Comment en finir avec l idée que les techniques BiaCore peuvent aborder les interactions intramembranaires!

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1 QUE PEUVENT APPORTER LES TECHNIQUES DE BIACORE DANS LA COMPREHENSION DES INTERACTIONS ENTRE PROTEINES/PEPTIDES MEMBRANAIRES? ou Comment en finir avec l idée que les techniques BiaCore peuvent aborder les interactions intramembranaires!

2 Principe Surface (sensorchip) ligand analyte Un des partenaires de la liaison (le ligand) est fixé sur une surface (sensorchip) L autre, (l analyte), circulant, se lie à la surface

3 Principe de la technologie BIAcore 1 Sensor chip prisme verre or Intensité flux Angle Sensor chip prisme verre or flux ligand analyte

4 En conditions cinétiques R k a. C. R R = max x (1 - e - (k a. C + k d ). t ) k a. C + k d t

5 Response(RU) Sensorgram Time (seconds) k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K A (M -1 ) x10 5 5x

6 Sensorgramme 1000 RU 1 ng Surface sensorchip 1mm_

7 Importance du canal de référence(fc1) RU FC2 (ligand) 30 Response FC1 (reference) Time s 80 RU Response Time s

8 Conditions expérimentales [densité de ligand (B), concentration de l analyte (A), température, flux ] Conditions cinétiques A bulk (C) = A surf Conditions de transport de masse A bulk (C) A surf Paramètres de l interaction Quantification de l analyte k m k a A bulk A surf + B AB k m k d k m k a A bulk A surf + B AB k m k d

9 La surface (sensorchip) Ligand Chaînes de dextran carboxylées non réticulées Linker Or Verre

10 L immobilisation Ligand immobilisé de manière covalente - couplage amine - couplage thiol - aldéhyde * Ligand capturé - streptavidine/biotin - NTA/His-tag - surface hydrophobe/lipides - anti-anticorps/anticorps - anti-gst/gst(protéine de fusion) - anti-peptide/peptide (protéine de fusion) Analyte Ligand Analyte Ligand Capture

11 Fixation de ligands par liaisons chimiques

12 Réponse RU Ligne de base Immobilisation du ligand Temps Activation des groupements carboxyles du dextran Retour à la ligne de base Injection du ligand La plupart des protéines fixées par des liaisons électrostatiques est éluée Désactivation et lavage par l éthanolamine Ligands fixés disponibles pour les interactions avec l analyte s

13 QUELLES SURFACES "MEMBRANAIRES" UTILISER? Sensor chip HPA Sensor chip CM5 Sensor chip L1

14 A DEFAUT DE MEMBRANES, TRAVAILLER EN DETERGENTS 1- Cas des récepteurs à tyrosine kinase 2- cas de peptides, membranaires ou non

15 Etude de l état de phosphorylation du récepteur de l Insuline RU 1-Étalonnage mg/ml mg/ml Réponse mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml S 2 COURBE D'ETALONNAGE Pente 1,5 1 0,5 y = 1758,2x 0 0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 Concentration (mg/ml)

16 2- Activation des récepteurs de l insuline 50 R?ponse (RU) Ins + TX Ins + AP Sans ins + AP Sans ins + TX Temps (s) Pente [pir] (ng/ml) Activation Ss ins+ap 0, ,2 Ss ins+tx 0, ,8 ins+ap 0, ,8 2,4 ins+tx 0, ,2 4,6

17 PHOSPHORYLATION SUR TYROSINE DES PROTEINES CELLULAIRES INDUITES PAR L EGF RU 40 Réponse EGF + Genistein Sans EGF + Genistein Temps s

18 ANALYSE DES INTERACTIONS PEPTIDES/PEPTIDES 2- pour un système hydrophobe TM TM intein TM intein TM SDS, 100 C intein TM Une Une protéine protéine de de fusion fusion composée composée d un d un peptide peptide transmembranaire transmembranaire et et d intein d intein est est synthétisée synthétisée dans dans des des bactéries bactéries et et purifiée purifiée par par une une colonne colonne d affinité d affinité de de chitin, chitin, puis puis détache détache par par un un traitement traitement SDS. SDS. La La proteine proteine Intein-TM Intein-TM est est alors alors fixée fixée sur sur la la surfece surfece CM5 CM5 du du Biacore. Biacore.

19 RU 1200 Intein-TM (TX100) SDS intein intein TM TM Response Time s Lors Lors de de l addition de de l intein-tm, il il y a possibilité de de formation de de diméres via via les les peptides transmembranaires. L addition de de SDS SDS a tendance a déstabiliser ces ces dimères

20 Flow-Mediated On-Surface Reconstitution of G-Protein Coupled Receptors for Applications in Surface Plasmon Resonance Biosensors (2002) Olof P. Karlsson and Stefan Löfås, Anal Biochem 300,

21 Flow-Mediated On- Surface Reconstitution of G- Protein Coupled Receptors for Applications in Surface Plasmon Resonance Biosensors (2002) Olof P. Karlsson and Stefan Löfås, Anal Biochem 300,

22 Flow-Mediated On- Surface Reconstitution of G-Protein Coupled Receptors for Applications in Surface Plasmon Resonance Biosensors (2002) Olof P. Karlsson and Stefan Löfås, Anal Biochem 300,

23 Flow-Mediated On-Surface Reconstitution of G- Protein Coupled Receptors for Applications in Surface Plasmon Resonance Biosensors (2002) Olof P. Karlsson and Stefan Löfås, Anal Biochem 300,

24 Flow-Mediated On-Surface Reconstitution of G- Protein Coupled Receptors for Applications in Surface Plasmon Resonance Biosensors (2002) Olof P. Karlsson and Stefan Löfås, Anal Biochem 300,

25 Exploring Peptide Membrane Interaction Using Surface Plasmon Resonance: Differentiation between Pore Formation versus Membrane Disruption by Lytic Peptides Niv Papo and Yechiel Shai Biochemistry 2003, 42,

26 Exploring Peptide Membrane Interaction Using Surface Plasmon Resonance: Differentiation between Pore Formation versus Membrane Disruption by Lytic Peptides Niv Papo and Yechiel Shai Biochemistry 2003, 42, Magainin, lyse sans formation de pores Mellitin, lyse avec formation de pores

27 Exploring Peptide Membrane Interaction Using Surface Plasmon Resonance: Differentiation between Pore Formation versus Membrane Disruption by Lytic Peptides Niv Papo and Yechiel Shai Biochemistry 2003, 42,

28 Exploring Peptide Membrane Interaction Using Surface Plasmon Resonance: Differentiation between Pore Formation versus Membrane Disruption by Lytic Peptides Niv Papo and Yechiel Shai Biochemistry 2003, 42,

29 Exploring Peptide Membrane Interaction Using Surface Plasmon Resonance: Differentiation between Pore Formation versus Membrane Disruption by Lytic Peptides Niv Papo and Yechiel Shai Biochemistry 2003, 42, Table 2: Equilibrium Affinity Constants of the Peptides with PC/Cholesterol and PE/PG Monolayers (HPA Chip) and Bilayers (L1 Chip) Derived According to a Steady-State Affinity Model magainin melittin PC/Cholesterol (10:1 w/w) PE/PG (7:3 w/w) K A (? 10 4 M -1 ) K A (? 10 4 M -1 ) monolayer bilayer K A bil/ K A monol monolayer bilayer K A bil / K A monol 0.11 (±0.01) 1.88 (±0.09) 0.09 (±0.01) (±0.12) 47 (±3) (±0.02) 10.9 (±0.8) 15.9 (±0.9)

30 QUE PEUVENT APPORTER LES TECHNIQUES DE BIACORE DANS LA COMPREHENSION DES INTERACTIONS ENTRE PROTEINES/PEPTIDES MEMBRANAIRES? Beaucoup, sans doute au niveau des interactions protéines non membranaires/membranaires, dans un contexte membranaire Peu pour les interactions intramembranaires, sauf à utiliser des détergents