A la rencontre du séquençage haut-débit nouvelle génération. Infosys Building, Kuwait

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1 A la rencontre du séquençage haut-débit nouvelle génération Infosys Building, Kuwait

2 2001 : Aboutissement du projet Génome Humain Ancêtres & Renouveau 2010 Hélicos, Ion torrent, Pacbio, Oxford Nanopore Applied Biosystems SOLiD : séquençage par ligation 2005 Roche 454 : pyrosequençage Solexa Illumina : séquençage par synthèse Automatisation de la technique de Sanger (Applied Biosystems) : traceurs fluorescents, séquenceurs automatiques, électrophorèse capillaire... Sanger : méthode par synthèse enzymatique Maxam & Gilbert : méthode par dégradation chimique sélective 2/35

3 Ancêtres & Renouveau 2010 Hélicos, Ion torrent, Pacbio, Oxford Nanopore Applied Biosystems SOLiD : séquençage par ligation 2005 Roche 454 : pyrosequençage gé 1 è r e né ra ti o n Solexa Illumina : séquençage par synthèse Automatisation de la technique de Sanger (Applied Biosystems) : traceurs fluorescents, séquenceurs automatiques, électrophorèse capillaire... Sanger : méthode par synthèse enzymatique Maxam & Gilbert : méthode par dégradation chimique sélective 3/35

4 gé 2 è m e né ra ti o n Ancêtres & Renouveau 2010 Hélicos, Ion torrent, Pacbio, Oxford Nanopore Applied Biosystems SOLiD : séquençage par ligation Next Generation Solexa Illumina : séquençage par synthèse Sequencing Roche 454 : pyrosequençage Automatisation de la technique de Sanger (Applied Biosystems) : traceurs fluorescents, séquenceurs automatiques, électrophorèse capillaire... Sanger : méthode par synthèse enzymatique Maxam & Gilbert : méthode par dégradation chimique sélective 4/35

5 gé 3 è m e né ra ti o n Ancêtres & Renouveau 2010 Hélicos, Ion torrent, Pacbio, Oxford Nanopore Applied Biosystems SOLiD : séquençage par ligation 2005 Roche 454 : pyrosequençage Solexa Illumina : séquençage par synthèse Automatisation de la technique de Sanger (Applied Biosystems) : traceurs fluorescents, séquenceurs automatiques, électrophorèse capillaire... Sanger : méthode par synthèse enzymatique Maxam & Gilbert : méthode par dégradation chimique sélective 5/35

6 Ancêtres & Renouveau 2010 Hélicos, Ion torrent, Pacbio, Oxford Nanopore High Applied Biosystems SOLiD : séquençage par ligation Throughput Sequencing Solexa Illumina : séquençage par synthèse 2005 Roche 454 : pyrosequençage Automatisation de la technique de Sanger (Applied Biosystems) : traceurs fluorescents, séquenceurs automatiques, électrophorèse capillaire... Sanger : méthode par synthèse enzymatique Maxam & Gilbert : méthode par dégradation chimique sélective 6/35

7 Ancêtres & Renouveau Spécificités des séquenceurs de 3ème génération par rapport aux 2ème génération Capture du signal en temps réel = signal perçu pendant la réaction enzymatique gain de temps & possibilité d'observer les variations structurales gé 2 è m e né ra tio n gé 3 è m e né ra tio n Pas d'étape d'amplification des séquences gain de temps & absence de biais 2010 Hélicos, Ion torrent, Pacbio, Oxford Nanopore 2008 Applied Biosystems SOLiD : séquençage par ligation 2006 Solexa Illumina : séquençage par synthèse 2005 Roche 454 : pyrosequençage 7/35

8 Roche 454 Fragmentation de l'adn Ligation d'adaptateurs sur les fragments simples brins Fixation uniques des fragments sur une micro bille Amplification sur la bille : PCR à émulsion Pyroséquençage séquençage de l'adn monobrin par synthèse du brin complémentaire, base par base Émission de rayonnement lumineux quand le bon nucléotide est détecté par la polymérase Analyse des images à chaque prise de vue pour une position 8/35

9 Roche 454 Inconvénients Prix encore très élévé Peu de données de sortie : 0,7 Gb/run Difficulté à traiter les homopolymères : signal lumineux plus intense & proportionnel au nombre de bases incorporées Limité à 6 nucléotides identiques, au delà il est impossible de distinguer le nombre exacte de bases répétées Avantages Grande taille des lectures : 700 pb Vitesse : 24H/run Séquenceurs GS Junior System GS FLX+ System 9/35

10 Solexa Illumina Fragmentation de l'adn Ligation d'adaptateurs sur les fragments simples brins Fixation sur support Amplification en phase solide CRT (terminaison cyclique réversible) : Séquençage par terminaison de synthèse par un nucléotide ayant un groupement de protection Analyse des images par lecture optique de la fluorescence Émission de rayonnement lors de l'élimination du groupement et la polymérase peut incorporer le prochain nucléotide 10/35

11 Solexa Illumina Inconvénients Avantages Temps de séquençage long : 3-10 jours Fichiers de sortie assez lourd : 600 Gb Petites tailles de lectures : pb Faible coût : réduction du volume de réaction Grand nombre de données de sortie : 600 Gb/run Séquenceurs HiSeq 2500/1500 HiSeq 2000/1000 Genome Analyzer IIx MiSeq 11/35

12 AB SOLiD Fragmentation de l'adn Ligation d'adaptateurs sur les fragments simples brins Fixation uniques des fragments sur une micro bille Amplification sur la bille : PCR à émulsion Séquençage par ligation Recherche de la complémentarité de 2 bases à la fois et à la suite des doubles bases sont ajoutés des nucléotides universels Analyse des images suite à la fluorescence 12/35

13 AB SOLiD Inconvénients Avantages Temps de séquençage long : 7-14 jours Petites tailles de lectures : pb Haute précision de séquençage : 99,94 % Séquenceurs 5500xl Genetic Analyzer 5500 Genetic Analyzer SOLiD 4 System 13/35

14 Résumé 14/35 Source : Comparison of Next-Generation Sequencing Systems, Lin Liu et al, 2012

15 Résumé 15/35 Source : biorigami.com

16 Séquençage de 2 génération Avantages ème Nombreuses lectures (read = séquences issues des séquenceurs) Rapide et précis Faible coût Moins de main d'oeuvre Domaines d'application Etude des profils d'expression génique quantitative Etude des régions répétées Détection de SNP Etude des variants structuraux Etude de l'épissage alternatif Métagénomique Etude de l'adn méthylé Etude des interactions ADN/protéine Etude des régulations post-transcriptionnelles Nécessite un mapping et/ou un assemblage 16/35

17 Séquençage de 2 ème génération Problèmes pour le mapping et l'assemblage Tailles des lectures Erreurs de séquençage 17/35

18 Taille des lectures Contourner le problème en utilisant des séquences appariées : donnent une information en plus sur la distance entre 2 séquences lecture 1 lecture 2 insert 400 pb paired-end 3,5 kb mate-pair Deux types d'insert : Inner distance = celle qui sépare les 2 lectures sans inclure la taille des lectures Outer distance = celle qui inclue la taille des lectures Bien vérifier de quelle distance parle les différents logiciels 18/35

19 Erreurs de séquençage Contourner le problème en effectuant un nettoyage. Exemple du nettoyage par élagage à partir de l'extrémité 3'. Fixation d'un seuil à 5 : nettoyage sur le minimum, fenêtre de taille 5, pas de 4 5' C G G C G C A C G G C ' C G G C G C A C 5 G G C 3' T T A T 3' T A Outil : Prinseq = génère des statistiques et peut effectuer différents nettoyages 19/35

20 Erreurs de séquençage Outil : FastQC = contrôle qualité repérant les problèmes du séquenceur ou des séquences 20/35

21 Erreurs de séquençage Visualisation bonne qualité mauvaise qualité Score de qualité faible = forte probabilité que la base soit fausse 21/35

22 Assemblage 1/ Formation de contigs = formation de séquences continues à partir de séquence de nucléotide d'ordre connu se chevauchant (absence de «gap») Outils : Minia, Velvet, ABySS... 2/ Arrangement de ces contigs en scaffold à partir des régions appariées : taille d'insert (présence de «gap») Outil : SSPACE scaffold contig 1 contig 2 Assemblage de novo = Reconstruction d'un génome en l'absence de génome de référence 22/35

23 Assemblage scaffold contig 1 contig 2 Qualité : estimée à l'aide de la N50 = 50 % de l'assemblage est contenu dans les contigs ou scaffolds de taille supérieure ou égale à la N50. Unité en pb. D'autres métriques... Exemple : N50 de contigs = 200pb : la moitié de l'assemblage est contenu dans des contigs de 200pb ou plus 3 23/35

24 Assemblage Fonctionnement d'un logiciel d'assemblage Graphe de de Bruijn : approche k-mer (= séquence de taille k) k : peut être choisie & a un impact sur l'assemblage 1/ le logiciel construit tous les k-mers possible de taille k à partir d'une ou plusieurs séquences 2/ le logiciel construit le graphe de de Bruijn par chevauchement des k-mers 3/ parcours du graphe pour tenter de reconstituer la séquence complète du génome (du graphe émerge les chemins) pour k = 3 lectures (~100b) k-mers génome entier Graphe complexifié avec les séquences répétées & erreurs de séquençage : chemins alternatifs entre lesquels il est parfois impossible de choisir Exemple : 3 chemins qui arrivent au k-mer GAC 24/35

25 Assemblage Difficulté d'un assemblage Pour l assembleur, les lectures provenant de la répétition A (lectures rouges) et de la répétition B (lectures jaunes) sont supposées provenir de la même région génomique. Peut entraîner la formation de contigs chimériques et l apparition de trous dans 25/35 l assemblage final.

26 Assemblage Difficulté d'un assemblage génome Cas 1 séquence répétée génome séquence répétée Cas 2 Cas 1 : une lecture au niveau d'un élément répété et un autre en dehors Cas 2 : utilisation de grande taille d'insert pour avoir les lectures encadrant la séquence Nécessité d'utiliser des tailles d'insert adaptées pour identifier les séquences répétées 26/35

27 Mapping Outils : Bowtie2, BWA... Visualisation : IGV génome de référence séquence du génome de référence positions génomiques observées k-mers UNIQUES s'alignant en un seul locus de la référence Alignement des lectures sur un génome de référence = MAPPING Alignement 27/35

28 Mapping Outils : dsk, tallymer, meryl, jellyfish... : dénombrement des k-mers Etude des k-mers distincts et uniques k-mers UNIQUES s'alignant en un seul locus de la référence 28/35

29 Profondeurs Couverture = en terme de recouvrement du génome (coverage) 4X = Profondeur de séquençage de 4 (depth of coverage) : chaque base est séquencée 4 fois Outils : BEDTools 29/35

30 Lectures INPUT : format fastq INPUT : format fasta >ID1_sequence SEQUENCE1 >ID2_sequence SEQUENCE2 (Code ASCII) Absence d'informations sur les qualités des bases 30/35

31 Lectures OUTPUT : format sam La synthaxe du format est la même généralement mais il peut y avoir ajout/suppression de colonne en fonction des logiciels 31/35

32 Lectures OUTPUT : format sam Outils : Picard de samtools : 32/35

33 Lectures OUTPUT : format sam Méfiance : Les méthodes de calculs des scores de qualité ne sont pas explicitées par les auteurs comparaison des logiciels impossible Certains logiciels ne donnent pas de score de qualité Outils : dwgsim : simulation des lectures 33/35

34 Lectures Traitement des OUTPUT : Outils : SAMtools Permet de convertir le format «sam» en format «bam» (binaire), format utilisé par la plupart des logiciels Extraction et filtre sur les différentes colonnes du fichier sam Détection des SNP et indel 34/35

35 Infosys Building, Kuwait Merci de votre attention