en Addictologie TD - décembre 2010 UE d d Addictologie
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- Oscar Carbonneau
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1 Laboratoire d Analyses d Toxicologiques en Addictologie TD - décembre 2010 UE d d Addictologie Hélène Eysseric pharmacien biologiste MCU-PH Médecine Légale UFR de Médecine UF Pharmacologie -Toxicologie CHU de Grenoble
2 Déroulement du TD 1. Questionnaire 2. Cours avec Cas pratiques Complété par cours de toxicologie 4eme année Pcie : - analyses toxicologiques hospitalières (M Bartoli) - toxicologie médicolm dicolégale (alcoolémies, sécurits curité routière, re, soumission chimique) 3. Discussion - Synthèse
3 Questionnaire 1. Quelles peuvent être les missions d un laboratoire de toxicologie analytique dans le domaine de l addictologie? 2. Quels types de prélèvements peuvent être analysés? 3. Quand doivent-ils être prélevés? 3. Quels équipements analytiques y trouve-t-on? 4. Combien de temps dure une analyse? 5. Combien coute une analyse?
4 Ex de Cas Cliniques Cas n 1 n 1 : H, préparateur parateur en pharmacie convulsions après s prise de tramadol hypersensibilité,, banale intox aiguë? Cas n 2 n 2 : plusieurs cas de décès d s médicom dico-légaux : méthadone m +. imputabilité variable selon sujets (naïfs, usagers chroniques, en sevrage) => étude des cheveux? Cas n 3 n 3 : 2 lycéens internes, notion toxicomanie Urgences : hallucinations visuelles, mydriase, agitation cannabis ou autre substance?
5 Quelles explications, quelles solutions? Cas n 4 n 4 : Enfant 3 ans, Somnolence, dépistage urinaire positif en cannabis et opiacés s! origine? Cas n 5 n 5 : Enfant 32 mois, Somnolence, [oxazépam] Plasma = 45 mg/l!! (20 à 50 x conc.th mais bonne tolérance => exposition chronique? conc.thérap.)
6 Objectif de la Toxicologie Analytique Mise en œuvre de moyens techniques pour isoler, identifier et doser un xénobiotique à partir d une d matrice (le plus souvent biologique ) ce n est n pas que la nature d un produit qui détermine d sa toxicité mais aussi sa concentration! Dans le domaine de l addictologiel addictologie, le xénobiotique est en général g un produit toxicomanogène ne
7 Intérêts de la Toxicologie Analytique en addictologie Selon le contexte, Selon l histoire l du patient, 4 types d aide d potentielle 1. évaluation du degré de dépendanced 2. suivi traitements de substitution 3. suivi sevrage 4. scientifique
8 1. Aide à l évaluation du degré de dépendance Confirmation biologique d une conduite addictive (abus) Toxicologie clinique Toxicologie médico-légale Toxicologie épidémiologique Toxicologie professionnelle
9 Toxicologie Clinique Hospitalisation lors d une d intoxication aiguë, Prise en charge médicale, m Cas n 1 n 1 : H, 29 ans, préparateur parateur pharmacie 1cp Contramal LP200 puis 6 cps Topalgic à 50 en 6h pour lombalgies Convulsions ; Rivotril 1mg OK Analyses Toxicologiques pour confirmer niveau d expositiond
10 Analyse de tramadol? Tramadol Opioide Morphine Opiacé Pas de méthode m IC de détection d rapide! chromatographie héroïne codéine codéthyline pholcodine
11 Tramadol et Abus (Dossier CAP Angers, 04/2006) Analyse toxicologique type screening chromatographique : (LC/DAD) [tramadol] Plasma : 3,5 mg/l mau DAD1 A, Sig=230,4 Ref=550,100 (AVR06\ D) T EI 6 toxique > 1 mg/l potentiellement létale > 2 mg/l min *DAD1, (122 mau,apx) Ref=5.837 of D *TRAMADOL Norm mois avant : crise convulsive origine? Aveu ultérieur d abus => Prise en charge pour sevrage nm
12 Toxicologie Professionnelle Analyse des causes d un accident du travail (sang) Suivi médical m d un d salarié (urines, cheveux) - évaluation aptitude à un poste à risques, - cas des patients toxicomanes
13 Analyses Toxicologiques Médico-Légales : matrices/adme
14 Analyses Toxicologiques Matrices selon Cinétique Sang : quelques heures (24 à max. 48) Urines : quelques jours (3 à max. 6) Cheveux : des semaines, des mois
15 Analyses Toxicologiques Médico-Légales : intérêt du sang Seul milieu biologique pour lequel sont définis : - des concentrations thérapeutiques - des concentrations toxiques - des concentrations létales ex de l oxazépam dans le sang chez sujet naïf en µg/l: mortel toxique thérapeutique
16 Prélèvements biologiques en tox : avantages/ inconvénients nients Matrice Avantages Inconvénients Sang Urines Cheveux Interprétation (SR, RCM) quantification +++ /expo aiguë Analyse facile (dépistage rapide possible) Fenêtre détection de 3 jours Non putréfiable Conservation Info sur exposition chronique Analyse difficile Conservation Fenêtre détection de 24 heures Information essentiellement qualitative Analyse difficile
17 Prélèvements biologiques en tox : avantages/ inconvénients nients
18 Analyses Toxicologiques Médico-Légales : Cheveux
19 Généralités s sur les Cheveux Passé Pointe Présent Scalp Racine Pousse d environ d 1 cm/mois ( cm) «Mémoire» de l exposition l à des toxiques
20 Analyses Toxicologiques Intérêt des Cheveux Consommateur régulier Consommateur en sevrage Toxicorama 1996, Pépin P et coll.
21 Analyses Toxicologiques Médico-Légales : Cheveux Mise en évidence d une consommation chronique soumission chimique Personnes vulnérables... conduite addictive restitution de permis/ injonction thérapeutique dopage cadavre putréfi fié : profil de consommation
22 Dopage? Gasquet disculpé par ses cheveux Des analyses démontrent que le tennisman, sanctionné pour un contrôle positif à la cocaïne, n'est pas un consommateur régulier. Un pas vers la fin du feuilleton?
23 Toxicologie Médico-Légale Recherches des Causes de la Mort enquète annuelle Afssaps DRAMES (Décès s en Relation avec Abus Médicaments M ou Substances) Conduite automobile après s usage de substances psycho-actives (Loi SR 2003) cf cours tox 4 ème A Infraction à la législation des stupéfiants (contrôle judiciaire, analyse de saisies, )
24 DRAMES décès d STUP Illicites : 137 cas Opiacés licites hors TSO : 34 cas Ttt.Subst.Opiacés : 89 cas
25 DRAMES décès d s avec stupéfiants illicites 91 cas : produit unique dont 75 héroïne 15 cocaïne 1 GHB/GBL 346 cas : associations dont 28 héroïne + autres 17 cocaïne + autres 1 kétamine + autres Sur l ensemble des 137 cas : 20.4 % association avec Med. PsychoActifs 38.7 % avec Ethanol > 0.5 g/l
26 DRAMES décès d s avec opiacés s licites Produit unique : 29 cas morphine : 18 pholcodine : 4 tramadol : 3 codéine : 2 dextropropoxyphène : 2 Sur l ensemble des 34 cas : 17 cas association avec Med. PsychoActifs 16 cas avec Ethanol > 0.5 g/l
27 DRAMES 2009 Opiacés 89 décès d s avec Med. Substitution Opiac 48 cas : méthadone dont 28 en association avec Med. PsychoActifs 30 cas : Buprénorphine Haut Dosage dont certains en association avec Med. PsychoActifs 11 cas : MSO + autres substances (entre elles, codéine, héroïne, morphine, amphétamine, GHB/GBL, morphine, tramadol) Sur l ensemble des 89 cas : 53.9 % association avec Med. PsychoActifs 37.1 % avec Ethanol > 0.5 g/l
28 Cas n 2 n et RCM Observation de décès d s avec une faible concentration sanguine de méthadone m interprétation tation? Intérêt de l analyse des cheveux (information sur l exposition chronique) pour l él évaluation de l él état de tolérance pharmaco-dynamique? Sachant qu une une concentration sanguine est toxique dès s 200 µg/l chez sujet naïf dès s 750 µg/l chez usager chronique
29 diagnostic de décès d s toxique impliquant la méthadone Pour 3 parmi 6 cas de décès d s médicom dico-légaux, l analyse des cheveux a apporté une aide à l interprétation tation : Méthadone capillaire Segment récent/passr cent/passé +/+ Consommateur chronique -/- +/- Consommateur récent Sujet naïf [méthadone] sang en µg/l interprétation tation thérapeutique toxique toxique Communications journées pharmacodépendances pendances Biarritz 2005, congrès s annuel SFTA 2006
30 Toxicologie Epidémiologique Mise en évidence de nouveaux usages chez les jeunes adultes, chez les sportifs, Casn 3 3 : 2 lycéens internes Notion toxicomanie Urgences : hallucinations visuelles, mydriase, agitation cannabis ou autre substance?
31 Intoxication au Datura stramonium (thèse M.Tollet Angers 2006) Alcaloïdes tropaniques responsables de la toxicité : atropine, scopolamine Interrogatoire (souvent limité du fait des hallucinations) Examen clinique ++ Syndrome anticholinergique Recherche urinaire d atropine et de scopolamine (GC/MS) Voire dans les cheveux (LC/MS/MS) (Kintz et al. JAT 2006) de 2000 à 2004 : 69 Intoxications (CAP Angers) Augmentation progressive des appels (5 en 2000, 23 en 2004)
32 Intérêts de la Toxicologie Analytique Selon le contexte, Selon l histoire l du patient, 4 types d aide d potentielle 1. évaluation du degré de dépendanced 2. suivi traitements de substitution 3. suivi sevrage 4. scientifique
33 2. Aide au suivi des traitements de substitution Contrôle biologique d observance ex : législation l méthadonem Surveillance de rechutes Mise en évidence d émergence d autres d toxicomanies ex : cocaïne en hausse chez les patients substitués à la méthadone m?
34 3. Aide au suivi des sevrages Stupéfiants Médicaments Tabac Alcool
35 Ex de suivi urinaire : sevrage à la buprénorphine Patient 1 : en sevrage Patient 2 : en rechute U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 U9 U10 U U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 U9 U10 U11 Bup (ng/ml) Nor Bup (ng/ml) Bup (ng/ml) Nor Bup (ng/ml)
36 Marqueurs biologiques du tabac CO air expiré < 8ppm abstinence Cotinine et Hydroxycotinine urine (tests IC, LC/UV) < 50 µg/l abstinence Tabagisme passif < 150 µg/l Nicotine, Cotinine et Hydroxycotinine plasma, salive (LC/MS/MS) Distinction : fumeur léger/important l (ratio OH-COT/COT) Suivi cinétique des patients sous patch
37 Marqueurs biologiques de l alcooll Indirects enzymes (γgt,, ASAT, ALAT), VGM transferrine déficiente d en hydrates de carbone (CDT) transferrine désialylée (SDT) Directs esters éthyliques d acides d gras (FAEE) : cheveux (GC/MS) éthyl glucuronide (sang), urine, cheveux (LC/MS/MS) marqueur alcoolisation récente r (U,(, 3j), chronique (C)( distinction consommateurs occasionnels, réguliers, r importants corrélation avec quantité consommée e : > 30g/j > 4pg/mg de cheveux
38 4. Intérêts Scientifiques : toxicocinétique tique Ex d éd élimination urinaire de méthadone m et EDDP chez le nouveau-né de mère m traitée J1 J3 J5 J7 J9 J11 J13 J15 J17 J19 Méthadone (ng / mg de créatinine) EDDP (ng / mg de créatinine)
39 Exigences de la Toxicologie Analytique Mise en œuvre de moyens techniques pour l isolement, l identification l et le dosage d un d xénobiotique à partir d une d matrice (le plus souvent biologique ) ce n est n pas que la nature d un d produit qui détermine d sa toxicité mais bien aussi sa concentration! qualité des prélèvements + qualité des techniques et contrôles qualité
40 Qualité du Prélèvement - le choix du bon milieu biologique => Contexte + Délai entre exposition et prélèvement (Cinétique d éd élimination) - une bonne conservation => Moyens Techniques (chambre froide, congélateurs)
41 Analyses Toxicologiques Prélèvements selon Contexte Sécurité routière Infraction législation des stupéfiants Hospitalisation : anamnèse toxique? dépistage : urine, (salive) dosage : sang, air expiré restitution permis : cheveux usage : urine, (sueur) injonction thérapeutique : urine, cheveux sang, urine Soumission chimique Selon le délai : sang, urine ou cheveux
42 Analyses Toxicologiques Matrices selon Cinétique Sang, salive : quelques heures Urines : quelques jours Cheveux : des semaines, des mois
43 Quelles Techniques Analytiques? 1ère étape qualitative recherche large (screening) 2ème étape quantitative Pas une mais un ensemble de méthodes avec avantages /inconvénients nients : rapidité sensibilité,, spécificit cificité coût reproductibilité,, précision Méthodes immunochimiques Méthodes chromatographiques
44 Analyses de toxicologie clinique démarche analytique
45 Méthodes Immunochimiques Qualitatives Objectif : identifier une Classe de médicaments m ou stupéfiants, donc plusieurs molécules d une d même famille - Choix d un d Anticorps pour une Famille Chimique - Résultat Qualitatif : Positif ou Négatif N voire Semi-quantitatif - Interprétation tation parfois délicate d : Seuil de Positivité # Seuil de DétectionD Affinité variable des différentes molécules de cette famille vis à vis de l Anticorps l : Faux NégatifsN Réactions Croisées (parenté structurale) : Faux Positifs
46 Avantages : Analyses de toxicologie : immuno-analyse Rapide Automatisable (ex : stupéfiants dans les urines) Coût Inconvénients nients : Non spécifique Pas toujours suffisamment sensible Pas toujours adapté au sang (ex : stupéfiants)
47 Tests rapides IC et Cannabis Enfant 3 ans, somnolent : médicaments m mère m? Syndrome atropinique,, extrapyramidal, Infection bronchique IC solide : opiacés, cannabis : + évolution favorable sortie J3 CPG/SM cannabis : négatif opiacés : pholcodine CLHP/DAD chlorphéniramine, ac. niflumique Après enquête : Nifluril suppo Autre prise : Hexapneumine? Ac. niflumique 50 mg/l IC solide : positif
48 Exemple du Kit Opiacés Anticorps anti morphine pas de FP ; FN (si < seuil) Opiacés détectés : morphine, codéine, codéthyline, dihydrocodéine, pholcodine Opiacés non détecté : buprénorphine Opioïdes non détectés : méthadone, dextropropoxyphène, fentanyl, tramadol
49 Méthodes Immunochimiques Spécificit cificité des Tests selon famille chimique Benzo. Opiacés Cocaïne pas de Faux-Positifs (FP) mais Faux-Négatifs (FN) (bromazépam, BDZ faiblement dosées) pas de FP ; FN (si < seuil) buprénorphine non dosée opioïdes non dosés (méthadone, DPX, fentanyl, tramadol) pas de FP ; FN (si < seuil) Cannabis pas de FP (sauf ac. niflumique en tests solides) ; FN (si < seuil) Amphét. FP (anorexigènes ; benfluorex, heptaminol, ofloxacine) FN (dérivés ecstasy ; amphét. exotiques)
50 Méthodes Chromatographiques Approche Qualitative et Quantitative Objectif : identifier formellement et quantifier une ou plusieurs substances médicamenteuses, m stupéfiantes, Séparation par chromatographie en phase gazeuse (CPG( CPG) ) ou chromatographie en phase liquide haute performance (CLHP( CLHP) Détection Par spectrométrie trie de masse (MS( MS), par barrette de diodes (DAD( DAD); ); Spécificit cificité optimale recherchée
51 Méthodes Chromatographiques Approche Qualitative et Quantitative Recherche en aveugle : screening (LC/DAD, GC/MS, LC/MS, LC/MS/MS) Recherche/dosage ciblé : (LC/DAD, GC/MS mode SIM, GC/MS/MS, LC/MS/MS)
52 Chromatographie couplée à la détection d par spectrométrie trie de masse Chromatographie : analyse des constituants d 1 mélange par adsorption sélective (ou partage) entre une phase stationnaire et une phase mobile (liquide ou gazeuse) Spectrométrie de masse : technique d identification d une substance selon sa masse et sa charge électrique => Spécificité+++
53 Avantages : Spécificit cificité +++ Sensibilité +++ Inconvénients nients : Analyses de toxicologie : chromatographie Préparation des échantillons longue Investissement en matériel Personnel hautement qualifié coût
54 Séparation Chromatographique (GC ou LC) CPG CLHP Elution = f (Température) Elution = f (Solvants) Inj Gaz (N2, He) Tr 0 Tr 1 Four C Ech. Injecteur C O L O N N E Ech. Injecteur C O L O N N E Four C Inj Pompe Tr 0 Tr 1 S o l v a n t s Signal Détecteur Détecteur Signal
55 couplée à une Détection Barrette de Diodes (LC/DAD) ex du sang d un d patient : 10 pics Mélange 8 BDZ + 2 métabolites mau DAD1 A, Sig=230,10 Ref=550,100 (0212A03A.D) Norm *DAD1, (150 mau,dn1) Ref=5.501 of 0212 *BROMAZEPAM Norm *DAD1, (13.1 mau,up2) Ref=5.501 of 021 *NITRAZEPAM 10 Norm *DAD1, (39.9 mau,up2) Ref=5.501 of *LORAZEPAM Norm *DAD1, (9.5 mau,dn1) Ref=5.501 of 0212A *ALPRAZOLAM 4 30 Norm *DAD1, (4.3 mau,apx) Ref= of *FLUNITRAZEPAM Norm nm 20 *DAD1, (108 mau,apx) Ref= of *NDM DIAZEPAM Norm nm *DAD1, (387 mau,apx) Ref= of *CLOBAZAM Norm nm *DAD1, (11.1 mau,apx) Ref= of *LORMETAZEPAM Norm nm nm nm nm nm 0 Area: *DAD1, (23.6 mau,up2) Ref=5.501 of 021 *NDM CLOBAZAM nm min
56 GC couplée à une détection d par Spectrométrie trie de Masse (GC/MS) ex d une d urine hydrolysée - Datura Abundance TIC: D 9.44 N CH A N CH CH 2 OH O CH C O Atropine A met A-H 2 O 8.73 S-H 2 O S O CH 2 OH O CH C O Scopolamine Abundance Abundance m/z--> Abundance Time--> Scan 621 (9.436 min): D (-) m/z--> Abundance 42 Scan 678 ( min): D (-) m/z--> #167: ATROPINE m/z--> #170: SCOPOLAMINE
57 LC couplée à une détection d par Spectrométrie trie de Masse (LC/MS (n) Mode Simple MS Identification : General Unknow Screening (GUS) bibliothèque (Humbert et al.) Quantification : Selective Ion Monitoring (SIM) (n) ) Mode Tandem MS/MS Identification : Enhanced Product Ion scan (EPI) bibliothèque (Sauvage et al. Clin. Chem. 2006) Quantification : Multiple Reaction Monitoring (MRM)
58 Spectrométrie de MASSE Multiple Reaction Monitoring (MRM) : transition Sélectivité détection - quantification Sélection ion parent Fragmentation Sélection ion fils M 1 H+ M 2 H+ I 1 + M 3 H+ M 4 H+ M 5 H+ M 6 H+ M 3 H+ I 2 + I 2 + I 3 + Q1 fixe Q2 Q3 fixe
59 Cas n 4, enfant intox oxazépam : 45 mg/l bonne tolérance => exposition chronique? Analyse capillaire de 5 segments (LC/MS/MS) bl cheveux uplc souchi % % % % % % 0 Quattro Premier VAA Mar :56:34 1: MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e Zolpidem Time Blanc S5 4cm S4 2cm S3 2cm S2 1cm S1 1,5cm racine bl cheveux uplc souchi % % % % % % 0 Oxazépam Quattro Premier VAA Mar :56:34 2: MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e Time
60 Notion de seuil de détectiond Pour chaque couple substance/méthode thode Ex du bromazépam (Lexomil, anxiolytique) technique Immunochimie CLHP/DAD 1 seuil de détectiond seuil moyen en µg/l 300 (toxique) 30 (thérapeutique) CLHP/SM 3 (infra. Théra ra.) CLHP/SM/SM 0.3 spécificit cificité
61 Difficultés du Biologiste Toxicologue 1 Se procurer les produits de référencer rence et les métabolitesm Les industriels doivent nous aider! Collaboration avec des chimistes Recueillir le maximum de données cliniques initiales pour le meilleur prélèvement et la meilleure stratégie analytique Collaboration clinico-biologique essentielle
62 Difficultés du Biologiste Toxicologue 2 Connaître les limites des méthodologiesm utilisées Favoriser le travail en réseau r de laboratoires S évaluer grâce à des contrôles de qualité externes et progresser Evoluer vers des Technologies de plus en plus sophistiquées
63 Difficultés du Biologiste Toxicologue 3 Interpréter la concentration en tenant compte des données - toxicocinétiques tiques - et toxicodynamiques de la substance identifiée et par exemple Comment distinguer la limite entre un usage thérapeutique justifié et un usage «abusif» d un médicament m psychotrope?
64 Discussion- Conclusion Essentiel à retenir? Le bon prélèvement, au bon moment, bien conservé Connaissance des limites de chaque type d analysed spécificit cificité,, sensibilité,, rapidité,, coût, Collaboration clinico-biologique
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