Préparation de l échantillon
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- Ghislain Nadeau
- il y a 7 ans
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1 UTILISATION HPLC
2 Préparation de l échantillon 1 mg de produit dans 1 ml de MeOH, CH3CN ou H2O Placer le septum sur le vial, face bleu (PTFE) coté produit et face blanche vers le haut. Précautions Vérifiez s il y a assez de solvant dans les bouteilles. Si les bouteilles sont vides, remplissez-les avec du solvant de qualité HPLC. Vérifiez également la poubelle à solvant. L allumage de la chaîne se fait de haut en bas : - le général - les lampes - le passeur - la pompe NE PAS TOUCHER LA SOURIS ET LE CLAVIER DE L ORDINATEUR AVEC LES GANTS Démarrage Pour ouvrir le logiciel de pilotage de la HPLC, cliquez sur l'icône Ezchrom Elite située sur le bureau Ezchrom Elite Puis double-cliquez sur l'icône de l instrument à ouvrir (HPLC DAD) ou clic-droit puis Open. Vous travaillez alors en mode Online. L instrument est connecté physiquement et il est prêt à réaliser une acquisition. HPLC DAD HPLC DAD+DEDL HPLC PREP La fenêtre de login s ouvre. Il n y a pas de mot de passe. Cliquez sur login pour continuer.
3 Mise en route de la chaîne Afin d équilibrer le système dans les conditions d analyses, ouvrez la méthode correspondant à la première injection à réaliser : cliquez sur l icône Open puis Open Method. Dans la fenêtre apparaissant, choisissez une méthode dans le dossier method standard. Allez dans le menu Control et choisissez Download Method : la méthode est chargée dans les modules et la pompe démarre. Pour avoir un aperçu général de l état du système, allez dans le menu Control et choisissez Instrument Status.
4 Cliquez sur l onglet Pump pour avoir accès aux paramètres de la pompe. Cliquez sur Purge pour purger les différentes voies de solvant. Choisissez la voie à purger cliquez sur Purge On ouvrez la vanne de purge sur l appareil et cliquez sur OK dans le message Drain Valve. Pour changer de voie, cliquez sur Purge off dans la fenêtre Purge L-2130 Pump A, puis sélectionnez un autre solvant. Quand toutes les voies sont purgées, refermez la vanne de purge et cliquez sur OK dans le message Drain Valve.
5 Dans l onglet System, vous visualisez l état global du système. Dans l onglet DAD, vérifiez que les lampes soient allumées.
6 Equilibrage Pour visualiser la ligne de base, cliquez sur l icône Preview de la barre d outils. Sur l écran qui apparaît, vous pouvez alors suivre l'évolution de la ligne de base. Une fois la colonne équilibrée et la pression stable, cliquez sur le bouton Stop Run de la barre d outils.
7 Injection Vous pouvez alors lancer l acquisition. Pour cela, cliquez sur l'icône Single Run Acquisition de la barre d outil. Donnez un nom à l échantillon à analyser. Choisissez une methode dans le dossier method standard. Choisissez le dossier où vous voulez que les données soient enregistrées. Indiquez la position du vial. Indiquez le volume d injection. Cliquez sur Start pour lancer l acquisition. Si un Run est déjà en cours lorsque vous arrivez, remplissez les mêmes cases et appuyez sur Submit. Pour visualiser les injections en attente, cliquez sur Control puis Run Queue.
8 Traitements Le traitement des données peut se faire directement dans la même fenêtre (i-e en mode Online) s il n y a pas d acquisition en cours. Sinon, pour traiter des données déjà acquises, il faut utiliser le mode Offline. Pour cela, dans l explorateur EZChrom Elite, faire un clic-droit sur l icône de l instrument et choisir Open Offline. L instrument peut être ouvert dans les modes à la fois. Dans le quart en haut à gauche, vous pouvez faire varier la longueur d onde. Le résultat s affiche dans le quart du dessous. Dans l onglet Views, choisissez Mixed View. Pour extraire un chromatogramme à une longueur d onde, cliquez sur Actions et choisissez Add to Multi-Chromatogram Table. Dans le fenêtre qui s ouvre, tapez la longueur d onde et cliquez sur Add. Pour extraire d autres longueurs d onde, répétez cette étape puis cliquez sur Close. Dans l onglet Method, cliquez sur PDA Options. Dans la fenêtre qui s ouvre, choisissez les longueurs d ondes extraites que vous voulez voir apparaître sur l écran.
9 Dans l onglet Views, choisissez Multi- Chromatogram pour les visualiser. Cliquez sur Analyze dans la barre d outils pour voir les temps de rétention et les intégrations. Pour retraiter un spectre a une longueur d onde précise, sélectionnez cette longueur d onde dans le menu déroulant. Si une multitude de pic est détectée, vous pouvez redéfinir la ligne de base en cliquant sur le bouton Threshold de la barre d outil d'intégration (en bas a gauche de l écran). ensuite, suivez les indications qui apparaissent dans le coin inférieur droit de l écran.
10 Rapport Pour éditer un rapport, cliquez dans la barre d outil sur Edit Custom Report.
11 Extinction Afin d éviter que la chaîne soit mise en route plusieurs fois par jour, ne l éteignez qu en fin de journée. Cela permettra d économiser la lampe puisque son allumage correspond à 6H d utilisation. S il n y plus d injection prévue après vous, réduisez le débit de la pompe à 0,1ml/min afin d économiser les solvants. Pour cela, allez dans l onglet Pump de la fenêtre instrument status. Cliquez ensuite sur Manual set Dans la case Flow Rate, tapez 0,1 ml/ min En fin de journée, fermer la fenêtre HPLC DAD. S il vous demande s il faut enregistrer les modifications apporter à la méthode répondre non. Ensuite éteignez la chaîne de bas en haut: - la pompe - le passeur - les lampes - le général
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