BCPST-Véto 1 Mercredi 14 janvier- Devoir n 4 Durée 3h30. Sujet avec documents type ENS (partiel) - durée : 2h30

Transcription

1 BCPST-Véto 1 Mercredi 14 janvier- Devoir n 4 Durée 3h30 Sujet avec documents type ENS (partiel) - durée : 2h30 Exercice n 1 : La lignification : un marqueur de la différenciation cellulaire. La lignification est une étape importante dans le processus de différenciation du xylème et des fibres du phloème. Des travaux ont été conduits afin : - de déterminer le rôle de deux gènes de la voie de biosynthèse des monolignols dans la formation des différentes sous-unités ; - de comparer leurs profils d expression spatio-temporels au cours de la différenciation des systèmes vasculaires ; - de comprendre comment la plante contrôle l incorporation des différents monomères au sein des parois secondaires afin d adapter le plus précisément les propriétés physico-chimiques des parois aux fonctions qu elles doivent assurer au sein des différents tissus. Fig. 0 : Les trois monolignols constituant la lignine A. Afin de comprendre le rôle de deux enzymes, la COMT (Caffeic Acid O-methyl Transferase) et la CCoAOMT (Caffeoyl CoA O-Methyl Transferase) dans la synthèse des unités G et S, des plantes de luzerne sous-exprimant les gènes codant ces enzymes ont été produites à l aide de la stratégie anti-sens. On utilise des sondes oligonucléotidiques complémentaires des ARNm issus de la transcription des gènes étudiés, sondes qui, en se fixant sur ces ARNm, en bloquent la traduction en enzymes. Pkat = picokatal, unité mesurant l activité catalytique MS = masse sèche A.1. D après vos connaissances, rappelez brièvement comment se fait la lignification des parois végétales et les propriétés conférées par la mise en place de lignine au sein de la paroi. A.2. Commentez le tableau I et concluez quant aux rôles de la COMT et de la CCoAOMT dans la synthèse des unités G et des unités S. 1

2 B. Dans le but de déterminer le rôle de ces deux enzymes dans le processus de lignification des systèmes vasculaires, une expérience d hybridation en tissue-printing des ARNm a été réalisée sur des sections d entrenœuds d âges différents de Zinnia elegans (Fig. 1). B.1. Comparez les profils d expression des gènes COMT et CCoAOMT au cours de la différenciation et de la lignification des systèmes vasculaires. C. Une analyse plus détaillée de l ordre d apparition des différents types cellulaires constituant le système vasculaire primaire a été réalisée sur des sections de tiges de Zinnia elegans (Fig. 2) C.1. Etudiez l ordre d apparition des différents types cellulaires du système vasculaire primaire. C.2. Confrontez ces observations avec les résultats expérimentaux présentés dans la Fig. 1. C.3. Déduisez-en la composition monomérique des lignines des vaisseaux du xylème et des fibres xylémiennes et phloémiennes. C.4. Proposez un mécanisme régulateur de la composition monomérique des lignines dans les différents types cellulaires des systèmes vasculaires. 2

3 Exercice n 2 : Etude du mutant wol et caractérisation fonctionnelle de la protéine Wol Le profil des divisions cellulaires est un déterminant important de l organisation des tissus vasculaires chez les plantes supérieures. Des approches génétiques ont montré que les divisions à l origine de l établissement du système vasculaire sont sous la dépendance de facteurs hormonaux tels que l auxine, les cytokinines, les gibbérellines et l éthylène. A. Dans la présente étude, nous nous intéresserons à la caractérisation d un mutant d Arabidopsis, dénommé WOL (Woodenleg), affecté dans la différenciation du système vasculaire au niveau des racines (Fig. 1). Figure 1 b : Coupe transversale effectuée au même niveau d une racine d Arabidopsis sauvage (wt) et du mutant wol (wol). Les cellules surlignées sont des cellules à l origine de xylème. A.1. En vous aidant de la figure 1a, présentez les différentes étapes conduisant à la mise en place des tissus conducteurs dans la racine d Arabidopsis. A.2. Situez les coupes de la fig.1b et relevez les principales caractéristiques phénotypiques du mutant wol. Que révèlent-elles sur les modifications du fonctionnement de l apex racinaire chez le mutant? 3

4 B. L identification du gène wol par clonage positionnel a permis d aborder l étude de son expression. Une étude est menée au cours des stades précoces du développement de la plante. B.1. Après avoir expliqué comment la technique utilisée permet de déterminer la zone d expression du gène wol, vous indiquerez ce que nous montrent les résultats obtenus chez l embryon. Confrontez vos conclusions aux constats faits en A. Après avoir isolé le gène wol on l associe avec un gène codant une protéine fluorescente, la GFP (green fluorescent protein). Lorsque ce gène chimère s exprime, il conduit à la production d une protéine Wol.GFP qui est fluorescente. Le gène chimère est inséré dans un plasmide (petite molécule d ADN circulaire) puis le plasmide intégré dans une cellule végétale isolée et sans paroi (protoplaste de mésophylle). Remarque : le protoplaste témoin a reçu le gène de la GFP seul et n exprime donc que la protéine GFP B.2. Que peut-on déduire des résultats obtenus quant à la localisation de la protéine Wol dans les cellules où elle est produite? 4

5 C. On recherche l implication éventuelle de la protéine Wol dans la régulation hormonale de la différenciation des tissus vasculaires, régulation effectuée par l action des cytokinines (hormones végétales). Des expériences de transfection de protoplastes ont été conduites pour étudier l expression de gènes appartenant à la classe des ARRs de type A (ARR : Arabidopsis Response Regulator) et dont l expression est déclenchée par les cytokinines. Pour ce faire, on a intégré, par l intermédaire de plasmides, dans des protoplastes incubés en présence ou en l absence de cytokinines exogènes, un gène surexprimant wol sous sa forme native ou mutée (Fig. 4). C1. Quelle relation pouvez-vous établir entre la protéine wol et les cytokinines? On notera le fait que les cytokinines n entrent pas dans les cellules sur lesquelles elles agissent. C2. Quel peut être le rôle des résidus His.459 et Asp973 dans la fonction de la protéine Wol sachant que ceux-ci peuvent être phosphorylés et que leur localisation est cytosolique. On notera que les cytokinines agissent sur leurs cellules-cibles sans y pénétrer. D. Un autre facteur protéique, dénommé AHP (Arabidopsis Histidine-containing Phosphotransmitter), subit une phosphorylation en présence de cytokinines. Pour tenter d établir un lien entre les protéines ARRs et la protéine WOL, suivant le même principe que l expérience décrite en B, un plasmide permettant l expression du gène chimérique AHP:GFP a été intégré dans des protoplastes incubés. Ces protoplastes sont mis en présence ou en l absence de cytokinines (Fig. 6). Fig.6 : Essais d expression transitoire sur protoplastes montrant les profils de localisation intracellulaire des protéines AHPs. Le gène recombinant (GFP:AHP) a été introduit dans des protoplastes incubés en absence ou présence de cytokinines. D.1. Que vous suggèrent ces observations sur le rôle de la protéine AHP dans la régulation des réponses aux cytokinines? D.2. Replacez l ensemble des facteurs (WOL, ARR, AHP) et leurs interactions dans un schéma récapitulatif décrivant les régulations des divisions cellulaires au cours de la formation des tissus vasculaires au niveau de la racine. 5

6 A rendre avec la copie Devoir conçu à partir d un TD de biologie et physiologie du développement végétal de l université de Jussieu (A.S. Leprince, M. Barret, Eugénie Carnero). Les principales sources bibliographiques identifiées sont : Mähönen et al., 2000), Scheres et al

7 Exercice 1 : La lignification : un marqueur de la différenciation cellulaire : A.1. lignification = sclérification Affecte secondairement la paroi primaire et la paroi secondaire de certaines cellules au cours de leur différenciation polymère de 3 dérivés du phénylpropane, les liaisons entre les monomères est une polymérisation oxydative ayant lieu dans la paroi catalysée par une péroxydase. Il s'agit d'une construction par incrustation et intussuception. haute résistance aux tensions et à la compression. La lignine est aussi un polymère hydrophobe qui assure une imperméabilisation de la paroi. A.2. Dans le cas du témoin, l activité catalytique de la CCoAOMT est très supérieure à l activité de la COMT (22,35 pkat/mg contre 5,98). Les lignines G sont environ deux fois plus abondantes que les lignines S (305,4 µmol/g contre 158,8). Les lignines des parois de Luzerne sont majoritairement constituées d unités G. Dans le cas de la plante sous-exprimant le gène COMT, l activité catalytique de la COMT est quasi-nulle. L activité de la CCoAOMT est quasi-stable. Ceci correspond bien au résultat attendu. La proportion de lignines S est nulle alors que celle de lignines G est diminuée de l ordre de 10% L enzyme COMT est donc impliquée dans la synthèse de lignines S et en partie dans la synthèse de lignines G. Dans le cas de la plante sous-exprimant CCoAOMT, l activité catalytique de l enzyme CCoAOMT est quasinulle comme attendu. En revanche, l activité de la COMT est plus que doublée. La proportion de lignines S dans les lignines reste stable par rapport au témoin. La proportion de lignines G est diminuée de moitié. On peut donc en déduire que l enzyme CCoAOMT participe uniquement à la synthèse de lignines G, d où la diminution de sa proportion. L absence de CCoAOMT conduit donc à la stimulation de l activité de la COMT (en activant ou en désinhibant sa synthèse). Cette enzyme compense alors en partie l absence de CCoAOMT sur la voie de synthèse des unités G. B.1. Au niveau du premier entre nœud (A), le plus récent, on note la différenciation de xylème mais pas encore celle des fibres du phloème. On observe une très faible activité de la COMT au niveau des futures fibres phloémiennes, et une expression du gène de la CCoAOMT dans les vaisseaux du xylème en différenciation. Au niveau du deuxième entre-nœud (D), on observe les mêmes profils d expression. Cependant, les taches plus sombres indiquent une activité d expression plus intense. Au niveau du troisième entre-nœud (G), le plus âgé, on observe une expression du gène de la COMT à la fois dans les fibres phloémiennes, mais aussi au niveau des vaisseaux de xylème en différenciation. Le gène de la CCoAOMT s exprime de même à la fois dans les vaisseaux de xylème et les fibres phloémiennes, mais toujours plus intensément au niveau des vaisseaux de xylème en différenciation. L enzyme CCoAOMT est synthétisée plus tôt au cours de la différenciation des tissus de la tige. Elle participe à la lignification des futurs vaisseaux du xylème. Puis plus tardivement à celle des fibres du phloème conjointement à COMT. L enzyme COMT synthétisée un peu plus tardivement Participe au début de lignification des fibres phloémiennes Puis participe à un stade plus avancé conjointement à CCoAOMT à la lignification du xylème. C.1. En A (premier entre-nœud), seuls les vaisseaux de xylème apparaissent colorés au phloroglucinol. Ils sont donc lignifiés. En B (quatrième entre-nœud), la coloration au phloroglucinol permet de mettre en évidence la lignification 7

8 des vaisseaux du xylème, mais aussi des fibres xylémiennes et des fibres phloémiennes. Les vaisseaux conducteurs de sève brute sont donc lignifiés avant les fibres du xylème et du phloème. C.2. Le gène de la CCoAOMT qui s exprime précocement (cf figure 1) permet le début de la lignification des vaisseaux du xylème. Le gène de la COMT qui s exprime plus tardivement (cf figure 1) permet le début de la lignification des fibres du xylème et du phloème. C.3. La CCoAOMT participant à la synthèse des lignines G, on peut en déduire, que les lignines des vaisseaux de xylème contiennent essentiellement des unités G. La COMT assure la synthèse de lignines S (et peut permettre la synthèse de lignines G). On peut donc en déduire que ce sont des lignines S qui représentent la plus grande proportion de lignines des parois des fibres du xylème et du phloème. C.4. On peut alors supposer que l expression des gènes des enzymes responsables de la synthèse de lignines est contrôlée génétiquement. L activation / inactivation spécifique de l expression des gènes codant les enzymes dans chacun des types cellulaires aboutit à une lignification différente des parois de ces différents types cellulaires. Cette lignification différente des parois confère aux cellules qui l ont subie des propriétés et une fonction différente : résistance et conduction pour les vaisseaux, résistance et soutien pour les fibres. Total sur 40 Document complémentaire : Biosynthèse des lignines chez les angiosperm es Les intervention s des enzymes COMT et CCoACMT sont repérables 8

9 Corrigé de l exercice n 2 : Etude du mutant wol et caractérisation fonctionnelle de la protéine Wol A.1. Au dessus du centre quiescent dont les cellules ne se divisent pas se trouve la zone méristèmatique du cylindre central Les cellules se divisent dans la zone limitée par le péricycle pour donner les cellules à l origine du xylème, du phloème, des cellules compagnes, des cellules procambiales (non encore engagée dans une voie particulière) Les cellules qui donneront le phloème sont disposées en alternance avec celles qui donneront le xylème. Le protophloème se différencie avant le protoxylème. Dans la racine d Arabidopsis, après différenciation centripète du métaphloème et du métaxylème, il y aura 2 massifs de phloème et 2 faisceaux de xylème. A.2. Les 2 coupes sont situées à peu près au même niveau que la coupe I soit 69 ou 120mm au dessus du centre quiescent. Chez les mutants wol, le nombre de cellules du cylindre central est plus réduit. Ces cellules sont des cellules à l origine du xylème uniquement. Il n y a pas de protophloème ni ce cellules à l origine de parenchyme médullaire. La mutation réduit donc le nombre de divisions cellulaires au niveau de la zone méristématique à l origine du cylindre central. Elle empêche la mise en place de cellules à l origine du phloème et du parenchyme et donc la diversification des processus de détermination au niveau de cette zone. B.1. L ARNm antisens de l ARNm du gène wol (= sonde) s hybride par complémentarité avec l ARNm issu de la transcription du gène wol. Il se concentre donc dans les cellules qui expriment le gène, c'est-à-dire produisent la protéine Wol. On constate ici que l ARNm antisens est concentré au niveau de la racine embryonnaire et plus précisément au niveau de la zone centrale. On en déduit que le gène wol s exprime très précocement dans la racine dans la zone où il joue les rôles sur les divisions cellulaires et la détermination. Ces fonctions sont déficientes chez le mutant, ceci a été mis en évidence dans la partie A. B2. La protéine Wol rendue fluorescente peut être localisée dans la cellule. Dans le protoplaste témoin, la fluorescence est localisée dans toute la cellule sauf dans une zone centrale qui est probablement le noyau. Elle se trouve dans le cytoplasme. Dans le protoplaste contenant le plasmide on constate en plus de la fluorescence en périphérie au niveau de la membrane plasmique. Cette fluorescence supplémentaire peut donc être attribuée à la protéine wol rendue fluorescente. On en déduit que la protéine wol se localise au niveau de la membrane plasmique : c est une protéine membranaire. C1. On constate que la présence de cytokinines dans les protoplastes entraîne une augmentation de la présence de protéine ARR-A. (x5) Cette augmentation est beaucoup plus importante lorsqu il y a surexpression du gène wol (x 20). Au contraire la surexpression des gènes mutés a tendance à diminuer l effet stimulateur des cytokinines. Le fait qu en présence de cytokinines il y ait plus d ARR-A confirme que les cytokinines déclenchent l expression du gène ARR-A. La surexpression de wol accentuant cet effet déclencheur conduit à déduire que la protéine Wol joue un rôle d intermédiaire dans l effet des cytokinines sur l expression de ARR-A. Ce rôle d intermédiaire ne peut être réalisé si les protéines sont anormales. La présence de protéines anormales diminuant l effet acquis avec les protéines normales, on peut supposer qu elles exercent un effet compétitif avec les protéines normales. La protéine Wol étant située au niveau de la membrane plasmique, on peut supposer qu elle joue un rôle de récepteur aux cytokinines. C2. On peut supposer que la fixation de la cytokinine sur la protéine Wol entraîne sa phosphorylation au niveau des acides aminés His.459 et Asp973. Cette phosphorylation permet la transduction du message hormonal dans la cellule. 9

10 D1. La technique utilisée permet de localiser la protéine AHP grâce à sa fluorescence. On constate qu en l absence de cytokinines seul le cytoplasme est fluorescent. En présence de cytokinines, seul le noyau est fluorescent. On en déduit que les cytokinines déclenchent l entrée de la protéine AHP dans le noyau. Sachant que les cytokinines déclenchent la phosphorylation de la protéine AHP, on peut supposer que cette phosphorylation permet son entrée dans le noyau. La protéine AHP-P agirait ensuite sur les gènes dont l expression est stimulée par les cytokinines, les gènes ARR. AHP est un facteur de transcription Schéma récapitulatif des interactions des facteurs WOL, ARR et AHP lors de la régulation des divisions cellulaires au cours de la formation des tissus vasculaires Total sur 40 10