Université des Antilles-Guyane UFR des Sciences Médicales «Hyacinthe BASTARAUD»
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- Chantal Malo
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1 Université des Antilles-Guyane UFR des Sciences Médicales «Hyacinthe BASTARAUD» PAES maïeutique :méthode d analyse du génome Dr Maryse ETIENNE-JULAN
2 Programme La séparation des acides nucléiques, enzymes et manipulation de l ADN recombinant - L amplification et le clonage - Les techniques générales d étude du génome humain normal et pathologique - Les principes de la biotechnologie - L isolement et la manipulation des gènes. Les méthodes de transfert de gènes (2h30) -Les applications médicales et pharmaceutiques du transfert de gènes (1h) -La bioinformatique et l analyse du génome et de son expression : utilisation des banques de données, analyse et annotation des séquences, génomique, transcriptomique, protéomique (1h30) 2
3 A- Définition du génie génétique ou technologie de l ADN recombinant Ensemble des techniques qui permettent d'isoler un fragment d'acide nucléique (ADN) dans un organisme donné, de le multiplier (clonage) et de le réintroduire dans le génome d'un autre organisme. Basé sur la réunion d acides nucléiques d origines différentes 3
4 Applicables aux procaryotes et aux eucaryotes : Universalité de structure des acides nucléiques Universalité des modalités de réplication Autres dénominations : Technologie de l ADN recombinant (recombinaison non naturelle de molécules d ADN) Biotechnologie de l ADN 4
5 Objets : Caractérisation et/ou étude fonctionnelle d un gène individuel, d un groupes de gènes ou de tout autre ADN d intérêt (Fragments d ADN de tailles variables) 5
6 B- Rappels : Universalité de la structure des acides nucléiques
7 La structure des acides nucléiques Acides nucléiques = polynucléotides Acide désoxyribonucléique ou ADN (molécule double brin) Acide ribonucléique ou ARN (simple brin) Composent le matériel génétique des procaryotes et des eucaryotes 7
8 Nucléotides NUCLEOTIDE = BASE + SUCRE + PHOSPHATE Adénosine phosphate Guanosine phosphate Uridine phosphate Cytidine phosphate Désoxynucléotides : ADN (désoxythymidine phosphate) 8
9 La molécule d ADN est une double hélice Dans toutes les espèces vivantes, quantité de G toujours = quantité de C quantité de A toujours = quantité de T Les 2 chaînes sont associées par des liaisons hydrogène entre bases azotées - G avec C (3 liaisons H) - A avec T (2 liaisons H) 9
10 L enroulement des deux brins l un autour de l autre forme une double hélice : avec un petit sillon ( 12 Å de large) avec un grand sillon ( 22 Å de large). double hélice droite. enroulement se fait dans le sens des aiguilles d une montre le long de l axe de l hélice. ADN de forme B. 10
11 Petit sillon Grand sillon 20 Å 34 Å 11
12 C- Principes et principales étapes
13 Identifier l ADN d intérêt et l isoler : 1 ou plusieurs gènes provenant d un organisme donneur Insertion dans une molécule d ADN douée d autoréplication = vecteur Vecteur + insertion = ADN recombinant Insertion de l ADN recombinant dans une bactérie ou une levure amplification : production de nombreuses copies de la molécule recombinante : clones Etude du ou des gènes clonés 13
14 2 méthodes Méthode cellulaire ou in vivo: La plus ancienne La première étape : l ADN d intérêt est rattaché au vecteur in vitro Puis transfert de l ADN recombinant dans un système cellulaire (in vivo) où amplification 14
15 2 méthodes Méthode acellulaire : Tout se passe in vitro L ADN d intérêt est amplifié par une méthode enzymatique (Polymerase Chain Reaction) 15
16 D- Isolation de l ADN d intérêt
17 La méthode cellulaire
18 1- Nature de l ADN d intérêt N importe quelle région d une molécule d ADN peut être clonée Le plus souvent : 1 ou plusieurs gènes avec ou sans séquences régulatrices, séquences régulatrices, séquences codantes d un gène (ADN complémentaire, ),.. Provient d un organisme dit donneur 18
19 1- Nature de l ADN d intérêt (2) L ADN d intérêt doit être isolé in vitro de la molécule complète d ADN dont il représente une infime partie : Exemples : Génome humain : > 10 9 paires de bases Gène b-globine : 0,00005% du génome humain Gène de la dystrophine (myopathie) : le plus long des gènes connus : 0,08% du génome 19
20 2- Isolement de l ADN d intérêt Endonucléases de restriction de type II Endonucléase = enzyme capable de cliver des liaisons phosphodiesters entre deux nucléotides à l intérieur d une molécule d acide nucléique Capables de couper les molécules d ADN de toutes origines au niveau de courtes séquences spécifiques composées de 4 à 8 paires de bases 20
21 2- Isolement de l ADN d intérêt (2) Ces séquences (sites de restriction) sont retrouvées dans toutes les molécules d ADN du virus à l homme : répartition au hasard Les enzymes de restriction ne sont pas présents dans toutes les espèces : surtout dans les bactéries (défense contre les infections par les phages) 21
22 2- Isolement de l ADN d intérêt (3) Séquences de reconnaissance : palindromes dans la plupart des cas Séquences de paires de bases identiques sur chaque brin mais en position antiparallèle 22
23 Exemples de sites de restriction Enzyme de restriction EcoRI : Site : séquences de 6 paires de nucléotides 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 Bam HI HindIII 5 GGATTC 3 3 CTTAGG 5 5 AAGCTT 3 3 TTCGAA 5 23
24 2- Isolement de l ADN d intérêt (4) 2 types de coupures par les enzymes de restriction 2 types d extrémités Coupures générant des extrémités franches Avantage : permet de relier n importe quelles extrémités à bouts francs quelle qu en soit la fréquence Inconvénient : Si molécules à relier non isolées n importe quelle molécule d ADN à bouts francs va se lier à n importe quelle autre molécule d ADN à bouts francs 24
25 2- Isolement de l ADN d intérêt (5) 2 types de coupures par les enzymes de restriction 2 types d extrémités Coupures décalées générant des extrémités collantes simple brin complémentaires Exemple EcoRI : 25
26 26
27 2- Isolement de l ADN d intérêt (6) 2 types de coupures par les enzymes de restriction 2 types d extrémités Coupures décalées générant des extrémités collantes simple brin complémentaires appariemment Lorsque les 2 molécules d ADN sont clivées par le même enzyme mêmes extrémités collantesliaison 27
28 La méthode acellulaire : la PCR (polymerase chain reaction)
29 Polymerase Chain Reaction ou Amplification en chaîne par polymérisation qui permet de synthétiser un grand nombre de copies d une région d ADN Méthode très utilisée en biologie moléculaire mise au point en 1985 par Kary Mullis (Prix Nobel en 1993) On utilise une polymérase pour copier de l ADN dénaturé 29
30 La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l étudier. L amplification est de l ordre du milliard 30
31 Pour se faire, une série de réactions permettant la réplication d une matrice d ADN double brin est répétée en boucle. Au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant, l amplification est donc exponentielle. 31
32 Pour avoir réplication d un ADN double brin, il faut agir en trois étapes se déroulant à températures différentes. (1) Il faut dénaturer l ADN pour obtenir des matrices simple brin ; (2) délimiter la zone à amplifier et amorcer la réplication de la séquence à amplifier à l aide d oligonucléotides amorces spécifiques ; (3) réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire. A la fin de chaque cycle, les produits sont sous forme d'adn double brin. 32
33 La délimitation de la zone à amplifier : Par des amorces spécifiques qui vont s hybrider aux deux extrémités de la zone à amplifier: Il s agit d oligonucléotides de 20 à 25 nucléotides de long Ces oligonucléotides, par leur extrémité 3 OH, servent également d amorces pour l ADN polymérase 33
34 l étape de dénaturation, est réalisée à environ 95 C, pour une dissociation complète des deux brins d ADN. l étape d hybridation se fait à une température qui sera définie selon la nature des amorces (cette température varie de 50 à 60 C). Cette température va déterminer la stabilité des hybrides une fois que l appariement amorces / matrice est réalisé. 34
35 l étape de polymérisation est à environ 72 C, température de «travail» de l ADN polymérase thermorésistante utilisée. Au cours de cette étape, les brins complémentaires d ADN sont synthétisés à partir des extrémités 3 OH libre des amorces hybridées. 35
36 L ADN polymérase intervenant dans la PCR Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie thermophile (résistante à des températures très élevées), comme par exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase). De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces et plus fidèles. 36
37 37
38 E- Les vecteurs de clonage
39 Molécules d ADN douées d autoréplication = qui se répliquent indépendamment du chromosome cellulaire («replicons») Ont une origine de réplication : Origine de réplication extrachromosomique naturelle (vecteurs d origine bactérienne) Origine de réplication d origine chromosomique (vecteur provenant de la levure : chromosome artificiel de levure ou YAC) 39
40 Dans certains cas, le vecteur utilisé a la capacité de s insérer dans le génome de la cellule hôte pour se répliquer : Vecteurs rétroviraux Applications précises 40
41 Choix du vecteur Fonction de la taille du fragment d ADN à insérer Petits fragments d ADN (< 10 kpb) : vecteurs plasmidiques puis amplification dans des bactéries ou des cellules eucaryotes élémentaires Jusqu à 44 kpb : vecteurs dérivés du batériophage l (vecteurs d insertion lambda jusqu à 23 kpb, vecteurs cos jusqu à 44 kpb) 41
42 Choix du vecteur (2) Fonction de la taille du fragment d ADN à insérer > 300 kpb : vecteurs dérivés du plasmide de fertilité de E. coli (F-factor) : chromosome artificiel bactérien Vecteurs dérivés du bactériophage P1 : insertions de 100 kpb Très grands fragments de plusieurs milliers de pb (jusqu à 2 Mpb): chromosomes artificiels de levure 42
43 Vecteur de clonage Standard high copy number plasmid vectors Bacteriophage λ insertion vectors Bacteriophage λ replacement vectors Cosmid vectors Bacteriophage P1 PAC (P1 artificial chromosome) vectors BAC (bacterial artificial chromosome) vectors YAC (yeast artificial chromosome) vectors Taille du fragment d ADN 0 10 kb 0 10 kb 9 23 kb kb kb kb up to 300 kb Mb 43
44 1- Les vecteurs plasmidiques Bactéries Petites molécules d ADN circulaire double brin Contiennent quelques gènes 44
45 1- Les vecteurs plasmidiques (2) Modifications en vue du clonage : Introduction d un site de clonage multiple de 30 pb environ («polylinker») : séquence de synthèse contenant un exemplaire unique de plusieurs sites de restriction Introduction d un gène de résistance à un antibiotique : Seules les cellules qui auront reçu ce vecteur seront résistantes à l antibiotique concerné 45
46 1- Les vecteurs plasmidiques (3) Modifications en vue du clonage : Insertion d un système qui permette de reconnaître les molécules de plasmides qui auront intégré l ADN étranger : Présence d un gène marqueur Polylinker inséré dans gène marqueur ( très courte séquences) + (taille = multiple de 3) présence polylinker ne gène pas l expression du gène dans lequel il est inséré Insertion de l ADN étranger dans le polylinker inactivation du gène marqueur 46
47 1- Les vecteurs plasmidiques (4) Exemple : le plasmide puc19 1 site de clonage multiple (polylinker) 1 gène de résistance à l ampicilline : identification des cellules transformées Gène de la béta galactosidase sera inactivé par l insertion de l ADN étranger 47
48 1- Les vecteurs plasmidiques (5) 48
49 2- Les chromosomes artificiels de levure : YACs Avantages : Insertion de fragments d ADN de grande taille Présence de : séquences répétées des eucaryotes Centromères disjonction des chromatides (mitose) ou des chromosomes homologues (méïose) Télomères réplication complète des molécules linéaires et protection des extrémités contre attaque par nucléases Séquences de réplication autonome (ARS) 49
50 2- Les chromosomes artificiels de levure : YACs 50
51 3- Vecteurs pour l étude de l expression des gènes Objets : Etude des mécanismes d expression Production en grandes quantités du produit d un gène Procédures : Fragment cloné : ADNc = séquences codantes ARN messager ADNc (Transcriptase réverse :: synthèse d ADN à partir d une matrice ARN) 51
52 3- Vecteurs pour l étude de l expression des gènes (2) Procédures : Vecteur : séquences nécessaires à l expression Vecteur recombinant sera transférré dans des cellules : procaryotes pour l expression de gènes procaryotes eucaryotes pour l expression de gènes eucaryotes 52
53 F- Autres étapes
54 1- Insertion du fragment d ADN étranger dans le vecteur Digestion du fragment d ADN et du vecteur par la même enzyme de restriction Mis en contact ADN ligase liaisons phosphodiesters ADN recombinant 54
55 2- Amplification de l ADN recombinant Transfert de l ADN recombinant dans des bactéries ou des levures (transformation) autoréplication multiples copies Division bactérienne colonies bactériennes : milliards de copies du plasmide recombinant : :amplification +++ Se fait en deux étapes 55
56 2- Amplification de l ADN recombinant (2) Se fait en deux étapes : Les cellules transformées sont étalées sur une boîte de PETRI sur de l agar croissance de colonies séparées (clones = proviennent chacune d une cellule transformée) Colonies individuelles sont prélevées et amplifiées séparément dans un milieu de culture 56
57 2- Amplification de l ADN recombinant (3) Lyse des cellules Isolement de l ADN recombinant à partir des cultures 57
58 En résumé 58
59 59
60 60
61 G- Les applications en médecine et en pharmacie du transfert de gènes
62 1- La production de molécules recombinantes
63 1-1. Principes Insertion d un gène ou d un ADNc dans un vecteur d expression eucaryote (plasmide ou virus) Transformation de cellules hôtes : bactéries ou cellules eucaryotes qui vont exprimer le gène recombinant Phase de Production abondante de la protéine Séparation et extraction du milieu de culture puis purification de la protéine 63
64 Système de production de protéines recombinantes : couple vecteur d expression / cellule ou organisme hôte 64
65 1-2. Cellules hôtes les plus fréquentes Eischerichia coli La levure Saccharomyces cerevisae Cellules CHO (ovaires de hamster) 65
66 a) Production avec Eischerichia coli Premier hôte utilisé Principaux avantages : Génétique bien connue Grand nombre et diversité des vecteurs plasmidiques disponibles Facilité d utilisation Taux d expression élevé : plusieurs grammes de protéines par litre 66
67 a) Production avec Eischerichia coli (2) Principaux inconvénients : Sécrète mal les protéines : nécessité d une lyse cellulaire Pas de modifications post traductionnelles des protéines qui sont souvent une des conditions à leur activation 67
68 b) Production avec Saccharomyces cerevisae Levure de boulanger Principaux avantages Matériel génétique simple Pas de toxicité Taux d expression des protéines bons Capable de fabriquer des protéines complexes et de réaliser des modifications post traductionnelles 68
69 b) Production avec Saccharomyces cerevisae (2) Principaux inconvénients Sécrétion que pour les petits peptides Protéines complexes : Nécessité de lyser les cellules (production intracytoplasmique) diminution du rendement 69
70 c) Production avec les cellules CHO CHO : cellules des ovaires d hamster Principaux avantages : Production de masse Production de protéines complexes de haut poids moléculaire Certains vecteurs permettent d exprimer des gènes humains 70
71 c) Production avec les cellules CHO (2) Principaux inconvénients : Faibles rendements Cellules fragiles de culture onéreuse 71
72 1-3. Exemples de protéines recombinantes produites pour la médecine Hormone de croissance humaine (GH) : déficit en GH Insuline : diabète insulinodépendant Antigènes du virus de l hépatite : vaccin recombinant Facteurs de la coagulation : déficit en ces facteurs 72
73 1-4. Intérêts principaux en médecine Production industrielle de molécules précieuses Inocuité des protéines produites Exemple 1: Déficit en GH : Cas de maladie de Creutzfeld-Jacob chez des patients traités avec de la GH extraite d hypophyses humaines (cadavres) ; présence d une molécule dans ces extraits, responsable de la maladie 73
74 1-4. Intérêt principal en médecine Exemple 2 : Vaccination contre l hépatite B (production d antigènes du virus) Au départ, utilisation de virus atténués risque d hépatite mortelle ou de cancer du foie en cas de réactivation du virus Risque nul avec le vaccin recombinant Vaccin recombinant utilisable chez les immunodéprimés, 74
75 2- Les organismes transgéniques
76 Définition Organismes vivants dans lesquels un gène a été inséré dans le patrimoine génétique Plantes ou animaux 76
77 Animaux transgéniques Technique : Micro-Injection dans le noyau ou dans le cytoplasme d embryon Ou vecteurs rétroviraux recombinants dans des cellules souches embryonnaires 77
78 Applications potentielles Production de protéines recombinantes Modèles animaux de maladies humaines Compréhension des mécanismes pathologiques d une maladie Tests de nouveaux traitements 78
79 Exemple de la drépanocytose Mutation ponctuelle sur le gène b-globine (6ème codon) Maladie humaine grave et incurable Peu de traitements disponibles Mécanismes physiopathologiques mal compris 79
80 Exemple de la drépanocytose (2) Nécessité d un modèle animal : souris transgénique Microinjection du gène b-globine muté dans un œuf fécondé Réimplantation dans souris Souris drépanocytaire Utilisée pour étude des mécanismes physiopathologiques de la maladie et pour tester de nouvelles thérapeutiques 80
81 3- La thérapie génique
82 Introduction dans cellules somatiques du patient d un gène normal pour corriger les effets délétères du gène muté Thérapie somatique par transfert de gène dans des cellules somatiques 82
83 Nombreuses questions et difficultés majeures Comment délivrer aux cellules qui en ont besoin le gène d intérêt? Dans quelles cellules? Comment assurer une bonne régulation de l expression de ce gène? Comment assurer la production en quantité suffisante du produit de ce gène? Comment maintenir l expression sur un temps long (la vie durant)? Comment réaliser cela en toute sécurité pour le patient? Importance des études pré-cliniques et des modèles animaux
84 3-1 Comment délivrer aux cellules le gène d intérêt? = Quels vecteurs? Vecteurs non viraux: plasmides associés à des liposomes expression transitoire, très peu efficace Rétrovirus: Ex vivo Nécessité cellules en division pour intégration dans génome insertion dans génome avec expression permanente mais possibilité mutagenèse par insertion Lentivirus (famille des rétrovirus) mais peuvent s intégrer dans une cellule qui ne se divise pas Autre vecteurs dérivés de virus 84
85 3-2. Deux approches Approches ex-vivo greffe de cellules génétiquement modifiées in vitro prélèvement chez le malade de cellules transduction (transformation à l aide d un vecteur rétroviral) de ces cellules ex vivo au laboratoire Réadministration de ces cellules transduites au patient 85
86 3-2. Deux approches (2) Approches in vivo administration par voie IV ou IM du vecteur contenant le gène d intérêt chez le patient 86
87 3-2. Deux approches (3) 87
88 Premiers essais chez l homme 1990 : dans le déficit en adénosine désaminase déficit immunitaire combiné sévère ou SCID (Enfants «bulle») décès avant l âge de 2 ans Greffe de moelle osseuse efficace mais nécessité donneur compatible + mortalité élevée Transfert dans des lymphocytes T de malades d un vecteur rétroviral portant le gène de l ADA Bonne efficacité chez certains receveurs mais nécessité d administrations répétées car durée de vie limitée des lymphocytes 88
89 SCID liée à l X Mutation de la chaine gamma des récepteurs aux interleukines Greffe de moelle osseuse efficace mais nécessité donneur compatible + mortalité élevée Transfert à l aide d un rétrovirus dans dansla moelle osseuse Efficacité démontrée sur une durée de plusieurs années MAIS apparition après plusieurs mois chez certains receveurs d une leucémie liée à un phénomène de mutagenèse insertionnelle 89
90 Depuis 1990, 95 essais cliniques approuvés pour le transfert de gènes dans des maladies héréditaires monogéniques Mais peu de succès réels 90
91 Cas de la drépanocytose Thérapie génique testée sur le Modèle animal de la drépanocytose (souris drépanocytaire) 91
92 CORRECTION OF SICKLE CELL DISEASE IN TRANSGENIC MOUSE MODELS BY GENE THERAPY Pawliuk R, Westerman K, Fabry M, Payen E, Tighe Bouhassira E, Acharya A, Ellis J, London I, Eaves Humphries R, Beuzard Y, Nagel R, Leboulch P (Science, dec. 2001) 92
93 Vecteur sans gène correcteur Hb = 7 g/dl Vecteur avec gène correcteur Hb = 13 g/dl 93
94 Cas de la béta thalassémie b E /b 0 Béta thalassémie : maladie monogénique polyallélique Béta thalassémie b E /b 0 : forme la plus fréquente de bthalassémie dans les populations du sud est asiatique et leurs descendants b E thalassémie: Mutation au niveau d un site d épissage épissage alternatif ARN non codant Ou ARN instable qui code pour une protéine instable 94
95 Pour information : Cas de la béta thalassémie b E /b0 (septembre 2010) b 0 thalassémie: Mutation au niveau d un site d épissage allèle non fonctionnel Béta thalassémie b E /b 0 Importante réduction de la synthèse des chaines b- globine 50% des patients sont dépendants de la transfusion sanguine Seul traitement curatif : greffe de cellules souches hématopoïétiques mais manque de donneurs compatibles sur le plan immunitaire Risque de rejet et de réaction du greffon contre l hôte 95
96 Thérapie génique de la béta thalassémie b E /b 0 1 patient de 18 ans porteur d une forme sévère, dépendante des transfusions Pas de donneur HLA compatible Greffe de cellules le 07 juin 2007 avec un lentivirus porteur du gène b-globine Devenu indépendant des transfusions 21 mois après la greffe : taux d hémoglobine entre 09 et 10 g/dl 96
97 Thérapie génique de la béta thalassémie b E /b 0 (pour information) Bénéfice lié essentiellement à la présence d un clone dominant : activation par l intégration du lentivirus du gène activation transcriptionnelle du gène HMGA2 dans les cellules érythroïdes uniquement protéine HMGA2 tronquée (quel risque??) Au moment de la diffusion des résultats : 33 mois d efficacité thérapeutique 97
98 Perspective : Enjeu actuel Nécessité d un suivi à long terme de ce patient Réalisation à plus grande échelle dans le respect de l éthique Application aux patients drépanocytaires Transfusion independence and HMGA2 activation after gene therapy of human b-thalassaemia Marina Cavazzana-Calvo et al, Nature, 2010, septembre
99 LA BIOINFORMATIQUE ET L ANALYSE DU GÉNOME ET DE SON EXPRESSION 99
100 Définition La génomique est composée de trois volets complémentaires : la génomique structurale, la génomique fonctionnelle la protéomique. 100
101 Définition La génomique structurale analyse la structure des gènes et autres parties du génome. Elle permet l'annotation des génomes et l'identification des séquences informatives les gènes avec ou sans introns codant des protéines ou des ARN fonctionnels, les séquences régulatrices, les séquences répétées, les éléments transposables,
102 Définition La génomique fonctionnelle analyse la fonction des gènes et autres parties du génome et elle inclut l'analyse du transcriptome (ARN messagers) ou transcriptomique. La protéomique est l'analyse du protéome (protéines). La génomique structurale, la génomique fonctionnelle, la transcriptomique et la protéomique sont des approches complémentaires. 102
103 103
104 Le "matériau" de base de la génomique est l'ensemble des séquences d'acides nucléiques et de séquences polypeptidiques obtenues par différentes méthodes de séquençage. Ces séquences et d'autres types d'informations qui découlent de leur analyse sont stockées dans des bases de données. 104
105 L'accès aux bases de données s'effectue via le Web et Internet. Enfin, l'analyse de l'ensemble de ces données nécessitent des méthodes bioinformatiques. 105
106 OBJECTIFS La génomique a pour buts : de décrire l'organisation des gènes et des séquences de régulation de la transcription d'identifier les régions des génomes dont on ignore encore le rôle et élucider ce rôle d'étudier les différences d'expression des produits des gènes dans le temps et pour chaque type de tissus et de cellules 106
107 OBJECTIFS La génomique a pour buts (2) : d'étudier la structure et la fonction des protéines et des ARN pour lesquelles les gènes codent d'intégrer toutes ces informations dans un ensemble plus vaste, celui du métabolisme (métabolome) en décrivant les interactions entre tous ces types de macromolécules biologiques (interactome) d'obtenir ces données pour le plus grand nombre d'organismes possibles. 107
108 Génomique structurale : buts L'assemblage de cartes physiques et génétique des génomes : Position des gènes dans un génome L'obtention de séquences génomiques, de séquences transcrites et leur assemblage. Après avoir séquencé un génome, il faut identifier les gènes qu'il contient. 108
109 Génomique structurale : buts Une fois un gène identifié, il faut l'annoter, c'est- à-dire le relier aux données de génétique concernant sa fonction, son expression et les variations phénotypiques des mutants pour la protéine codée. 109
110 Concrètement, cela consiste à déterminer la structure globale du gène rechercher les cadres de lecture ouvert ou ORF ("Open Reading Frame") localiser les régions codantes localiser les sites d'épissage aux bornes exon / intron localiser les motifs de régulation de l'expression des gènes (sites d'initiation ou de terminaison de la transcription,...) déterminer les pseudogènes, les éléments 110 transposables...
111 Puis, on annote ces éléments, c'est-à-dire qu'on assigne aux molécules pour lesquelles ils codent : une fonction biologique / biochimique une localisation sub-cellulaire leur implication dans des processus de régulation leur interactions avec d'autres molécules biologiques une expression spatio - temporelle des produits des gènes 111
112 Des logiciels bioinformatiques sont dédiés à l'étude de la structure des gènes et à leur annotation. Par exemple : BLAST qui permet d'aligner la séquence du génome avec les séquences d'adnc ou rechercher des similarités entre ce génome et d'autres génomes déjà connus et annotés. "ORF Finder" (NCBI) : ARNm de la glutamate déshydrogénase. Suite logicielle pour l'annotation de Arabidopsis thaliana 112
113 Des bases de données regroupent les données de structure des gènes et leur annotation : Gene Ontology Annotation (GOA) Database Rice Genome Annotation Project Vertebrate Genome Annotation (VEGA) database Ensembl Genome browser 113
114 l'ensemble de ces données sont intégrées dans les grandes bases de données biologiques mondiales que sont : NCBI / Entrez (National Center for Biotechnology Information) EMBL - EBI UniProt 114
115 Proétomique La protéomique a pour but d'identifier (et de quantifier) l'ensemble des protéines synthétisées ou protéome, à un moment donné et dans des conditions données au sein d'un tissu, d'une cellule ou d'un compartiment cellulaire. apporte des réponses auxquelles la transcriptomique ne peut répondre Est très complexe 115
116 CONCLUSION Les biotechnologies et la bioinformatique occupent une place croissante en médecine : 116
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