Apport d un nouvel inhibiteur, la fuscine, dans l ktude des chaines respiratoires de mitochondries animales et de mitochondries de levures

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1 Eur. J. Biochem. 13 (1970) Apport d un nouvel inhibiteur, la fuscine, dans l ktude des chaines respiratoires de mitochondries animales et de mitochondries de levures Jacques D LE, Paulette M. VIGNAIS et Pierre V. VIGNAIS Laboratoire de Biochimie, Centre d Etudes Nuclbaires et Faculti! de MJZkdecine, Grenoble (Repu le 15 dkembre 1969) Fuscin, a quinoid compound elaborated by Oidiodendron fuscum, is a powerful inhibitor of mitochondrial respiration in animal and yeast mitochondria. It is not an uncoupler. In rat liver mitochondria fuscin inhibits the oxidation of glutamate, but is without effect on the oxidation of succinate. Bound fuscin cannot be removed by washing mitochondria. Inhibition of glutamate oxidation is of the same order of magnitude in state 3 and in state 4 and the efficiency of oxidative phosphorylation remains unaltered. Halfinhibition is obtained with 14 nmoles of fuscin per mg of mitochondrial protein. The inhibition of electron transfer by fuscin is not released by 2,4dinitrophenol. Menadione does not induce a bypass of electron transfer around the site inhibited by fuscin, as is the case for rotenone inhibition. In rat liver mitochondria, fuscin prevents the reduction of cytochrome b by glutamate and the succinatelinked reduction of mitochondrial NAD. In beef heart mitochondria, fuscin inhibits to the same extent the NADHoxidase and the NADHmenadione reductase. The extent of reduction of the nonheme iron protein associated with NADHdehydrogenase (electron paramagnetic resonance spectra) is not altered by the addition of fuscin. These data suggest that the site of action of fuscin in the NAD respiratory chain of animal mitochondria is located between the nonheme iron component of the NADHdehydrogenase and cytochrome b. In mitochondria of Candida utilis, and by contrast to animal mitochondria, fuscin inhibits both succinate and pyruvate oxidations; it partially prevents the reduction of cytochrome b by succinate and the reoxidation of ubiquinone reduced by pyruvate. The amount of fuscin required for half inhibition of respiration is four times smaller in the case of succinate oxidation, (14 nmoles/ mg of protein) than in the case of pyruvate oxidation (4656 nmoles/mg of protein). No uncoupling effect is observed. Contrary to rotenone which is some 500 times less active on Candida utilis mitochondria than on animal mitochondria, fuscin exerts its inhibitory effect on animal and on yeast mitochondria in the same range of concentrations. Respiration of mitochondria of Saccharomyces cerevisiae which are rotenoneinsensitive and mitochondria of Candida utilis which are rotenonesensitive is inhibited by fuscin to the same extent whether succinate or pyruvate is used as substrate. Moreover, mitochondria obtained from ironlimited Candida utilis, which have lost their sensitivity to rotenone, are still sensitive to fuscin. These data clearly point to different sites of action of fuscin and rotenone in the respiratory chain of yeast mitochondria. Fuscin inhibits the reduct)ion by succinate of the nonheme iron protein associated with succinate dehydrogenase in Candida utilis mitochondria, but it does not alter the reduction of the nonheme iron protein of NADH dehydrogenase. Electron paramagnetic resonance studies point to a site of action of fuscin, in yeast mitochondria, on the succinate side of the nonheme iron protein linked to succinate dehydrogenase. This site of action could also account for NADH oxidase inhibition if, in yeast mitochondria the two nonheme iron proteins linked to the flavoproteins FPS and F ~D are closely connected. The different patterns of inhibitory effects of fuscin in animal mitochondrial and in yeast mitochondria are discussed in terms of organization of the respiratory chain according to the source of mitochondria. Abr&&ions usuelles. TMPD, p~,~,, tbtra ou ~glucose6phosphate :NADP oxydorbductase (EC 1.1. m&hylph&yl&ne &mine; &, ubiquinone; 2,4~~p, 1.49) ; glutamate di!shydroghase, ou Lglutamate : NAD(P) 2,4dinitrophi!nol. oxydorbductase (EC ) ; mhadione rbductase ou NADH,: 2mhthyll,4naphtoquinone oxydorbductase Enzymes. Alcool dkshydroghase, ou alcool : NAD oxydo (EC ) ; hexokinase ou ATP : ~hexose6phosphotransrhductase (EC ); glucose6phosphate dbshydroghnase, fbrase (EC ).

2 Vol.13, Ko.3, 1970 J. D LE, P. M. VIGNAIS et P. V. VICNAIS 417 La fuscine, compose quinonique &labor& par le champignon Oidiodendron fuscum, possi.de une structure proche de celle de la rotenone (Fig. 1). Dans une note preliminaire [l] nous avions mentionni? l analogie des effets inhibiteurs de la fuscine et de la rotenone [2,3] sur la respiration des mitochondries de foie de rat. Des travaux recents concernant le site d action de la rotenone sur la chaine respiratoire des mitochondries de levure [4,5] nous ont conduit B rechercher quelle hit l action de la fuscine sur la respiration de mitochondries isolees B partir de deux souches de levures, l une, Candida utilis, sensible & la rotenone, l autre, Saccharomyces cerevisiae, insensible B la rotenone. Nous avons Bgalement htudih l effet de la fuscine sur des mitochondries de Candida utilis ayant perdu leur sensibilith B la rotenone par croissance sur un milieu carenci: en fer [5]. ch30% 0..CH*; CH3 c <:; Wmne Fuscine Fig. I. Forrnules compare es cle la rotinone et de la fuscine Contrairement B ce qui pouvait &re attendu des premieres experiences effectuees avec des mitochondries de foie, la fuscine s est comportee dans les mitochondries de levures comme un inhibiteur aussi bien de l oxydation du succinate que de l oxydation du NADH et son action a pu Stre nettement diffhrenciee de celle de la rothone. Le but de cet expose est de presenter une etude comparee de l action de la fuscine sur les chaines respiratoires de mitochondries de mammiferes (foie de rat et cceur de bceuf) et de mitochondries de levures (Candida utilis et Saccharomyces cerevisiae). Les resultats obtenus indiquent yue l organisation des transporteurs respiratoires au niveau du carrefour de la NADHdeshydroghnase et de la succinatedkshydrogenase differe suivant la source des mitochondries. MATERIEL ET Ml?THODES Culture des levures Les levures Candida utilis (souche CBS 1516) et Saccharomyces cerevisiae (souche D 261) sont cultivhes B 25 pendant 18 heures, soit en fioles de Fernbach de 2 litres contenant 400ml de milieu, soit dans les recipients de 14 litres du fermenteur New Brunswick Scientific Co. (N. J., U.S.A.), de type FS 314, contenant 8 B 10 litres de milieu. Dans les deux cas, une agitation et une aeration vigoreuses sont r6alis6es. La culture est initihe par l addition au milieu de culture d un inoculum, cultivi: him&me pendant 24 heures en abrobiose. Le milieu (( naturel H dhcrit par Mattoon et Sherman [6] a 6th utilis6; il contient 10 g/l d extrait de levures Difco, 20 g/l de bactopeptone Difco, et une concentration de glucose variable selon la souche, 15 g/l pour C. utilis et 7,5 g/1 pour S. cerevisiae. Les cellules de levures r6colthes apres IS heures de croissance dans ce milieu naturel enrichi en glucose ne presentent pas de repression respiratoire. En particulier elles ont un Qo, identique B celui de cellules cultivhes sur hthanol. D autre part les mitochondries isolees B partir de levures cultivees sur glucose presentent la mbme sensibilith B l oligomycine que les mitochondries isolees B partir de levures cultivees sur 6thanol. Les experiences de croissance de levures limithe par une carence en fer ont &ti: conduites en fioles de 10 litres, renfermant 8 litres du milieu dbcrit par Light et al. 151, pendant 18 heures B 20, sous aeration et agitation constantes. L inoculum est luimbme cultivh sur le milieu carence en fer. Une culture temoin est realisbe dans des conditions identiques sur milieu de Light enrichi en FeSO, 100 pm. Les cellules de levures sont recueillies par centrifugation b l aide d une centrifugeuse Sharples type MV H et lades deux fois par de l eau distillhe. Isolement des mitochondries Les mitochondries de foie de rat de souche Wistar ont &ti: isolees par la mhthode classique de Hogeboom [7] B partir d un homogenat loo/, (poids/volume) dans une solution de saccharose 0,27 M, TrisHC1 2 mm de ph 7,3. Les mitochondries de cceur de bceuf sont isolhes selon la methode de Smith [8]. Les fragments submitochondriaux sont obtenus par action des ultrasons pendant 4 phriodes de 30 sec, a la puissance maximale de l appareil Branson mod& S 110, en refroidissant l bchantillon dans un bac B glace. Les mitochondries de levures ont 8th isolhes indiffhremment par deux methodes : la premiere met en Ceuvre un broyage direct des levures dans le micromill MV 63 (GiffordWood Co., Hudson, N.Y., U.S.A.) suivant Balcavage et Mattoon [9]. La seconde combine le broyage [lo] avec une digestion prbalable des parois des cellules de levures par le suc digestif d Helix pomatia (h6licase Industrie Biologique Franpaise, Gennevilliers) [ Les levures sont prhincubhes en presence de 2mercapto Bthylamine 0,05 M, pendant 10 min B 30, puis lavhes et soumises B l action de l hhlicase st 30 pendant 90 B 120 min. A partir des protoplastes ainsi obtenus les

3 418 Fuscine et respiration mitochondriale Eur. J. Biochem. mitochondries sont isolhes par centrifugation d86 rentielle apres broyage rapide dans le micromill MV63. Ces deux methodes nous ont donne des resultants tout B fait comparables en ce qui concerne l indice de contrble respiratoire. La mkthode a enzymatique)), de meilleur rendement, mais de durbe nettement plus longue, a 6th utilisee surtout lorsque la quantiti: de levures etait faible. Etude de la phosphorylation oxydative La consommation d oxygene a 6th mesuree B 25 par la methode polarographique, B l aide de l appareil Oxygraphe GME (Gilson Medical Electronics) irquipi: avec une electrode de Clark, selon la methode de Kielley et Bronk [14]. La phosphorylation couplee B la respiration a 4th mesurire soit par la mirthode de Nielsen et Lehninger [I51 en utilisant l orthophosphate marquit par 32P, soit par la mitthode de Chance et Williams [16] oh le rapport ADPjO est deduit de la quantiti: d oxygene consommee pendant la phase de respiration stimulee par l addition d une quantiti: connue et limitbe d ADP (&at 3). Le milieu utilis6 pour la respiration des mitochondries de foie de rat et de cceur de bceuf contenait : KC1 0,ll M, tampon phosphate 16 mm, ph 7,4, MgCI, 6 mm. Celui utilise pour les mitochondries de kvures contenait : mannitol 0,6 M, KC1 I0 mm, tampon phosphate 11 mm, ph 6,5, Trismaleate 10 mm, ph 6,5 et EDTA 40 pm; la concentration en oxygene de ce dernier milieu est Bgale ;I 196pM (Balcavage et Mattoon [9]), celle du milieu salin utilise dans le cas des mitochondries de foie ou de cceur est de 240 pm (Chance et Williams [IS]). hkude des transporteurs de la chaine respiratoire Le NAD+ et le NADP+ ont 6th doses en utilisant les reactions catalysees par l alcool dkshydrog6nase et la glucose6phosphate dhhydroghase respectivement, selon les methodes dircrites par Klingenberg [17,18] adapthes au spectrophotometre B deux longueurs d onde AmincoChance (American Instrument Co., Silver Spring, Md, U.S.A.). Les NADH et NADPH ont BtB doses selon la mitthode fluorimktrique d6crite par Estabrook et Maitra [19]. La quantit6 totale d ubiquinone, ainsi que la fraction d ubiquinone ritduite dans stationnaire, ont 8th dbterminees selon Kroger et Klingenberg [20]. La somme Q oxydite + Q r6duite est mesurbe, apres reduction de Q oxydee par KBH,, en mettant B profit l autooxydation rapide de Q rhduite, apres addition de 10 pl de KOH 8 M B 3 ml de la solution de Q dans I irthanolheptane (Kroger et Klingenberg [Sl]). Les dosages ont 8th realis& B l aide d un spectrophotometre B deux longueurs d onde AmincoChance &quip6 d une lampe B deuterium Sylvania DE 50 A dont le courant continu est fourni par une alimentation Sorensen, modple DLS 28 (38 B 55 volts sous 0,6 B I ampere). Les longueurs d onde choisies sont nm, pour lesquelles le coefficient d extinction de Q est de 12,5 mml cml (Storey [22]). L Btat redox du cytochrome b a 6th Btudie par spectrophotom6trie des suspensions mitochondriales, B l aide du spectrophotomptre AmincoChance, B nm. Mkthodes de dosage L activitb de la NADHmhnadione reductase a 6th mesuree selon Sanadi et al. [23]. Les protkines mitochondriales ont 8th dosees par la methode du biuret, selon Gornall et al. [24] et la correction de turbidit6 Bvaluee apres addition de KCN selon Szarkowska et Klingenberg [25]. L orthophosphate a irtb dos6 par la m6thode de Fiske et SubbaRow [26]. Le fer non heminique est extrait par l acide trichloracetique et dose sous forme de complexe avec la I,lOphhantroline apres reduction par l acide ascorbique selon la methode decrite par Massey [27]. Le fer total, aprh mineralisation par chauffage en presence d acide nitrique, est dose selon Beinert [28j. Rdactifs Le Lglutamate, 1 ATP et l ADP, l hexokinase type V (48 unites par mg) et l amytal proviennent de Sigma Chemical Co. Le NAD+ et le NADP+, le NADH et le NADPH, et les enzymes (alcool dhshydrogenase, glucose6 phosphate deshydrogknase et glutamate dhshydroghnase) sont des produits Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Allemagne). La rotenone provenant d Aldrich Chemical Co. a &ti: recristallisee trois fois dans 1 6thanol avant usage. La fuscine nous a 6th g6nereusement donn6e par le Professeur D. H. R. Barton (Imperial College of Science and Technology, Londres). L orthophosphate marque par 32P est fourni par le Commissariat B I Energie Atomique (Saclay). La rotenone et la fuscine ont 6th utilisires en solution preparee extemporanement dans 1 6thanol pour 6tre ajoutees aux mitochondries de foie de rat et de cceur de bceuf, et dans le methanol pour les mitochondries de levures. La concentration finale du solvant alcoolique dans le milieu apes les additions d inhibiteur n a jamais d6passb lo/o. Dans tous les cas un temoin a itte trait6 par la m6me quantitir de solvant pour bliminer toute interference de 1 6thanol ou du methanol. D autre part, nous avons verifii: que la fuscine en solution dans le methanol donnait des effects analogues sur les mitochondries de foie B la fuscine en solution ethanolique.

4 Vol. 13, No. 3, 1970 J. D LE, P. M. VIQNAIS et P. V. VIQNAIS 419 Mitochondries I Succinate + mitochondries I H 1 0pM k 100pM 2.4DNP f 1 rnin I lrnin F +I Fig.2. Effet de la fuscine sur l oxydation du glutamate et du succinate par les mitochondries de foie de rat. Les chiffres qui indiquent les vitesses de respiration correspondent B une diminution de la concentration en 0, du milieu A 0, pm/min. Conditions (cf. Methodes): volume final 2 ml, temperature 25O; sur le track de gauche le glutamate est ajoute B la concentration de 10 mm, mitochondries 3,6mg de protkine; sup le trace de droite, le succinate est ajoutk B la concentration de 12,5 mm, mitochondries 4,5 mg de protkine f R~SULTATS Effet de la fuscine sur la respiration de mitochondries de foie de rat en prisence de glutamate et de succinate Le tract5 oxygraphique present6 dans la Fig. 2 (cat6 gauche) montre l effet de concentrations croissantes de fuscine sur la vitesse de consommation d oxygene par les mitochondries de foie de rat mises en incubation avec du glutamate. Les valeurs des rapports ADP/O ne sont pas abaissees par la fuscine, m6me pour une concentration de 29 pm (16 nmoles/ mg de protbine), qui inhibe & environ 60 /, la respiration en &at 3. AprPs avoir reduit la vitesse d oxydation du glutamate it environ 50/, de sa valeur initiale par l addition de fuscine B une concentration de 31 pm (17 nmoles/mg de protbine), il est possible de restaurer, par addition de succinate, une respiration stirnulee par le 2,4dinitroph&nol. Dans une exp6 rience independante nous avons verifib que le 2,4dinitrophbnol ne restaurait pas l oxydation du glutamate inhibee par la fuscine. Une experience parallele, effectuee en utilisant le succinate comme seul substrat oxydable (Fig.2, c8tb droit), montre l absence d inhibition de l oxydation du succinate en &at 3 comme en &at 4, par une concentration de fuscine de 79 pm (35nmoles/mg de prothe) qui inhiberait totalement l oxydation du glutamate. Les rbsultats cidessus suggerent que la fuscine agit, comme la rotenone et l amytal, sur la partie de la chaine respiratoire NADH 0, comprise entre d une part le NAD et d autre part le carrefour de la NADH deshydrogenase et de la succinate dhshydrogenase. Cette conclusion est en accord avec le fait que la fuscine inhibe la reduction des pyridinenucleotides par le succinate (Tableau 1); la reduction 28 Eur. J. Biochem., Vo1.13 Tableau 1. Effet de la fuscine sur la re duction des pyridine nucle otides par le succinate dans les mitochondries de foie de rat Les mitochondries (35 mg de protkine) sont mises en incubation en akrobiose pendant 1 min & 28 dans 2 ml de milieu KCl 100mM, TrisHC1 13mM (ph7,35). Les composes ajoutks sont presents aux concentrations suivantes: succinate 5 mm et fuscine 0,15 mm. L incubation est arretke par addition de 0,5 ml de potasse alcoolique 3N. Les pyridine nucleotides NADH + NADPH sont doses par fluorimktrie (voir Materiel et Nkthodes) Addition NADH + XADPH pmoles/mg de prothe Aucune 2,5 Succinate 64 Succinate + fuscine 28 des pyridine nuclkotides par le succinate correspond dans nos conditions experimentales it un reflux d dectrons B partir du succinate vers le NAD [3]. Ernster et al. [2] ont montre que l inhibition respiratoire due it la rotenone est levee par addition de mhadione. Dans ce cas la menadione crbe au niveau du site d action de la rothone une derivation du flux d electrons sans conservation d energie. En accord avec Ernster et al. [a] on note (Fig.3, c6t6 droit) que le quotient de phosphorylation relatif & l oxydation du glutamate est dirninui: d une unite par la mbnadione. Contrairement A ce qui est observi: dans le cas de la rothone, l inhibition de l oxydation du glutamate par la fuscine n est pas abolie par l addition de menadione (Fig.3, cat(? gauche). Le 2,4dinitrophhol est kgalement sans effet sur la

5 420 Fuscine et respimtion mitochondriale Eur. J. Bioohem. Glutamate I,Mitochondries 7 Mitochondries + glutamate [,79pM Fuscine f 40pM Mhadone 13 mm DDpM 2.iDNP 1 mh It T 2 $=1,5 8 f 1 min 4 F Fig.3. Effet de la me nadione sur les mitochondries de foie de rat dont la respiration en prisence de glutamate est inhibie par la fuscine ou la rotinone. Les chiffres qui indiquent les vitesses de respiration correspondent B une diminution de la concentration en 0, du milieu A 0, pm/min. Conditions (cf. MBthodes): volume final 2 ml, temphature 25, glutamate 10 mm, mitochondries 4,5 mg de prothine.\a Fuscine (pm) Rotenone (nm) Fig.4. Effets wmparis de la fuscine et de la rotinone sur l oxydation du glutamate en e tat 3 et en e tat 4 par les mitochondries de foie de rat. Conditions (cf. MBthodes): volume final 2 ml, temp6rature 25, mitochondries 4,2 mg de protbinc (exp. fuscine) et 3,6 mg de proteine (exp. rothone), glutamate 10mM, ADP 100p.M en Btat 3. L inhibition B 50O/, est obtenue pour une concentration en fuscine de soit 14 nmoles de fuscine par mg de proteine respiration inhibee par la fuscine et la respiration ne reprend qu apres l addition de succinate (le trace droit de la Fig.2 montre que la vitesse d oxydation du succinate n est pas modifiee par la mbnadione). Cette observation permet de diffhrencier les sites d action de la fuscine et de la rotenone. Une titration de l effet de la fuscine sur l oxydation du glutamate (Fig.4) a permis d 8valuer la quantitb de fuscine entrainant une inhibition de 50 /, de l oxydation du glutamate B 14 nmoles par mg de proteine. I1 est interessant de remarquer que, contrairement B la rotenone dont l effet inhibiteur est beaucoup marque sur 1 6tat 3 que sur 1 Btat 4 (insertion dans la Fig.4), la fuscine inhibe au m6me degri: la respiration en &at 3 et en ittat 4. I1 convient bgalement de noter que la courbe d inhibition causbe par la fuscine est du type (( sigmoi de )). Ceci suggere que la reaction de transfert d 6lectrons inhibee par la fuscine est precedee dans la chaine respiratoire par un autre transfert d 6lectrons moins rapide, dont la vitesse est par consbquent limitante ; l inhibition de l oxydation globale du pyruvate, detectee au deb d une certaine concentration en fuscine n apparait que lorsque la vitesse de la reaction inhibee par la fuscine est inferieure B la vitesse de la reaction limitante qui la precede. Afin de rechercher si la fuscine se fixait rbversiblement sur les mitochondries de foie de rat, les mitochondries ont 6tB preincubees pendant 10 min L 0 avec 20 nmoles de fuscine par mg de proteine, quantite capable d inhiber B 7O0lO la respiration en presence de glutamate. Puis la suspension mitochondriaie a sediment6e B x g pendant I0 min, et le culot a 6th remis en suspension dans une solution de saccharose 0,27 M. Apres avoir repet6 ce lavage, on a compare l activite respiratoire des mitochondries pr6traitees par la fuscine B celle des mitochondries temoins. L inhibition de la respiration des mitochondries lades est de 8O0lO. La fuscine reste donc fermement liee aux mitochondries, B l instar de la rotenone et B l inverse de l amytal [2].

6 VoI. 13, No J. D LE, P. M. VI~NAIS et P. V. VIGNAIS min Mitochondries 4 V.a3P Fig.5. Effet de la fuscine 8ur l e tat redox du cytochrme b dam des mitochondries de foie de rut oxydant le glutamate. Conditions (cf. Methodes): volume final 3 ml; temperature 16 ; chemin optique 1 cm; mitochondries 10 rng dans un milieu KCl 0,11 M, Pi 16 mm, MgCl, 6 mm, de ph 7,4; fuscine 15 nmoles/mg de proteine. Sur le trace de gauche, tbmoin sans fuscine. Sur le trace de droite, les mitochondries sont ajoutbes immkdiatement aprh la fuscine Localisation du site sensible ci la fuscine dans la chatne respiratoire des mitochondries de foie de rat et de mur de bauf Dans les mitochondries de foie de rat, la reduction du cytochrome b par le succinate n est pas modifiee par l addition d une quantite de fuscine (15 nmoles par tng de protitine) capable d inhiber B 50 /, environ l oxydation du glutamate; de plus, les cycles d oxydoreduction du cytochrome b correspondant aux transitions rbversibles &at 4 Qtat 3 sont parfaiternent conserves en presence de fuscine, ce qui indique la persistance d un couplage efficace. Afin d obtenir une reduction significative du cytochrome b par le glutamate, il a 6tB nbcessaire d ajouter du cyanure it une faible concentration (50 pm), de fapon B ralentir la reoxydation du cytochrome b (Fig.5). Dans ces conditions, la fuscine B une concentration de 15 nmoles par mg de protbine inhibe de fapon quasi totale la reduction du cytochrome b induite par le glutamate. L addition ulterieure de succinate entraine une reduction rapide du cytochrome b, aussi bien en presence qu en absence de fuscine. Ces resultats permettent de localiser le site sensible it la fuscine entre NAD et cytochrome b. 11s indiquent d autre part que la succinate deshydroghnase est branchhe sur la chaine NAD0, du cat6 de l oxygene par rapport au site inhibe par la fuscine. L Btat redox de Q n a pas Bt6 precise dans les mitochondries de foie de rat car ces mitochondries sont relativement pauvres en Q [21] et elles sont d autre part riches en vitamine A dont l intense absorption dans l ultreviolet g6ne le dosage de Q ~ 91. Afm de determiner une Bventuelle interference entre Q et la fuscine dans les mitochondries animales, nous avons pr8fm rechercher l action de la fuscine sur l activit6 NADH menadione r6ductase. En effet la NADH mbnadione rbductase a btb identifibe b la NADH ubiquinone reductase en tant gue portion de 28. Tableau 2. Effets de la fuscine et de l amytul sur la NADH menadione riductase de mitochondries de caur de bczuf entibres ou fragmentiees par les ultrasons La NADH menadione rkductase a 6tb mesurke Q 30 dans 3 ml d un milieu contenant Trissulfate 0,05 M (ph 8,0), mknadione KCN 1 mm et NADH 130 pm, en suivant la diminution de l absorbance Q 340 nm Preparation mi tochondriale Inhibiteurs A NADH Inhibition WM x min x mg protbine Mitochondries entihres (1,4 mg de prothe) Aucun 24 Fuscine 60 ym 14 Fuscine 130 pm 7 Amytal330 pm 9 Fragments (0,5 mg de proteine) Aucun 46 Fuscine 60p.M 34 Amytal330 pm 20 Fragments (0,4 mg de prot6ine) Aucun 57 Fuscine 130 pm S8 chaine respiratoire sur la base d inhibitions analogues par l amytal[30], par la rotenone et la piericidine (211. Pour cette btude nous avons utilise les mitochondries de cmur de bmuf car l activit6 NADH mbnadione reductase est particulierement Blevbe dans ces particules. Les Tableaux 2 et 3 comparent lea inhibitions causees par la fuscine et l amytal sur les activites NADH mbnadione reductase et NADH oxydsse dans des mitochondries de camr de bmuf intactes et fragmentees par ultrasons. La fuscine inhibe au m6me degrb la NADH menadione rbductase des mitochondries intactes et fragment6es (Tableau 2). Par contre une concentration en fuscine qui inhibe it 50 /, la NADH oxydase des mitochondries intactes

7 422 Fuscine et respiration mitochondriale Eur. J. Biochem. Tableau 3. Effets de la fuscine et de l amytal sur la NADH oxydase de mitochondries de cmr de bmuf entiires ou fragmenties par les ultrasons L activith de la XADH oxydase a 6th mesurke A 25 dans 2 ml dun milieu KCI 110mM, MgCl, 6mM, Pod3 7,4), NADH 1,25 mm. La diminution de la concentration en oxyghe A 0, est evaluite comme indiqub dans Materiel et M6thodes Preparation mitochondriale Mitochondries entikres (3 mg de proteine) Aucun Fuscine 100 pm Fuscine 150 pm Amytal250 pm Amytal500 pm Fragments (3 mg de prot6ine) Aucun Fuscine 150 pm Fuscine 200 pm Amytal250 Amytal500 pm Inhibiteurs A 0. Inhibition WM x min x mg protkine lo Fragments (1 mg de proteine) Aucun 75 Fuscine 90 pm 75 0 Fuscine 150 pm 75 0 Fragments (0,4 mg de prothine) Aucun 79 Fuscine 90 pm Fuscine 220 pm n a aucun effet sur la NADH oxydase des mitochondries fragmentbes (Tableau 3, exp. 1); dans ce dernier cas, une inhibition apparait lorsque le rapport de la quantite de fuscine B la quantitit de mitochondries est considerablement augment6 (Tableau 3, exp. 2). Contrairement h la fuscine, l amytal inhibe la NADH mhadione reductase et la NADH oxydase au m6me degrb b la fois dans les mitochondries intactes et fragmentbes. Ces rbsultats indiquent que, comme l amytal, la fuscine inhibe le flux d 6lectrons dans la portion de chaine NAD > Q. 11s permettent Bgalement de dbrencier les sites d action des deux inhibiteurs. En effet la fragmentation des mitochondries par ultrasons modifie l arrangement des transporteurs dans le segment NAD + Q de telle fapon que le flux d blectrons dans les fragments mitochondriaux courtcircuite le site inhibe par la fuscine, mais non celui inhibb par l amytal. L effet de la fuscine sur 1 8tat d oxydoreduction des flavoprotbines n a pas btb blucidb en raison de l absorption de la lumi6re par la fuscine entre 400 et 500nm. Par contre, la localisation du site inhibb par la fuscine par rapport au fer non hbminique de la NADHdbshydrogbnase a BtB determinee par resonance paramagnetique blectronique. Pour la Tableau 4. Effet de la fuscine sur l oxydation, par les mitoekondries de Candida utilis, du pyruvate et du succinate, et sur la phosphorylation associe e Les mitochondries (2,2 mg de prothine) sont miss en incubation dans 2 ml de milieu contenant mannitolo,6 M, orthophosphate marque par 32P 10 mm, Trismalhate 10 mm, EDTA 0,l mm, glucose 20 mm, ADP 10 mm, MgCI, 0,6 mm et 2 mg dhexokinase type Y; le ph final est 6,5. Les substrats utilids sont le pyruvate 10 mm, le malate 5 mm ou le succinate 15 mm. L incubation est arretbe par l addition de 0,2 ml dacide trichloroachtique B 30 o/ip!poids/volume). Les quantites $0, consommk et de Pi esthrifie sont mesurhes comme indiqub dans Mathriel et Mbthodes Substrats Fuscine de consommation Inhibition de la respiration PI0 d O. IrM natom x min x mg protkine 0 Pyruvate Malate 75 0 Succinate 12, , , , facilite d exposition ces rbsultats ont 6th rassembl6s avec ceux obtenus pour les mitochondries de levures et ils seront discutbs avec ces derniers. Discrimination du site sensible ic la fuscine et du site sensible ic la rotdnone dans les mitochondries de levures Des prbparations mitochondriales obtenues b partir de trois types dabrents de cellules de levures ont 6th utilisbes dans cette btude. Ce sont : a) des cellules de Candida utilis possbdant une sensibilitb normale de l oxydation du NADH vis B vis de la rotenone ; b) des cellules de Candida utilis rendues deficientes en fer par culture sur un milieu carence en fer et ne possedant plus de sensibilite B la rotbnone; c) des cellules de Saccharomyces cerevisiae oh l absence de la sensibilite B la rotenone est constitutive. Les rbsultats rapport& dans le Tableau 4 concernent la respiration des mitochondries de Candida utilis mises en incubation soit avec du pyruvate et du malate soit avec du succinate. 11s montrent que l oxydation du succinate est plus sensible st la fuscine que l oxydation du pyruvate et que les quotients de phosphorylation relatifs B l oxydation du pyruvate ou du succinate ne sont pas diminues de fapon significative par des concentrations de fuscine qui inhibent 50 /, de la respiration. La preparation inhibee par la fuscine est restaurbe intbgralement par l addition de TMPD et d ascorbate. La quantiti: de fuscine nhcessaire pour inbiber de 5001, la respiration est 4 fois plus &levee lorsque le

8 Vol. 13, No. 3, 1970 J. D LE, P. 11. VIGNAIS et P. V. VIGNAIS c 8 50.E D d Succinate Pvruvate + malate Tableau 5. Effet de la fuscine sur l itat redox de l ubiquinone duns les mitochondries de Candida utilis Les mitochondries (1,5 mg do protkine) sont mises en incubation pendant 30 sec 20 dans 1 ml d un milieu contenant: mannitolo,6 M, KCl 10 mm, Trismalkate 10 mm, Pi 11 mm, EDTA 40 pm, de ph 6,5, et Qventuellement, pyruvate 5 mm, malate 2 mm, succinate 5 mm, HCN 1 inm, fuscine 50 pm, soient 33 nmoles/mg de protdine. Du malonate 4 mm a QtQ ajoutb au pyruvate + malate pour empecher l oxydation du succinate endoghe. L incubation est arrat6e par addition de 4ml d un mdlange &her de pktrolemqthanol (40:60, vol/vol). Q rkduite et Q oxydqe sont doskes comme indiquh dans Materiel et Mbthodes. La quantite totale d ubiquinone est kgale B 4,4 pmoles/g de protkine Substrats Additions Q rbduite Fuscine (pm) Fig.6. Effet de la fuscine sur la respiration de mitochondries de Candida utilis, en fonction du substrat et de l ttat respiratoire. Conditions (cf. Mkthodes) : mitochondries 1,4 mg de protkine, volume final 2 ml, tempkrature 25. Lorsque I ADP est ajoutk, il est present b la concentration de 3 mm. Snr le track de gauche le substrat est le succinate 30 mm. La fuscine entraine 50 /, d inhibition b soit 14 nmoles par mg de protkine. Sur le trace de droite, les substrats sont le pyruvate 30mM et le malate 10mM. La fuscine entraine 50 /, d inhibition: en &at 4, & 32,5 p3 I (46 nmoles/mg de protkine); en &at 3, b 39 pm (56 nmoles/mg de protbine) substrat est le pyruvate (56 nmoles par mg de protkine) que lorsqu il s agit de succinate (14 nmoles par mg de proteine) (Fig. 6). L inhibition est directement proportionnelle B la concentration en inhibiteur dans le cas du succinate, alors que dans le cas du pyruvate l inhibition n est mise en evidence qu aprhs une phase de plateau (courbe d inhibition (( sigmoide v). Cette courbe d inhibition (( sigmoide B est vraisemblablement due il une reaction limitante de transfert d electrons entre le NADH et le site d action de la fuscine, comme ceci a d6jb 6th suggere en ce qui concerne les mitochondries de foie de rat (voir plus haut). La sensibiliti: de l oxydation du pyruvate vis&vis de la fuscine est diminuee lorsque 1 ADP est ajoute aux mitochondries avant l inhibiteur. I1 est interessant de noter que la sensibilite B la rotenone de la respiration des mitochondries de Candida utilis est du m6me ordre de grandeur que leur sensibilite b la fuscine et nettement plus faible que la sensibilitb B la rotenone des mitochondries animales : l oxydation du malate + pyruvate par les mitochondries de Candida utilis est inhibee B 50 /, par environ 15 nmoles de rotenone. De la m6me fapon que dans les mitochondries de foie de rat, les pyridine nucleotides endogpnes des mitochondries de Candida utilis sont reduits par le succinate, vraisemblablement par reflux d 6lectrons dans la chaine respiratoire [3] ; comme dans les mitochondries de foie de rat, cette reduction eat inhibee par la fuscine. Pyruvate + malate Aucune 13 Fuscine 23 KCN 61 KCN + fuscine 64 Succinate Aucune 34 Fuscine 33 KCN 85 KCN + fuscine 77 L effet de la fuscine sur 1 8tat redox de Q et dn cytochrome b dans les mitochondries de Candida utilis est present6 dans le Tableau 5 et dans la Fig. 7. La fuscine B une concentration de 33 nmoles par mg de proteine (quantitl: capable d inhiber B plus de 950/, l oxydation du succinate et & 20 /, l oxydation du pyruvate) entraine une legere augmentation du pourcentage de Q reduit par le pyruvate (NAD deshydroghation), mais aucune variation du pourcentage de Q reduit par le succinate (Tableau 5). L absence de reponse de 1 6tat redox de Q il l addition de fuscine lorsque le substrate oxydable est du succinate suggpre que Q n est pas directement implique dans la chaine des transporteurs oxydant le succinate et qu il pourrait 6tre branch6 en derivation sup cette chaine de transporteurs. Par contre l augmentation de la forme reduite de Q lorsque le pyruvate est utilise comme substrat oxydable suggpre que le site d action de la fuscine dans la chaine NAD... 0, est situe du c6tk de 0, par rapport B Q. Les tracks de la Fig.7 permettent de comparer les diffkrents Btats redox du cytochrome b en 6tat stationnaire. La valeur de 1000/o &ant fixee comme reference pour la quantite de cytochrome b reduit aprk addition de substrat et de cyanure (sans prbjuger du pourcentage reel du cytochrome b reduit dans ces conditions, ni de son &tat redox initial), le pourcentage de cytochrome 6 reduit en Qtat stationnaire est de 380/, lorsque le substrat utilisi? est le succinate et il s B1Pve B 550/, par addition ulterieure de pyruvate et de malate. La m6me experience a Qt6 realisee en presence de 50 nmoles de fuscine par mg de protkine, c est&dire d une quantite de fuscine capable d inhiber totalement l oxydation du succinate 0

9 424 Fuscine et respiration mitochondriale Eur. J. Biochem. Pyruvate 3.3 rnm +Malate 3.3 rnm nm W I Q Succinate 3.3 rnm Fusche 33vM I Succir(ate3.3rnM Mi tochondriis Mitochondries Pyruvate 3.3mM +malate 93mM Fig.?. Effet de la fuscine sur l itat redox du cytochrome b de mitochondries de Candida utilis. Sur le trace de gauche, tbmoin sans fuscine. Sur le trace de droite les mitochondries sont ajoutees immbdiatement apres la fuscine. Conditions: mitochondries 2 mg de proteine, volume final 3 ml, tempkrature 2 5O, chemin optique 1 cm. Fuscine 50 nmoles/mg de proteine. Milieu mannitol 0,6 M, KCl 10 mm, Trismaleate 10 mm, Pi 10 mm et EDTA 40 ym, de ph 6,5. L ktat redox du cytochrome b en regime permanent a kt6 determine en donnant la valeur arbitraire de 100 /, B la reduction maximale obtenue aprhs addition de substrat et de cyanure 4 g = 2.00 g 1.94 g=2.00 g= 1.94 m P I 100 Gauss A m Fig. 8. Spectres de rbonance paramagnktique klectronique de mitochondries de levure (Candida utilis). (A) I, Mitochondries de levure seules (12 mg de prothe) (le spectre d absorption B basse temperature des cytochromes a montre que leur chaine respiratoire est completement oxydke); 11, aprhs addition de 20 ymoles de succinate; 111, aprhs addition de 20 ymoles de succinate + 0,2 ymole de fuscine en solution dans du mkthanol. (B) Les mitochondries le levure ont, au prhalable, BtB congelkes et peuvent oxyder le NADH. IV, Mitochondries de levure (16 mg de proteine) + 0,5 pmole de NADH; V, mitochondries de levure (16 mg de protkine) + 0,5 ymole de NADH + 0,2 pmole de fuscine dissoute dans du methanol; VI, mitochondries de levure (16 mg de protkine) + 0,5 ymole de NADH + 0,15 ymole de rotenone dissoute dana du mkthanol. Lea mesures sont faites dans des tubes en quartz de 3mm de diamhtre interne. Les additions de substrats sont faites B OZO; apr& 2 a 3 min de contact les Bchantillons sont congel& dans l azote liquide et lea spectres pris Q 180 dans un spectrometre Varian type V4502 en utilisant un dispositif B temperature variable V4540 B 9500 MHz. La position du pic B g = 2,OO est reperke B l aide de diphenylpicrylhydrazide B m

10 Vol. 13, No. 3, 1970 J. D LE, P. M. VIGNAIS et P. V. VICNAJS 425 et de 500/, l oxydation du pyruvate; dans ces conditions, le pourcentage de cytochrome b reduit par le succinate ne s 6lPve plus qu B go/, et atteint 31 /, par addition ulterieure de pyruvate et de malate. Ces resultats montrent que le point d action de la fuscine dans la chaine succinate... 0, est localis6 entre le succinate et le cytochrome b. Light et al. [5] ont montre que des mitochondries de Candida utilis cultivees sur milieu deficient en fer perdent leur sensibilite B la rotenone et sont appauvries en fer non heminique. Nous avons prepare des mitochondries B partir de Candida utilis deficient en fer et avons confirm6 que la teneur en fer non heminique diminue considerablement (1 nanoatomegramme de fer nonheminiquepar mg de prothine dans les mitochondries deficientes contre 5 dans les mitochondries normales) et que la sensibilite de la respiration b la rotenone disparait. Bien qu elles perdent leur sensibilite B la rotenone les mitochondries deficientes en fer conservent leur sensibilite B la fuscine: une inhibition de 50 /, de l oxydation du succinate et du pyruvate est obtenue avec 9 et 33 nmoles de fuscine par mg de proteine respectivement. Une derniere serie d experiences a port6 sup des mitochondries obtenues B partir de Xaccharomyces cerevisiae. Bien que les mitochondries de Saccharomyces cerevisiae soient constitutivement insensibles it la rotenone, leur respiration est inhibee par la fuscine. Une inhibition de 50 /, de la respiration est obtenue avec 30nmoles de fuscine par mg de prothe lorsque le substrat est le pyruvate, et avec 21 nmoles de fuscine par mg de prothine lorsque le substrat est le succinate. Ces concentrations de fuscine sont du meme ordre que celles qui sont actives sur Candida utilis, levure sensible B la rothone. Les donnees obtenues avec Xaccharomyces cerevisiae confirment les resultats obtenus avec Candida utilis deficient en fer et indiquent que la rotenone et la fuscine agissent sur des transporteurs diffhrents dans les chaines respiratoires des mitochondries de levures. Action CEe la fuscine sur les signaux de rdsomnce pramgn6tique 6lectronipue donnh par le fer non hdminipue de la NADHddshydrogdnase et de la succinatedgshydrogdnase Palmer et al. [32] ont mis b profit les signaux du fer non heminique sous 1 6tat ferreux de la NADHdeshydrogenase et de la succinatedbshydrog6nase dans la region de g = 1,94 pour determiner le site d action de d86rents inhibiteurs respiratoires (amytal, rotenone, pi6ricidine). Les experiences presentees ici b propos de l action de la fuscine vis8vis des signaux de resonance paramagnetique Blectronique du fer non heminique de la chaine respiratoire sont bas& sur le m6me principe. Alors que, dans les mitochondries de foie de rat, les spectres de resonance paramagnetique Blectronique ne sont pas affect& par la fuscine, des modifications des signaux de resonance paramagnetique Blectronique B g voisins de 1.96 et de 1,94 ont Bt6 obtenuea de fapon particuliprement nette avec les mitochondries de Candida utilis traitees par des concentrations totalement inhibitrices de fuscine. Le trace I1 de la Fig. 8 (compare au trace I) montre clairement l apparition du signal B g = 1 94 aprps addition de succinate B des mitochondries de Candida utilis; ce signal disparait aprps addition de fuscine (trace 111). Une seconde serie d experiences effectuees avec NADH comme substrat fait apparaitre en plus du signal B g = 1 94 la composante, B g voisin de 1,96 (trace IV) due au fer non heminique de la NADHdeshydrogenase; les signaux B g = 1.94 et g = 1 96 ne sont pas affect& par la fuscine (trace V); contrairement B la fuscine, la rotenone fait disparaitre la composante B g = 1,96 initi6e par NADH (trace VI). Cet effet de la rotenone a 6th observe aussi bien avec des mitochondries de Candida utilis qu avec des mitochondries de foie de rat. De plus la rotenone ne modifie pas le signal B g = 1 94 initie par le succinate dans les mitochondries de Candida utilis. Des mesures de resonance paramagnetique Blectronique faites sur des preparations de membranes internes de foie de rat isolees selon Parsons et al. [33] montrent que la rotenone dhprime trps nettement les signaux B g = 1,94, g = 1 96 et g = 2,OO inities par addition de NADH. La fuscine ajoutee B ces preparations de membrane internes n interfpre que l6gprement avec ces signaux. Ces resultats indiquent : a) que le point d action de la fuscine dam la chaine d oxydation du NADH (mitochondries animales et mitochondries de Candida utilis) est localise du c8tb de 0, par rapport au fer non heminique de la NADHdeshydrogenase ; b) que, dans les mitochondries de Candida utilis, le point d action de la fuscine dans la chaine d oxydation du succinate est localis6 du cbt6 du succinate par rapport au fer non h6minique de la succinatedeshydrogenase. Ces observations corroborent 12s donnees spectroscopiques qui prbcpdent et soulignent le fait que le site sensible B la fuscine est different du site sensible i la rotenone. Duncan et Mackler [34] ainsi que Schatz et al. [35] ont montre que Xaccharomyces cerevisiae ne presente pas le signal caracteristique du fer non heminique de la NADHdhshydrogenase. Comme nous l avons vu cidessus, et en accord avec Sharp et al. [36] l addition de NADH B des mitochondries de Candida utilis (cultivhe sur milieu complet) fait apparaitre un signal B g = Le fait que la fuscine, B concentration &levee, inhibe l oxydation du pyruvate au m8me degre chez Sacchuromyces cerevisiae, chez

11 426 Fuscine et respiration mitochondriale Bur. J. Biochem. Candida utilis deficient en fer et chez Candida utilis non deficient en fer indique qu il n existe pas de correlation entre l existence de fer non heminique dans la NADHdbshydrogenase et l inhibition, par la fuscine, de l oxydation du NADH. Au contraire, la correlation qui existe entre la diminution de la concentration en fer non heminique dans Xaccharomyces cerevisiae dkficient en fer et la disparition de la sensibilitb de I oxydation du NADH B la rotknone sugg6re fortement que la rotenone agit au niveau du fer non heminique de la NADHdkshydrogenase. DISCUSSION Les rbsultats rapport& dans cette communication montrent que la fuscine agit spbcifiquement sur la respiration mitochondriale et n entraine pas en particulier de dkcouplage de l oxydation phosphorylante ; fait curieux, la fuscine inhibe l oxydation du NADH et l oxydation du succinate de fagon diffhrente selon que les mitochondries proviennent de tissus animaux ou de levures. Dans les mitochondries de foie de rat, la fuscine inhibe l oxydation du glutamate sans ralentir l oxydation du succinate, comme le font d ailleurs la rheine [37], l amytal et la rotenone [2,3]. De mkme que ces inhibiteurs, la fuscine empeche la reduction du cytochrome b par le NADH. Cependant, B la difference de ce qui est observe pour l amytal et la rotknone, la mbnadione ne restaure pas l oxydation du glutamate inhibee par la fuscine. De plus, la fuscine ne diminue pas l intensitb du signal du fer non hkminique de la NADHdeshydrogenase. Dans la sequence de chaine respiratoire NAD Fp NH cyt. b, oh NH represente le fer non heminique, le site d action de la rotenone a btk fix6 entre Fp et NH par Hatefi [38], entre NH et cytochrome b par Palmer et al. [32] et par Tyler et al. [39], au niveau mkme de NH par Bois et Estabrook [40], entre deux composants flavoproteiniques de la NADHdeshydrogenase par Chance et al. [41]. Avec les mitochondries de foie de rat, alors que dans nos conditions expkrimentales la rotenone affecte la composante B g = 1,96 du signal g = 1,94, la fuscine n interfere pas avec l absorption en resonance paramagnetique Blectronique du complexe it fer non heminique lib B la NADHdhshydrogenase. C est pourquoi on est conduit b postuler que le site sensible b la fuscine dans la chaine respiratoire des mitochondries de foie de rat est different du site sensible B la rotenone et se situe du c6tk de 0, par rapport au fer non heminique de la NADHdeshydrogenase. Dans les mitochondries de Candida utilis (et B la diffbrence des mitochondries animales) l oxydation du succinate par 0, ou par le cytochrome b est nettement plus inhibee par la fuscine que l oxydation du NADH (oxydation du pyruvate + malate). Cet effet de la fuscine n est pas isole. On connait des inhibiteurs respiratoires autres que la fuscine dont les effets sont differents suivant la source des mitochondries. Par exemple, la piericidine A [42] possbde un effet inhibiteur beaucoup plus marque sur la NADHdkshydrogenase des mitochondries de cceur de bceuf que sur les mitochondries des particules respiratoires d dxotobacter. De mkme la sensibilite B la rotenone de la NADHdeshydrogbnase des mitochondries animales est beaucoup plus grande (500 fois plus) que celle des mitochondries reputbes (( sensibles w B la rotenone comme Candida utilis (cf. [2,4,5] et resultats personnels). Par ailleurs, le seconal inhibe l oxydation du succinate dans les mitochondries de Candida utilis alors qu il est sans effet sur cette oxydation dans les mitochondries de ccaur de bcauf [36]. Succina te Fig.9. Sites d action prbumb de la fuscine dans lea mitochondries de Candida utilis La grande sensibilite, visbvis de la fuscine, de l oxydation du succinate dans les mitochondries de Candida utilis, et la disparition, en presence de fuscine, du signal b g = 1,94 initie par le succinate conduit b localiser le site d action de la fuscine du c6tb du succinate par rapport au fer non hbminique de la succinate deshydrogbnase (cf. schema de la Fig.9). Puisque la reduction du fer non hbminique associbe B la NADHdeshydrogenase n est pas sensible b la fuscine (Fig.8), le site d action de la fuscine sur la NADIIdeshydrogenase doit ktre localis6 du c6t6 de 0, par rapport au fer non heminique de la NADHd6shydrogBnase (Fig.9) b moins qu il n existe, dans les mitochondries de Candida utilis, une connection Btroite entre les deux protbines b fer non heminique ; dans ce cas un seul site d action pourrait rendre compte B la fois de l inhibition de l oxydation du succinate et de celle du NADH. Les resultats obtenus avec la fuscine renforcent l intbrkt d autres observations concernant les d36 rences de sensibilite B la rotenone de mitochondries animales et de mitochondries de levures. 11s indiquent clairement que l organisation des transporteurs d electrons au niveau du carrefour de la NADHdbshydrogenase et de la succinatedbshydrogbnase est diffkrente dans les mitochondries animales et dans les mitochondries de levures.

12 Vol.13, No.3, 1970 J. D LE, P. If. VIGNAIS et P. V. VIGNAIS 427 Les auteurs remercient le Professeur E. Lederer (Orsay) qui a initib et suivi avec intbrht ce travail, le Professeur D. H. R. Barton (Londres) qui nous a gbnbreusement adressb des Bchantillons de fuscine, et Monsieur ServozGavin (C. E. N.Grenoble) qui a mis b notre disposition le spectrometre Varian. Madame J. Huet nous a aimablement prw son concours en nous prhparant des suspensions de mitochondries B partir de Candida utilis. Les auteurs remercient 6galement Madame J. Chabert et Monsieur J. Doussihre pour leur excellente collaboration technique. Ce travail a Bth en partie subventionnb par le C.N.R. S. (RCP21 et ERA no 36) et la D. G. R. S. T. BIBLIOGRAPHIE 1. Vignais, P. M., et D le, J., Congrb de la Fdlration des Socittb Biochimiques Europtennes, Varsovie 1966, 1c1: Ernster, L., Dallner, G., et Azzone, G. F., J. Biol. Chem. 238 (1963) Chance, B., et Hollunger, G., J. Biol. Chem. 238 (1963) Ohnishi. T.. Sottocasa. G.. et Ernster., L.., Bull. SOC. Chim: Biol. 48 (1966) Light, P. A., Ragan, C. I., Clegg, R. A., et Garland, P. B., FEBS Letters, 1 (1968) Mattoon, J.R., et Sherman,F., J. Biol. Chem. 241 (1966) Hogeboom,G., In Methods in Enzymology (edited by S. P. Colowick and N. 0. Kaplan), Academic Press, LondresNew York 1955, Vol. 1, p Smith,A. L., In Methods in Enzymology (edited by S. P. Colowick and N. 0. Kaplan), Academic Press, LondresNew York 1967, Vol. 10, p Balcavage, W. X., et Mattoon, J. R., Biochim. Biophys. Acta, 153 (1968) Mattoon, J. R., communication personnelle. 11. HeymanBlanchet, T., Zajdela, F., et Chaix, P., Biochim. Biophys. Acta, 36 (1959) Zajdela, F., HeymanBlanchet, T., et Chaix, P., C. R. Hebd. Stances Ad. Sci. (Paris), 235 (1961) Ohnishi, T., Kawaguchi, K., et Hagihara, B., J. Biol. Chem. 241 (1966) Kielley, W. W., et Bronk, J. R., J. Biol. Chem. 230 (1958) Nielson, S. O., et Lehninger, A. L., J. Biol. Chem. 215 (1955) Chance, B., et Williams, G. R., J. Biol. Chem. 217 (1955) Klingenberg, M., In Methods of Enzymatic Analysis (edited by H. U. Bergmeyer), Academic Press, LondresNew York 1963, p Klingenberg, M., In Methods of Enzymatic Analysis (edited by H. U. Bergmeyer), Academic Press, LondresNew York 1963, p Estabrook, R. W., et Maitra, P. K., Anal. Biochem. 3 (1962) Kroger, A., et Klingenberg, M., Biochem (1966) Kroger,A., et Klingenberg,M., In Current Topics in Bioenergetics (edited by D. R. Sanadi), Academic Press, LondresNew York 1967, Vol. 2, p Storey, B. T., Arch. Biochem. Biophys. 114 (1966) Sanadi, D. R., Pharo, R. L., et Sordahl, L. A., In Methods in Enzymology (edited by S. P. Colowick and N. 0. Kaplan), Academic Press, LondresNew York 1967, Vol. 10, p Gornall, A. G., Bardawill, C. J., et David, M. M., J. Biol. Chem. 177 (1949) Szarkowska, L., et Klingenberg, M., Biochem (1963) Fiske, C. H., et SubbaRow, Y., J. Biol. Chem. 66 (1925) Massey, V., J. Biol. Chem. 229 (1957) Beinert, H., cite par Brumby, P. E., et Massey, V., In Methods in Enzymology (edited by S. P. Colowick and N. 0. Kaplan), Academic Press, LondresNew York 1967, Vol. 10, p Pumphrcy, A. M., et Redfearn, E. R., Biochem. J. 76 (1960) Crane, F. L., Cunningham, W. P., et Hall, C. L., In NonHeme Iron Proteins (edited by A. San Pietro), The Antioch Press, Yellow Springs, Ohio 1965, p Hall, C. L., et Crane, F. L., Biochem. Biophys. Res. Commun. 26 (1967) Palmer, G., Horgan, D. J., Tisdale, H., Singer, T. P., et Beinert, H., J. Biol. Chem. 243 (1968) Parsons, D. F., et Williams, G. R., In Methods in Enzymology (edited by R. W. Estabrook and M. E. Pullman), Academic Press, London 1967, Vol. X, p Duncan, H. M., et Mackler, B., Biochemistry, 5 (1966) Schatz, G,, Racker, E., Tyler, D. D., Gonze, J., et Estabrook. R. W.. Biochem. Biowhus. Res. Commun. L w 22 (1966) 585. ' 36. Sharp, C. W., Mackler, B., Douglas, H. C., Palmer, G., et Felton, S. P., Arch. Biochem. Biophys. 122 (1967) Kean, E. A., Arch. Biochem. Biophys. 127 (1968) Hatefi, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 60 (1968) Tyler, D. D., Gonze, J., Estabrook, R. W., et Butow, R. A., In NonHeme Iron Proteins (edited by A. San Pietro), The Antioch Press, Yellow Springs, Ohio 1965, p Bois, R., et Estabrook, R. W., Arch. Biochem. Biophys. 129 (1969) Chance, B., Ernster, L., Garland, B., Lee, C. P., Light, P. A.. Onishi. T., Raean. C. I., et Wonn. D.. Proc. u I Natl.'Acad. Sei. U.S (1967) Jew, M.. Hall. C. L.. Crane. F. L.. Takahashi. N., Tan&a,S., et 'Folk&, K., iwchemhtry, 7 (1968) Adresse actuelle de J. D le: 4 Rue Embouque d'or F34 Montpellier, France P. M. Vignais et P. V. Vignais * Laboratoire de Biochimie du C. E. N. CBdex 85, F38 Grenoble, France * to whom requests for reprints should be adressed

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