Méthodes d analyse globales et ciblées en génétique et biologie moléculaire des tumeurs

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1 UE : Biopathologie moléculaire, cellulaire et tissulaire Date :21/03/12 Promo : PCEM2 Plage horaire : 16h-18h Enseignant : JP Merlio Ronéistes : Alice Larroumet alicelarroumet@hotmail.com Quentin Jarrion Méthodes d analyse globales et ciblées en génétique et biologie moléculaire des tumeurs I.Tumeurs et anomalies génomiques II.Méthodes d'étude de ces anomalies 1.Méthodes globales 2.Méthodes ciblées III.Conclusion (on ne peut plus brève!) Nous avons retranscrit tout ce qu'a dit J.P. Merlio. Cependant, la recherche de sens dans ses longues phrases est parfois restée vaine. Nous avons quand même essayé de rendre au mieux ses explications, mais ça ne change malheureusement pas grand chose au grand pouvoir pédagogique de notre cher professeur. Veuillez donc nous excuser si quelques fois (voir plus), les explications paraissent alambiquées. Bon courage!!! Aujourd'hui, j'ai demandé à ma copine quel héros de BD je pourrais être. Je viens de relire tous les Astérix, mais pas une trace de "Micropénix". VDM Aujourd'hui, j'ausculte les seins d'une patiente. C'est devenu bizarre quand elle a commencé à passer ses mains dans mes cheveux. VDM Aujourd'hui, au milieu de la nuit, ma copine a commencé à avoir le sommeil agité et à balbutier quelques mots. Je trouvais ça attendrissant avant qu'elle se dresse comme une furie, crie : "MEURS, SALE BÊTE!" et abatte son poing sur mes testicules. VDM Aujourd'hui, alors que je fais mes devoirs dans ma chambre, mon chat angora monte sur mon cahier en ronronnant. Énervée, je crie : "Enlève ta grosse queue poilue de mon visage!" La fenêtre était ouverte et mes voisins, en repas de famille. Trente personnes ont rigolé. VDM Aujourd'hui, je fais remarquer à ma copine, avec qui je suis depuis peu, qu'elle est habillée comme le jour où l'on a commencé à sortir ensemble. Sa réponse : "Oui, je trouvais ça marrant de mettre les mêmes vêtements pour notre rupture." VDM Aujourd'hui, ma copine est nymphomane et je suis précoce. VDM Aujourd'hui, je trouve un mot dans ma trousse : "Ta gomme a été kidnappée. Si tu veux la revoir, tu devras payer deux euros." Pensant que c'est une blague, je laisse passer. Plus tard dans la journée, je trouve un autre mot : "Plus que deux heures...", accompagné d'un bout de ma gomme scotché. VDM 1/13

2 I. Tumeurs et anomalies génomiques. Les tumeurs sont des altérations, soit génétiques, soit épigénétiques, aboutissant à des défauts de régulation de la division, de la survie ou de la différenciation cellulaire. Elles se caractérisent généralement par la capacité accrue pro-angiogénique. Dans tous les cas ça implique des altérations génétiques soit : primaires, pilotes (driver mutation), qui ont un effet de causalité, soit des altérations secondaires qui vont aggraver la tumeur. Il y a des gènes viraux, qu on observe dans 15% des cancers. - Comme par exemple dans les cancers du col utérin où il y a une présence constante de papilloma virus et qui caractérisent les cancers épidermoïdes. Alors que pour les cancers de la partie endocervicale ça peut être lié ou non à l HPV. On peut éventuellement aux phases pré-cancéreuses détecter par PCR la présence ou non de ces virus et typer ces virus pour voir s ils sont de type oncogène ou non oncogène. Mais la détection d'un virus n est pas obligatoirement lié au diagnostic de cancer. Avec un virus oncogène on est dans un groupe à risque de développer un cancer du col, mais pour le dépistage du cancer du col, actuellement on fait un mélange de frottis et de détection de l HPV avec la biologie moléculaire chez les patientes qui présentent des anomalies du frottis. Le fait de détecter l HPV ne signe pas le fait qu on ait une métaplasie ou une dysplasie ou un cancer. - Dans d autres cancers, on a un autre rôle des virus, comme le virus d Eppstein Barr par exemple qui infecte les lymphocytes B. Il peut être intéressant pour le diagnostic du cancer de détecter sa présence par des techniques d Hybridation In Situ. Il y a des gènes cellulaires, - qui sont soient accélérateur, soient suppresseur de l'oncogenèse, ou encore contrôlant l'angiogenèse, la migration cancéreuse, etc. - il y a un aussi certain nombres d altérations structurales et fonctionnelles de ces gènes (qui peuvent être dépister par les méthodes que nous verrons). Ça peut être des anomalies cytogénétiques, que l on voit au niveau des chromosomes, par exemple la translocation 9-22 avec le chromosome Philadelphie. En hématologie, ils font fréquemment des caryotypes parce qu on a la possibilité au niveau du sang d aller chercher les cellules après un 1er diagnostic d'orientation, et donc on refait un prélèvement (car c'est facile de faire une prise de sang ou une ponction sternale), et à ce moment là on peut programmer le caryotype en ayant déjà un 1er diagnostic. Dans les tumeurs solides c est plus compliqué, parce que le prélèvement sert au diagnostic, et on n a pas l information par une culture de cellules fraîches. De plus toutes les tumeurs ne se divisent pas assez bien pour faire un caryotype. Donc les caryotypes de tumeurs solides sont beaucoup plus difficiles car les 2/13

3 chromosomes sont moins étalés, etc, c'est pourquoi on ne le fait pas souvent. Cependant il faut apprendre à raisonner sur ces tumeurs même en l absence de caryotype pour regarder les anomalies soit de structure soit de nombre. Ces chromosomes sont en général au nombre de deux pour les autosomes, et dans notre génome on a un chromosome paternel et un maternel. Dans certains cas de recombinaison mitotique, on peut avoir un profil chromosomique parfaitement équilibré, mais il y a une recombinaison somatique qui a abouti à une perte de l hétérozygotie. On peut voir ça quand on utilise des marqueurs du polymorphisme génétique que sont les Single Nucleotide Polymorphisms ou les marqueurs microsatellites. Ça peut arriver dans les tumeurs, et ça peut être exploré par des techniques pour explorer la LOH (loss of heterozygocity) lorsqu un chromosome maternel acquiert une partie de chromosome d origine paternel. des phénomènes plus simples facilement visibles, comme de polyploidie, c est-à-dire augmentation du nombre de chromosomes. Ces phénomènes ne font que signer la nature anormale des tumeurs. des phénomènes d aneuploidie, c est-à-dire déséquilibre du nombre de chromosomes, par exemple une trisomie (12, 7 par exemple) ; sans qu on sache toujours pour toutes les tumeurs quelle est la signification. des translocations sont beaucoup plus intéressantes en termes de diagnostic. Le chromosome philadelphie, décrit dans les années 60, ou on a un échange de matériel génétique entre 9 et 22, et on peut voir cela soit par des techniques de banding soit par des techniques de FISH. Il y a aussi des translocations avec des déséquilibres, un des deux perd du matériel génétique. des amplifications, soit mini chromosomes sans vraiment de signification, soit en région homogènes répétées (HSR), où on a en tandem une multiplication du génome qui fait gagner un oncogène. On peut voir ça par exemple pour le gène myc (N-myc dans le neuroblastome), C-myc, ou autres. Soit encore, il y a éventuellement des amplifications par distribution aléatoire dans le génome d oncogènes. des mutations ponctuelles (phénomène plus subtil), activatrices pour les proto-oncogènes ou inactivatrices pour les suppresseurs de tumeurs ; et pour détecter ça on va faire des techniques de biologie moléculaire, soit avec des sondes complémentaires soit par le séquençage. Pour les mutations il faudra étudier l ADN. des délétions, qui pour être détectées, vont demander des particularités. En effet, il va falloir soit doser le gène, soit détecter par FISH interphasique si il y a une, deux, ou zéro (délétion) copie(s) normale(s) du gène, ou éventuellement utiliser les techniques de CGH array. Enfin il y a des marqueurs d intérêt clinique qui sont les modifications épigénétique, par exemple la méthylation de promoteurs qui vont inactiver un allèle. C est un phénomène normal, mais ça peut être pathologique, pour un suppresseur de tumeur, si on a un allèle inactivé par mutation et que le deuxième a son promoteur méthylé. La majorité des analyses que l on fait en routine, c est pour les mutations, délétions et translocations. - On fait de la génétique somatique pour les cancers sporadiques et certains cancers héréditaires ; par contre il faut faire de la génétique germinale pour les cancers héréditaires (5 à 10% des cancers). Les altérations de gènes peuvent être qualitatives (translocation/mutation) ou quantitative (amplification/délétion), ce qui aboutit à des altérations des profils d expression de l ARN. Ce qui peut permettre (l'arn) d'être une cible d'étude des tumeurs. Quand on va étudier l ARN d'une tumeur, il est nécessaire d avoir du tissu congelé parce que la fixation sur le formol altère l ARN. 3/13

4 A quoi servent ces méthodes moléculaires et cytogénétiques pour détecter ces altérations? - Ça peut être soit cognitif, de la recherche, pour comprendre le mécanisme qui a conduit à la tumeur ; ou on peut prendre des groupes de patients qui ont des pronostics défavorables vs plutôt favorables, et voir quels gènes sont liés à un mauvais pronostic pour essayer de trouver, in fine, des thérapeutiques, ou modalités d'intervention. - Ça peut être diagnostic parce que certaines anomalies (comme chromosome Philadelphie) sont quasi pathognomoniques de certaines tumeurs, et on demande à rechercher le chromosome en ayant déjà une suspicion de diagnostic. - Pronostic, ça peut être l intérêt de trouver des marqueurs associés à l activité tumorale. Par exemple, on a dans les lymphomes B lymphocytaires à grandes cellules, plusieurs hit (cassures chromosomiques) capables de donner une intensification thérapeutique. Donc ça peut être intéressant, car il peut y avoir une intervention clinique. Cependant, il faut avoir un esprit critique, parce que la littérature est remplie de papiers avec des facteurs pronostics. Il est donc important de dissocier ceux qui auront un impact dans la démarche thérapeutique des autres. Ils sont soit de validation, soit validés. - Critères d inclusion ou d exclusion pour une thérapie, notamment une thérapie ciblée, c'est à dire que si il y a une mutation de la cible, on peut donner des inhibiteurs de la cible si la mutation est activatrice (ex la tyrosine kinase anti-egfr dans les cancers du poumon). Par contre, si il n'y a pas de mutations, on ne donnera pas d'inhibiteurs de tyrosine kinase. Il peut y avoir aussi des mutations activatrices d effecteurs en aval d une cible, et là au contraire ça va être des motifs d'exclusions. Ce n'est pas parce ce qu'on coupera des mécanismes d'amont qu'on coupera des mécanismes d'aval! II. Méthodes d'étude de ces anomalies Pour détecter ces anomalies génomiques, on a soit des méthodes globales quand les anomalies sont inconnues ou qu on a besoin de la combinaison d anomalies pour établir un diagnostic, par exemple pour obtenir ce qu on appelle une signature moléculaire (comme par exemple l hybridation génomique comparative, qui permet de dire les gains et les pertes et de voir quelle tumeur se caractérise par cet ensemble, soit au niveau de l ADN soit de l ARN). On obtient une cartographie d'expression de la tumeur (heat map) où on voit les gènes sur-exprimés dans certains groupes (gliomes, rhabdomyosarcomes,...) et 4/13

5 les gènes sous-exprimés dans d'autres. Ces techniques ont eu beaucoup d essor dans les années 2000 parce qu elles ont permis de distinguer des sous groupes tumoraux, que ça soit avec l'arn ou par techniques hybridations génomiques comparatives. Dans le cas de l ARN, on le met après transcription inverse comme sonde sur la puce. Et pour l'hybridation génomique comparative, on met de l ADN tumoral en rouge avec de l ADN normal en vert, et on va voir si, en en mettant les mêmes quantités en hybridation compétitive et comparative, le normal gagne (c est-à-dire qu on aura une perte au niveau de la tumeur) ou le tumoral gagne (et là il y aura un gain au niveau de la tumeur). Ces techniques avaient un intérêt essentiellement pour connaître certaines pathologies mais pas d intérêt pour la prise en charge clinique des patients jusqu à récemment. C était lié au fait, premièrement, qu elles coûtaient plusieurs milliers d euros alors que maintenant plus que plusieurs centaines, et deuxièmement parce qu'il y avait des problèmes de reproductibilité de l ARN car individuellement tous les cas n avaient pas le même profil d expression. Il y a des boites américaines qui proposent des tests de prédiction d une tumeur si on leur envoie la tumeur par la poste (1500 euros), et ils peuvent prédire si la tumeur va récidiver (MammaPrint). Ils ne sont pas validés comme étant obligatoires et ne sont pas pris en charge ni par l assurance maladie, ni par l institut national du cancer. Le problème dans les cancers du sein et de la prostate c est qu on estime qu on sur-traite 60 voire 80% des cancers, et probablement ces tests permettraient d orienter le traitement et d éviter de cela. Ce qui est développé de manière importante depuis une dizaine d année, ce sont les méthodes ciblées pour aller chercher une anomalie moléculaire bien connue (surtout si anomalies d'impact uniques ou peu nombreuses). Avec une biopsie fraîche on peut éventuellement faire une culture cellulaire (rare), ou obtenir de la congélation pour faire de l'adn, de l'arn, de la CGH array ou de la transcriptomique. Avec la fixation, on peut faire coupe, FISH, biologie moléculaire, caryotypes, etc. 5/13

6 1.Méthodes globales Les méthodes globales sont : - Les caryotypes, apparus en les caryotypes en bande, qu on a pu faire dans les années 68, on peut voir les bandes G et les bandes R. - l invention du Southern Blot en 1975 a permis le développement de la biologie moléculaire et surtout toutes les techniques de clonage qui ont été nécessaires à la production des sondes utilisées en FISH. - les techniques de FISH vers 1986, en même temps que l'invention de la PCR. - vers la fin des années 90 sont arrivés les oligonucléotides qui ont permis de faire eux de la PCR. En une génération on est passé de l identification des anomalies cytogénétiques à des techniques, que l on utilise en routine, d immunohistochimie puis de biologie moléculaire. - ensuite il y a eu les puces ADN, la multi FISH : chaque chromosome avec un cocktail de sondes particulier permettant le traitement de l image avec des pseudo couleurs. Ça permet de détecter des translocations complexes avec des partenaires multiples ou des translocations qu on ne verrait pas sur le caryotype. 6/13

7 - le caryotype multicouleur, chaque chromosome multiplié par des sondes, et une pseudo-couleur est associée à une sonde. Ce type de techniques permet de voir l ensemble du génome, ça a permis aux cytogénéticiens de dépister des translocations aussi importantes que celles qui impliquent BCL2 (un gène anti apoptotique), myc (facteur de transcription),... C'est grâce à Kallionemi qui avait hybridé au départ l ADN tumoral et l ADN normal sur les métaphase d'un autre individu sain, et a eu l idée de spotter l ensemble du génome sur des lames de verre. Ça a des applications par exemple dans les neuroblastomes, les patients qui n ont pas d amplification ont un meilleur pronostic. Le pourcentage de patients qui, soit récidivent soit ne récidivent pas, ou, soit meurent ou ne meurent pas, on voit que les patients qui n ont pas d amplification du gène N-myc ont un meilleur pronostic. Et donc pour ceux qui ont l amplification du gène N-myc et auront un mauvais pronostic, on aura une intensification thérapeutique et une greffe de moelle pour ces jeunes patients (car c est une maladie des enfants qui affecte les neurones adrénergiques du système nerveux autonome). Il peut y avoir d autres anomalies surajoutées ou alternatives à l amplification de N-myc qui sont aussi de mauvais pronostic, ce qui montre l intérêt de faire une technique globale de CGH array par rapport à une technique uniquement centrée sur N-myc. Chaque laboratoire a intérêt à se spécialiser pour les tumeurs rares. Quand il n y a pas d amplification ou d anomalies de 1p, c'est de bon pronostic et alors on a chirurgie 7/13

8 seule ou avec acide rétinoïque ou chimiothérapie à faible dose. L analyse de transcriptome peut être applicable soit au cancer du sein soit au cancer de la prostate mais pour l instant on fait pas ça en routine. 2.Méthodes ciblées Les méthodes ciblées découlent des connaissances qu on a acquises en techniques globales, on sait que dans certains types de tumeur il va y avoir un gain, ou une translocation, ou une activation. Le pathologiste va donner le diagnostic s il le peut sur des caractéristiques morphologiques et/ou en immunohistochimie, mais il faut qu il fasse des techniques moléculaires pour verrouiller son diagnostic et/ou l'invalider. - on peut utiliser de la FISH interphasique pour visualiser le locus et aussi établir pourcentage cellules portant locus. - ou de la PCR ADN qui va permettre d identifier des points de cassure d une translocation. - ou encore la RT-PCR avec la transcription inverse à partir de l ARN et essayer d'amplifier des transcrits de fusion et de regarder une surexpression. - ou enfin par immunohistochime, on peut dire que l'expression d'une protéine est anormale, par ce qu'elle découle par exemple d'une translocation, soit par son niveau d'expression soit par sa localisation (comme dans le lymphome folliculaire ou on a une surexpression du gène BCL2 qui empêche les cellules de mourir par apoptose). Ces techniques ont un gros intérêt par rapport aux caryotypes et aux techniques de mise en culture, c est qu elles peuvent être faites a posteriori après orientation histologique. On le fait sur tout type de matériel, mais la qualité la meilleure est de loin l'empreinte : on pose une tranche fraîche de la tumeur sur trois ou quatre lames, ces empreintes tumorales permettent de faire une coloration au MGG ce qui permet de faire 8/13

9 de la cytologie (parfait pour les techniques de FISH, voire de biologie moléculaire). Quand on fait ça, les cellules sont entières sur la lame, et on a le noyau entier, donc la qualité d hybridation est très bonne. On va pouvoir précisément compter le nombre de spots d hybridation, donc compter le nombre de gènes, alors que quand on fait des coupes on a des noyaux tronqués (car une cellule est plus épaisse que les coupes réalisées). La FISH est soit l obtention de la sonde, soit on achète la sonde marquée chez un fournisseur. Ensuite les externes (en pharmacie) préparent les échantillons sur des coupes de tissus, des cytospins, et empreintes, et on fait de la FISH sur noyaux interphasiques (ifish). Ca passe par des étapes de dénaturation de la sonde et de la cible (doubles brins), et on fait l hybridation, on lave et enfin on fait la technique de fluorescence. On a une approche dite de fusion : quand on a une translocation, on va voir se rapprocher le signal rouge et le signal vert (par exemple avec le Bcr-Abl et les chromosomes 9 et 22 dans la LMC). Typiquement, au lieu d'avoir deux rouges et deux verts, on a un rouge et un vert et deux fusions (c'est la marque de la translocation). Ce sont les sondes de fusions. Ensuite on a des sondes (split (chez Dako) ou break apart (chez Abbott)) que notre moustachu national appelle lui, sondes de séparation. A l état normal il y a fusion, car on a recouvert le locus du gène normal en rouge en 5 et vert en 3, et à l'état normal on observe deux allèles fusionnés. Mais si un des deux allèle est transloqué, on a une séparation du rouge et du vert. L'intérêt est qu'on détecte ça facilement sur des noyaux interphasiques (ce qui est plus dur avec les fusions sans les cellules entières). Un autre avantage est qu'on peut détecter les cassures quelque soit le partenaire de la translocation, c est utile si les patients ont le même pronostic quel que soit le traitement. Dans les laboratoires de détection sur les sarcomes on utilise une sonde de split pour EWS, car c est la dérégulation de ce gène qui compte pour le traitement. Quand on a des signaux qui se dédoublent c est qu on a réplication de la chromatine et deux chromatides. La FISH permet de rechercher des délétions : gènes codant pour 1p et 19q dans les neuroblastomes et les 9/13

10 gliomes, gènes CDKN2A et CDKN2B dans de nombreux types de cancers. Des amplifications comme N-myc dans les neuroblastomes, C-myc et HER2/ERBB2 dans le cancer du sein et on a un médicament STRATUZIMab anti-her2 qui permet une thérapie ciblée. Les délétions 1p36 au niveau des tumeurs gliales ont un intérêt pronostic. Mais comment voir une délétion? Pour voir une délétion, il faut une sonde témoin du chromosome qui permet de dire qu on a bien les deux centromères, et aussi une sonde du locus d intérêt. C est important parce qu on peut avoir sur des cellules tumorales des polysomies ou des pertes de chromosomes. Si on veut montrer une perte et/ou un gain, il est logique d avoir une sonde du même chromosome qui sert de contrôle par rapport au locus d intérêt. On va compter le nombre de spots verts par rapport au nombre de spots rouges dans les cellules tumorales. C'est plus facile si on a une empreinte! La PCR permet d amplifier une séquence d intérêt, soit pour la séquencer, soit pour la faire migrer sur gel. On a de plus en plus de problème car on va s adresser à de l ADN tout venant, de pièces chirurgicales fixé par le formol ou inclus en paraffine. De plus les étapes de fixation peuvent être assez variables d un endroit à l autre et il faut donc avoir des techniques robustes de PCR qu on va adapter à la génétique tumorale et il faut essayer d amplifier des fragments d assez petite taille. Notre problème c est qu on va devoir cibler de l ADN assez souvent dégradé, et donc on va adapter les techniques de génétique globale aux techniques de génétique ciblée pour étudier de façon de plus en plus précise des ADN dégradés. Et donc, comme on s adresse à de l ADN dégradé, il y a des nouvelles techniques qui émergent de séquençage parallèle ou en profondeur (dans les 5 ans qui arrivent on va devoir adapter ces techniques à l étude de matériel issu de la filière anapath). La PCR a largement remplacé les techniques de southern bloting et northern bloting. Ça permet de doser le nombre de copies de gènes (amplifications/délétions), de mettre en évidence des translocations, de détecter l ARN, d'avoir de l'adn avant le séquençage, etc. La PCR quantitative permet de travailler avec des systèmes fermés, ce qui évite la contamination des produits de PCR. Elles sont en plus sensibles et rapides. Cependant, le problème de la PCR c est que les amplifias (ou amplicons) sont extrêmement volatils et peuvent contaminer les mains ou cheveux des techniciens, donc il faut avoir des locaux séparés pour chaque étape. 10/13

11 Dans la méthode de Sanger, on utilise des didéoxynucléotides qui vont être des terminateurs de chaînes, on obtient donc des longueurs différentes, on passe le tout en électrophorèse pour séparer, puis on détermine le nucléotide fonction de la couleur du terminateur de chaîne. On a ainsi l enchaînement et le séquençage de notre ADN Quand on utilise du matériel tissulaire, il faut aller repérer la zone tumorale, aller la prélever,et non pas le tissu conjonctif, et interpréter la PCR en fonction du nombre de cellules tumorales. Si le prélèvement contient trop peu de cellules tumorales, il est probable de passer à coté de la détection de la mutation (en dessous du seuil de détection). Ces mutations intéressent notamment les récepteur tyrosine kinase, comme FGFR3 dans le cancer de la vessie, EGFR dans le cancer du poumon, c-kit dans les mélanomes, etc. L'intérêt des techniques qui étudient des marqueurs du polymorphisme génétique : - on a notamment les Single Nucléotide Polymorphisme (SNP) qui correspondent à un nucléotide alternatif dans la population générale permettent de voir si le patient est hétérozygote et de voir si en analyse de liaison on a association d un phénotype avec un allèle (renseigne sur l agressivité tumorale, la chimio-résistance). Par exemple pour les thérapies ciblées anti EGFR, il a été démontré qu'un polymorphisme au niveau du RC gammaf3 il y avait un polymorphisme qui conditionnait la réponse. Ça se fait par séquençage ou avec des sondes spécifiques d allèle. - ensuite il y a de l application pour l analyse des marqueurs microsatellites, les Short Tandem Repeat 11/13

12 (STR), qui sont des répétitions de dinucléotides ou trinucléotides. Ca va permettre de rechercher en comparant la tumeur à l ADN constitutionnel (du sang, des cellules buccales) si il y a une perte d hétérozygotie. C'est surtout théorique pour l'instant, mais il y a un intérêt pratique majeur qui est dans le cancer du colon, c'est l instabilité microsatellitaire. Dans un cas de cancer du colon chez un sujet jeune (moins de 60 ans (et plus 50 depuis la réforme de l'inca)) on peut avoir des pertes d expression de gènes qui interviennent dans la réparation de l ADN, qui sont les gènes MLH1, PMS2, MSH2 et MSH6, et qui normalement fonctionnent de façon hétérodimérique. Or les cellules tumorales ont perdu cette expression. Donc, dans ce cas là, il faut rechercher une instabilité des microsatellites qu on appelle le phénotype MSI ou RER. On fait d une part de l IHC pour regarder une perte d expression des protéines des gènes de réparation, et d autre part, toujours combiné à l IHC, on fait une étude des micro satellites, c'est une études des marqueur du génome qui sont des marqueurs de répétitions de l'adn et on regarde si dans la tumeur on a l apparition de néo allèles. En effet, les gènes de réparation de l ADN (qd ils sont mutés) vont entraîner un «bégaiement» et donc l apparition de néo allèles. Donc le phénotype (bien phénotype et pas génotype, bien qu'on utilise de l'adn, car on ragarde la conséquence au niveau du génome) MSI high est la conséquence de la mutation des gènes de réparation de l'adn. Dans le phénotype MSI high il y a au moins deux néo allèles qui apparaissent. Ceci va conduire sauf si il y a une mutation BRAF dans la tumeur à une consultation oncogénétique constitutionnelle. C est ensuite dans la génétique constitutionnelle qu on décidera en fonction de l enquête familiale et du phénotype MSI high si on fait une fait une recherche des mutations des gènes du mis-match. Les deux approches de recherche du phénotype MSI high: une approche IHC de perte d expression des gènes (de protéines correspondant au mis-match repair) et, conséquence phénotypique du bégaiement des gènes lors de l'élongation (sans corrections donc) par les polymérases, on a apparition de néo allèles au niveau des marqueurs microsatellites. Secondairement et selon le profil, on va séquencer le gène qui est inactivé et pas celui qui s exprime. Il y a une exception à cette nécessité de séquençage, c est que 10 à 15% des cancers colorectaux sporadiques (non familiaux) ont des phénotypes RER liés à la sénescence, ou liés, soit à la mutation somatique des îlots CpG du promoteur du gène MLH1, soit a une mutation somatique du gène BRAF (qui se voit dans 40% des syndromes MSI et 60% de ceux qui ont perdu MLH1). La détection de BRAF permet d exclure le caractère génétique. Il n'y a jamais de famille qui sont BRAF mutés et qui ont mutation génétique rentrant dans le cadre de la maladie de Lynch). Il y a une continuité de la clinique et du pathologiste. Ce dernier va détecter en IHC la perte d expression. Ce cas du cancer colo-rectal, ou il peut y avoir une instabilité microsatellitaire peut rentrer dans le cas d un syndrome héréditaire mais aussi dans des cas sporadiques. 12/13

13 Le cas de méthylation du promoteur de MLH1 montre qu'il peut être utile d'étudier la méthylation. Quand les îlots CpG ne sont pas méthylés, le traitement par le bisulfide de Na de l ADN va transformer les C en U et donc, une séquence CGCT va se lire après amplification par PCR : TGTT. Mais si la cytosine porte un dérivé méthylé, à ce moment là elle résiste à la conversion et donc la séquence va se lire CGTT. Pour étudier la méthylation de l'adn, on va faire d abord un traitement d ADN par le bisulfide, puis une amplification d ADN avec soit des primer spé de cette séquence, soit des primer consensus, soit des primer globaux, et à la fin on peut regarder par rapport à la séquence connue du gène, le nombre de C qui ont été méthylés. L hyperméthylation peut induire l inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs, alors que l hypométhylation peut induire la surexpression de gènes. Conclusion Ces méthodes ont un but cognitif, diagnostic, pronostic et c est de plus en plus un critère d éligibilité pour les thérapies ciblées. Toutes nos condoléances pour cette ronéo!!! Aujourd'hui, mon chat est mort écrasé. Il s'appelait Compote. VDM 13/13