Four checkpoints. Components of the DNA Damage Checkpoint. Mécanismes de surveillance du cycle cellulaire EFFECTORS SIGNALS

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1 Mécanismes de surveillance du cycle cellulaire Four checkpoints Components of the DNA Damage Checkpoint SIGNALS SENSORS MEDIATORS TRANSDUCERS EFFECTORS TARGETS

2 (UV, HU, replication errors) ATR DNA damage (Ionizing radiations, ds DNA breaks) ATM Chk1 Chk2 CDK2 Cyclin E/A CDC25A S G2 DNA damage checkpoints CDC25C M CDK1 Cyclin B Des molécules nouvelles interviennent ATM et ATR: serine/threonine kinases ATM= Ataxia Telangiectasia Mutated - Patients AT: immuno-déficience, degénérescence progressive du système nerveux, stérilité, susceptibilité au cancer élevée. - Cellules AT hypersensibles aux radiations ionisantes (coupures d ADN double-brin) mais pas aux UV ou aux agents qui bloquent la réplication ATR= Ataxia Telangiectasia Related - Patients atteints du Seckel syndrome: retard de croissance intra-utérin, retard mental, microencéphalie - Cellules sensibles aux UV et aux agents qui bloquent la réplication Chk1 et Chk2 : serine/threonine kinases (check-point kinase)

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4 Activation d ATM Lorsqu une cassure DS survient dans l ADN, le complexe MRN (Mre11/Rad50/Nbs1) est recruté au site d ADN endommagé et recrute à son tour la protéine ATM. Celle-ci, présente normalement dans la cellule sous forme de dimère inactif, s auto phosphoryle au niveau de la sérine 1981, entraînant une dédimérisation et son activation. Elle phosphoryle ensuite H2AX, une variante de la famille des histones, qui recrute au site d ADN endommagé plusieurs protéines qui sont phosphorylées par ATM, dont 53BP1, BRAC1, et Chk2. Chk2 est principalement activée par ATM, alors que Chk1 est principalement activée par ATR. Il semble donc exister deux voies parallèles dans les cellules de mammifères: la voie ATR-Chk1 et la voie ATM-Chk2. La voie ATR-Chk1 répond principalement aux blocages des fourches de réplication et aux lésions produites par les rayons ultraviolets alors que la voie ATM-Chk2 répond aux cassures double-brin de l ADN

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7 Components of the DNA damage checkpoints in human cells. The damage is detected by sensors that, with the aid of mediators, transduce the signal to transducers. The transducers, in turn, activate or inactivate other proteins (effectors) that directly participate in inhibiting the G1/S transition, S-phase progression, or the G2/M transition.

8 La Famille des Protéine Impliquées dans Les Réparations de l ADN Irradiation Levures Découverte des Gènes Impliqués dans la Réparation de l ADN L Ensemble de ces Protéines sont Conservées chez l Homme

9 Si l'adn est lésé, l'activation de deux voies inhibitrices des complexes Cycline/Cdk de la phase S permet d'arrêter le déroulement de la phase S Si l'adn est lésé, ou si la réplication n'est pas achevée, l'activation de plusieurs voies inhibitrices du complexe Cdk1/CyclineB permet d'empêcher l'entrée en mitose.

10 The G1/S checkpoint. DNA damage is sensed by ATM after double-strand breaks or by ATR, Rad17-RFC, and the complex after UV-damage. ATM/ATR phosphorylates Rad17, Rad9,, and Chk1/Chk2 that in turn phosphorylates Cdc25A, causing its inactivation by nuclear exclusion and ubiquitin-mediated degradation. Phosphorylated and inactivated Cdk2 accumulates and cannot phosphorylate Cdc45 to initiate replication. Maintenance of the G1/S arrest is achieved by, which is phosphorylated on Ser15 by ATM/ATR and on Ser20 by Chk1/Chk2. Phosphorylated induces p21waf-1/cip1 transcription, and p21waf-1/cip1 binds to the Cdk4/CycD complex, thus preventing it from phosphorylating Rb, which is necessary for the release of the E2F transcription factor and subsequent transcription of S-phase genes. p21waf-1/cip1 also binds to and inactivates the Cdk2/CycE complex, thus securing the maintenance of the G1/S checkpoint.

11 Roles of ATM and ATR in G 2 checkpoint activation. The left branch of this pathway is activated when cells incur DNA damage before completion of S phase, and is governed primarily by ATR. The right branch of the pathway is activated by DNA damage during the G 2 phase itself, and depends largely on the activation of ATM. Both branches converge on the Cdc25C phosphatase, and prevent activation of the mitotic cyclin B/cdc2 complex by inducing the cytoplasmic sequestration and/or catalytic inhibition of Cdc25C. ATM et ATR agissent également par la voie -dépendante. Le gène est situé sur le chromosome 17p13.1 La protéine est une phosphoprotéine de 393 acides aminés de poids moléculaire 53 kda. P53 a été surnommée " le gardien du génome". Elle est exprimée tout au long du cycle cellulaire, mais son taux d'expression reste bas du fait de sa dégradation rapide. C'est une protéine nucléaire qui possède plusieurs fonctions. C'est un facteur de transcription, mais c'est aussi une exonucléase qui participe directement à la réparation de l'adn.

12 est un gène suppresseur de tumeur impliqué dans le couplage du cycle cellulaire, de la réparation de l'adn et de l'apoptose. C'est le gène suppresseur de tumeur le plus souvent inactivé dans les cancers humains. Les cassures de l ADN se traduisent par une augmentation rapide des taux de dans la Cellule Schéma de la structure biochimique de la protéine. Pour être active, elle doit agir sous forme de tétramère. Régulation de La protéine est instable, sa durée de vie est très courte, < 20mn Dans des conditions normales, est pratiquement indétectable Protéases Cytoplasme Noyau + dégradée Gène

13 MDM2 Activation Liaison ADN CTerminal MDM2 Ubiquitine Protéasome dégradée La Protéine MDM2 se fixe sur la partie NH2 terminale de et Induit la Dégradation de Régulation de par le Contrôle Chk-ATM Activation Liaison ADN CTerminal Cassure de l ADN ATM Ser 15 MDM2 Activation CBP Liaison ADN CTerminal Chk Ser 15 Ser 20 MDM2 Activation CBP Liaison ADN CTerminal 06 Activation de Blocage du Cycle Cellulaire Réparation La Phosphorylation sur Sérine 15 par ATM permet le Recrutement de CBP mais ne chasse pas MDM2. La Phosphorylation sur Sérine 20 par Chk2 bloque l interaction /MDM2 et stabilise

14 CDK2 Cyclin E S G2 M CDK1 Cyclin B G1 MDM2 p14 ARF p14 ARF p21 CIP1 apoptosis MDM2 P p63 Chk2 p73 MDM2 P ATM DNA damage, hypoxia, heat shock, etc.

15 Locus INK4a/ARF (région 9p21) 1β 1α 2 3 P16/INK4a 13 Kb P14/ARF Région chromosomale 9p21 ATG p16 * ATG ARF * Exon 1β Exon 1α Exon 2 Exon 3 The human INK4a/ARF locus encodes two distinct tumour-suppressor proteins p16 INK4a and p14 ARF (p19 ARF in the mouse) in part, through the utilization of alternative reading frames. p16 INK4a and p14 ARF function by promoting the activities of the retinoblastoma protein (RB) and transcription factor, respectively. and Ink4a are the two most frequently mutated genes in human tumors Locus Chromosome location type of alterations estimated frequency of alterations 17p13 nucleotide substitution ~ 50% INK4a 9p21 homozygous deletion nucleotide substitution small deletion/insertion promoter methylation ~ 40%

16 Les protéines codées par le locus ink4a/arf régulent les anti-oncogènes prb et ADN ink4a ARF Transcription alternative Mdm2 - ARF Mdm2 Ubiquitine ligase inhibée p16 ink4a P i - - Activation de prb Cdk6 Cdk4 P i Arrêt en G1 Inhibition de l inactivation de prb Arrêt en G2 Suppression des checkpoints et instabilité génétique L'inactivation de entraîne une augmentation du taux de mutations, de recombinaisons, et d'amplifications géniques dans les cellules tumorales et explique donc en partie l'accumulation des lésions génétiques et des aberrations chromosomiques caractéristiques de l'instabilité génétique de ces tumeurs. Les individus porteurs de façon congénitale d'une mutation germinale inactivatrice mono-allélique de présentent un syndrome de prédisposition familiale au cancer très grave, le syndrome de Li et Fraumeni caractérisé par une propension accrue aux tumeurs cérébrales, aux sarcomes des tissus mous, aux cancers du sein, de la surrénale et aux leucémies.

17 Mutations in Human Tumors are Found with High Frequency In the DNA Binding Domain In 143 families reported: point mutations (85%) deletions (9%) splice mutations (3.5%) insertions (2%) La plupart (>90 %) des mutations de rencontrées dans les cancers sont des mutations faux-sens responsables de la substitution d'un seul acide aminé dans la protéine produite. L'inactivation de est souvent corrélée avec l'agressivité tumorale et un mauvais pronostic.