ETUDE DES PIGMENTS DE LA PHOTOSYNTHESE

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1 Laboratoire de Physiologie végétale Université de Neuchâtel Travaux pratiques de Physiologie végétale ETUDE DES PIGMENTS DE LA PHOTOSYNTHESE 1. Introduction Les chlorophylles sont les pigments majeurs impliqués dans la capture des photons. La chlorophylle est synthétisée et dégradée dans l'enveloppe du chloroplaste, mais elle n'est présente et active comme pigment que dans les thylacoïdes. Les caroténoïdes accompagnent toujours les chlorophylles dans les membranes thylacoïdales où ils jouent apparemment le double rôle de pigments accessoires pour la capture de l'énergie lumineuse et de photoprotecteurs contre les intensités lumineuses élevées. On les trouve également associés à l'enveloppe du chloroplaste. Ils sont aussi très répandus dans de nombreux tissus végétaux (parenchyme de Tomate, racines de Carottes, pétales, écorce d'orange, etc...). Dans la membrane thylacoïdale, les caroténoïdes sont très probablement associés à des protéines (tout comme les chlorophylles); de plus, leur répartition paraît hétérogène et semble ainsi refléter, dans le plan de la membrane, les diverses spécialisations fonctionnelles de ces pigments (cf. annexe). Au cours de ce TP, vous allez mettre en évidence les propriétés des différents pigments présents dans les feuilles de petits pois par chromatographie sur couche mince et spectrophotométrie. 2. Méthodes Fraction membranaire (thylacoïdes) Extrait lipidique total Séparation par chromatographie sur couche mince (CCM) Caractérisation spectrale Identification

2 Extraction Les thylacoïdes ont été préparés selon le protocole décrit dans le TP "Mesure de la réaction de Hill dans des thylacoïdes fonctionnels". Les pigments sont extraits de la façon suivante: Préparer 2 tubes Eppendorf (eppi) de 2ml. Ajouter dans chaque tubes 0.3 ml de suspension thylacoïdale (contenant environ 2 mg chlorophylle/ml, noter la concentration donnée par l assistant), 1 ml CHCl 3 /MeOH (53:37, v/v) et 0.3 ml de KCl 500 mm. (MeOH = méthanol). Vortexer les eppis, puis centrifuger à Vmax pendant 5 minutes environ, jusqu'à obtention de 2 phases parfaitement limpides. Noter la présence d'un "gâteau" de protéines à l'interface des deux phases liquides. Incliner le tube, à l'aide d'une pipette Pasteur, transférer uniquement la phase inférieure (contenant les lipides et les pigments en solution chloroformique) dans un eppi de 1.5 ml Préparation de l'échantillon pour la CCM Faire évaporer le solvant en utilisant un speedvac (60 C, 1/2h). Lorsque la totalité du solvant a été éliminée, reprendre les pigments dans 100 µl CHCl Chromatographie sur couche mince (CCM) ( travailler le plus possible à l'abri de la lumière!) Monter un système de CCM pour deux groupes : la plaque couche mince est une plaque de verre recouverte de gel de silice. Attention, ne pas toucher la silice avec les doigts. Avec un crayon, partager la plaque en deux verticalement, puis faire une ligne horizontale à 3 cm du bord et une ligne verticale à 2 cm du chaque bord. Vérifier que les cuves de chromatographie sont installées avec du tampon et du papier filtre. A l'aide d'un capillaire, appliquer l'extrait par petits spots alignés le long de la ligne du bas sans s approcher trop du milieu de la plaque (pour ne pas mélanger avec l échantillon des voisins!). introduire chaque plaque dans la cuve contenant le mélange pétrole-ether/acétone (2 :1, v/v), dans une semi-obscurité. Lorsque le front de migration du solvant atteint presque la fin de la plaque, arrêter la chromatographie, et noter immédiatement l'emplacement du front de migration du solvant sur la plaque, avec un crayon. Relever rapidement et schématiquement la position (Rf) des diverses bandes par rapport au front de migration et les noter A, B, C, etc. Scanner la plaque. A l'aide d'une lame de rasoir ou d'une spatule, gratter et détacher les différentes bandes sur une feuille de papier lisse (papier à peser) et les transférer ensuite dans des tubes Eppendorf entourés d'aluminium. Ajouter alors 1 ml d'éthanol, agiter fortement, puis centrifuger pendant 5 min.

3 Caractérisation spectrale Préparer le spectrophotomètre (en mode scan, ou connecter l'ordinateur et initialiser le pilotage du spectrophotomètre avec le logiciel SWIFT-SCAN) et mesurer l'absorbance entre 400 et 750 nm. Diluer, si nécessaire, chaque échantillon avec de l'éthanol (EtOH) pour que l'absorbance ne soit jamais supérieure à 0.8. Utiliser de l'etoh comme référence. Couvrir les cuvettes pour éviter l évaporation, puis enregistrer les spectres d'absorption en mode SCAN entre 400 et 750 nm. Noter les longueurs d'onde des maxima d'absorption (à 1 nm près), tenir compte du fait que les λmax dépendent beaucoup du solvant et de sa polarité (degré d'humidité, par exemple) Résultats Identifier les différents caroténoïdes et chlorophylles en comparant les valeurs obtenues avec celles données dans l'annexe. Justifier la position de chaque bande (Rf) sur la plaque en tenant compte de la structure du pigment et du fait que la chromatographie utilisée ici fait intervenir principalement des phénomènes d'adsorption et de polarité. Présenter les spectres d'absorption des pigments, et déterminer si l'identification des pigments est possible à l'aide des spectres mesurés. Estimer (sur la base du spectre et de la CCM) l'abondance de chaque pigment dans les thylacoïdes. Discuter le rôle des pigments dans le processus photosynthétique.

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