TRILLIUM DIAGNOSTICS. Leuko64 TM Mélange pour la détection de la réponse inflammatoire systémique aiguë. V Pour diagnostic in vitro

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1 Leuko64 TM Mélange pour la détection de la réponse inflammatoire systémique aiguë i Informations sur le produit h LK (75 tests) ; V Pour diagnostic in vitro LK (250 tests) RESUMÉ ET PRINCIPE L'expression du CD64 sur les neutrophiles est rapidement accrue, en quelques heures, in vitro et in vivo, par les médiateurs de l'inflammation, comme l'interféron gamma et le G-CSF (1-3). Une modification identique est observée en réponse à une infection ou à une lésion tissulaire documentée, ce qui indique de ce fait que la mesure de l'expression du CD64 sur les neutrophiles est corrélée avec la présence de tels états pathologiques chez l'être humain (4-14). Le dosage Leuko64 TM est constitué d'un mélange de trois anticorps monoclonaux présentant des spécificités pour le CD64 (clones 22 et 32,2) et le CD163 (clone Mac2-158). L'utilisation de deux anticorps de déterminants antigéniques différents de CD64 améliore le rapport signal/bruit du dosage et fournit un mécanisme pour réduire d'un lot sur l'autre la variance du signal de fluorescence du réactif. L'adjonction au CD163 de l'anticorps monoclonal, un antigène particulier du monocyte, accroît la spécificité de l'identification de la surpopulation des leucocytes, simplifiant par le fait la recherche d'algorithme moléculaire du logiciel Leuko64 TM QuantiCALC TM et permettant l'identification de populations «contrôle positif et négatif» internes. L'utilisation d'un logiciel automatique élimine la variance inhérente à l'analyse standard subjective en mode liste de cytométrie en flux. Le recours à une suspension de perles fluorescentes pour la standardisation de la numération du CD64 cellulaire permet la traçabilité au NIST Standard Reference Material SRM 1932 (RM 8640) et fournit également un mécanisme pour réduire d'un lot sur l'autre les différences dans les kits de dosage Leuko64 TM. Les résultats du dosage Leuko64 TM sont rapportés comme un indice PMN CD64 en tant que paramètre diagnostic, avec les indices Monocyte CD64 et CD163. APPLICATION Les versions LK et LK du kit de dosage Leuko64 TM ont été conçues pour être utilisées spécifiquement avec les cytomètres en flux suivants : Beckman Coulter XL, Beckman Coulter FC-500, Beckman Coulter Navios, BD Biosciences FACScan, BD Biosciences FACSCalibur, et BD Biosciences Cantos.

2 DOMAINE D'APPLICATION La trousse de dosage Trillium Diagnostics Leuko64 TM a été conçue pour être utilisée dans la mesure de l'expression du CD64 sur les neutrophiles leucocytaires. Elle est également destinée à être utilisée avec d'autres résultats et évaluations cliniques en laboratoire afin de faciliter le diagnostic in vitro de la réponse inflammatoire systémique aiguë aux lésions tissulaires qui se produit notamment en cas de dommages aux tissus, d'infection ou de sepsie. Le Trillium Leuko64 TM est uniquement destiné au diagnostic in vitro réalisé uniquement par un personnel formé et qualifié. KIT COMPONENTS Mélange d'anticorps monoclonaux murins (contient une solution saline Réactif A tamponnée avec 0,5 % d'albumine sérique bovine purifiée (BSA) et 0,01 % d'azide de sodium). Solution de lyse Trillium concentrée 10X (contient du chlorure Réactif B d'ammonium) Suspension de perles en polystyrène de 5 à 6 µm marquées au Réactif C StarFire Red TM et d'isothiocyanate de fluorescéine (contient <0,1 % d'azide de sodium et 0,01 % de Tween 20). Utilisé pour analyser les fichiers en mode liste de cytométrie en flux et Leuko64 TM calculer les indices CD64 sur les leucocytes. Le CD du logiciel joint contient également des didacticiels destinés à la formation de Logiciel l'utilisateur afin d'optimiser l'utilisation de la trousse de dosage Leuko64 TM. RÉACTIFS ET MATERIELS NECESSAIRES MAIS NON INCLUS Eau distillée Tubes en polystyrène 12x75 jetables Cytomètre en flux Micropipette(s) capable(s) de distribuer 5 µl, 50 µl, et 1 ml Mélangeur vortex Ordinateur pour l'analyse du fichier en mode Liste SPECIMEN Le dosage Leuko64 TM ne nécessite que 50 µl de sang total anticoagulé; EDTA, héparine, citrate de sodium ou ACD sont tous compatibles avec ce système d'analyse. Les échantillons de sang demeurent acceptables pendant 8 heures s'ils sont conservés à température ambiante (18-22 C) ou pendant 48 heures s'ils ont été réfrigérés (2-8 C). PREPARATION DU SPÉCIMEN 1. Diluez la solution de lyse Trillium 10X (Réactif B) au 1:10 en mélangeant 1 partie de Réactif B concentré à 9 parties d'eau distillée filtrée. Le ph final de cette solution devrait être égal à Préparez un volume suffisant pour le nombre de tests prévus (1,0 ml est nécessaire pour chaque échantillon). La solution de lyse Trillium diluée ou 1X est stable pendant 1 semaine à température ambiante (20-26 C) ou 30 jours si elle est réfrigérée (2-8 C). 2. La solution de lyse Trillium diluée doit être portée à une température comprise entre 20 C et 37 C pour être utilisée. Une solution froide peut avoir pour conséquence une mauvaise lyse et des conditions de dosage suboptimales. 3. Étiquetez un tube en polystyrène 12 x 75 mm pour chacun des échantillons qui doit être analysé. 4. Pipetez 50 µl de Réactif A Leuko64 TM dans chaque tube étiqueté. LK64-V A4 EN Page 2 de 9

3 5. Pipetez 50 µl d'échantillon sanguin, sous anticoagulant, bien mélangé, ayant une numération leucocytaire <25 x 10 9 cellules/l (diluez si nécessaire) dans le tube correspondant contenant le Réactif A, mélangez doucement ou passez au vortex, puis incubez pendant 10 minutes dans l'obscurité et à température ambiante (18-22 C). 6. Ajoutez 1 ml de solution de lyse Trillium 1X (Réactif B dilué) à chaque tube et passez soigneusement au vortex. Incubez pendant 15 minutes dans l'obscurité et à température ambiante. Des passages intermittents au vortex améliorent la lyse. 7. Ajoutez 5 µl de perles TM (Réactif C) à chaque tube, passez au vortex et analysez sur un cytomètre en flux en utilisant la configuration de l'instrument et le protocole d'analyse indiqué ci-dessous. Les échantillons préparés et qui ne sont pas immédiatement analysés doivent être maintenus à 2-8 C, et protégés de la lumière jusqu'à ce qu'ils soient analysés. L'analyse par cytométrie en flux doit être réalisée dans les 4 qui suivent la coloration. CONFIGURATION DU CYTOMETRE EN FLUX Avant d'analyser votre premier spécimen, un protocole d'acquisition doit être configuré sur le cytomètre en flux. Les perles Leuko64 TM (Réactif C) servent de calibrateur pour les paramètres de tension et de gains de l'instrument. Afin que le logiciel automatique fonctionne de façon appropriée, il est impératif de respecter exactement les étapes suivantes. Pour obtenir de plus amples instructions, consultez les didacticiels se trouvant sur le CD du logiciel Leuko64 TM QuantiCALC. 1. Préparez un tube de polystyrène 12x75 contenant 5 µl de perles Leuko64 TM (Réactif C) dans 0,5 ml de solution de lyse Trillium 1X (Réactif B dilué au 1:10 avec de l'eau distillée filtrée, ph 7,40 + 0,05). Cette suspension de perles sera utilisée pour établir la tension PMT et les paramètres de dispersion optimaux du cytomètre en flux. 2. En mode acquisition de votre cytomètre (utilisateurs Beckman Coulter XL, FC500 ou Navios, voir ci-dessous), configurez 5 histogrammes à 2 paramètres : FS (lin) vs SS (log) CD64 FITC vs SS (log) CD163 PE vs SS (log) FL3 (perles) par rapport à SS (log) CD163 PE vs CD64 FITC et 3 histogrammes à paramètre unique : FL1 - CD64 FITC FL2 - CD163 PE FL3 (ou PMT avec une configuration du filtre capable de détecter à 685 nm) REMARQUE :Les instruments Beckman Coulter XL, FC500 et Navios doivent présenter les paramètres des protocoles d'acquisition sélectionnés dans l'ordre suivant : P1 = FALS P4=log PE P2 = log dispersion latérale P5=log PMT pour le signal à 685 nm P3 = log FITC (généralement FL4) 3. Mettez en position OFF tous les paramètres de compensation et de seuils. 4. Paramètres de tension pour tous les instruments, à l'exception de BDB FACSCanto II. (Utilisateurs FACSCanto II, voir instructions ci-dessous) Remarque : Réglez tous les paramètres log sur affichage à 4 décades dans le logiciel de recueil par cytométrie en flux avant l'acquisition. Analysez la suspension de perles et procédez aux réglages suivants sur les histogrammes à paramètre unique (voir diagramme) : Le centre du pic sur l'axe FL1 (FITC) doit se trouver sur le canal 100 (au début de la troisième décade de l'intensité de fluorescence). LK64-V A4 EN Page 3 de 9

4 Le centre du pic sur l'axe FL2 (PE) doit se trouver à ~20 (le premier repère dans la deuxième décade de l'intensité de fluorescence). Le centre du pic sur l'axe FL3 doit se trouver sur le canal 100 ou au début de la troisième décade de l'intensité de fluorescence. Sur l'histogramme FS vs log SS, la population des perles doit être positionnée à la fin de la troisième décade sur le log du signal de la dispersion latérale et à proximité du canal 200 sur le signal de la dispersion vers l'avant ou à angle faible (sur 256 canaux, utilisez le canal 25-50). Pour les utilisateurs de tous les modèles Beckman Coulter, FACSCalibur et FACScan TM : CD64- FITC CD163- PE Starfire Red SSC Log **Paramètres de tension pour les utilisateurs BDB FACSCanto II TM uniquement : Les cytomètres en flux BD FACSCanto II nécessitent des instructions d'installation alternatives, du fait des différences présentes dans l'affichage de l'échelle de fluorescence du log qui est spécifique à la série de logiciels BD FACSDiva utilisée sur le Canto II. Remarque : Réglez tous les paramètres log sur un affichage à 4 décades dans le logiciel de recueil par cytométrie en flux avant l'acquisition. Analysez la suspension de perles et procédez aux réglages suivants sur les histogrammes à paramètre unique (voir diagramme) : Le centre du pic sur l'axe FL1 (FITC) doit se trouver sur le canal 3000 (le second repère de la troisième décade de l'intensité de fluorescence). Le centre du pic sur l'axe FL2 (FITC) doit se trouver à proximité de la fin de la deuxième décade de l'intensité de fluorescence. Le centre du pic sur l'axe FL3 doit se trouver sur le canal 3000 (le second repère de la troisième décade de l'intensité de fluorescence). Sur l'histogramme FS vs log SS, la population des perles doit être positionnée à la fin de la troisième décade sur le log du signal de la dispersion latérale et sur le canal sur le signal de la dispersion vers l'avant ou à angle faible. LK64-V A4 EN Page 4 de 9

5 Pour les utilisateurs de BD FACSCanto II uniquement : CD64- FITC CD163- PE Starfire Red SSC Log 5. Le seuil permettant d'exclure les plaquettes et les débris de globules rouges doit être défini sur log SS à l'aide de lymphocytes. Le discriminateur sur log SS doit être défini pour se situer juste à la gauche de la population des lymphocytes. N'utilisez pas d'ensemble discriminateur sur la dispersion vers l'avant car les perles seront exclues de l'acquisition. 6. Les paramètres Acquisition et Stockage doivent être réglés pour permettre le recueil de événements non sélectionnés. Le réglage de la résolution sur 1024 est généralement recommandé, mais il est obligatoire lors de l'utilisation de cytomètres Beckman Coulter Cytomics TM FC500 ou BD Biosciences FACSCanto TM. 7. Enregistrez les paramètres et le modèle d'acquisition. Répétez les étapes 4 à 7 avec tout nouveau lot de Leuko64 TM ou après une intervention d'entretien sur l'instrument. ANALYSE DU FICHIER EN MODE LISTE Installez le logiciel Leuko64 TM QuantiCALC inclus sur le MacIntosh ou le PC qui sera utilisé pour l'analyse des données. Pour l'analyse des données en mode liste suivez les instructions conviviales qui se trouvent dans le fichier d'aide du logiciel. REMARQUE : Le logiciel est spécifique au lot et les protocoles d'utilisation sont spécifiques au modèle de l'instrument. Vous serez invité à vérifier que la sélection est correcte. STRATÉGIE DE CONTRÔLE QUALITÉ POUR LE DOSAGE LEUKO64 TM Le dosage utilise des populations cellulaires autologues dans l'échantillon du patient pour les contrôles positifs et négatifs, ce qui optimise l'évaluation des variables pré-analytiques. La population lymphocyte, qui n'exprime pas de CD64 ni de CD163, sert de population de contrôle négatif et permet de s'assurer de l'ajout des réactifs appropriés. Elle peut aussi permettre de détecter la présence de substances fluorescente au sein de l'échantillon de diagnostic. La population monocyte, qui provoque une expression constitutive de CD64 et de CD163, sert de contrôle positif afin de s'assurer que la coloration de l'échantillon avec le réactif A est correcte. Pour obtenir plus de détails concernant les contrôles positifs et négatifs du dosage, suivez les instructions conviviales qui se trouvent dans le fichier d'aide du logiciel Leuko64 TM. REMARQUE : Le logiciel dispose de témoins et de directives concernant le contrôle. LK64-V A4 EN Page 5 de 9

6 t l H Y C MANIPULATION ET STOCKAGE Conservez les flacons à la verticale, bien fermés, à 2-8 C quand ils ne sont pas en cours d'utilisation. Les flacons non ouverts sont stables jusqu'à la date de péremption indiquée sur chacun d'entre eux et sur la fiche de dosage. Évitez les cycles de réchauffement et de refroidissement inutiles car le dosage n'est valable que pour trente (30) cycles thermiques. Protégez le produit de la congélation, de températures supérieures à 30 C et d'un séjour prolongé à température ambiante (18-26 C) ou d'une exposition à la lumière. AVERTISSEMENT Tous les composants de ce kit contiennent de l'azide de sodium (<0,1 % p/ v). Ce produit chimique est un composé toxique et dangereux quand il est combiné à des acides ou des métaux. Manipulez en prenant les précautions appropriées. Les solutions contenant de l'azide de sodium doivent être éliminées de façon appropriée. CONTROLE QUALITÉ DU PRODUIT Les performances et la spécificité des réactifs contenus dans ce kit ont été testées à l'aide des méthodes de contrôle qualité interne de Trillium. La fabrication de ce produit a été faite dans le respect de directives de système qualité et de fabrication conformes aux normes FDA QSR et ISO 13485:2003. LIMITATIONS DU PRODUIT Il a été établi que l'utilisation thérapeutique de l'interféron gamma, du G-CSF ou d'autres agents qui modulent les réponses immunitaires naturelles affectent la régulation à la hausse de l'expression du CD64 leucocytaire et, donc, l'interprétation du dosage. Les résultats du dosage Leuko64 TM ne doivent pas constituer la seule mesure de l'inflammation chez ces patients mais ils peuvent servir à mesurer l'effet de tels traitements. Il convient de respecter les conditions de conservation et d'utilisation de ce produit et des spécimens à tester afin d'assurer des performances optimales et d'éviter les résultats erronés ou inexacts. Un mélange incomplet du Réactif C avant emploi rend invalide l'aliquote qui a été prélevée ainsi que le matériel qui reste dans le flacon. Le choix d'un protocole pour instrument ou d'un numéro de lot de trousse incorrect lors du lancement du logiciel peut réduire la précision de l'analyse des données en mode liste. Le logiciel est spécifique au lot et les protocoles d'utilisation sont spécifiques au modèle de l'instrument. Effectuez une sélection correcte lorsque vous y êtes invité. Tout fichier relatif à un échantillon sanguin sévèrement leucopénique ou neutropénique indiquant moins de 200 événements de leucocytémie sélectionnés par le logiciel Leuko64 TM dans l'une des trois catégories (PMN, Lymphocyte ou Monocyte) ne peut pas être analysé par le dosage Leuko64 TM sans une importante réduction de la justesse et de la précision de l'indice PMN CD64. Tout fichier dont le nombre de perles est inférieur à 1000 doit être évalué afin de déterminer la raison de ce faible nombre de perles, qui peut être dû à des paramètres incorrects sur l'instrument ou à un échantillon sanguin non dilué dont la leucocytémie est >25 x 10 9 cellules/l. LK64-V A4 EN Page 6 de 9

7 Bien que ce phénomène soit rare, il peut arriver que les filtres des instruments de cytométrie en flux soient installés dans une configuration atypique dans laquelle FL1 ne correspond pas au signal CD64 FITC et où FL2 ne correspond pas au signal CD163 PE, ce qui compromet les performances du logiciel Leuko64 TM. Dans ce genre de situation ou si vous rencontrez un problème quelconque lors de l'utilisation du logiciel, contactez le fournisseur de l'instrument et le service d'assistance technique de Trillium Diagnostics pour résoudre le problème. CARACTERISTIQUES DES PERFORMANCES Chaque laboratoire doit établir une ou plusieurs plages de référence acceptables pour chacun des lots de Leuko64 TM. Il est prévu que la plage de référence de l'indice PMN CD64 pour des échantillons sanguins normaux soit 1,00. En général, plus la réponse inflammatoire systémique aiguë est sévère, plus la valeur mesurée de l'indice PMN CD64 (et Monocyte) est élevée. Les plages de référence prévues pour les indices Monocyte CD64 et CD163 n'ont pas été établies. RÉFÉRENCES 1. Davis BH. Improved diagnostic approaches to infection/sepsis detection. (Approches améliorées des diagnostiques dans la détection des infections et des septicémies). Expert Rev Mol Diag 2005;5: Schiff D, Rae J, et al. Increased phagocyte CD64 expression and improved Fc-receptor mediated phagocytosis following in vivo recombinant human interferon-ɣ treatment of normal human subjects. Blood 1997;90: Petroni KC, Shen L, Guyre PM. Modulation of human polymorphonuclear leukocyte IgG Fc receptors and Fc receptor-mediated functions by IFN-gamma and glucocorticoids. J Immunol 1988;140: Davis BH, Bigelow NC, et al. Neutrophil CD64 expression: potential diagnostic indicator of acute inflammation and therapeutic monitor of interferon-g therapy. Lab Hematol 1995;1: Guyre PM, Campbell AS, et al. Monocytes and polymorphonuclear neutrophils of patients with streptococcal pharyngitis express increased numbers of type I IgG Fc receptors. J Clin Invest 1990;86: Ng PC, Lam HS. Diagnostic markers for neonatal sepsis. Curr Opin Pediatr 2006;18: Davis BH, Bigelow NC. Comparison of neutrophil CD64 expression, manual myeloid immaturity counts, and automated hematology analyzer flags as indicators of infection or sepsis. Lab Hematol 2005; 11: Leino L, Sorvajarvi K, et al. Febrile infection changes the expression of IgG Fc receptors and complement receptors in human neutrophils in vivo. Clin Exp Immunol 1997;107: Davis BH, Olsen S, et al. Neutrophil CD64 is an improved indicator of infection or sepsis in emergency room patients. Arch Pathol Lab Med 2006;130(5): Van der Meer W, Pickkers P, et al. Hematological indices, inflammatory markers and neutrophil CD64 expression: comparative trends during experimental human endotoxemia. J Endotoxin Res 2007;13: LK64-V A4 EN Page 7 de 9

8 11. Groselj M, Ihan A, Derganc M. Neutrophil and monocyte CD64 and CD163 expression in critically ill neonates and children with sepsis: comparison of fluorescence intensity and calculated Indexes. Mediators Inflamm 2008; 2008: Bhandari V, Wang C, et al. Hematologic profile of sepsis in neonates: neutrophil CD64 as a diagnostic marker. Pediatrics 2008;121: Hoffmann JJ. Neutrophil CD64 as a sepsis biomarker. Biochemica Medica 2011;21: Icardi M, Erickson Y, Kilborn S, et al. CD64 Index provides simple and predictive testing for detection and monitiroing of sepsis and bacterial infection in hospital patients. J Clin Microbiol 2009;47: US Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration (Ministère du travail américain ; Administration de la sécurité et de l'hygiène industrielles américaine). 29 CFR Parts , Occupational Exposure to Bloodborne Pathogens; Final Rule. (Expositions professionnelles aux pathogènes à diffusion hématogène ; règle finale). Enregistrement fédéral 235: US Department of Health and Human Services (Département de la Santé et des Services sociaux des Etats-Unis). Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Biosécurité dans les laboratoires microbiologiques et biomédicaux). HHS Publication (NIH) Washington: US Government Printing Office (imprimerie nationale américaine) MARQUES COMMERCIALES Leuko64 QuantiCALC software est une marque déposée et a été développé par VERITY SOFTWARE HOUSE Topsham, Maine, USA et TRILLIUM DIAGNOSTICS, LLC Brewer, Maine, USA FACSCanto and FACScan sont des marques déposées de BD Biosciences San Jose, CA, USA Navios, Gallios Cytomics FC500 et XL sont des marques déposées de Beckman Coulter, Inc Brea, CA, USA Leuko64 est un dosage breveté, couvert par le brevet américain N 8,116,984, le brevet japonais et la demande EPO N SUPPORT CLIENTELE M Trillium Diagnostics, LLC PO Box 67 Brewer, Maine, USA Téléphone : Télécopie : Informations techniques Commandes par téléphone, télécopie ou sur le site Web à l'adresse LK64-V A4 EN Page 8 de 9

9 P IQ Products BV Rozenburglaan 13a 9727 DL Groningen, Pays-Bas Téléphone : +31(0) Télécopie : +31 (0) Informations techniques Commandes Site Web LK64-V A4 EN Page 9 de 9

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