TD 1: Initiation à la culture cellulaire

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1 TD 1: Initiation à la culture cellulaire

2 Plan Pourquoi une culture cellulaire? C est quoi une culture cellulaire? Définition Culture primaire Culture secondaire Culture des lignées cellulaires Comment faire une culture cellulaire? Les sources Les milieux de culture Environnement de culture Matériel et instruments Contaminations et précautions

3 C est quoi une culture cellulaire? C est une technique de laboratoire pour faire vivre des cellules in vitro C est le prélèvement de cellules, d'un animal ou d'une plante et leur placement ultérieur dans un environnement artificiel conduisant à leur croissance Le but est de multiplier des cellules ou de les maintenir vivantes pour les utiliser

4 Culture cellulaire Fragment d organe ou de tissu Après quelques jours Milieu de culture adapté Dissociation mécanique et enzymatique Action mécanique (broyer, émincer) Action d enzymes protéolytiques (trypsine, collagénase) Suspension cellulaire Mise en culture

5 Culture cellulaire Cas de la cellule végétale: Culture d explant Un explant + un milieu de culture stérile+ un environnement favorable de croissance

6 Culture cellulaire Cas de la cellule végétale: Culture d explant

7 Pourquoi mettre des cellules en culture? Matériel en grande quantité Conservation des caractéristiques du tissu initial Homogénéité des cellules Contrôle de l environnement et de traitements appliqués Modèle pour l étude de la physiologie cellulaire Pour la production de: Vaccins Protéines thérapeutiques (anticorps, agents immunologiques, Hormones) Tissus Vecteurs viraux Cellules souches

8 Culture cellulaire Culture primaire Culture cellulaire Culture secondaire Culture de lignées cellulaires

9 Culture primaire Culture primaire Lorsque les cellules sont prélevées directement d'un tissu et placées dans un environnement de culture approprié, elle se divisent et prolifèrent Primoculture

10 Culture primaire Fragment d organe ou de tissu Après quelques jours Culture primaire Milieu de culture adapté Dissociation mécanique et enzymatique Culture primaire Action mécanique (broyer, émincer) Action d enzymes protéolytiques (trypsine, collagénase) Suspension cellulaire Mise en culture

11 Culture primaire Avantages Proche de la "réalité" de la vie d'une cellule Inconvénients Matériel en faible quantité Mélange de différents types cellulaires Ces cellules ne peuvent être maintenues en culture que pendant quelques générations

12 Culture secondaire Lorsque les cellules dans le récipient de culture primaire ont poussé et couvert tout le substrat de culture disponible (arrivent à confluence), elles doivent être décollées du support, dispersées et réensemencées à une densité plus faible dans un nouveau récipient de culture avec du milieux frais Cette opération est appelée: repiquage Culture secondaire C est une culture obtenue par repiquage à partir d une culture primaire (ou d une autre culture secondaire)

13 Culture secondaire Repiquage Culture primaire Culture secondaire

14 Lignée cellulaire Une lignée cellulaire est une population homogène de cellules, stables après des mitoses successives, et ayant en théorie une capacité illimitée de division (entretien in vitro par repiquages successifs) Il s'agit en général de: Cellules cancéreuses, cellules prélevées sur une tumeur au départ Cellules saines rendues immortelles (transformation = cancérisation) par traitement mutagène: chimique physique par utilisation de virus oncogènes

15 Lignée cellulaire Une lignée peut être : à durée de vie limitée : on observe une dégénérescence (vieillissement) des cellules au bout d un certain nombre de repiquages à durée de vie illimitée: elle est alors appelée lignée continue

16 Culture cellulaire

17 Les sources de cellules Deux sources de cellules sont possibles : 1- Les cellules circulantes (en suspension ) Indépendance vis-à-vis de l ancrage Cellules mises en culture en suspension dans le milieu de culture (avec ou sans agitation) (Exemple: Sang, moelle osseuse, liquides physiologiques) 2- Les cellules adhérentes à partir de tissus ou d'organes Dépendance vis-à-vis de l ancrage Nécessité d être attachées entre elles et ancrées sur un support pour survivre

18 Les milieux de culture Généralement constitués de: Récipients de cultures appropriés (en verre ou en plastique) Contenant un milieu qui apporte les nutriments essentiels à la survie et à la croissance Le milieu de culture doit reproduire aussi fidèlement que possible les conditions de l environnement que les cellules trouvaient in vivo: Apporter des éléments nutritifs Contribuer au maintien des conditions physico-chimiques comme le ph et l osmolarité Permettre la prolifération des cellules (divisions cellulaires)

19 Les milieux de culture Milieu de culture minimum C est un milieu comportant les éléments chimiques (sous une forme utilisable) strictement nécessaires à la croissance de la cellule: L eau, indispensable à toute forme de vie (eau distillée stérile) Une source de carbone et d'énergie (le glucose) Une source d azote Des sels minéraux (K 2 HPO 4 ou KH 2 PO 4 ; MgSO 4 ; MgCl 2 ; CaCl 2 ) Une source d oligo-éléments (fer, zinc, manganèse, cuivre, cobalt, molybdène) Un ph constant (grâce au système tampon CO2/HCO3)

20 Les milieux de culture Milieu de culture empirique Il contient des composants indéfinis (des extraits de viande, des extraits de levures, peptones, des liquides biologiques...) Une composition approximative Ce sont des milieux très riches en substances organiques permettant une croissance aisée de nombreuses cellules Milieu de culture synthétique ou défini Milieu constitué de substances chimiques pures La composition qualitative et quantitative est rigoureusement connue.

21 Les milieux de culture Quel milieu de culture utiliser? Il y a plus de 200 types cellulaires chez les animaux et les végétaux qui différent selon: La localisation anatomique L'état de différenciation Le choix du milieu de culture se fait en fonction du type cellulaire ou de l'expérience à réaliser

22 Les milieux de culture Tubes à essai Boîtes de pétri Flacons de culture Plaques Multipuits Erlenmeyer

23 Environnement de culture Les paramètres à respecter: Température T= 37 Hygrométrie de 84 à 85 % d humidité ph à 7.4 maintenu avec: les tampons du milieu l atmosphère à 5% de CO2 dans l étuve d incubation

24 Matériel et instruments

25 Matériel et instruments La stérilisation Autoclaves Chaleur + Pression

26 Matériel et instruments PSM: Poste de Sécurité Microbiologique Hotte à flux laminaire

27 Matériel et instruments Hotte à flux laminaire : Manipulation du matériel animal ou végétal sous conditions stériles

28 Matériel et instruments Hotte à flux laminaire : Manipulation du matériel animal ou végétal sous conditions stériles

29 Matériel et instruments PSM: Poste de Sécurité Microbiologique

30 Matériel et instruments PSM: Poste de Sécurité Microbiologique Ne pas introduire trop d'objets (perturbe le flux et la sécurité) Ne pas introduire d'objet poussiéreux (colmate les filtres) Ne pas effectuer de mouvements rapides à l'intérieur de l'enceinte stérile Ne pas tousser, ni éternuer en direction de la zone stérile Procéder à la désinfection alors qu'elle est toujours en marche L'emploi de source de chaleur dans l'enceinte est interdite Il est interdit d'introduire la tête dans la zone stérile

31 Matériel et instruments Micropipette Eppendorf Boîtes de pétri + Flacons de culture Micropipette Eppendorf Plaques Multipuits

32 Matériel et instruments Chambre de culture: Matériel végétal Incubateur: Matériel animal

33 Matériel et instruments Observation par microscope photonique (optique)

34 Contaminations Contaminants biologiques Bactéries Levures/moisissures Virus Mycoplasmes Contaminants chimiques Endotoxines Qualité du plastique Reste de détergent Trace d aluminium Résidus désinfectants Contamination croisée Autres cellules

35 Techniques Aseptiques pour la culture cellulaire Se laver les mains avant après. Port de gants et blouse Cheveux attachés Nettoyage du plan de travail (Ethanol 70%, détergent désinfectant ) Tout ce qui est en contact avec la culture doit être stérile (flasques, pipettes, tubes ) Nettoyer le matériel (mettre sous la hotte)

36 Merci de votre attention