Arthropodes pour étudier les
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- Charles Desjardins
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1 U R Arthropodes pour étudier les pathologies humain Dr. Cristina SOCOLOVSCHI Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Émergentes Université Aix-Marseille
2 autres arthropodes
3 Embranchement le plus important du règne animal (85%) en nombre d espèces et en biomasse 90% : insectes Diversité morphologique / Plasticité écologique : - colonisation de tous les milieux, terrestre, aquatique, aérien - adaptations, modes de vie et de reproduction des plus variés (prédateurs, parasites, phytophages, hématophages )
4 Mécanismes de transmissions divers:
5 TIQUE
6 PLUSIEURS TYPES DE RECHERCHES Recherche Appliquée Modèles Expérimentaux Terrain Investigation Recherche Clinique
7 1. Utilisation de la biologie Moléculaire pour l Epidémiologie des Maladies Transmises par les tiques
8 METHODOLOGIE GENERALE Collecte des Tiques (1) «au drapeau»
9 sur les hôtes METHODOLOGIE GENERALE Collecte des Tiques (2)
10 METHODOLOGIE GENERALE Identification morphologie des tiques? Clés d identification Développement des outils moléculaires +++
11 METHODOLOGIE GENERALE Test d hémolymphe si tiques vivantes Apposition sur une lame pour coloration spécifique ou IF Inoculation sur des milieux de culture spécifiques Biologie moléculaire
12 METHODOLOGIE GENERALE Détection moléculaire des bactéries Tique désinfectée en surface -80 C amorces de PCR +/- spécifiques
13 METHODOLOGIE GENERALE Isolement des bactéries associées aux tiques Isolement par culture cellulaire en tubes bijoux en cas de nouvelle séquence 1/2 tique correspondante congelée
14 METHODOLOGIE GENERALE Précautions Niveau de sécurité biologique Ex: tiques potentiellement infectées P3 pour mise en culture Biologie moléculaire Risques de contaminations Rôle du choix des témoins négatifs un témoin de PCR: eau stérile remplaçant l échantillon d ADN un témoin d extraction d acides nucléiques: arthropode non infecté (1/10)
15 EXEMPLE CONCRET Rickettsiose en Afrique?
16 Epidemiology of TBR in Africa before our study Morocco R. conorii Chad: R. conorii R. aeschlimannii Djibouti: none SFGR Ethiopie: R. africae R. africae R. conorii conorii R. conorii caspia R. sibirica mongolotimonae R. Aeschlimannii R. massiliae R. rhipicephali R. monascensis R. raoultii Uganda: none SFGR
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18 Rickettsiose boutonneuse = Fièvre boutonneuse Méditerranéenne à R. conorii?? Toutes les études sur des rickettsioses conduites au Maroc: basées sur des données cliniques et sérologiques.
19 R. aeschlimannii 1997: une nouvelle rickettsies dans Hyalomma m. marginatum : detectée de H. m. rufipes en Afrique de H. m. marginatum en Europe du Sud 2002: Premier cas humain chez un patient au retour du Maroc 2e cas chez un chasseur en Afrique du sud Raoult et al. Emerg Infect Dis 2002, 8: Pretorius et al. Emerg Infect Dis 2002, 8: 874
20 MATERIELS ET METHODES (1) Collection et identification des tiques: Période: Avril mars 2006 Lieu de collection: - animaux domestiques - végétation Région de Taza au nord-est du Maroc Identification morphologique: les clefs taxonomiques Maintenance: en éthanol à température ambiante Extraction d ADN: laboratoire des Maladies Vectorielles, Institut Pasteur du Maroc, Casablanca, Maroc. Des échantillons d'adn ont été ensuite livrés à Marseille, France.
21 MATERIELS ET METHODES (2) Détection par PCR et identification des espèces de rickettsies. gène de la citrate synthase (glta) gène d'ompa Deux contrôles négatifs : eau distillée et ADN d une tique d élevage Un contrôle positif (ADN de R. montanensis) séquençage Analyse des séquences par BLAST et comparaison à la base de données de GenBank. Identification moléculaire des tiques. gène de l'arn 12S des tiques
22 Socolovschi C.,et al Molecular detection of spotted fever group rickettsiae including emerging pathogens in ticks frommorocco.emerging Infectious Diseases. 14(7): R. massiliae (5/106) R. endosymbiont of Ha. sulctata ( Rickettsia kastelanii ) (61/79) R. endosymbiont of Ha. sulctata ( Rickettsia kastelanii ) (17/24) R. monacensis(5/9) R. helvetica(4/9) R. aeschlimannii(3/35) R. slovaca(5/6) R. raoultii(1/6)
23 Clin Microbiol Infect 2009
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27 Socolovschi C.,et al First molecular identification of pathogenic rickettsiae from ticks collected in Uganda and Djibouti. Emerg Infect Dis. 13(10): R. africae in Djibouti R. conorii in Uganda
28 + Coxiella burnettii (Fièvre Q)
29 2. MODELES EXPERIMENTAUX Ex: Interactions R. conorii Rh. sanguineus
30 Elevage de Tiques en Laboratoire [Matsumoto et al. 2005]
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32 Fièvre Boutonneuse Méditerranéenne Rhipicephalus sanguineus Tique endophile: niches, maisons Spécificité d hôte: Peu d affinité pour piquer l homme Activité saisonnière: Adultes: printemps début été puis fin été début automne Larves: Juillet Nymphes: tout l été
33 Fièvre Boutonneuse Méditerranéenne La plus fréquente rickettsiose Decouverte en 1909 La plus sévère (2-10% mortalité en Portugal) Les dernières années : présence des multiple escarres La tique vecteur et réservoir Rhipicephalus sanguineus Présente que dans les pays de pourtour mediterranée: Pourquoi pas ailleurs!!!! U R
34 Fièvre Boutonneuse Méditerranéenne Incubation 6 7 jours Fièvre 100% Escarre (unique?) 72 % Parfois conjonctivite Eruption maculopapuleuse 97%
35 Bacteriemic rabbit «Tick swimming» Capillary feeding
36 Experimental model (1) Day 0: tick attachment larvae+ nymphs R. conorii Day 1, 2, 3, and 4 Take 1ml of blood 30 min after injection until 6hr and just before next injection Collection of blood Test blood samples using shell vial culture: 500 µl Keep 500µl for quantitative PCR (-80C)
37 Experimental model (2) Modèle I: injection directe IV (IVD) 5 min Model II: continuous IV injection: IVSE 2 hours Collection of engorged larvae and nymphs at day 5, 6 and 7 after attachment
38 RESULTATS: Forte mortalité de tiques infectées Day 1 Day 2 Day T C weight of 5 nymphs (mg) Relative quantity of R.conorii Inoculation D.1 Time (h) D.2 D.3 D Time (h) IVSE IVD IVSE (T C) IVD (T C)
39 Une explication à la faible prévalence des Rh. sanguineus infectées dans la nature? MAIS Attention aux déductions des modèles expérimentaux!
40 TIQUES NATURELLEMENT INFECTEES: 100% de transmission transovarienne Taux d infestation de la descendance: 99%! TOT rate : 100%
41 3. INVESTIGATION ET MODELES EXPERIMENTAUX AUTOUR DE CAS PLoS Negl Trop Dis 2008; 2 (11): e 338 ARTICLE DE REFERENCE POUR CE COURS
42 NIMES cas de «Fièvre Boutonneuse» dont 2 sévères avec choriorétinite
43 Investigation Tiques +++ Attaques +++ Rh. Sanguineus Detection par PCR : R. conorii (24/133; 18%) R. massiliae (13/133; 10%).
44 1 patient infecté par R. conorii 1 patient infecté par R. massiliae
45 Avril 2007: le plus chaud mois d avril depuis 1950
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47 Clin Microbiol Infect 2008: in press
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49 BORRELIOSES RECURENTES
50 BORRELIOSES RECURRENTES A TIQUES Vecteurs = Argasidae ou Tiques Molles Différences anatomiques et écologiques/ tiques dures Terriers, nids, cabanes... Piqûre +/- douloureuse Plusieurs repas rapides par stade Longévité et résistance
51 TICK BORNE RELAPSING FEVER Fièvre Récurrentes à Tiques 14 Borreliasp. Ornithodoros sp. Reservoirs: rongeurs et insectivores Maladie modérée à sevère
52 FIEVRES RECURRENTES A TIQUES Incubation environ 7 jours Début Brutal Frissons Fièvre Céphalées Arthralgies Myalgies. Durée du 1er épisode: 3 jours en moyenne (jusquà 15) Puis defervéscence. Intervalles sans fièvre de 7 j en moyenne 3 récurrences en moyenne (jusqu à 15) Formes sevères
53 The Lancet Vol 368 July 1, 2006 Incidence Moyenne TBRF sur 14 ans : 11 / 100 personnes-an (de 4 en 1990 à 25 en 1997). O sonrai : 31% infectées par B crocidurae The incidence of TBRF at the community level is the highest described in Africa for any bacterial disease. Une cause fréquente de fièvre d origine inconnue au Senegal, Mauritanie, Mali.
54 FU0 Senegal, December Juin 2009: 134 patients & 206 echantillons 27 echantillons de 25 patients positifs pour borrelia en RT-PCR (13%), dont 26 de Dielmo (26/172; 15%) et 1 Ndiop (1/34; 0.3%). La plupart des patients (13; 56%) < 10 ans Incidence / mois à Dielmo : jusqu à 1.79 en Juin et juillet 2009 Seulement 4 (15%) avait été trouvés positifs en FGE au dispensaire, et 15 (56%) trouvés positifs par des techniciens entrainés à Dakar. Parola et al., Emerg Infect Dis, 2011
55 ENQUETE ENTOMOLOGIQUE: G DIATTA Ndiop Dielmo
56 Ndiop Dielmo
57 186 Ornithodoros sonrai 60 NDiop & 126 Dielmo
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59 J5 après le repas des tiques de 4 terriers de NDIOP
60 J5 1 / 2 terrier Dielmo N1 terrier Negatif
61 Tiques testées en Borreliade Ndiopet Dielmo
62 POUX
63 Elevage de poux de corps humains Initialement = production du vaccin de Weigl Puis tests de sensibilité aux antibiotiques Hommes volontaires puis lapins
64 Pediculus humanus humanus Taxonomie (2) 3 espèces humaines => comportements différents 2 familles : Pediculidae : Phthiridae: P. humanus humanus P. humanus capitis P. pubis
65 Les Poux poux humains P. humanus capitis P. humanus humanus Phtirus pubis
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77 Elevage de poux de corps humains
78 Pediculus humanus humanus Vecteur de bactéries pathogènes Rickettsia prowazekii: : typhus épidémique, Maladie de Brill-Zinsser Bartonella quintana: : Trench fever, endocardites, lymphadénopathies chroniques, bactériémies Chroniques, angiomatose bacillaire Borrelia recurrentis: : fièvre récurrente à poux
79 Pediculus humanus humanus Co-évolution vecteur-bactéries Date de l association poux-bactéries inconnue Seul vecteur connu des 3 pathogènes majeurs Pas de similarité taxonomique, phylogénétique, ou physiopathologique => évènements indépendants? Caractéristique commune = maladies à rechutes
80 Modèle expérimental d infection par Rickettsia prowazekii (Houhamdi, Fournier, Fang, et al. J. Infect. Dis. 2002;186: ) Mort du pou infecté (maladie des poux rouges) 120 pourcentage de poux survivants jours L administration de doxycycline ne guérit pas les poux
81 Modèle expérimental d infection par Rickettsia prowazekii (Houhamdi, Fournier, Fang, et al. J. Infect. Dis. 2002;186: ) Infection de l estomac Pas de transmission à la descendance Survie de R. prowazekii dans les fécès > 15 jours
82 Infection de l épithélium digestif par R. prowazekii 1 er er jour Repas sanguin hématies de lapin R. prowazekii Estomac Épithélium digestif du pou Hémolymphe Invasion cellulaire Intestin
83 5 ème ème jour Multiplication intracellulaire Eclatement de quelques cellules Elimination de R. prowazekii dans les fécès
84 6 ème ème jour Rupture de l épithélium Passage dans l hémolymphe des hématies et des bactéries Coloration du pou en rouge puis mort du pou
85 Typhus épidémique Incubation 1 semaine Fièvre, céphalées, myalgies et prostration (tuphos) 5 jour : rash respectant paumes et plantes Pneumonie fréquente Mortalité sans traitement ~ 30 %
86 Le typhus épidémique, maladie réémergente : 1992: Cas isolés en Ethiopie et au Nigéria (Perine, Chandler, Krause et al. Clin. Infect. Dis. 1992; 14: ) : 1993: Cas isolés au Pérou (WHO memorandum. Bull. World Health Organ. 1993; 71:293-6) 1993 : Guerre civile au Burundi et au Rwanda 1994 : réfugiés Rwandais à Goma, Zaïre Epidémie de poux mais pas de typhus 1995: Epidémie dans une prison au Burundi: 9 cas (Raoult, Roux, Ndihokubwayo, et al. Emerg. Infect. Dis. 1997;3:357-9) 9) : 1997: Epidémie dans les camps de réfugiés au Burundi: > cas (Raoult, Ndihokubwayo, Tissot-Dupont et al. Lancet. 1998; 352:353-8)
87 Le typhus épidémique, maladie réémergente 1997: Epidémie dans un hôpital psychiatrique : 29 cas (Tarasevich, Rydkina, and Raoult. Emerg. Infect. Dis. 1998; 352:1151) Absence de chauffage, population importante de SDF infestée de poux 1998: Séroprévalence de 12% au Pérou (Raoult, Birtles, Montoya, et al. Clin. Infect. Dis. 1999;29:434-6) 1998: 1 cas importé d Algérie (Niang, Brouqui and Raoult. Emerg. Infect. Dis. 1999;5:716-8) 1999: 3 cas de maladie de Brill-Zinsser en France (Stein, Purgus, olmer and Raoult. Lancet. 1999;353:1936)
88 P. h. humanus et l histoire
89 Retraite de Russie, 1812
90 Vilnius 2002
91 Découverte de poux dans le sol de la fosse commune
92 Identification de 5 poux, confirmés par PCR/séquence => B. quintanadans 3 des poux (Raoult D, et al. J.Infect.Dis. 2006;193: ) 120)
93 ADN extrait de la pulpe dentaire de 35 soldats => 7 B. quintana+ + 3R. prowazekii
94 Ferdinand II d Aragon, roide Naples (Fornaiariet al. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2009;104:671-2) 2) Cadavre momifié Identification de P. h. humanus et P. pubis Mercure (anti-poux?)
95 MOUSTIQUES
96 Rickettsiafelis transmission? Le seul vecteur validé par la commission scientifique sont les puces de chat (Ctenocephalides felis) Etude sur 12 chats infestés avec des puces infectées en continu : séroconversion à 4 mois post-exposition 3/6 chats infestés avec 50 puces infectées 15 minutes/semaines: séroconversion à 4 mois postexposition 5/16 chats: R. felisdna détecté par PCR dans le sang Wedincamp et al Transmission verticale sur 12 générations: 65% à 2.5% (12eme génération) Wedincamp et al Transmission horizontale par co-feeding(3.3-40%) Hirunkanokoun S. et al. 2011
97 R. felis transmission? Fleas Ctenocephalides felis (C. felis felis and C. felis strongylus) Ctenocephalides canis Ctenocephalides orientis Leptopsylla segnis Pulex irritans Xenopsylla cheopis Anomiopsyllus nudata Archaeopsylla erinacei Echidnophaga gallinacea Spilopsyllus cuniculi Ctenophthalmus sp. Xenopsylla brasiliensis Tunga penetrans Polygenis atopus Diamanus montanus Dogs, cats, rodents, monkeys, opossums Dogs, cats, monkeys Dogs, cats Rats Humans, mammals Rodents, shrews Rodents Hedgehogs, dogs, cats, foxes Poultry, dogs, cats Cats, rabbits Rodents Rodents Humans, dogs, cats, pigs Dogs, cats, opossums Ticks Haemaphysalisflava Haemaphysaliskitasatoe Rhipicephalussanguineus Cats Cattle, deer Dogs, horses Amblyommacajennense Dogs, horses Ixodes granulatus Shrews Ixodes ovatus Mites Trombiculidae Leptotrombidium deliense Mesostigmata Lice Liposcelis bostrychophila Cats
98 R. felis transmission? Etude Kenya /6 patients durant le saison des pluies 16,2% 7,3 % 24,1 % Etude Sénégal ,7% 173/225 patients durant le saison des pluies (p=0.001) Keur Momar Sarr Niakhar Sine Saloum 18,7% Kedougou mm Casamance Casamance 0 mm % mois 0
99 R. felis transmission? Moustiques: ordre des Diptères et le sous-ordre des Nématocères 3 genres : Anopheles, Aedes, et Cules le plus important vecteursd agents pathogènes transmissibles Vecteurs de trois groupes d'agents pathogènes Plasmodium (paludisme: 212 million cas en 2008) Filaires (filarioses lymphatiques:120 millions de personnes) Nombreux arbovirus (dengue: 50 à 100 million cas dans des region endemique) Question: Rickettsies dans les moustiques?
100 Rickettsies-moustiques 1924présence des Rickettsia-likemicroorganisme dans les moustiques Culex pipiens Wolbachiapipientis, famille Anaplasmataceae, ordre Rickettsiales 1975présence d une autre Rickettsiasp. En microscopie électronique différente de W. pipientis dans les moustiques Aedes scutellaris Transmission transsovarienne dans les moustiques Nommé souche Tafahi
101 R. Felis-moustiques 1040 moustiques testés Socolovschi et al. 2012
102
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