Les innombrables aspects des anticorps antinucléaires en IFI : quelle leçon en tirer au moment du dépistage Docteur Alain Chevailler

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1 Les innombrables aspects des anticorps antinucléaires en IFI : quelle leçon en tirer au moment du dépistage Docteur Alain Chevailler Laboratoire d immunologie et d allergologie CHU Angers -BIOFORMA "Les auto-anticorps anti-nucléaires: dépistage, identification et signification" -21 et 22 octobre Revue Francophone des Laboratoires 2006, 384 : U 892

2 Gammapathies monoclonales à activité auto-anticorps anticorps : de l immunofluorescence indirecte comme technique de dépistage Docteur Alain Chevailler Laboratoire d immunologie et d allergologie CHU Angers U 892

3 Structure du monomère d IgG1 VL VH F(ab) CH1 F(ab ) 2 CH1 VH VL Prix Nobel Médecine 1972 CL CL Rodney Porter CH2 CH2 Gérard Edelman Fc CH3 CH3

4 IMMUNOGLOBULINE MONOCLONALE production d'un clone de lymphocyte Soit H 2 L 2, soit L, soit H plus rarement caractérisation : homogénéité : charge : Électrophorèse (pic) isotypie : immunoélectrophorèse (sang et urines, IES et IEU) immunofixation (IFx)

5 Gammapathie monoclonale Une des anomalies biologiques les plus fréquentes > 50 ans : 3 % > 70 ans : 7 % RA Kyle, 2007

6 MGUS monoclonal gammopathy of undetermined significance 55 % Définition : Pic < 30 g/l Plasmocytose médullaire < 10 % Pas d atteinte osseuse, d organomégalie, d insuffisance rénale, d hypercalcémie

7 Signes cliniques Prolifération lymphocytaire Signes osseux (lyse, fracture, hypercalcémie) Envahissement médullaire (cytopénie) Compression médullaire Immunoglobuline monoclonale Syndrome d hyperviscosité Cryoglobulinémie Dépôt (amylose, MDCL) (Auto)-anticorps

8 AUTO-ANTICORPS ANTICORPS NATURELS Physiologiques : Avraméas, Dighiero lymphocytes B CD5+ antigènes : solubles : transferrine, thyroglobuline, etc... intra-cellulaires : actine, myosine, tubuline, ADN,... gènes germinaux non mutés Ac présents chez souris axéniques pas de maturation d'affinité (mutation, sélection par antigène) répertoire limité, conservé (sélection positive) rôle : épuration? (blocage par interaction Id-anti anti-id) immunité naturelle : opsonisation pathogènes

9 Gammapathie monoclonale à activité (auto)-anticorps anticorps Preuve : F(ab ) 2 Myélome IgG1k ASLO très élevés : - sérum - IgG purifiées - F(ab ) 2 IFD moelle : - γ rouge - SLO-FITC Photo : Daniel Hurez

10 Auto-anticorps monoclonaux les plus fréquents Maladie des agglutinines froides Antigène polysaccharidique Ii Cryoglobulinémie de type 2 (facteur rhumatoïde monoclonaux) Antigène : fragment Fc des immunoglobulines Neuropathie avec anticorps IgM anti-mag - Antigène : myéline associated glycoprotéine

11 Tableau I : activités autoanticorps les plus fréquemment associées avec les gammapathies monoclonales Globules rouges (I ou i) [9] Phospholipides [44] Anticoagulant [47] Protéines plasmatiques Actine [11] IgG (facteur rhumatoïde) [24] Tubuline [11] β lipoprotéines [15, 36, 49] Myosine [10] albumine [43] Vimentine [10] α2macroglobuline [20, 38] Muscle lisse [25, 34, 40] transferrine [43] facteur VIII [43] facteur von Willebrand [23] inhibiteur de la C1 estérase [8] thyroglobuline [48, 50] Myelin associated glycoprotein (MAG) [16] gangliosides [17] Sulfatides [6] Héparane sulfate [37] Antigènes nucléaires ADN [18, 46] SSA, SSB [4] Sm, RNP [1, 46] Histones [43]

12 Activités auto-anticorps anticorps monoclonales Stone et al al (Semin oncol 2003, 30, 318) Que MGUS IgM (172) 71 % activité auto-anticorps anticorps 43 % : glycoprotéines, glycolipides, oligosaccharides, glycosaminoglycans 12 % : glycoprotéines, gangliosides (neuropathies) 11 % : antigènes nucléaires al (An NY Acad Sci,, 2007,1107, 206) Carlizzi et al 1/3 des MGUS (tout isotype): activité auto- anticorps Un seul patient signes cliniques en rapport

13 Apport de l IFI pour la détection des gammapathies monoclonales Auto-anticorps monoclonal : Titre élevé historique, mais pas le plus fréquent Spécificité restreinte Aspect incomplet en comparaison à la réponse polyclonale

14 Réponse auto-immune Polyclonale : anti-a a + anti-b b + anti-c a b Auto-antigène Monoclonale : anti-a c

15 Réponse anti-muscles lisses polyclonale (estomac de rat) Conjugué : anti-gamkl FITC Photo : G Renier

16 Réponse anti-muscles lisses monoclonale, IgM kappa (estomac de rat) Conjugué : anti-gamkl FITC Photo : G Renier B

17 Suspicion d auto auto-anticorpsanticorps monoclonal IFI avec anti-sérums anti-chaînes lourdes et anti-chaînes légères Monotypie : même aspect avec une seule chaîne lourde et une seule chaîne légère IEP/IFx IFx : Seuil de sensibilité : 100 fois moindre qu IFI

18 Suspicion d auto auto-anticorpsanticorps monoclonal : résultat IEP/IFx IFx : Ig monoclonale de même H et L qu en IFI : auto-anticorps anticorps monoclonal Pas d Ig monoclonale détectable : auto- anticorps monotypique Ig monoclonale d un autre isotype que celui de l IFI : 2 clones

19 Gammapathie monoclonale à activité (auto)-anticorps anticorps G Renier Congrès Eur Immunol demandes d auto-anticorpsanticorps / 1 an (2002) 68 suspicions (aspect inhabituel, fort titre) 32 (1%) mcl Ig (15 connues, 17 découvertes) 22 IgM 8 IgG 2 IgM + IgG Importance du conjugué : Anti-GAM GAMκλ

20 Poursuite de l étude : BACHY B, BURBAN M, FOUSSARD C, BEAUVILLAIN C, JEANNIN P, DELNESTE E Y, RENIER G, CHEVAILLER A. Gammapathies monoclonales à activité auto-anticorps anticorps : de l'immunofluorescence indirecte comme technique de dépistage. 5ème colloque GEAI2008. Revue Francophone des Laboratoires 2008, 404bis : Janvier 2002 décembre 2006 Environ demandes d auto auto-anticorpsanticorps 73 cas (0,61 %) Sex-ratio (homme/femme) : 33/40 (45%, 55%) Âge moyen : 62,2 ans Femme : 60 ans (21-97) Homme : 63,5 ans (9-94) 94)

21 Résultats 44 auto-anticorps anticorps monoclonaux 27 auto-anticorps anticorps monotypiques 2 (externes) : pas assez de sérum pour IEP

22 Tableau II : auto-anticorps monoclonaux 10 inconnues sur 44 Majorité IgM (30 / 44) isotype inconnue Connue sans Connue avec total renseignement renseignement IgM κ IgM λ IgG κ IgG λ IgM κ + IgM λ IgG κ + IgM λ IgG κ + IgM κ IgGκ κ + IgGλ λ + IgMλ total

23 10 ont un 2ème clone détectable par IEP, dont 1 connu Tableau III : auto-anticorps monotypiques isotype inconnue connue total IgM κ IgM λ IgG κ IgG λ IgM κ + IgM λ IgGκ κ + IgGλ total

24 Aspect : > 50% cytoplasme Tableau IV : aspect de fluorescence des gammapathies monoclonales à activité auto-anticorps aspect pourcentage Cytoplasme autre que cytosquelette 44,1 Cytosquelette Muscle lisse 19,1 Cytosquelette non muscle lisse 6 Nucléaire 13,2 autres 17,6

25 Tableau V : pathologies associées pathologies Nombre (pourcentage) hématologiques 32 (60,4%) infectieuses 4 (7,5%) Auto-immunes 5 (9,5%) rhumatologiques 2 (3,7%) autres 10 (18,9%) total 53 (100 %)

26 Tableau VI : diagnostic selon la connaissance préalablement à l'ifi ou non de l'immunoglobuline monoclonale pathologie Immunoglobuline monoclonale connue Immunoglobuline monoclonale inconnue waldenström 13 1 lymphome 4 0 MGUS 1 4 LAM 0 2 Simpson Golabi 0 1 PR 1 0 Hodgkin 0 1 infection 0 1 SAPL 0 1 total MGUS : gammapthie monoclonale de signification indéterminée LAM : leucémie aiguë PR : polyarthrite rhumatoïde SAPL : syndrome des anti-phospholipides

27 Etude prospective Etude sur 100 patients Janvier 2010, une semaine et demi IFI avec spécifiques : HEp-2 et 3 tissus 22 résultats positifs : 22 % - 1 Anticorps monoclonal - 21 Anticorps monotypiques

28 répartition substrat total MCl MTY Gλ Gκ Mλ Mκ Aκ HEp T total

29 Cas clinique n 1 Homme, né le 7 décembre 1937 Février 1997 : opération rétrécissement aortique, découverte MGUS IgM lambda Avril 2006 : paresthésies distales des membres sans anti-mag Janvier 2007 : diagnostic de Maladie de Waldenström (envahissement médullaire lymphoplasmocytaire 50 %); modification de l IEP

30 Immunoélectrophorèse de janvier 2007 IFx après immunoprécipitation par A B Janvier 2007 Avril 2006 Anti-kappa Anti-lambda

31 Sérologie auto-immune Absence d anticorps anti-mag Présence d anticorps anti-sulphatides (dot M + G) Anticorps anti-muscles lisses de spécificité anti-actine actine de titre élevé (1/40000) Spécificité µ lambda

32 Immunofluorescence indirecte sur cellules HEp-2 du sérum dilué au 100ème (40X) B A Substrat : cellules HEp-2, µ Substrat : cellules HEp-2, anti-lambda Parfaitement négatif avec anti-γ, anti-α et anti-k

33 Immunofluorescence indirecte sur cellules HEp-2 de la fraction IgM purifée 100ème (40X) A B C D A : Courbe obtenue par Gel filtration du sérum présentant les différentes fractions en fonction de la DO à 280 nm B : Analyse de la fraction 34 par immunofixation, permettant de confirmer qu'il s'agit de l'igmλ. C et D : IFI sur cellules HEp-2 en utilisant un conjugué anti-λ (C) et un conjugué anti-µ (D) retrouvant l'aspect anti-actine Avec les anti-sérums anti-γ, anti-α et anti-κ la fluorescence est négative

34 Inhibition Disparition de la fluorescence Du sérum De la fraction purifiée Avec actine F

35 Cas clinique n 2 : garçon, né le 21/02/1997 Syndrome de Simpson Golabi Xq 26 : Mutation gène glypican 3 (mutation faux sens dans l exon 3) : mutation maternelle Association devant doigts courts,hexadactylie, philtrum long, haute stature, viscéromégalie, macroglossie et hernie inguinale Déficit immunitaire non classé AHAI : 6 épisodes de 4 à 8 ans IgG 2 def Hyperplasie lymphoïde entre 3 et 9 ans Découverte d une IgM lambda anti-cytosquelette : en avril 2005 (IES et dosages normaux en juillet 2004)

36 Conclusion Intérêt de pratiquer la recherche des auto-anticorps anticorps et des immunoglobulines monoclonales dans le même laboratoire Connaître possibilité auto-anticorps anticorps monoclonal/typique : aspect inhabituel d IFI Intérêt de l IFI : dépistage plus précoce des MGUS

37 Remerciements Benjamin Bachy Mélanie Burban Cécile Robineau Pascale Jeannin Céline Beauvillain Gilles Renier Yves Delneste U892 Rachel Boivinet Catherine Daniel Christine Deau Anne-Marie-Royer Et les cliniciens du CHU hématologistes adultes et enfant Et des CH extérieurs