Traitement d images appliqué à la mesure de temps de vie de fluorescence sur des structures mobiles dans les cellules biologiques

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1 Traitement d images appliqué à la mesure de temps de vie de fluorescence sur des structures mobiles dans les cellules biologiques P. Roudot 1, C. Kervrann 1, J. Boulanger 2, F. Waharte 2 1 INRIA Rennes Bretagne Atlantique, Campus de Beaulieu, Rennes 2 UMR 144 CNRS - PICT IBiSA - Institut Curie, Paris Lyon, 12 Décembre 2012

2 Contexte biologique et motivation

3 Contexte biologique et motivation Cédric Blouin (UMR144, Institut Curie) Proximité moléculaire entre IFNAR1-GFP et tyk2-mcherry sur les vésicules? Suivi pendant l endocytose de cette interaction? (dynamique spatio-temporelle)

4 Utilisation du temps de vie (FLIM) pour la mesure de FRET Principe du FRET (Förster Resonant Energy Transfer) Effet sur le temps de vie de fluorescence τ = 1 k r + k nr + k t

5 Methode de mesure par modulation de phase

6 Détermination de la carte spatiale de temps de vie Séquence d acquisition des images à différents décalage de phase : Construction de la carte de temps de vie : Effet Doppler sur l estimation du temps de vie

7 Origine de l erreur sur le temps de vie Mouvement des vésicules pendant l acquisition : Solutions possibles : acquisitions plus rapide (si signal suffisant et dans les limites de l instrument), analyse par régions centrées sur les structures (choix des régions, résolution spatiale), suivi des vésicules et estimation du temps de vie.

8 Suivi du mouvement des ve sicules uorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) : Method and issues Mode le de variation spatiale et temporelle d intensite des ve sicules dans l image de phase k a la position x : I (k)(x) = Sθb (k)(x) + Sθ0 (k)gγ (x x0 (k)) + ε(k)(x) Sθ0 (k) est l intensite odel linkingou intensity to fluorescence lifetimemax du spot qui suit un mode le de variation sinusoı dal : ave (k )Gγ (x x0(k )) + ε(k )(x) Sθ0 (k ) = CS0 + AS0 cos imum intensity which follows a 2πk K + Φ τ0 + Φτ0, with θ0 = (CS0, AS0, Φτ 0 )T frame index (k ) ollowing the same model. e modeling 5. Iterative and alternative estimation of motion and lifetime Le bruit ε(k)(x) de pend donc de k (signal he te rosce dastique) et conduit a des erreurs d estimation du temps de vie. Tracking by gaussian fitting gives (x (k ), γ ) τ = % $ #%&,-%&.$,(.++/$ ""1$ tan(φ τ0 φm +φe ) 0 ωe 0 +0$ Sine parameters are estimated using a Leclerc M-estimator I(k )(x) Sθ (k )Gγ n (x x 0n (k )) 0 θ 0n = argmin k x W ρη Var[I(k )(x)] θ0!"#$ )] + σξ2 2 r2[ℵ(x)] + gccd (E2[gINT ] + Var[gINT ]) Var[ℵ(x)] + σξ2 model Var[ℵ(x)] = λ(x) = E[ℵ(x)] : mξ )2 + gccd (E[gINT ] + Var[gINT ] )([I(x)] mξ ) + σξ2. E[gINT ] false 0 (x0(k ),γ) Vesicle intensities MLE M-estimation k 2.22 Phase dered as non-stationary gaussian. nsifier gain could not be considered as constant. θ0n θ0n+1 δ θ0n Robust tracking is performed using a gaussian spot model (x 0n+1(k ), γ n+1) = argmin x W ρη I(k )(x) Sθ n (k )Gγ (x x0(k )) Intensity (x) = gint gccd ℵ(x) + ξ true F. Waharte, Institut Curie/CNRS Traitement d image 0applique a l analyse de temps de vie iteration number Frame index

9 Caractérisation du bruit de mesure Photocathode Phosphor screen CCD h e - e - h MCP Modèle de bruit de la caméra CCD intensifiée : I (x) = g intg ccdℵ(x) + ξ Le gain de l intensificateur n est pas constant mais peut-être modélisé :

10 Estimation du temps de vie sur échantillon fixé Utilisation du modèle de bruit pour l amélioration de la précision sur l estimation du temps de vie dans le cytosol : Important pour l analyse spatio-temporelle de la proximité moléculaire par FRET (différence de temps de vie vésicule/cytosol).

11 Estimation robuste conjointe du mouvement et du temps de vie

12 Estimation robuste conjointe du mouvement et du temps de vie

13 Résultats du suivi robuste des particules

14 Reconstruction de la carte de temps de vie Trouver les N différences!

15 Reconstruction de la carte de temps de vie Trouver les N différences!

16 Reconstruction de la carte de temps de vie Trouver les N différences! Notre méthode de nano-coloriage permet d améliorer la précision dans la détermination du temps de vie et donc du FRET, sur un échantillon dynamique donc une analyse spatio-temporelle de la proximité moléculaire.

17 Perspectives Il nous reste (entre autres!) à : amélioration de la reconstruction du fond (remplissage), application à l analyse spatio-temporelle des interactions entre IFNAR1-GFP et Tyk2-mCherry. améliorer le suivi de vésicules (disparitions, croisements...), traiter le cas de structures déformables (recalage élastique, flot optique...).