alpha-amylase Saliva Assay

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1 Fiche technique alpha-amylase Saliva Assay Test enzymatique pour le dosage de l activité d alpha amylase dans la salive humaine. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. BUT DU TEST Test enzymatique pour le dosage de l activité d alpha amylase dans la salive humaine. 2. SOMMAIRE ET INTRODUCTION La mesure de l'activité de l alpha Amylase dans la salive est utile dans le domaine de la psychobiologie du stress. Un grand nombre d'études ont montré que l'activité salivaire alpha-amylase est corrélée à l'activité du système médullaire adréno-sympathique. Le cortisol salivaire libre est un marqueur non invasif reconnu de l'activité de l'axe adréno-hypothalamohypophysaire. Actuellement, l'alpha-amylase salivaire semble représenter un marqueur bien caractérisé de l'activité du système sympatho-adrénomédullaire (SAM). L'alpha-amylase salivaire semble aussi être liée au stress chronique, aux troubles du stress post-traumatique, au comportement, à la fonction cognitive et à la santé. De plus, l augmentation de l'alpha-amylase salivaire peut être provoquée par des médicaments activant le système nerveux orthosympathique (comme la yohimbine) et stoppée par les bétabloquants (comme le propanolol). 3. PRINCIPE DU TEST Ce dosage est un dosage enzymatique en phase liquide. L'alpha-amylase salivaire métabolise spécifiquement le substrat. L'intensité de la couleur développée est proportionnelle à l'activité de l'alphaamylase dans l'échantillon. Les résultats des échantillons peuvent être déterminés directement à partir de la courbe étalon. 4. PRECAUTIONS D EMPLOI 1. Seulement prévu au diagnostic in-vitro et à l usage professionnel. 2. Lire les instructions complètement et avec attention avant de commencer le test. Utiliser la version valide de la fiche technique incluse dans le kit. S assurer que tout a été bien compris. 3. Dans le cas de dommages importants de l emballage du kit, veuillez contacter IBL ou votre fournisseur sous forme écrite, une semaine au plus tard après avoir reçu le kit. N utilisez pas les composants abîmés pour un test, mettez-les de côté et en sécurité pour les besoins éventuels liés à la plainte. 4. Suivez le numéro du lot et la date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Ne pas utiliser de réactifs périmés. 5. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité. Porter des blouses de laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire. 6. Les réactifs de ce kit contiennent du matériel dangereux pouvant irriter les yeux et la peau. Consulter le MATERIEL FOURNI et les étiquettes pour les détails. Les Fiches de Données de Sécurité pour ce produit sont disponibles sur le site internet IBL ou sur demande particulière à IBL. 7. Les réactifs chimiques préparés ou utilisés doivent être traités comme matériel dangereux en accord avec les directives et règlements nationaux de sécurité pour tout matériel à risque. 8. Le personnel de nettoyage doit être formé par des professionnels en ce qui concerne les risques potentiels et la manipulation des produits. 9. Quelques réactifs contiennent de l acide de sodium (NaN 3 ) comme conservateurs. Laver abondamment à grande eau en cas de contact avec les yeux ou la peau. NaN 3 peut réagir avec le plomb et le cuivre pour former des acides de métal explosifs. L élimination de ces réactifs doit se faire avec une grande quantité d eau afin d éviter ce problème. 5. STOCKAGE ET STABILITE Le kit est envoyé à température ambiante et doit être stocké entre 2 C et 8 C. À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Le stockage et la stabilité des échantillons et réactifs préparés sont indiqués dans les chapitres correspondants. Version / 6

3 6. COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS Salive Ne pas manger, boire, mâcher de chewing-gum ou se laver les dents dans les 30 min précédant l échantillonnage. Sinon, bien rincer la bouche avec de l eau froide 5 min avant de prélever les échantillons. Ne pas collecter d échantillons en cas de maladie orale, inflammation ou lésions (contamination sanguine). La salive peut être collectée dans un tube adapté. Collecter un minimum de 0.5 ml de liquide. Le flux salivaire peut être stimulé en mâchant du Parafilm. Il est recommandé de congeler les échantillons à 20 C avant l analyse du laboratoire. Après décongélation, centrifuger 10 min à x g pour éliminer toute particule gênante. Vérifier l apparence des échantillons salivaires. (Teinte rouge indiquant une contamination sanguine) Stockage C 2 8 C -20 C (Aliquots) Stabilité 1 jour 28 jours 6 mois 7. MATERIEL FOURNI Quantité Symbole Composant 1 x 12 x 8 MTP 3 x 200 µl CAL LYO 2 x 3 x 200 µl CONTROL 1 LYO CONTROL 2 LYO 1 x 40 ml DILBUF CONC 1 x 21 ml SUBS Microplaque Barrettes sécables. Etalon mère, lyophilisé/e Contient: alpha-amylase salivaire humaine Méthode de référence pour la calibration: photomètre tempéré Consulter les concentrations exactes sur les étiquettes des flacons ou sur le certificat CQ. Contrôle 1+2, lyophilisé/e Contient: alpha-amylase salivaire humaine Méthode de référence pour la calibration: photomètre tempéré Consulter les concentrations exactes sur les étiquettes des flacons ou sur le certificat CQ. Tampon d Échantillon, Concentré (10x) Contient: PBS, BSA, stabilisateurs. Solution Substrat Prêt(e) à l emploi. Contient: CNPG3, stabilisateurs. 8. MATERIEL NECESSITE MAIS NON FOURNI 1. Pipettes (Multipette Eppendorf ou matériel similaire, CV < 3 %) Volumes: 10; 100; 200; 1000 µl 2. Tubes à usage unique pour la dilution des échantillons 3. Micropipette à 8-canaux avec réservoirs pour réactifs 4. Lecteur de microplaque capable de lire l absorbance à 405 nm (longueur d onde de référence nm) 5. Eau bidistillée ou désionisée 6. Papier absorbant, embouts de pipette et chronomètre 7. Vortex 9. NOTES POUR LA PROCEDURE 1. Toute manipulation impropre des échantillons ou modification de la procédure du test peut influencer les résultats. Les volumes indiqués pour pipeter, les temps d incubation, températures et étapes de prétraitement doivent être strictement suivis selon les instructions. N utiliser que des pipettes et appareils calibrés. 2. Une fois que le test a commencé, toutes les étapes doivent être suivies sans interruption. S assurer que les réactifs, matériels et appareils nécessaires soient prêts au moment approprié. Amener tous les réactifs et échantillons à température ambiante (18-25 C) et mélanger doucement en tournant chaque flacon de réactif liquide et d échantillon avant emploi. Mélanger les réactifs sans former de mousse. 3. Eviter toute contamination des réactifs, pipettes et puits/tubes. Utiliser des nouveaux embouts de pipette en plastique pour chaque réactif, étalon ou échantillon. Ne pas interchanger les bouchons. Toujours refermer les flacons non utilisés. Ne pas réutiliser les puits/tubes ou réactifs. 4. Il est recommandé de doser les échantillons en double pour pouvoir identifier d éventuelles erreurs de pipetage. 5. Utiliser un schéma de pipetage pour vérifier la répartition appropriée de la plaque. Version / 6

4 6. Le temps d incubation affecte les résultats. Tous les puits doivent être manipulés dans le même ordre et au même intervalle de temps. Il est recommandé d utiliser une micropipette à 8-cannaux pour pipeter une même solution dans tous les puits. 7. L apha-amylase se trouve dans la sueur et la salive. Portez des gants durant le test et ne pas pipeter avec la bouche. 10. PREPARATIONS PREALABLES AU TEST Préparation des composants concentrés Composant Relation Diluant Remarques Stockage Stabilité Tampon d Échantillon DILBUF CONC 1:10 eau bidist. par ex. 10 ml Tampon d Échantillon + 90 ml eau bidist. Mélanger sans former de mousse. 2-8 C 4 semaines Préparation des composants lyophilisés Composant avec Diluant Remarques Stockage Stabilité CAL LYO 200 µl Laisser reposer 15 min. 2-8 C 7 jours CONTROL 1+2 LYO 200 µl Mélanger sans former de mousse. 2-8 C 7 jours Preparation des étalons L étalon reconstitué de réserve doit être dilué dans la mesure de 1:301. C'est l étalon 1. Une dilution sérielle de cette solution permet d'obtenir des étalons à différentes concentrations. L'exemple suivant montre comment obtenir une courbe étalon avec 5 points de calibrage. Nom Relation Diluant Remarques Étalon 1 1:301 Étalon 2 1:2 Étalon 3 1:2 Étalon 4 1:2 Étalon 5 - p.ex. : 10 µl de l étalon de réserve reconstitué + 3 ml. Bien mélanger avant de poursuivre la dilution. 100 µl étalon µl Bien mélanger avant de poursuivre la dilution. 100 µl étalon µl Calculation de U/mL Voir l'étiquette p.ex.: 400 U/mL p.ex: 200 U/mL p.ex.: Bien mélanger avant de poursuivre la dilution. 100 U/mL 100 µl étalon µl p.ex.: Bien mélanger avant de poursuivre la dilution. 50 U/mL Seulement tampon d échantillon dilué. 0 U/mL Prédilution des Contrôles et Echantillons Les échantillons doivent être pré-dilués jusqu'à 1:301 comme suit : Relation Diluant Remarques Echantillon 1:301 Contrôles 1:301 par ex.: 10 µl Echantillon (Saliva) + 3 ml. Bien mélanger après la dilution. par ex.: 10 µl Contrôle (reconstitué) + 3 ml. Bien mélanger après la dilution. Les échantillons montrant une concentration supérieure à celle de l étalon le plus élevé doivent être davantage dilués et testés à nouveau. Version / 6

5 11. PROCEDURE DU TEST 1. Pipeter 10 µl de chaque Etalón predilué, Contrôle predilué et échantillon predilué dans les puits respectifs de la Microplaque. 2. Pipeter 200 µl de Solution Substrat dans chaque puits. Agiter la plaque avec précaution. 3. Utiliser une micropipette à 8 canaux si possible pour l ajout des solutions substrat et d arrêt. Pipeter ces solutions à la même cadence. Utiliser un déplacement positif et éviter la formation de bulles d air. 4. Incuber 3 min à temperature ambiante (18-25 C). 5. Mesure 1: Mesurer la densité optique (DO) avec un photomètre à 405 nm (longueur d onde de référence: nm). 6. Durant l'incubation l'alpha amylase présente dans l'échantillon métabolise spécifiquement le substrat. Il est important d'obtenir une différenciation satisfaisante entre les étalons. Néanmoins la DO de l étalon le plus élevé obtenu pour la deuxième mesure ne doit pas dépasser Suivre le développement de la DO aux différentes périodes pour éviter un excédent. Ceci vaut particulièrement en cas de température ambiante élevée. Les résultats de l'activité de l'alpha amylase ne seront pas affectés! 7. Incuber pendant encore 5 min (temps d'incubation total de 8 min) à temperature ambiante (18-25 C). En cas de température ambiante élevée ou de première utilisation du test il est recommandé de mesurer la plaque une nouvelle fois après 3 min (temps d'incubation total de 6 min). 8. Mesure 2: Mesurer la densité optique avec un photomètre à 405 nm (longueur d onde de référence: nm). 12. CONTROLE QUALITE Les résultats du test ne sont valides que si l essai a été réalisé en suivant les instructions. De plus, l utilisateur doit strictement suivre les règles de bonne pratique de laboratoire (GLP, Good Laboratory Practice) ou autres lois/standards applicables. Tous les étalons et contrôles du kit doivent être trouvés dans les gammes acceptables indiquées dans le certificat de Contrôle Qualité (QC). Si ces critères ne sont pas remplis, le test est non valide et il doit être répété. Chaque laboratoire devrait utiliser des échantillons connus comme contrôle supplémentaire. En cas de déviation des résultats, vérifier les origines éventuelles techniques: dates de péremption des réactifs (préparés), conditions de stockage, pipettes, appareils, conditions d incubation et méthodes de lavage. 13. CALCUL DES RESULTATS Calculer la delta DO pour chaque étalon, contrôle et échantillon en déduisant la DO de la "mesure 1" de la DO de la "mesure 2". Les delta DO des étalons (axe y, linéaire) sont reportées en fonction de leurs concentrations (axe x, logarithmique) soit sur papier graphique semi-logarithmique soit en utilisant une méthode automatisée. Une bonne analyse est obtenue avec les méthodes cubic spline, Logistics 4 Paramètres ou Logit-Log. Pour le calcul de la courbe étalon, appliquer chaque signal des étalons (une valeur apparemment fausse d un double dosage peut ne pas être prise en compte et peut être remplacée par une valeur plus plausible). L activité d alpha amlylase des échantillons et des contrôles peut être lue à partir de la courbe étalon. Les résultats des échantillons ayant été davantage dilués doivent être multipliés par le facteur de dilution appliqué. Les échantillons montrant une concentration supérieure à celle de l étalon le plus concentré doivent être dilués de la façon décrite dans les PREPARATIONS PREALABLES AU TEST et testés de nouveau. Vous pouvez contacter IBL pour avoir une assistance dans le calcul des résultats. Les résultats sont exprimés en U/mL. Pour convertir dans le système international d'unités (IS) veuillez multiplier par le facteur Les résultats sont alors exprimés en nkat/l. Version / 6

6 14. PERFORMANCE Précision Récupération Moyenne Activité SD Intra-Essai Inter-Essai Echantillon Salive Dilution Dosée Activité Récupération (%) 1: : : : : : Linéarité 1: : : : : : : : : Activité endogène Ajouté Activité Dosée Activité Récupération (%) Salive (25.5) Comparaison de Méthode Salive 2 (38.9) Salive 3 (107.1) CV (%) IBL = x Essai enzymatique commerciallement disponible N r = n = 24 Version / 6

7 15. LITTERATURE DE REFERENCE DU PRODUIT 1. DIN EN ISO 18153:2003, In vitro diagnostic medical devices Measurement of quantities in biological samples Metrological traceability of values for catalytic concentration of enzyme assigned to calibrators and control materials. 2. Emily S. Winn-Deen, Harold David, Gerald Sigler, Rodrigo Chavez; Development of a Direct Assay for alpha-amylase ; Clin. Chem. 34/10, (1988) 3. Jean-Pierre Bretaudiere, Robert Rej, Patricia Drake, Anne Vassault, Michel Bailly Suitability of Control Materials for Determination of alpha-amylase activity ; Clin. Chem. 27/6, (1981) 4. G. Gubern, F. Canalias, FJ Gella; Determination of alpha-amylase activity: method comparison and commutability study of several control material ; Clin. Chem. 41, (1995) 5. Urs M. Nater, Nicolas Rohleder, Wolff Schlotz, Ulrike Ehlert, Clemens Kirschbaum; Determinants of the diurnal course of salivary alpha-amylase ; Psychoneuroendocrinology 32, (2007) 6. Daniela Schoofs, Diana Preuß, Oliver T. Wolf; Psychosocial stress induces working memory impairments in an n-back paradigm ; Psychoneuroendocrinology 33, , (2008) 7. Tom Smeet, Henry Otgaar, Ingrid Candel, Oliver T. Wolf; True or false? Memory is differentially affected by stress-induced cortisol elevations and sympathetic activity at consolidation and retrieval ; Psychoneuroendocrinology 33, (2008) 8. Katrin Starcke, Oliver Wolf; Anticipatory Stress Influences Decision Making Under explicit Risk Conditions ; Behavioral Neuroscience, 122/ 6, (2008) 9. Noriyasu Takai, Masaki Yamaguchi, Toshiaki Aragaki, Kenji Eto, Kenji Uchihashi and Yasuo Nishikawa; Gender-Specific Differences in Salivary Biomarker Responses to Acute Psychological Stress ; New York Academy of Sciences 1098: (2007) 10. Anda van Stegeren, Nicolas Rohleder, Walter Everaerda and Oliver T. Wolf; Salivary alpha amylase as marker for adrenergic activity during stress: Effect of betablockade ; Psychoneuroendocrinology 31, (2006) 11. Ulrike Ehlert, Katja Erni, Gundula Hebisch, and Urs Nater; Salivary α-amylase Levels after Yohimbine Challenge in Healthy Men ;The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 91(12): (2006) Version / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /