DETECTION D ANTICORPS DANS LE SERUM DE LAPIN PAR ELECTROPHORESE

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1 Fiche sujet-élève L injection d un antigène à un lapin déclenche des réactions immunitaires. Elles aboutissent à la synthèse d anticorps présents dans le sérum et détectables par électrophorèse. Chez certains lapins, un déficit immunitaire ne permet pas la production d anticorps. On cherche à déterminer si un lapin ayant reçu une injection d antigène présente ou non un déficit immunitaire. Matériel - cuve à électrophorèse ; - 100ml de tampon d électrophorèse à ph 9, et une éprouvette de 100ml ; - deux bandes d acétate ; - applicateurs de sérum (lamelles de dépôt en verre ou équivalent) ; - un verre de montre contenant du sérum de lapin L1 immunisé contre un antigène inoffensif (BSA ou autre) ; - un verre de montre contenant du sérum de lapin L non immunisé ; - un verre de montre contenant du sérum du lapin L à tester ; - papier filtre. Activités et déroulement des activités Capacités et principaux critères d évaluation Barème 1- Mettre en œuvre le protocole en suivant les indications de la fiche technique. Appeler l examinateur pour vérifier le montage et obtenir les bandes des résultats après coloration. Réaliser une manipulation en suivant un protocole respect des étapes du protocole utilisation maîtrisée du matériel organisation de la paillasse 10 - Justifier l intérêt de l électrophorèse des trois sérums. 3- Réaliser un schéma des résultats observés sur les bandes distribuées. 4- En déduire si le lapin L présente un déficit immunitaire. Justifier à l aide des données fournies. Adopter une démarche explicative Représenter une observation par un schéma Adopter une démarche explicative 3 5

2 Fiche technique élève Principe : en milieu basique, les protéines sont chargées négativement. Lorsqu un mélange de protéines est soumis à un champ électrique, les protéines migrent à une distance caractéristique par rapport à la ligne de dépôt, en fonction de leur taille et de leur charge. Les anticorps sont des protéines gamma-globulines. Remarques : la migration nécessitant une durée d une heure, des bandes d acétate après migration et déjà colorées au rouge Ponceau (ou une fiche de résultats) seront distribuées pour interprétation. Le rouge Ponceau est un colorant spécifique des protéines, ayant une grande affinité pour elles. Protocole d utilisation du matériel : MISE EN PLACE DES BANDES D ACETATE DE CELLULOSE DANS LA CUVE 1. Remplir la cuve à électrophorèse au /3 avec la solution tampon, de chaque côté, en évitant tout débordement. Ne jamais toucher les bandes d acétate avec les doigts, sinon des traces apparaîtront à la coloration.. Sortir les bandes des bacs à l aide d une pince, les placer entre feuilles de papier filtre et les sécher à l aide d un mouvement rapide. 3. Fixer les bandes d acétate de cellulose sur le portoir de la cuve, tendues autant que possible (sans les déchirer bien entendu), de façon à ce que la face mate qui est absorbante soit sur le dessus (encoche de la bande en bas à droite). Les bandes doivent être parallèles entre elles et perpendiculaires à l axe du portoir pour permettre une migration des protéines dans l axe du portoir. 4. Poser le portoir dans la cuve et vérifier que les extrémités de chaque bande trempent dans le tampon de la cuve. DEPOT DES SERUMS 1. Tremper l applicateur dans le sérum du lapin L, déposer rapidement l applicateur près du bord, du côté de l encoche et perpendiculairement à l axe du portoir (faire une application bien nette).. Faire de même sur une autre bande pour le sérum L1 et le sérum L (pour ces sérums, le dépôt se fait sur la même bande, en veillant à ce que les taches ne se touchent pas). MISE EN ROUTE DE L ELECTROPHORESE 1. Fermer la cuve avec le couvercle, côté de la cathode (pôle négatif, borne noire) près du bord avec encoche.. Relier la cuve au générateur à l aide du cordon. Respecter la correspondance des couleurs entre cordons et douilles. 3. Régler la tension de l alimentation sur 160V. 4. Raccorder l appareil au secteur. 5. Mettre sous tension. La migration démarre et durera une heure. Les résultats fournis sont colorés au rouge Ponceau.

3 Fiche résultats élève 1

4 Fiche résultats élève

5 Fiche réponse élève Etablissement : Classe : Nom - Prénom : A rendre à l issue de l épreuve

6 Fiche laboratoire Le matériel nécessaire à la réalisation de ce TP est vendu sous forme de KIT par SORDALAB. Une cuve avec portoir pour bandes d acétate de cellulose est nécessaire. Avant le début du TP Préparer le sérum : reconstituer le sérum de lapin et verser les sérums dans des verres de montre. Immerger bandes d acétate de cellulose dans du tampon véronal rendant 10 minutes. Ajouter 00 µl d eau stérile à chaque tube de sérum. Pour les bandes de résultats à distribuer aux élèves Les bandes colorées se conservant très bien, on peut utiliser des bandes de résultat obtenues au cours de l année. Sinon, il faudra réaliser la décoloration à l acide acétique puis la coloration au rouge Ponceau des bandes (après migration des sérums) avant l évaluation de l élève. o Prévoir une solution à 5% d acide acétique (pour la décoloration des bandes colorées au rouge Ponceau). o Pour 50 ml de rouge Ponceau : o préparer 1 L d eau acétifiée à 1% (mettre 10ml d acide acétique dans 1 L d eau déminéralisée) ; o ajouter,5 g de rouge Ponceau à 50ml d eau acétifiée 1% ; o conserver au réfrigérateur à l abri de la lumière. o Préparer une solution de «transparisation» qui permet de rendre transparentes les bandes après traitement : - méthanol (75 ml), - acide acétique (0 ml), - diacétone alcool ((5 ml). En cas d échec, les résultats peuvent être les bandes colorées proposées sur la «fiche résultats élève», à imprimer en couleur sur papier de bonne qualité ou à afficher sur un écran (utiliser dans ce cas soit le fichier 05_I7_B_Pro_06a.doc, soit le fichier 05_I7_B_Pro_06b.doc). Pour le sérum à tester, prévoir, suivant les cas et pour diversifier les résultats, du sérum tantôt positif, tantôt négatif (résultats correspondants aux fiches résultats élèves 1 et ). Un résultat négatif peut être obtenu avec un sérum de lapin non immunisé.

7 Fiche barème d'évaluation Capacités et critères d évaluation (en gras, évaluation pendant la séance) Barème Nom des élèves 1. Réaliser une manipulation d après un protocole - respect des différentes étapes du protocole - utilisation maîtrisée du matériel : - pas de débordement de la cuve - mise en place des bandes - dépôt des sérums - mise en route de la cuve - organisation de la paillasse et rangement du matériel en fin de manipulation. Adopter une démarche explicative - sérums connus : témoins pour la présence d anticorps et leur localisation sur les bandes. 3. Représenter une observation par des schémas - représentation fidèle aux résultats - présence de légendes correctes et d un titre adapté Adopter une démarche explicative cohérence de la déduction avec les résultats du tableau Note /0