pas de billes ou autre choses qui sont gênants donc les cellules sont généralement directement utilisables.